L'objectiu principal d'aquesta tesi era l'estudi dels mecanismes bioquímics que determinen la resistència de les pomes contra un atac de Penicillium expansum. Els diferents estudis es van centrar en determinar el paper que el peròxid d'hidrogen juga en la resistència, directament o com a inductor d'altres processos també involucrats en la resistència dels fruits, com és la lignificació. Es van estudiar també les possibles relacions entre la capacitat d'enfosquiment enzimàtic del fruit i la resistència. D'altra banda, i amb els objectius de comprovar els resultats obtinguts en fruits sencers i d'establir un model d'interpretació, es va utilitzar un cultiu cel·lular de poma. Tots aquests estudis tenien com finalitat determinar les mecanismes bioquímics claus involucrats en la resistència a P. expansum i proposar un marcador de susceptibilitat en pomes. Els resultats presentats en aquesta tesi demostren la participació del peròxid d'hidrogen en la resistència, ja que s'observava una acumulació d'aquest compost en fruits en resposta a l'atac fúngic. Aquesta acumulació era present en fruits immadurs (fruits resistents), però no en els fruits madurs (fruits sensibles). En fruits sencers, la generació de peròxid d'hidrogen estava determinada per un increment en l'activitat de l'enzim superòxid dismutasa (SOD) i una disminució dels enzims involucrats en la degradació del peròxid d'hidrogen, especialment de la peroxidasa (POX). Els resultats obtinguts en el model in vitro confirmen la intervenció del peròxid d'hidrogen en el procés de resistència segons un model d'interacció de tipus compatible. En aquest model, l'acumulació del peròxid estava principalment determinada per l'acció de l'enzim NADPH oxidasa, mentre que els altres enzims (SOD, CAT i POX) eren secundaris. Quan el cultiu cel·lular de poma s'inoculava amb suspensió aquosa de P. expansum filtrada, el model es comportava com un model d'interacció de tipus incompatible, fet que mostra l'existència d'un inductor hidrosoluble en el patogen que pot promoure l'acumulació de peròxid d'hidrogen. Els resultats obtinguts en fruit sencer, també demostren que el peròxid d'hidrogen actua principalment promovent l'acumulació de lignines en la zona ferida, i que el procés d'enfosquiment enzimàtic no està vinculat a la resistència dels fruits. Els canvis metabòlics descrits amb anterioritat semblen ésser induïts principalment per l'acció de la ferida i no són constitutius. Com a conseqüència, cap d'aquests paràmetres podria ser utilitzat com a marcador de susceptibilitat del fruit a la collita. / El principal objetivo de la presente tesis era el estudio de los mecanismos bioquímicos que determinan la resistencia de las manzanas contra un ataque por Penicillium expansum. Los diversos estudios se centraron en determinar el papel que el peróxido de hidrógeno juega en la resistencia, directamente o como inductor de otros procesos también involucrados en la resistencia de los frutos, como es la lignificación. Se estudiaron también las posibles relaciones entre la capacidad de empardecimiento enzimático del fruto y la resistencia. Por otro lado, y con los objetivos de comprobar los resultados obtenidos en fruto entero y de establecer un modelo de interpretación, se utilizó un cultivo celular de manzana. Todos estos estudios tenían como finalidad determinar los mecanismos bioquímicos clave involucrados en la resistencia a P. expansum y proponer un marcador de susceptibilidad de las manzanas. Los resultados presentados en esta tesis demuestran la participación del peróxido de hidrógeno en la resistencia, ya que se observaba una acumulación de este compuesto en frutos en respuesta al ataque fúngico. Esta acumulación se daba en frutos inmaduros (frutos resistentes), pero no en los frutos maduros (frutos sensibles). En frutos enteros, la generación de peróxido de hidrógeno estaba determinada por un incremento de actividad de la enzima superòxido dismutasa (SOD) y una disminución de las enzimas involucradas en la degradación del peróxido de hidrógeno, especialmente de la peroxidasa (POX). Los resultados obtenidos en el modelo in vitro confirman la intervención del peróxido de hidrógeno en el proceso de resistencia según un modelo de interacción de tipo compatible. En este modelo, la acumulación del peróxido estaba principalmente determinada por la acción de la enzima NADPH oxidasa, mientras que las otras enzimas (SOD, CAT y POX) eran secundarias. Cuando el cultivo celular de manzana se inoculaba con una suspensión acuosa de P. expansum filtrada, el modelo se comportaba como un modelo de interacción de tipo incompatible, hecho que muestra la existencia de un inductor hidrosoluble en el patógeno que puede promover la acumulación de peróxido de hidrógeno. Los resultados obtenidos en fruto entero, también muestran como el peróxido de hidrógeno actúa promoviendo la acumulación de ligninas en la zona dañada y que el proceso de empardecimiento enzimático no está relacionado con la resistencia de los frutos. Los cambios metabólicos descritos anteriormente parecen ser inducidos principalmente por la acción de la herida y no son constitutivos. En consecuencia, ninguno de estos parámetros podría ser utilizado como marcador de susceptibilidad del fruto a la cosecha. / The main objective of this thesis was to study the biochemical mechanisms that determine the resistance of apple in response to an attack by Penicillium expansum. Emphasis was given in determining the role that hydrogen peroxide played in the resistance, directly or in relation to the induction of other processes also involved in fruit resistance, such as lignification. The possible relationship between the enzymatic browning potential of the fruit and resistance was also studied. On the other hand, studies on apple cell suspension were also carried out in order to verify the results obtained in whole fruit and establish an interpretation model. The purposes of all these studies were to determine the key biochemical mechanisms involved in the resistance to P. expansum and to propose a marker of apple susceptibility. As shown in our results, hydrogen peroxide appeared to play an underlying role in resistance, because an accumulation of this compound was observed in response to the fungal attack. This accumulation was detected in immature fruit (resistant fruit) but not in mature fruit (susceptible fruit). In whole fruit, the generation of hydrogen peroxide was mainly determined by the increase of superoxide dismutase enzyme activity (SOD) but also by a decrease of H2O2-scavenging enzymes, especially peroxidase (POX). The results obtained in the in vitro model confirmed the contribution of hydrogen peroxide in the resistance process according to a compatible interaction model. In this model the accumulation of the peroxide was mainly determined by the action of NADPH oxidase enzyme, whereas the other enzymes (SOD, CAT and POX) were secondary. When apple cell suspension was inoculated with the filtered aqueous suspension of P. expansum, the model behaved as an incompatible model, showing the existence of a pathogen-related hydrosoluble elicitor that may also elicits the accumulation of hydrogen peroxide. The results obtained in whole fruit also showed that hydrogen peroxide is mainly involved in defence mechanism through its action on lignin accumulation and that the enzymatic browning process was not linked to fruit resistance. All the parameters involved in apple resistance were not constitutive and appeared to be triggered by the wounding response. In consequence, none of these parameters could be used to predict the fruit susceptibility at harvest.

Diss. (sammanfattning) Alnarp : Sveriges lantbruksuniv. / Härtill 7 uppsatser.

Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniero Agrónomo / El control de enfermedades de poscosecha es una problemática constante en la producción de uva de mesa, siendo Botrytis cinerea y Penicillium expansum, dos de los patógenos más importantes. El cuestionamiento a la cantidad máxima de residuos de agroquímicos permitidos en la fruta en los mercados de destino y la acotada cantidad de fungicidas disponibles en el mercado, han llevado a la búsqueda de alternativas a los fungicidas sintéticos, la cual se ha enfocado a productos naturales, amigables con el medio ambiente y libres de residuos. El principal objetivo de este estudio fue evaluar la actividad de 15 extractos de macrohongos en el control de ambos patógenos. Los macrohongos fueron colectados desde su ambiente natural, posteriormente secados, triturados y macerados en alcohol al 95%, y los extractos resultantes fueron utilizados en bioensayos de inhibición in vitro e in vivo. Para el control in vitro se enmendó agar papa dextrosa con cada extracto en etanol al 1% donde se sembró micelio y conidias de los patógenos. El control in vivo se realizó sobre bayas de uva de mesa del cv. Red Globe sometidas o no a desinfección previa con NaClO (0,5%). A las bayas se les realizó una herida y luego se aplicaron los extractos 1 y 24 horas antes de la inoculación con conidias de los patógenos. Los extractos con mayor efectividad inhibitoria in vitro del crecimiento miceliar de B. cinerea fueron Suillus luteus, Agarical sp. y Amanita sp. los que inhibieron en un 92,9, 71,0 y 69,4%, respectivamente. Para el control in vitro de P. expansum los dos extractos que tuvieron un mayor efecto fueron los de Agarical sp. y Agaricus arvensis con un 35,3 y 34,6% de inhibición del crecimiento miceliar, respectivamente. Los extractos con mayor efectividad en la inhibición de la germinación de conidias fueron: Agarical sp. y Macrolepiota rhacodes, para B. cinerea, y Agaricus arvensis y Laetiporus sulphureus para P. expansum. En el control in vivo solo el extracto de Amanita sp. tuvo un efecto en la inhibición de la pudrición causada por B. cinerea sobre las bayas, aplicado 24 horas antes de la inoculación, e igualmente en bayas sin desinfectar inoculadas con P. expansum. / Postharvest rots of table grapes are a constant problem for the industry with Botrytis cinerea and Penicillium expansum as the most important pathogens. Restrictions on the maximum amount of pesticide residues allowed on the fruit, and the limited number of fungicides registered in the markets have prompted the look for alternatives to the traditional chemical fungicides, focusing mainly on natural products environmentally friendly and free from residue restrictions. This study was aimed to evaluate the activity of 15 extracts of mushrooms in the control of both pathogens. The mushrooms were collected from their natural sources, dried, grounded and macerated in ethanol 95%, and the extracts obtained were evaluated in vitro and in vivo. Potato dextrose agar media was amended with the ethanol extracts at a rate of 1%, for the in vitro tests with mycelia or conidia of the pathogens. In vivo assays were conducted on Red Globe berries that were surface disinfected with NaOCl (0,5 %) or not disinfected at all. The berries were wound inoculated with a spore suspension of each pathogen 1 or 24 hours after the extracts treatments. The extracts that gave the greatest inhibition of the mycelial growth of B. cinerea were those of Suillus luteus, Agarical sp. and Amanita sp, which gave a 92.9, 71.0 and 69.4 % inhibition, respectively. While the extracts with the higher inhibition of the mycelial growth of P. expansum were those of Agarical sp. and Agaricus arvensis with 35.3 and 34.6 % inhibition, respectively. The extracts with the higher inhibition of the conidia germination were those of Agarical sp. and Macrolepiota rhacodes, for B. cinerea, and Agaricus arvensis and Laetiporus sulphureus for P. expansum. Only the extract of Amanita sp. reduced the rot caused by B. cinerea when applied 24 hours before berry inoculation and the rot caused by P. expansum on berries that were not disinfected.

Tesis por compendio / [ES] Los péptidos antimicrobianos (AMP) son una alternativa prometedora para el desarrollo de nuevos antifúngicos que puedan sustituir a los fungicidas usados en agricultura. Sin embargo, el alto coste de la síntesis química y la dificultad para su producción a gran escala han limitado su aplicación. Las proteínas antifúngicas (AFP) son AMP naturales, pequeñas, catiónicas, secretadas y ricas en cisteína con gran potencial para el control de hongos fitopatógenos. Las AFPs se encuentran en hongos filamentosos, son estables y pueden producirse en grandes cantidades. Sin embargo, el papel biológico en su hongo productor no se conoce en profundidad. En esta tesis, se estudió la diversidad de AFPs en genomas de hongos ascomicetos y se propuso una nueva clasificación en tres clases (A, B y C). Penicillium digitatum es el principal patógeno postcosecha de cítricos y codifica solo una AFP en su genoma de clase B (AfpB), mientras que Penicillium expansum, el principal patógeno postcosecha de manzana, codifica una AFP de cada clase (AfpA, AfpB y AfpC). En este trabajo describimos la producción biotecnológica y la caracterización de estas cuatro AFPs. Se ha caracterizado el papel biológico del gen afpB en P. digitatum mediante estudios de expresión génica y generación de mutantes nulos y de expresión constitutiva. Los resultados indicaron que afpB es prescindible para la biología y el ciclo vital del hongo, aunque la expresión del gen afpB bajo el promotor constitutivo gpdA de Aspergillus nidulans es perjudicial para su crecimiento y virulencia. Sorprendentemente, ni la cepa parental ni las cepas constitutivas produjeron cantidades detectables de AfpB a pesar de la alta expresión del gen codificante. El modelado molecular y el diseño racional permitieron predecir la estructura terciaria de AfpB y diseñar péptidos sintéticos para mapear motivos antifúngicos en su secuencia primaria. Confirmamos que los bucles catiónicos L2 y L3 mostraron actividad antifúngica moderada y que pueden actuar sinergísticamente. Con el objetivo de producir AfpB mediante biotecnología, usamos un casete de expresión de AFPs basado en las regiones promotora y terminadora del gen paf de Penicillium chrysogenum, hongo que produce naturalmente grandes cantidades de su propia proteína PAF. Este casete funcionó en P. digitatum y permitió la producción homóloga de AfpB. Los datos también mostraron que las secuencias del péptido señal (SP) y el pro-péptido de la SP-Pro-AfpB no determinan la producción de proteína. También demostramos la estabilidad térmica y la resistencia a la proteólisis de AfpB, y aportamos datos que sugieren que la estructura terciaria no es necesaria para la actividad antifúngica. Similar a lo descrito en P. digitatum, ninguna de las tres AFPs se detectó en los sobrenadantes de cultivo en medio rico de P. expansum. Sin embargo, AfpA se produjo en grandes cantidades en cultivos de medio mínimo de P. expansum. Para completar el repertorio de AFPs, produjimos las tres AFPs de P. expansum (AfpA, AfpB y AfpC) en P. chrysogenum con el casete paf. Las tres proteínas de P. expansum se produjeron, purificaron y caracterizaron con éxito. Ninguna de las AFPs producidas en este trabajo fue citotóxica frente a eritrocitos de mamíferos. AfpA de P. expansum seguida de AfpB de P. digitatum fueron las AFPs más activas contra hongos filamentosos, incluyendo patógenos de plantas y humanos, productores de micotoxinas y sus propios hongos productores, una característica previamente no descrita en las AFPs. Además, la AfpA de P. expansum y la AfpB de P. digitatum protegieron frente a la infección causada por el hongo Botrytis cinerea en plantas de tomate, y AfpA de P. expansum protegió frente a P. digitatum en frutos de naranja. Estos resultados confirman nuestra hipótesis de que las AFPs son buenas candidatas para el desarrollo de nuevos antifúngicos en protección vegetal y conservación postcosecha, pero ta / [CA] Els pèptids antimicrobians (AMP) són una alternativa prometedora per al desenvolupament de nous antifúngics que puguen substituir als fungicides utilitzats en agricultura. No obstant això, l'alt cost de la síntesi química i la dificultat per a la producció biotecnològica a gran escala han limitat la seua aplicació. Les proteïnes antifúngiques (AFP) són AMPs naturals, xicotetes, catiòniques, secretades i riques en cisteína que oferixen un gran potencial per al control de fongs fitopatogens. Les AFPs estan presents de en fongs filamentosos, són molt estables i poden produir-se en grans quantitats. No obstant això, el paper biològic d'estes AFPs en el seu fong productor encara no està clar. En esta tesi es va estudiar la diversitat d'AFPs en genomes de fongs ascomicets i es va proposar una nova classificació en tres clases (A, B i C). Penicillium digitatum, el principal patogen postcollita de cítrics, codifica només una AFP en el seu genoma de classe B (AfpB). Penicillium expansum, el principal patogen postcollita de poma, codifica una AFP de cada classe (AfpA, AfpB i AfpC). En este treball presentem la producció biotecnològica i la caracterització d'estes quatre AFPs. Hem caracteritzat el paper biològic del gen afpB en P. digitatum mitjançant estudis d'expressió gènica i la generació de mutants nuls i d'expressió constitutiva. Els resultats van indicar que afpB és prescindible per a la biologia i el cicle de vida d'este fong, encara que l'expressió del gen afpB davall el promotor constitutiu gpdA d'Aspergillus nidulans és perjudicial per al seu creixement i virulència sobre fruits cítrics. Sorprenentment, ni el cep parental ni els ceps constitutius van produir quantitats detectables d'AfpB malgrat l'alta expressió del gen afpB. El modelatge molecular i el disseny racional van permetre predir l'estructura terciària d'AfpB i dissenyar pèptids sintètics per a identificar motius antifúngics dins de la seqüència primària. Confirmarem que les estructures catiòniques L2 i L3 mostren activitat antifúngica i que poden actuar de forma sinèrgica. Amb l'objectiu de la producció biotecnològica d'AfpB, utilitzarem un casset d'expressió d'AFPs basat en les regions promotora i terminadora del gen paf de Penicillium chrysogenum, el qual produïx naturalment grans quantitats de la seua pròpia proteïna PAF. Este casset va funcionar en P. digitatum i va permetre la producció homòloga d'AfpB. Les dades també van mostrar que les seqüències del pèptid señal (SP) i el propèptid de la SP-Pro-AfpB no determinaren la producció de proteïna. També demostrarem l'extrema estabilitat tèrmica i la resistència proteolítica d'AfpB, i proporcionem dades que suggerixen que l'estructura terciària no és necessària per a l'activitat antifúngica. Semblant a P. digitatum, cap de les tres AFPs es van detectar en els sobrenadants de medi de cultiu ric de P. expansum. Al contrari, AfpA es va produir en grans quantitats en cultius de P. expansum en medi mínim. Per a completar el repertori d'AFPs, vam produir les tres AFPs de P. expansum (AfpA, AfpB i AfpC) en P. chrysogenum mitjançant l'ús del casset paf. Així, les tres proteïnes de P. expansum es van produir, purificar i caracteritzar amb èxit. Cap de les AFPs produïdes en este treball va ser citotóxica front eritròcits de mamífer. AfpA de P. expansum seguida d'AfpB de P. digitatum van ser les AFPs més actives contra fongs filamentosos, incloent patògens de plantes i humans, productors de micotoxines i els seus propis productors, una característica prèviament no descrita per a les AFPs. A més, AfpA de P. expansum i AfpB de P. digitatum van protegir front la infecció causada pel fong Botrytis cinerea en plantes de tomaca, i l'AfpA de P. expansum va protegir front P. digitatum en fruits de taronja. Estos resultats confirmen la nostra hipòtesi anterior de que les AFPs són bones candidates per al desenvolupament d'antifúngics en protecció / [EN] Antimicrobial peptides (AMPs) are promising antifungal alternatives to the fungicides used in agriculture. However, the high cost of chemical synthesis and the difficulties of large-scale production have limited their application. Antifungal proteins (AFPs) are a group of natural, small, cationic, secreted, cysteine-rich AMPs that offer a great potential to develop new biomolecules for the control of phytopathogenic fungi. AFPs are naturally present in filamentous fungi, are very stable, and can be produced in large amounts. However, the biological role of these AFPs in their producer fungus is still unclear. In this thesis, we first studied the diversity of AFPs in ascomycetous genomes and proposed a new classification in three different classes (A, B and C). Penicillium digitatum is the main citrus postharvest pathogen and encodes only one AFP from class B in its genome (AfpB), while Penicillium expansum is the main pome postharvest pathogen and encodes one AFP from each class (AfpA, AfpB and AfpC). In this work, we report the identification, efficient biotechnological production and characterization of these four AFPs. We characterized the biological role of the afpB gene in P. digitatum by the study of its gene expression pattern and the generation of null and constitutive expression mutants. Results indicated that afpB is dispensable for the biology and life cycle of this fungus, although expression of the afpB gene under the constitutive Aspergillus nidulans gpdA promoter is detrimental to growth and virulence to citrus. Surprisingly, neither the wild type nor the constitutive strains produced detectable amounts of AfpB in spite of the high afpB gene expression. Molecular modeling and rational design allowed us to predict the AfpB tertiary structure and design synthetic peptides to map antifungal motifs within the AfpB primary sequence. We confirmed that the cationic exposed loops L2 and L3 showed moderate antifungal activity and that they can act synergistically. With the objective of the biotechnological production of AfpB, we used an AFP expression cassette based on the promoter and terminator regions of the well-studied paf gene from Penicillium chrysogenum, which naturally produces high amounts of its own protein PAF. This paf cassette worked efficiently in P. digitatum and allowed the homologous production of AfpB. Data also showed that the signal peptide (SP) and pro-peptide sequences of the translated SP-Pro-AfpB do not determine protein production. We also demonstrated the thermal stability and resistance to proteolytic cleavage of the P. digitatum AfpB, and provided data that suggest that tertiary structure is not required for antifungal activity. Similar to P. digitatum, none of the three AFPs were detected in supernatants of cultures of P. expansum in rich medium. By contrast, AfpA was produced with very high yields in P. expansum cultures in minimal medium. To complete the repertoire of AFPs from P. expansum we produced the three AFPs from P. expansum (AfpA, AfpB and AfpC) in P. chrysogenum with the use of the paf cassette. With this combined approach, the three P. expansum proteins were successfully produced, purified and characterized. None of the four AFPs produced in this work were cytotoxic against mammal erythrocytes. The P. expansum AfpA followed by the P. digitatum AfpB were the most active AFPs against filamentous fungi, including plant and human pathogens, mycotoxin-producer fungi, and their own producers, a feature that had not been previously described for AFPs. Moreover, AfpA from P. expansum and AfpB from P. digitatum protected against fungal infection caused by Botrytis cinerea in tomato plants, and additionally the P. expansum AfpA protected against P. digitatum in orange fruits. These results confirm our previous hypothesis that AFPs are good candidates for the development of antifungals in plant protection and postharvest conservation, but also in clinic or food preservation. / Garrigues Cubells, SM. (2018). Producción y utilización Biotecnológica de nuevas proteínas antifúngicas de hongos filamentosos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/113162 / Compendio

To assess the effects of gamma radiation at low doses, spores of Penicillium expansum NRRL 971 and Penicillium patulum NRRL 989 were exposed to doses of 0, 50, 100, 150, and 200 krads. The amount of patulin for each culture was quantitatively determined and growth at each dose was evaluated. The results showed a 31% increase in the amount of patulin synthesis after a dose of 150 krads for Penicillium expansum At 200 krads, both fungi showed low levels of patulin production and inhibited growth. Eight color mutants of P. expansum and eight color mutants of P. patulum were produced by exposing spores of each fungus to doses of 150 and 200 krads of gamma radiation. An evaluation of patulin production and growth for each mutant showed that color mutation could result in mutants with an enhanced ability to grow or produce increased levels of patulin. When grown at a subatmospheric pressure of 320 mm Hg, P. expansum produced 30% more patulin per flask, when compared to control cultures. At 160 mm Hg, P. expansum showed a 75% decrease over the control cultures. P. patulum was greatly affected by the temperature of 15℃ and showed decreases both in growth and patulin production. Effective control of growth and patulin synthesis was found for these fungi at 160 mm Hg.

Lagent de lutte biologique Aureobasidium pullulans souche Ach1-1 a présenté une grande potentialité dans le contrôle de Penicillium expansum, lagent causal de la pourriture bleue des pommes en conservation. Les mécanismes daction qui sont les plus impliqués dans son activité antagoniste ont été analysés, au cours de ce travail. Daprès des essais de protection réalisés sur pommes blessées, il apparaît que lefficacité de cette souche nest pas liée essentiellement à la sécrétion des métabolites toxiques dans le milieu ou à linduction de la résistance de fruit. Par contre, le mécanisme de la compétition pour la nutrition semble jouer un rôle important. Dans les essais in vitro, la souche antagoniste Ach1-1 a eu un important effet inhibiteur de la germination des conidies de P. expansum dans des milieux de jus de pomme à des faibles concentrations. Mais cet effet était réversible et les conidies inhibées étaient capables de germer une fois remises dans des conditions favorables en éléments nutritifs. Sur pommes blessées, leffet protecteur de la souche Ach1-1 vis-à-vis de P. expansum a été significativement affaibli par lajout dans les blessures de concentrations élevées des principaux composants des pommes en sucres, en vitamines et particulièrement en acides aminés. Il apparaît que lantagoniste exerce une activité fongistatique plus que fongicide vis-à-vis de P. expansum et agit par une compétition efficace pour les éléments nutritifs des blessures des pommes sans affecter la viabilité des conidies du pathogène. Une application exogène des acides aminés des pommes avec des concentrations croissantes dans les blessures a progressivement réduit lactivité antagoniste de la souche Ach1-1 sans altérer son développement dans les blessures, montrant que la compétition pour les acides aminés joue un rôle important dans la suppression de P. expansum. Ce résultat a été appuyé par lanalyse biochimique de la cinétique de lépuisement des acides aminés dans les blessures des pommes qui a montré que ces composés et particulièrement la sérine, la glycine et lacide glutamique sont mieux métabolisés par la souche antagoniste que par le pathogène. Lajout en excès de ces trois acides aminés en groupe ou individuellement dans les blessures des pommes a fortement réduit lefficacité de la souche Ach1-1 vis-à-vis de P. expansum. De plus, la présence de la sérine et la glycine avec des concentrations élevées dans des milieux synthétiques ne présentant aucune source azotée, a réduit leffet inhibiteur de la germination des conidies de P. expansum par la souche Ach1-1. Ainsi, ces acides aminés semble être parmi les éléments les plus limitants dans le mécanisme de la compétition./The biocontrol agent Aureobasidium pullulans strain Ach1-1 was very effective against Penicillium expansum, the causal agent of blue mold on stored apple. Modes of action that could be involved in its biocontrol activity were analysed in this work. According to some biocontrol trials on wounded apples, it appears that neither the production of metabolites nor the induction of fruit resistance were the principal modes of action of this strain. However the mechanism of nutrient competition appears to play an important role. In in vitro assays, the strain Ach1-1 had an important inhibitory effect of conidial germination of P. expansum in apple juice at low concentrations. However this inhibitory effect was suppressed when inhibited conidia were placed in favourable nutrients conditions. On wounded apples the protective activity of strain Ach1-1 against P. expansum was significantly reduced by adding, in the wounds, high concentrations of major apple compounds of sugar, vitamins and most particularly amino acids. It appears that the antagonist exerts a fungistatic rather than fungicidal activi ty on P. expansum as it can deplete limiting nutrient available at the infection site and inhibit conidia germination without affecting their viability. Moreover, an exogenous application of increasing apple amino acids concentrations in wounds had progressively reduced the antagonist activity of strain Ach1-1 without altering its development in wounds, suggesting that competition for apple amino acids by strain Ach1-1 plays an important role in suppressing P. expansum. This finding was strengthened by a time-course analysis of wounds amino acids during apple incubation in witch the strain Ach1-1 was able to assimilate apple amino acids better than P. expansum, most particularly Serine, Glycin and Glutamic acid. Exogenous additions of these three amino acids at high concentrations on apple wounds as a mixture or individually, strongly lowered the Biocontrol activity of strain Ach1-1. Moreover, the existence of amino acids serine and glycin at high concentration in synthetic media, without any nitrogen source, was able to reduce the inhibitory effect of conidial germination of P. expansum by the strain Ach1-1.Therefore these amino acids could be among the most limited nutrients in the mechanism of competition.

La present tesi doctoral es centra en l'aplicació dels bacteris de l'àcid lactic (BAL) com a agents bioprotectors davant microorganismes patògens i deteriorants.Es van aïllar i seleccionar BAL de fruites i hortalisses fresques i es van assajar in vitro davant 5 microorganismes fitopatògens i 5 patògens humans.Es van realitzar assajos d'eficàcia en pomes Golden Delicious amb tots els aïllats enfront les infeccions causades pel fong Penicillium expansum. La soca més eficaç era Weissella cibaria TM128, que reduïa el diàmetre de les infeccions en un 50%.Les soques seleccionades es van assajar enfront els patògens Salmonella typhimurium, Escherichia coli i Listeria monocytogenes en enciams Iceberg i pomes Golden Delicious.Els BAL interferien eficientment amb el creixemet de S. typhimurium, and L. monocytogenes, però van mostrar poc efecte enfront E. coli.Finalment, es van realitzar assajos dosi-resposta amb les soques Leuconostoc mesenteroides CM135, CM160 and PM249 enfront L. monocytogenes. De totes les soques assajades, la soca CM160 va ser la més efectiva. / The present thesis focuses on the use of lactic acid bacteria as bioprotective cultures to inhibit pathogenic and spoilage microorganisms.Lactic acid bacteria were isolated and selected from fresh fruit and vegetables and tested in vitro against five plant pathogens and five human pathogen test bacteria.Efficacy trials with all the isolates were performed in Golden Delicious apples against the blue mould rot infections, caused by Penicillium expansum. The highest effectivity found in this assay was of about 50%, with strain Weissella cibaria TM128.Selected lactic acid bacteria were tested against Salmonella typhimurium, Escherichia coli and Listeria monocytogenes in Iceberg lettuce and Golden Delicious apples. Lactic acid bacteria interfered efficiently with the growth of S. typhimurium, and L. monocytogenes, but showed little effectivity over E. coli.Finally, dose-response assays were done with Leuconostoc mesenteroides strains CM135, CM160 and PM249 against L. monocytogenes.Among the three strains tested, strain CM160 showed the highest effectivity.

Certains microorganismes qui coexistent sur la vigne, peuvent avoir des effets bénéfiques sur la qualité du vin alors que d'autres peuvent être à l'origine de déviations organoleptiques. Dans la dernière décennie, dans diverses régions viticoles de France, plusieurs odeurs de moisi ou de terre ont été mises en évidence. La (-)-géosmine a été considérée comme étant le principal composé responsable de ce défaut. Des moisissures comme Botrytis cinerea et d'autres appartenant au genre Penicillium ont été souvent isolées à partir des raisins présentant l'odeur " moisi-terreuse ". Les effets de cette molécule sur la qualité des vins a motivé notre étude sur la caractérisation des moisissures responsables de ce défaut organoleptique. A partir d'échantillons prélevés en 2007 en Bourgogne, on a identifié, par des méthodes morphologiques et moléculaires, les moisissures présentes sur les raisins, Une souche de Penicilium expansum (25.03) et deux souches de Botrytis cinerea (BC1 et BC2) ont été sélectionnées. Sur baies de raisin, la validation d'un modèle prédictif des effets combinés de la température et de l'activité de l'eau, sur la croissance des champignons, a pu être mise en oeuvre. Elle a montré, sur de larges gammes de T°C et d'aw, que les modèles cardinaux avec inflexion peuvent être validés sur les produits agro-alimentaires en utilisant le gamma concept. L'étude de l'effet du cuivre sur le taux de croissance radiale et le temps de latence des moisissures, a été entreprise afin de mieux comprendre les mécanismes de résistance au cuivre des champignons et d'en déduire des résultats pour une meilleure efficacité des fongicides. Les moisissures testées ont montré une grande tolérance au cuivre, jusqu'à 4,7 mM pour P. expansum et jusqu'à 8, 2 mM et 7,3 mM respectivement pour B. cinerea, BC1 et BC2. L'étude des effets combinés des facteurs environnementaux et nutritionnels (T°C, CO2; Cu+2) sur la production de géosmine par P. expansum, a conduit à définir les conditions minimisant la production de géosmine. Ainsi, on a pu déterminer que le cuivre (composant actif de nombreux fongicides) est un facteur clé dans la production de géosmine par P. expansum.