O pentilenotetrazol (PTZ) é um agente convulsivo amplamente utilizado em modelos animais para investigações envolvendo crises convulsivas. Embora haja um crescente número de estudos envolvendo zebrafish adulto e convulsão, não há até o momento uma caracterização comportamental detalhada do modelo de indução de crises por PTZ neste animal. Portanto, o objetivo deste estudo foi realizar uma caracterização detalhada das manifestações comportamentais no modelo de convulsão induzida por PTZ em zebrafish adulto. Grupos de 12 animais foram submetidos, por imersão, a distintas diferentes concentrações de PTZ (5, 7.5, 10 e 15 mM). O comportamento convulsivo foi observado durante 20 minutos. Os animais apresentaram os seguintes escores comportamentais: (0) nados curtos; (1) aumento na atividade natatória e na abertura opercular; (2) movimentos erráticos e acelerados; (3) movimentos circulares; (4) convulsão clônica; (5) convulsão tônica; (6) morte. Os animais expostos a diferentes distintas concentrações de PTZ apresentaram diferentes distintos perfis convulsivos, intensidades de convulsão e latência para chegar aos escores. Apenas os animais imersos na concentração de 15 mM apresentaram maior tempo para retornar ao comportamento normal após a exposição ao PTZ. A mortalidade foi de 33% e 50% para as concentrações de 10 mM e 15 mM, respectivamente. No intuito de avaliar abordagem perfil comportamental frente ao pré-tratamento de um fármaco anticonvulsivo, 12 animais foram expostos a diazepam (DZP) por 40 min e após expostos ao PTZ (10 mM). O tratamento com DZP atenuou a severidade da convulsão, mas não o tempo necessário para retornar ao comportamento normal. Levando em consideração que este modelo baseia-se na imersão direta do animal a uma solução de PTZ, avaliamos também as concentrações cerebrais deste agente convulsivo. Além disso, investigamos também uma possível correlação entre a concentração cerebral de PTZ, o tempo e a concentração de exposição. Os resultados decorrentes da exposição dos animais a 5 e 10 mM de PTZ, apontam para uma correlação tempo e concentração dependentes. Os resultados deste trabalho demonstram uma caracterização comportamental detalhada ao longo do tempo de exposição ao PTZ, além de avaliar pela primeira vez a intensidade de convulsão, tempo de retorno ao comportamento normal e mortalidade dos animais. Além disso, pela primeira vez foram determinadas as concentrações cerebrais deste composto neste modelo de convulsão em zebrafish adulto. Por fim, espera-se que tais ferramentas comportamentais e de quantificação cerebral deste composto possam ser úteis em futuras investigações translacionais e estudos que tenham como objetivo melhor compreender esta desordem. / Pentylenetetrazole (PTZ) is a common convulsant agent used in animal models to investigate the mechanisms of seizures. Although adult zebrafish have been recently used to study epileptic seizures, a thorough characterization of the PTZ-induced seizures in this animal model is missing. The goal of this study was to perform a detailed temporal behavior profile characterization of PTZ-induced seizure in adult zebrafish. The behavioral profile during 20 min of PTZ immersion (5, 7.5, 10, and 15 mM) was characterized by stages defined as scores: (0) short swim, (1) increased swimming activity and high frequency of opercular movement, (2) erratic movements, (3) circular movements, (4) clonic seizure-like behavior, (5) fall to the bottom of the tank and tonic seizure-like behavior, (6) death. Animals exposed to distinct PTZ concentrations presented different seizure profiles, intensities and latencies to reach all scores. Only animals immersed into 15 mM PTZ showed an increased time to return to the normal behavior (score 0), after exposure. Total mortality rate at 10 and 15 mM were 33% and 50%, respectively. Considering all behavioral parameters, 5, 7.5, 10, and 15 mM PTZ, induced seizures with low, intermediate, and high severity, respectively. Pretreatment with diazepam (DZP) significantly attenuated seizure severity. Finally, the brain PTZ levels in adult zebrafish immersed into the chemoconvulsant solution at 5 and 10 mM were comparable to those described for the rodent model, with a peak after a 20-min of exposure. The PTZ brain levels observed after 2.5-min PTZ exposure and after 60-min removal from exposure were similar. Altogether, our results showed a detailed temporal behavioral characterization of a PTZ epileptic seizure model in adult zebrafish. These behavioral analyses and the simple method for PTZ quantification could be considered as important tools for future investigations and translational researches.

Ciclooxigenase (COX) é a enzima marca-passo na rota metabólica onde o ácido araquidônico é convertido em prostaglandinas. COX-2 é a isoforma que é induzida em sítios de lesão/inflamação e expressa constituivamente em alguns poucos tecidos, como o sistema nervoso central. Tem sido sugerido que a COX-2 tem um papel importante em várias doenças neurodegenerativas, incluindo epilepsia. Neste estudo nós testamos se o celecoxib, um inibidor seletivo da COX-2 (0,2; 2 ou 20 mg/kg, p.o.) protege contra as convulsões, carbonilação de proteínas e inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidas por pentilenotetrazol (PTZ), um agente convulsivante clássico que tem sido largamente usado para estudo da epilepsia e na busca de novos compostos com atividade anticonvulsivante. A administração de celecoxib (2 mg/kg) atenuou as convulsões comportamentais e eletrográficas e a inibição da atividade da Na+,K+- ATPase induzidas por PTZ no hipocampo e córtex cerebral de ratos, sugerindo um papel facilitatório para COX-2 nos efeitos do PTZ. Já que existem evidências que a PGE2 é um mediador chave na via de sinalização da COX-2, nós decidimos investigar o efeito da administração intracerebroventricular de anticorpos anti-PGE2 (4 μg/2 μl, i.c.v.) sobre os episódios convulsivos e inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidas por PTZ. A administração de anticorpos anti- PGE2 atenuou as convulsões comportamentais e eletrográficas e a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidas por PTZ no hipocampo e córtex cerebral de ratos. Em outro experimento, nós mostramos que a administração intracerebroventricular de PGE2 (100 ng/2 μl, i.c.v.) não causou convulsões per se, mas induziu o aparecimento de convulsões eletrográficas em combinação com uma dose subconvulsivante de PTZ (20 mg/kg, i.p.), reforçando um importante papel para PGE2 nas convulsões induzidas por PTZ. Em conjunto estes dados suportam um papel facilitatório para a via COX-2/PGE2 nas convulsões e inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidas por PTZ. / Cyclooxygenase (COX) is the rate-limiting enzyme in the metabolic pathway where arachidonic acid is converted to prostaglandins. COX-2 is the isoform of cyclooxygenase which is inducible at injury/inflammation sites and expressed constitutively in a few tissues, such as the central nervous system. It has been suggested that COX-2 plays a role in several disorders, including convulsive behavior. In this study we tested whether celecoxib, a selective COX-2 inhibitor (0.2, 2 or 20 mg/kg, p.o.) protects against the convulsions, protein carbonylation and inhibition of Na+,K+- ATPase activity induced by pentylenetetrazol (PTZ; 60 mg/kg, i.p.), a classical convulsant agent that has been fairly used for the study of epilepsy and screening of new compounds with antiepileptic activity. The systemic administration of celecoxib (2 mg/kg) attenuated PTZ-induced behavioral and electroencephalographic seizures and Na+,K+-ATPase activity inhibition in the hippocampus and cerebral cortex of rats, suggesting a facilitatory role for COX-2 on the PTZ-induced effects. Since there is a bulk of evidence showing that PGE2 is a key mediator in COX-2 signaling, we decided to investigate the effect of the intracerebroventricular administration of anti-PGE2 antibodies (4 μg/2 μl, i.c.v.) on the convulsive episodes and inhibition of Na+,K+- ATPase activity induced by PTZ. Administration of anti-PGE2 antibodies attenuated PTZ-induced behavioral and electroencephalographic seizures and Na+,K+-ATPase activity inhibition in the hippocampus and cerebral cortex of rats. In a reverse approach, we showed that intracerebroventricular administration of PGE2 (100 ng/2 μl, i.c.v.) did not cause electrographic alterations per se, but elicits electroencephalographic convulsions if given in combination with a subconvulsant dose of PTZ (20 mg/kg, i.p.), further suggesting an important role for this prostaglandin in the convulsant effects of PTZ. Collectively, these data support a facilitatory role for the COX-2/PGE2 pathway in PTZ-induced convulsions and Na+,K+-ATPase activity inhibition.

Ciclooxigenase (COX) é a enzima marca-passo na rota metabólica onde o ácido araquidônico é convertido em prostaglandinas. COX-2 é a isoforma que é induzida em sítios de lesão/inflamação e expressa constituivamente em alguns poucos tecidos, como o sistema nervoso central. Tem sido sugerido que a COX-2 tem um papel importante em várias doenças neurodegenerativas, incluindo epilepsia. Neste estudo nós testamos se o celecoxib, um inibidor seletivo da COX-2 (0,2; 2 ou 20 mg/kg, p.o.) protege contra as convulsões, carbonilação de proteínas e inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidas por pentilenotetrazol (PTZ), um agente convulsivante clássico que tem sido largamente usado para estudo da epilepsia e na busca de novos compostos com atividade anticonvulsivante. A administração de celecoxib (2 mg/kg) atenuou as convulsões comportamentais e eletrográficas e a inibição da atividade da Na+,K+- ATPase induzidas por PTZ no hipocampo e córtex cerebral de ratos, sugerindo um papel facilitatório para COX-2 nos efeitos do PTZ. Já que existem evidências que a PGE2 é um mediador chave na via de sinalização da COX-2, nós decidimos investigar o efeito da administração intracerebroventricular de anticorpos anti-PGE2 (4 μg/2 μl, i.c.v.) sobre os episódios convulsivos e inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidas por PTZ. A administração de anticorpos anti- PGE2 atenuou as convulsões comportamentais e eletrográficas e a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidas por PTZ no hipocampo e córtex cerebral de ratos. Em outro experimento, nós mostramos que a administração intracerebroventricular de PGE2 (100 ng/2 μl, i.c.v.) não causou convulsões per se, mas induziu o aparecimento de convulsões eletrográficas em combinação com uma dose subconvulsivante de PTZ (20 mg/kg, i.p.), reforçando um importante papel para PGE2 nas convulsões induzidas por PTZ. Em conjunto estes dados suportam um papel facilitatório para a via COX-2/PGE2 nas convulsões e inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidas por PTZ. / Cyclooxygenase (COX) is the rate-limiting enzyme in the metabolic pathway where arachidonic acid is converted to prostaglandins. COX-2 is the isoform of cyclooxygenase which is inducible at injury/inflammation sites and expressed constitutively in a few tissues, such as the central nervous system. It has been suggested that COX-2 plays a role in several disorders, including convulsive behavior. In this study we tested whether celecoxib, a selective COX-2 inhibitor (0.2, 2 or 20 mg/kg, p.o.) protects against the convulsions, protein carbonylation and inhibition of Na+,K+- ATPase activity induced by pentylenetetrazol (PTZ; 60 mg/kg, i.p.), a classical convulsant agent that has been fairly used for the study of epilepsy and screening of new compounds with antiepileptic activity. The systemic administration of celecoxib (2 mg/kg) attenuated PTZ-induced behavioral and electroencephalographic seizures and Na+,K+-ATPase activity inhibition in the hippocampus and cerebral cortex of rats, suggesting a facilitatory role for COX-2 on the PTZ-induced effects. Since there is a bulk of evidence showing that PGE2 is a key mediator in COX-2 signaling, we decided to investigate the effect of the intracerebroventricular administration of anti-PGE2 antibodies (4 μg/2 μl, i.c.v.) on the convulsive episodes and inhibition of Na+,K+- ATPase activity induced by PTZ. Administration of anti-PGE2 antibodies attenuated PTZ-induced behavioral and electroencephalographic seizures and Na+,K+-ATPase activity inhibition in the hippocampus and cerebral cortex of rats. In a reverse approach, we showed that intracerebroventricular administration of PGE2 (100 ng/2 μl, i.c.v.) did not cause electrographic alterations per se, but elicits electroencephalographic convulsions if given in combination with a subconvulsant dose of PTZ (20 mg/kg, i.p.), further suggesting an important role for this prostaglandin in the convulsant effects of PTZ. Collectively, these data support a facilitatory role for the COX-2/PGE2 pathway in PTZ-induced convulsions and Na+,K+-ATPase activity inhibition.

O pentilenotetrazol (PTZ) é um agente convulsivo amplamente utilizado em modelos animais para investigações envolvendo crises convulsivas. Embora haja um crescente número de estudos envolvendo zebrafish adulto e convulsão, não há até o momento uma caracterização comportamental detalhada do modelo de indução de crises por PTZ neste animal. Portanto, o objetivo deste estudo foi realizar uma caracterização detalhada das manifestações comportamentais no modelo de convulsão induzida por PTZ em zebrafish adulto. Grupos de 12 animais foram submetidos, por imersão, a distintas diferentes concentrações de PTZ (5, 7.5, 10 e 15 mM). O comportamento convulsivo foi observado durante 20 minutos. Os animais apresentaram os seguintes escores comportamentais: (0) nados curtos; (1) aumento na atividade natatória e na abertura opercular; (2) movimentos erráticos e acelerados; (3) movimentos circulares; (4) convulsão clônica; (5) convulsão tônica; (6) morte. Os animais expostos a diferentes distintas concentrações de PTZ apresentaram diferentes distintos perfis convulsivos, intensidades de convulsão e latência para chegar aos escores. Apenas os animais imersos na concentração de 15 mM apresentaram maior tempo para retornar ao comportamento normal após a exposição ao PTZ. A mortalidade foi de 33% e 50% para as concentrações de 10 mM e 15 mM, respectivamente. No intuito de avaliar abordagem perfil comportamental frente ao pré-tratamento de um fármaco anticonvulsivo, 12 animais foram expostos a diazepam (DZP) por 40 min e após expostos ao PTZ (10 mM). O tratamento com DZP atenuou a severidade da convulsão, mas não o tempo necessário para retornar ao comportamento normal. Levando em consideração que este modelo baseia-se na imersão direta do animal a uma solução de PTZ, avaliamos também as concentrações cerebrais deste agente convulsivo. Além disso, investigamos também uma possível correlação entre a concentração cerebral de PTZ, o tempo e a concentração de exposição. Os resultados decorrentes da exposição dos animais a 5 e 10 mM de PTZ, apontam para uma correlação tempo e concentração dependentes. Os resultados deste trabalho demonstram uma caracterização comportamental detalhada ao longo do tempo de exposição ao PTZ, além de avaliar pela primeira vez a intensidade de convulsão, tempo de retorno ao comportamento normal e mortalidade dos animais. Além disso, pela primeira vez foram determinadas as concentrações cerebrais deste composto neste modelo de convulsão em zebrafish adulto. Por fim, espera-se que tais ferramentas comportamentais e de quantificação cerebral deste composto possam ser úteis em futuras investigações translacionais e estudos que tenham como objetivo melhor compreender esta desordem. / Pentylenetetrazole (PTZ) is a common convulsant agent used in animal models to investigate the mechanisms of seizures. Although adult zebrafish have been recently used to study epileptic seizures, a thorough characterization of the PTZ-induced seizures in this animal model is missing. The goal of this study was to perform a detailed temporal behavior profile characterization of PTZ-induced seizure in adult zebrafish. The behavioral profile during 20 min of PTZ immersion (5, 7.5, 10, and 15 mM) was characterized by stages defined as scores: (0) short swim, (1) increased swimming activity and high frequency of opercular movement, (2) erratic movements, (3) circular movements, (4) clonic seizure-like behavior, (5) fall to the bottom of the tank and tonic seizure-like behavior, (6) death. Animals exposed to distinct PTZ concentrations presented different seizure profiles, intensities and latencies to reach all scores. Only animals immersed into 15 mM PTZ showed an increased time to return to the normal behavior (score 0), after exposure. Total mortality rate at 10 and 15 mM were 33% and 50%, respectively. Considering all behavioral parameters, 5, 7.5, 10, and 15 mM PTZ, induced seizures with low, intermediate, and high severity, respectively. Pretreatment with diazepam (DZP) significantly attenuated seizure severity. Finally, the brain PTZ levels in adult zebrafish immersed into the chemoconvulsant solution at 5 and 10 mM were comparable to those described for the rodent model, with a peak after a 20-min of exposure. The PTZ brain levels observed after 2.5-min PTZ exposure and after 60-min removal from exposure were similar. Altogether, our results showed a detailed temporal behavioral characterization of a PTZ epileptic seizure model in adult zebrafish. These behavioral analyses and the simple method for PTZ quantification could be considered as important tools for future investigations and translational researches.

Cerca de 30% dos pacientes com epilepsia continuam refratários ao tratamento medicamentoso e continuam a sofrer crises, mesmo utilizando um ou mais fármacos antiepilépticas. Intervenções não farmacológicas representam uma alternativa aos fármacos antiepilépticos, dentre as quais a acupuntura, uma técnica tradicional chinesa, que é freqüentemente utilizada como tratamento complementar na medicina ocidental. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da acupuntura manual sobre as convulsões no modelo de kindling induzido por pentilenotetrazol (PTZ) em camundongos, comparar o efeito da acupuntura com diazepam, avaliar a sua utilização em associação a uma dose baixa de diazepam, e avaliar parâmetros de estresse oxidativo, inflamação, genotoxicidade e mutagenicidade. No modelo de kindling, os animais dos grupos que receberam acupuntura manual, foram tratados diariamente durante 16 dias com estimulação no acuponto VG20, e a cada três dias os animais receberam o salina ou diazepam (0,15 mg / kg; i.p.) 30 min antes da administração de PTZ (60 mg / kg; s.c.). Nos grupos que não receberam acupuntura manual, os animais receberam salina, diazepam (2 mg / kg; i.p. - controle positivo), diazepam (0,15 mg / kg; i.p.), 30 min antes da administração de PTZ (60 mg / kg; s.c.). O comportamento convulsivo (porcentagem de convulsão e latência para a primeira convulsão) foi observado por 30 min. Após o último tratamento, os animais foram eutanasiados e o córtex, hipocampo, sangue periférico e medula óssea foram coletados para avaliação dos parâmetros de estresse oxidativo, inflamação, genotoxicidade e mutagenicidade. Os dados de porcentagem (%) de convulsão e latência para a primeira convulsão (LFS) foram analisados pelo Teste de Fisher e GEE respectivamente. MAC e MAC + DZP 0.15mg/Kg não impediram a ocorrência das convulsões, nem aumentaram a LFS, com exceção do terceiro dia de tratamento, no qual observou-se aumento na LFS no grupo MAC + DZP 0.15mg/Kg, comportamento que não se repetiu ao longo do protocolo. Observou-se nos grupos MAC e MAC + DZP 0.15mg/Kg uma redução na formação de espécies reativas de oxigênio e na liberação de óxido nítrico, bem como aumento na atividade de SOD e CAT, sugerindo que a acupuntura oferece proteção contra estresse oxidativo. Além disso, nos mesmos grupos verificou-se a redução na expressão da citocina pró-inflamatória (TNF-α). No grupo MAC + DZP 0.15mg/Kg observou-se uma tendência à proteção do DNA no hipocampo, uma vez que não houve diferença em comparação ao grupo Sal/Sal, contudo não foi observada mutagenicidade em nenhum dos grupos de tratamento. Para concluir, os resultados indicaram que MAC em associação ao DZP 0.15mg/Kg foi capaz de alterar parâmetros associados a convulsões mediada por PTZ no modelo de kindling em camundongos, bem como a acupuntura teve um efeito protetor contra estresse oxidativo, neuroinflamação e danos ao DNA no mesmo modelo. / Around 30% of patients with epilepsy continue refractory to drug treatment and continue to suffer crises, even using one or more anti-epileptic drugs. Nonpharmacological interventions represent an alternative to antiepileptic drugs, among which acupuncture, a traditional Chinese technique, which is often used as a complementary treatment in Western medicine. The aim of this study was to evaluate the effect of manual acupuncture on seizures in the kindling model induced by pentylenetetrazol (PTZ) in mice, comparing the effect of acupuncture with diazepam, to evaluate their use in combination with a low dose of diazepam, and evaluate parameters of oxidative stress, inflammation, genotoxicity and mutagenicity. In the model of kindling, the animal groups receiving manual acupuncture, were treated daily for 16 days with stimulation of the acupoint VG20, and every three days the animals received saline or diazepam (0.15 mg / kg, ip) 30 min before PTZ administration (60 mg / kg, sc). In the groups not receiving manual acupuncture, the animals received saline, diazepam (2 mg / kg, ip - positive control), diazepam (0.15 mg / kg, ip) 30 min before the PTZ administration (60 mg / kg ; sc). The convulsive behavior (percentage of seizure and latency to the first seizure) was observed for 30 min. After the last treatment, the animals were euthanized and the cortex, hippocampus, peripheral blood and bone marrow were collected for evaluation of parameters of oxidative stress, inflammation, genotoxicity and mutagenicity. Percentage of seizure (%) and latency to the first seizure (LFS) were analyzed by Fisher test and GEE respectively. MAC and MAC + DZP 0.15mg / kg did not prevent the occurrence of seizures or increased LFS, except for the third day of treatment, in which there was an increase in LFS in the MAC + DZP 0.15mg / kg group, behavior that was not repeated throughout the protocol. It was observed in the MAC and MAC + DZP 0.15mg / kg groups a reduction in the formation of reactive oxygen species and release of nitric oxide and increase in SOD and CAT activity, suggesting that acupuncture provides protection against oxidative stress. Furthermore, in the same groups there was a reduction in the expression of pro-inflammatory cytokine (TNF-α). In the MAC + DZP 0.15mg / kg group there was a tendency to protect DNA in hippocampus since there was no difference in comparison to Sal/Sal group, however mutagenicity was not observed in any of the treatment groups. In conclusion, the results indicated that MAC in association with DZP 0.15mg / kg was able to change parameters associated with seizures mediated in PTZ kindling model in mice, also suggested that acupuncture had a protective effect against oxidative stress, neuroinflammation and damage DNA in the same model.

Epilepsy is a chronic neurological disease characterized by recurrent, unprovoked seizures. Evidence suggests that inflammation plays a role in the pathophysiology of seizures. Although cysteinyl leukotrienes (CysLTs) have been implicated in seizures, no study has investigated whether blocking of CysLT1 receptors potentiates the anticonvulsant action of classic antiepileptic drugs, as well as the expression of CysLT receptors is altered by inflammation. In this study we showed that the inverse agonist of CysLT1 receptor, montelukast, synergistically increases the anticonvulsant action of phenobarbital against seizures induced in a model of acute injection of pentylenetetrazole (PTZ). Furthermore, it is shown that LTD4 (leukotriene D4) prevents the effect of montelukast. Isobolographic analysis revealed an ED50 mix value for a fixed-ratio combination (1:1 proportion) of montelukast plus phenobarbital of 0.06 ± 0.02 μmol, whereas the calculated ED50 add value was 0.49 ± 0.03 μmol. The interaction index was 0.12, indicating a synergistic interaction. Montelukast significantly decreased the antiseizure DE50 for phenobarbital (0.74 and 0.04 μmol in the absence and presence of montelukast, respectively) and, consequently, phenobarbital-induced sedation at equieffective doses. We also investigated whether the CysLT1 inverse agonist montelukast and a classical anticonvulsant, phenobarbital, decrease seizures in PTZ-kindled mice and CysLT receptor expression. Montelukast (10 mg/kg, s.c.) and phenobarbital (20 mg/kg, s.c.) increased the latency to generalized seizures in kindled mice. Montelukast increased CysLT1 immunoreactivity only in non-kindled PTZ-challenged mice. Interestingly, PTZ challenge decreased CysLT2 immunoreactivity only in kindled mice. CysLT1 antagonists seem to emerge as promising adjunct therapeutic agents in the treatment of refractory seizures. Notwithstanding, additional studies are necessary to evaluate the clinical implications of this work. / A epilepsia é uma doença que se manifesta por crises epilépticas recorrentes, não provocadas. Evidências sugerem que a inflamação desempenha um papel na patofisiologia destas crises. Embora os leucotrienos cisteínicos (CysLTs) tenham sido implicados no desenvolvimento de crises convulsivas, nenhum estudo investigou se o bloqueio dos receptores CysLT1 potencializa a ação anticonvulsivante de antiepilépticos clássicos, assim como se a expressão dos receptores de CysLT é alterada por inflamação. Neste estudo mostramos que o agonista inverso de CysLT1, montelucaste, sinergicamente aumenta a ação anticonvulsivante do fenobarbital contra crises convulsivas induzidas em um modelo de injeção aguda de pentilenotetrazol (PTZ). Além disso, é mostrado que o LTD4 (leucotrieno D4) previne o efeito do montelucaste. A análise isobolográfica revelou que o valor de DE50 mix, calculado experimentalmente para uma combinação de proporção 1: 1 de montelucaste e fenobarbital foi de 0,06 ± 0,02 umol, ao passo que o valor de DE50 add, calculado foi de 0,49 ± 0,03 umol. O índice de interação encontrado foi de 0,12, indicando uma interação sinérgica. A associação dos fármacos diminuiu significativamente o DE50 para o efeito anticonvulsivante do fenobarbital de 0,74 para 0,04 umol (na ausência e na presença de montelucaste, respectivamente) e, consequentemente, a sedação induzida por fenobarbital em doses equieficazes. Posteriormente foi avaliado se o montelucaste e o fenobarbital diminuem as crises convulsivas em animais previamente abrasados, assim como se o tratamento farmacológico ou o abrasamento alteram a expressão de receptores CysLTs. O montelucaste (10 mg/kg; s.c.) e o fenobarbital (20 mg/kg, s.c.) aumentaram a latência para crises convulsivas generalizadas em camundongos abrasados. O montelucaste aumentou a imunorreatividade do receptor CysLT1 em camundongos não abrasados e que foram desafiados por PTZ que não foram abrasados. Entretanto, o desafio de PTZ diminuiu a imunorreatividade do receptor CysLT2 apenas em camundongos abrasados. Antagonistas do receptor CysLT1 parecem emergir como agentes terapêuticos adjuntos promissores no tratamento de crises refratárias. Não obstante, estudos adicionais são necessários para avaliar as implicações clínicas deste trabalho.

Cerca de 30% dos pacientes com epilepsia continuam refratários ao tratamento medicamentoso e continuam a sofrer crises, mesmo utilizando um ou mais fármacos antiepilépticas. Intervenções não farmacológicas representam uma alternativa aos fármacos antiepilépticos, dentre as quais a acupuntura, uma técnica tradicional chinesa, que é freqüentemente utilizada como tratamento complementar na medicina ocidental. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da acupuntura manual sobre as convulsões no modelo de kindling induzido por pentilenotetrazol (PTZ) em camundongos, comparar o efeito da acupuntura com diazepam, avaliar a sua utilização em associação a uma dose baixa de diazepam, e avaliar parâmetros de estresse oxidativo, inflamação, genotoxicidade e mutagenicidade. No modelo de kindling, os animais dos grupos que receberam acupuntura manual, foram tratados diariamente durante 16 dias com estimulação no acuponto VG20, e a cada três dias os animais receberam o salina ou diazepam (0,15 mg / kg; i.p.) 30 min antes da administração de PTZ (60 mg / kg; s.c.). Nos grupos que não receberam acupuntura manual, os animais receberam salina, diazepam (2 mg / kg; i.p. - controle positivo), diazepam (0,15 mg / kg; i.p.), 30 min antes da administração de PTZ (60 mg / kg; s.c.). O comportamento convulsivo (porcentagem de convulsão e latência para a primeira convulsão) foi observado por 30 min. Após o último tratamento, os animais foram eutanasiados e o córtex, hipocampo, sangue periférico e medula óssea foram coletados para avaliação dos parâmetros de estresse oxidativo, inflamação, genotoxicidade e mutagenicidade. Os dados de porcentagem (%) de convulsão e latência para a primeira convulsão (LFS) foram analisados pelo Teste de Fisher e GEE respectivamente. MAC e MAC + DZP 0.15mg/Kg não impediram a ocorrência das convulsões, nem aumentaram a LFS, com exceção do terceiro dia de tratamento, no qual observou-se aumento na LFS no grupo MAC + DZP 0.15mg/Kg, comportamento que não se repetiu ao longo do protocolo. Observou-se nos grupos MAC e MAC + DZP 0.15mg/Kg uma redução na formação de espécies reativas de oxigênio e na liberação de óxido nítrico, bem como aumento na atividade de SOD e CAT, sugerindo que a acupuntura oferece proteção contra estresse oxidativo. Além disso, nos mesmos grupos verificou-se a redução na expressão da citocina pró-inflamatória (TNF-α). No grupo MAC + DZP 0.15mg/Kg observou-se uma tendência à proteção do DNA no hipocampo, uma vez que não houve diferença em comparação ao grupo Sal/Sal, contudo não foi observada mutagenicidade em nenhum dos grupos de tratamento. Para concluir, os resultados indicaram que MAC em associação ao DZP 0.15mg/Kg foi capaz de alterar parâmetros associados a convulsões mediada por PTZ no modelo de kindling em camundongos, bem como a acupuntura teve um efeito protetor contra estresse oxidativo, neuroinflamação e danos ao DNA no mesmo modelo. / Around 30% of patients with epilepsy continue refractory to drug treatment and continue to suffer crises, even using one or more anti-epileptic drugs. Nonpharmacological interventions represent an alternative to antiepileptic drugs, among which acupuncture, a traditional Chinese technique, which is often used as a complementary treatment in Western medicine. The aim of this study was to evaluate the effect of manual acupuncture on seizures in the kindling model induced by pentylenetetrazol (PTZ) in mice, comparing the effect of acupuncture with diazepam, to evaluate their use in combination with a low dose of diazepam, and evaluate parameters of oxidative stress, inflammation, genotoxicity and mutagenicity. In the model of kindling, the animal groups receiving manual acupuncture, were treated daily for 16 days with stimulation of the acupoint VG20, and every three days the animals received saline or diazepam (0.15 mg / kg, ip) 30 min before PTZ administration (60 mg / kg, sc). In the groups not receiving manual acupuncture, the animals received saline, diazepam (2 mg / kg, ip - positive control), diazepam (0.15 mg / kg, ip) 30 min before the PTZ administration (60 mg / kg ; sc). The convulsive behavior (percentage of seizure and latency to the first seizure) was observed for 30 min. After the last treatment, the animals were euthanized and the cortex, hippocampus, peripheral blood and bone marrow were collected for evaluation of parameters of oxidative stress, inflammation, genotoxicity and mutagenicity. Percentage of seizure (%) and latency to the first seizure (LFS) were analyzed by Fisher test and GEE respectively. MAC and MAC + DZP 0.15mg / kg did not prevent the occurrence of seizures or increased LFS, except for the third day of treatment, in which there was an increase in LFS in the MAC + DZP 0.15mg / kg group, behavior that was not repeated throughout the protocol. It was observed in the MAC and MAC + DZP 0.15mg / kg groups a reduction in the formation of reactive oxygen species and release of nitric oxide and increase in SOD and CAT activity, suggesting that acupuncture provides protection against oxidative stress. Furthermore, in the same groups there was a reduction in the expression of pro-inflammatory cytokine (TNF-α). In the MAC + DZP 0.15mg / kg group there was a tendency to protect DNA in hippocampus since there was no difference in comparison to Sal/Sal group, however mutagenicity was not observed in any of the treatment groups. In conclusion, the results indicated that MAC in association with DZP 0.15mg / kg was able to change parameters associated with seizures mediated in PTZ kindling model in mice, also suggested that acupuncture had a protective effect against oxidative stress, neuroinflammation and damage DNA in the same model.

Cerca de 30% dos pacientes com epilepsia continuam refratários ao tratamento medicamentoso e continuam a sofrer crises, mesmo utilizando um ou mais fármacos antiepilépticas. Intervenções não farmacológicas representam uma alternativa aos fármacos antiepilépticos, dentre as quais a acupuntura, uma técnica tradicional chinesa, que é freqüentemente utilizada como tratamento complementar na medicina ocidental. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da acupuntura manual sobre as convulsões no modelo de kindling induzido por pentilenotetrazol (PTZ) em camundongos, comparar o efeito da acupuntura com diazepam, avaliar a sua utilização em associação a uma dose baixa de diazepam, e avaliar parâmetros de estresse oxidativo, inflamação, genotoxicidade e mutagenicidade. No modelo de kindling, os animais dos grupos que receberam acupuntura manual, foram tratados diariamente durante 16 dias com estimulação no acuponto VG20, e a cada três dias os animais receberam o salina ou diazepam (0,15 mg / kg; i.p.) 30 min antes da administração de PTZ (60 mg / kg; s.c.). Nos grupos que não receberam acupuntura manual, os animais receberam salina, diazepam (2 mg / kg; i.p. - controle positivo), diazepam (0,15 mg / kg; i.p.), 30 min antes da administração de PTZ (60 mg / kg; s.c.). O comportamento convulsivo (porcentagem de convulsão e latência para a primeira convulsão) foi observado por 30 min. Após o último tratamento, os animais foram eutanasiados e o córtex, hipocampo, sangue periférico e medula óssea foram coletados para avaliação dos parâmetros de estresse oxidativo, inflamação, genotoxicidade e mutagenicidade. Os dados de porcentagem (%) de convulsão e latência para a primeira convulsão (LFS) foram analisados pelo Teste de Fisher e GEE respectivamente. MAC e MAC + DZP 0.15mg/Kg não impediram a ocorrência das convulsões, nem aumentaram a LFS, com exceção do terceiro dia de tratamento, no qual observou-se aumento na LFS no grupo MAC + DZP 0.15mg/Kg, comportamento que não se repetiu ao longo do protocolo. Observou-se nos grupos MAC e MAC + DZP 0.15mg/Kg uma redução na formação de espécies reativas de oxigênio e na liberação de óxido nítrico, bem como aumento na atividade de SOD e CAT, sugerindo que a acupuntura oferece proteção contra estresse oxidativo. Além disso, nos mesmos grupos verificou-se a redução na expressão da citocina pró-inflamatória (TNF-α). No grupo MAC + DZP 0.15mg/Kg observou-se uma tendência à proteção do DNA no hipocampo, uma vez que não houve diferença em comparação ao grupo Sal/Sal, contudo não foi observada mutagenicidade em nenhum dos grupos de tratamento. Para concluir, os resultados indicaram que MAC em associação ao DZP 0.15mg/Kg foi capaz de alterar parâmetros associados a convulsões mediada por PTZ no modelo de kindling em camundongos, bem como a acupuntura teve um efeito protetor contra estresse oxidativo, neuroinflamação e danos ao DNA no mesmo modelo. / Around 30% of patients with epilepsy continue refractory to drug treatment and continue to suffer crises, even using one or more anti-epileptic drugs. Nonpharmacological interventions represent an alternative to antiepileptic drugs, among which acupuncture, a traditional Chinese technique, which is often used as a complementary treatment in Western medicine. The aim of this study was to evaluate the effect of manual acupuncture on seizures in the kindling model induced by pentylenetetrazol (PTZ) in mice, comparing the effect of acupuncture with diazepam, to evaluate their use in combination with a low dose of diazepam, and evaluate parameters of oxidative stress, inflammation, genotoxicity and mutagenicity. In the model of kindling, the animal groups receiving manual acupuncture, were treated daily for 16 days with stimulation of the acupoint VG20, and every three days the animals received saline or diazepam (0.15 mg / kg, ip) 30 min before PTZ administration (60 mg / kg, sc). In the groups not receiving manual acupuncture, the animals received saline, diazepam (2 mg / kg, ip - positive control), diazepam (0.15 mg / kg, ip) 30 min before the PTZ administration (60 mg / kg ; sc). The convulsive behavior (percentage of seizure and latency to the first seizure) was observed for 30 min. After the last treatment, the animals were euthanized and the cortex, hippocampus, peripheral blood and bone marrow were collected for evaluation of parameters of oxidative stress, inflammation, genotoxicity and mutagenicity. Percentage of seizure (%) and latency to the first seizure (LFS) were analyzed by Fisher test and GEE respectively. MAC and MAC + DZP 0.15mg / kg did not prevent the occurrence of seizures or increased LFS, except for the third day of treatment, in which there was an increase in LFS in the MAC + DZP 0.15mg / kg group, behavior that was not repeated throughout the protocol. It was observed in the MAC and MAC + DZP 0.15mg / kg groups a reduction in the formation of reactive oxygen species and release of nitric oxide and increase in SOD and CAT activity, suggesting that acupuncture provides protection against oxidative stress. Furthermore, in the same groups there was a reduction in the expression of pro-inflammatory cytokine (TNF-α). In the MAC + DZP 0.15mg / kg group there was a tendency to protect DNA in hippocampus since there was no difference in comparison to Sal/Sal group, however mutagenicity was not observed in any of the treatment groups. In conclusion, the results indicated that MAC in association with DZP 0.15mg / kg was able to change parameters associated with seizures mediated in PTZ kindling model in mice, also suggested that acupuncture had a protective effect against oxidative stress, neuroinflammation and damage DNA in the same model.

Orientador: Cláudia Vianna Maurer-Morelli / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T13:52:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbalho_PatriciaGoncalves_M.pdf: 8177547 bytes, checksum: 9a3923a19cb47c5609f933774ee68213 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O Danio rerio é um peixe teleósteo popularmente conhecido como zebrafish que têm se destacado como modelo animal favorável para investigações genéticas devido à facilidade de manipulação in vivo, por sua transparência nas fases embrionária e larval e por seu desenvolvimento externo. Recentemente, foi demonstrado que o zebrafish é capaz de exibir padrão comportamental e alteração da atividade eletrográfica durante crise epiléptica como visto em roedores, tornando-o um modelo promissor para as investigações moleculares das epilepsias. Os estudos sobre os diferentes eventos já conhecidos das epilepsias no zebrafish estão apenas começando e, portanto, há ainda muito que ser investigado para uma melhor caracterização deste modelo para estudos em epilepsia. Estudos clínicos e em modelos animais mostraram que a crise epiléptica eleva os níveis da interleucina-1 beta e induz morte neuronal. Nesse sentido, o presente trabalho se propôs a investigar (i) o perfil temporal de expressão do transcrito do gene da interleucina-1 beta (il1b) no cérebro imaturo e adulto do zebrafish após a indução de crise epiléptica pelo agente químico Pentilenotetrazol por transcriptase reversa-PCR quantitativa e também, sua relação da expressão com a idade em que é realizada a indução da crise no cérebro imaturo e (ii) a morte neuronal pela histoquímica do Fluoro-Jade B (FJB) no cérebro imaturo e adulto do zebrafish após a indução de crise epiléptica pelo agente químico Pentilenotetrazol. Neste trabalho conseguimos estabelecer com sucesso as condições ideais para o acasalamento desta espécie e obtenção de embriões e, para a criação de larvas. Além disso, padronizamos o processamento histológico para a criosecção do cérebro do zebrafish. A análise temporal do transcrito do gene il1b revelou um padrão de expressão similar ao observado em roedores. A marcação por FJB não identificou inequivocadamente a presença de morte neuronal após crise epiléptica / Abstract: Danio rerio is a teleost fish popular named as zebrafish that has emerged as a suitable animal model for genetic investigations due to its features such as: facility for in vivo manipulation, transparency during embryonic and larval stages and external development. Recently, It was demonstrated that larvae and adult zebrafish (Danio rerio) seizure model mimics the behavior, eletrographic and c-fos features that are well established in rodent models of epilepsy, making the zebrafish as a promising model for studying the molecular mechanisms underlying epilepsies. However, the potential of the zebrafish model for epilepsy studies has been partly described since the molecular changes and neuronal loss after seizure has not yet been investigated. Proinflammatory cytokines, such as interleukin-1beta (il1b), has shown to be upregulated in surgical specimens of pharmacoresistent patients and in experimental rodent models of seizure, however the profile of this cytokine in zebrafish model for epilepsy is unknown. For this reason, and in view of the importance of inflammatory response in the pathophysiology of epilepsy, we sought to investigate the temporal transcript profile of interleukin-1b (il1b), a proinflammatory cytokine, in adult and immature (larvae) zebrafish brain after Pentylenetetrazole-evoked seizure, as well its aged-related expression in the developing brain by reverse transcriptase-quantitative PCR and neuronal death by Fluoro-Jade B (FJB) staining in adult zebrafish brain. Zebrafish breeding was successfully established during this work as well as the protocol for histological procedures using the zebrafish brain. Our results showed a short up-regulation of il1b mRNA levels after seizure in immature and adult zebrafish brain similar as with those patterns observed in rodent models. FJB did not show a reliable neuronal death staining in the zebrafish brain after seizure / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestra em Ciências Médicas

Os campos magnéticos estáticos interferem com o sistema nervoso central lesado, modificando a atividade de diferentes estruturas e recuperando o comportamento afetado pela lesão. Esse trabalho tem por objetivo investigar os efeitos dos polos magnéticos em ratos Wistar saudáveis e as repercussões comportamentais no Labirinto em Cruz Elevado (LCE) induzidas por pentilenotetrazol (PTZ) e por Alprazolam (ALP) sob o efeito da estimulação magnética. EXPERIMENTO I - Foram utilizados 107 ratos albinos Wistar, machos, pesando entre 270 - 300g. Após quatro dias da implantação de um magneto (3200 Gauss) no crânio dos animais, esses foram submetidos à avaliação comportamental no LCE. Grupos injetados receberam, via intraperitoneal, 30 mg/kg de PTZ ou salina. Os dados obtidos foram analisados por ANOVA, as significâncias foram evidenciadas pelo pós-teste de Holm Sidak com valor de P significativo<0,05. Observamos diminuição no número de entradas nos braços abertos nos grupos PN, PTZ e SMPTZ em relação ao grupo C, e um aumento nas entradas do grupo PSPTZ sobre os grupos PTZ e SMPTZ (F6, 158= 1,91). Análise etológica revelou um aumento da apresentação do comportamento espreitar nos grupos PTZ, SMPTZ, PNPTZ, PSPTZ (F6, 79= 3,51), diminuição na apresentação dos comportamentos mergulho de cabeça (F6, 79= 2,40) e levantamentos (F6, 79= 17,64) nos grupos PN, PS, PTZ, SMPTZ, PNPTZ e PSPTZ em relação ao C. EXPERIMENTO II - Participaram 79 animais mantidos nas mesmas condições experimentais que no experimento I, injetados com Alprazolam (1mg/kg - intraperitoneal) ou salina. Observamos um aumento no número de entradas nos braços abertos nos grupos ALP e SMALP em relação ao grupo C (F6, 144= 3,53). A porcentagem de entradas nos braços abertos foi maior nos grupos ALP e SMALP em relação ao C (F6, 72= 2,41), e a porcentagem de tempo nos braços abertos foi maior no PNALP, comparado com o C (F6, 72= 3,95). A análise etológica revelou um aumento na frequência dos comportamentos mergulho de cabeça (F6, 72= 10,79) e exploração da extremidade final (F6, 72= 6,00) nos grupos ALP, SMALP e PNALP em relação ao C. Para o comportamento de levantamentos (F6, 72= 4,71) também observamos um aumento da frequência desse comportamento para os grupos ALP, SMALP e PSALP em relação ao C. No experimento I, o polo Sul conseguiu antagonizar o efeito do PTZ, na variável espaço-temporal entradas nos braços abertos, além disso, a estimulação magnética polo Norte, mimetizou o efeito do PTZ. No experimento II, ambos os polos magnéticos antagonizaram o efeito ALP na variável espaço-temporal entradas nos braços abertos. As variáveis etológicas também revelaram um antagonismo da resposta ALP, pelo polo Norte e pelo polo Sul. Dessa maneira, esse trabalho mostra através da análise comportamental no LCE que os campos magnéticos podem interferir de maneira distinta com as modificações no comportamento de ratos injetados com PTZ ou ALP / Static magnetic fields interfere with the injured central nervous system, modifying the activity of different structures and recovering the behavior affected by the lesion. The objective of this study was to investigate the effects of magnetic poles on healthy Wistar rats and the behavioral repercussions of the Penzolenotetrazole (PTZ) and Alprazolam (ALP) induction on the Elevated Plus-Maze (EPM) under the effect of magnetic stimulation. EXPERIMENT I - 107 male Wistar rats weighing between 270 and 300 g were used. After four days of implantation of a magneto (3200 Gauss) in the cranium of the animals, they were submitted to behavioral evaluation in the EPM. Injected groups received intraperitoneally 30 mg / kg of PTZ or saline. The data were analyzed by ANOVA, the significance was evidenced by the Holm Sidak post-hoc with a significant P value <0.05. We observed a decrease in the number of entrance open arms in the PN, PTZ and SMPTZ groups compared to group C, and an increase in the PSPTZ group on PTZ and SMPTZ groups (F6, 158 = 1.91). Ethological analysis showed an increase in the peeking out behavior in the PTZ, SMPTZ, PNPTZ, PSPTZ groups (F6, 79 = 3.51) and a decrease in the performance of the head dipping behavior (F6, 79= 2.40), and of rearing in PS, PTZ, SMPTZ, PNPTZ and PSPTZ in relation to C (F6, 79= 17.64). EXPERIMENT II - Participated 79 animals maintained in the same experimental conditions as in experiment I, injected with Alprazolam (1mg / kg - intraperitoneal) or saline. We observed an increase in the number of entrance into open arms in the ALP and SMALP groups compared to group C (F6, 144 = 3.53). And the percentage of open arms entries was higher in the ALP and SMALP groups than C (F6, 72 = 2.41), and the percentage of open arms time spented was higher in PNALP, compared to C (F6, 72 = 3.95). The ethological analysis revealed an increase in the frequency of head dipping behaviors (F6, 72 = 10.79) and end-arm activity (F6, 72 = 6.00) in the groups ALP, SMALP and PNALP in relation to C. Already for the rearing (F6, 72 = 4.71), we also observed an increase in the frequency of this behavior for the ALP, SMALP and PSALP groups in relation to C. In the experiment I, the South pole was able to antagonize the PTZ effect, as reported for the space-time variable in the open arms, besides the North pole magnetic stimulation, mimics the PTZ effect. In the experiment II, both magnetic poles antagonize the ALP effect in the space-time variable in the open arms. The ethological variables also revealed an antagonism of the ALP response, by the North and South poles. Thus, this work shows through the behavioral analysis in the EPM that the magnetic fields can interfere in a different way with the modifications in the behavior of injected rats with PTZ or ALP