A epilepsia é um distúrbio que afeta 1-2% da população e uma percentagem significativa destes pacientes não respondem aos medicamentos anticonvulsivantes disponíveis no mercado, sugerindo a necessidade de investigar novos tratamentos farmacológicos. Vários estudos demonstram que a inflamação ocorre durante a epileptogênese e pode contribuir para o desenvolvimento e progressão da epilepsia, demonstrando níveis aumentados de interleucinas pró-inflamatórias em modelos animais e em humanos. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do anti-inflamatório não-esteroidal diclofenaco de sódio na severidade das crises convulsivas e os níveis de interleucinas pró-inflamatórias em animais no modelo de kindling induzido por pentilenotetrazol (PTZ). O modelo de kindling foi induzido por injeções de doses subconvulsantes de PTZ (20 mg/kg) em dias alternados durante 15 dias de tratamento. Os animais foram divididos em quatro grupos: grupo controle recebeu solução salina, grupo tratado com diazepam (2 mg/kg) e os grupos tratados com o diclofenaco de sódio (5 e 10 mg/kg). Após o primeiro dia de tratamento, os testes de labirinto em cruz elevada e de campo aberto foram realizados. A gravidade das crises foi avaliada pela escala de Racine. Foram avaliados os níveis de IL- 1 beta, IL-6 e TNF-alfa no sangue, hipocampo e no córtex de animais. O tratamento com diclofenaco de sódio, no modelo de kindling induzido pelo PTZ, diminuiu a severidade das convulsões e os níveis de interleucina-6 e de TNF-alfa no hipocampo de animais tratados com doses de 5 e 10 mg/kg. Novos estudos são necessários para investigar uma nova abordagem terapêutica para o tratamento da epilepsia, com este anti-inflamatório nãoesteroidal. / Epilepsy is a disorder that affects 1-2% of the population and a significant percentage of these patients do not respond to anticonvulsant drugs available in the market suggesting the need to investigate new pharmacological treatments. Several studies have shown that inflammation occurs during epileptogenesis and may contribute to the development and progression of epilepsy, demonstrating increased levels of pro-inflammatory interleukins in animal models and human patients. The objective of this study was to evaluate the effect of non-steroidal anti-inflammatory diclofenac sodium on the severity of seizures and levels of pro-inflammatory interleukins in animals with kindling model induced by PTZ. The kindling model was induced by injections of subconvulsant doses of PTZ (20mg/kg) in alternated days for 15 days of treatment. The animals were divided into four groups: control group given saline, group treated with diazepam (2mg/kg) and groups treated with diclofenac sodium (5 and 10 mg/kg). After treatment the plus-maze and open field tests were conducted. The severity of seizures was evaluated by the Racine scale. We evaluated the levels of IL-1beta, IL-6 and TNF-alpha in the blood, hippocampus and cortex of animals. The treatment with diclofenac sodium, in the PTZ induced kindling model, decreased severity of seizures and interleukin-6 and TNF-alpha levels in the hippocampus of animals treated with doses of 5 and 10 mg/kg. New studies are needed to investigate a new therapeutic approach in the treatment of epilepsy with this anti-inflammatory nonsteroidal.

As epilepsias são um conjunto de distúrbios que incorrem sobre o sistema nervoso central que apresentam como característica crises recorrentes causadas por descargas neuronais anormais, hipersicrônicas e que ocorrem de maneira transitória. Em todo o mundo, aproximadamente 1% da população (65 milhões de pessoas) tem epilepsia, sendo que países menos desenvolvidos apresentam uma maior incidência. Algumas crises epilépticas, como as convulsões, apresentadas por pacientes com epilepsia podem gerar prejuízos cognitivos como uma maior incidência de depressão, déficit de atenção, comprometimento da aprendizagem, entre outros transtornos. As crises epilépticas são também motivo de estigmatização, que em muitos casos, leva ao isolamento social. Por se tratar de um conjunto de transtornos que comprometem o funcionamento cerebral, o tratamento das epilepsias é complexo e variado, com respostas distintas entre os pacientes. O tratamento com fármacos antiepilépticos apresenta bons resultados e se mostra eficiente para a maioria dos pacientes. No entanto, uma parcela dos pacientes não responde ao tratamento com fármacos antiepilépticos, necessitando de outras intervenções para cessar as crises e mesmo, reverter os danos causados por elas. Os tratamentos não farmacológicos mais comumente utilizados envolvem dietas, estimulação neural e remoção cirúrgica da área epileptogênica. O tratamento com exercício físico e com o enriquecimento ambiental em modelos animais de epilepsia em roedores têm se mostrado eficazes na prevenção do surgimento e também na redução do número de crises. Neste contexto, o objetivo da presente tese foi avaliar os efeitos do enriquecimento ambiental sobre o padrão de crise epiléptica e sobre o comportamento do peixe zebra submetido a crises epilépticas induzidas por PTZ, além de identificar fatores que influenciam a resposta do peixe zebra no teste de claro/escuro visando acessar o comportamento tipo ansiedade, tendo em vista que os testes presentes na literatura apresentam discrepâncias quanto a preferência neste modelo. A altura da coluna de água se mostrou determinante na escolha do peixe zebra quando exposto a um compartimento branco e outro preto, com os animais preferindo o compartimento preto apenas na menor coluna de água testada. Frente a um aquário com o fundo inclinado que gera um compartimento mais profundo do que o outro, mais uma vez a altura da coluna da água se mostrou relevante, mas neste caso os animais pareceram enfrentar um paradigma entre permanecer no compartimento mais profundo (quando este era preto ou no aquário transparente) ou permanecer no compartimento preto (quando o lado branco foi configurado para ser mais profundo). A intensidade luminosa utilizada também se mostrou um parâmetro determinante na resposta do peixe zebra no teste de claro/escuro. Com uma iluminação de 70 lux e uma profundidade de 4 cm os animais permaneceram mais tempo no compartimento preto. Utilizando 100 lux de iluminação os animais passam mais tempo explorando o compartimento branco. Quando utilizamos 200 lux de iluminação ou 100 lux no centro de um compartimento e 200 lux no outro lado do aquário, os animais não apresentam preferência por nenhum dos lados. A crise epiléptica induzida por PTZ em peixe zebra se mostrou menos intensa nos animais que forma mantidos a um aquário contendo enriquecimento ambiental do que aquela apresentada por animais mantidos em aquários padrão. O enriquecimento ambiental gera alteração do padrão exploratório do peixe zebra e previne as alterações observadas na locomoção dos animais submetidos ao modelo de crises induzidas por PTZ. As crises induzidas por PTZ tende a alterar a interação social do peixe zebra, enquanto o enriquecimento ambiental previne tal mudança comportamental. As crises induzidas por PTZ, assim como, a exposição por uma semana ao modelo de enriquecimento ambiental, não alteram o comportamento tipo ansioso do peixe zebra quando testado no teste de claro/escuro. Com base nos nossos achados, podemos concluir que o enriquecimento ambiental se configura em uma intervenção com potencial importante na prevenção e no tratamento de crises epilépticas, além de apresentar potencial para recuperar alterações cognitivas geradas pelas crises epilépticas. / Epilepsies are a group of disorders that affects the central nervous system, which have in common recurrent seizures that occur transiently and are caused by abnormal and hypersynchronic neuronal discharges. Throughout the world, about 1% of the population (65 million people) have epilepsy, whereas less developed countries have a higher incidence. Seizures presented by patients with epilepsy can lead to cognitive impairments as a higher incidence of depression, attention deficit, learning impairment, among other disorders. Seizures also generate stigmatization, which in many cases leads to social isolation. Since the cause of epilepsy is multifactorial, the treatment is complex and varied, with different responses between patients. Treatment with antiepileptic drugs gives good results being effective for most patients. However, a number of patients do not respond to treatment with AEDs, requiring further intervention to end the crisis and even reverse the damage caused by them. The non-pharmacological treatments most commonly used involve diets, neural stimulation and surgical removal of the epileptogenic area. Treatment with physical exercise and environmental enrichment have shown to be effective in preventing the onset and in reducing the number of seizures in rodents. In this context, the objective of this thesis was to evaluate the effects of environmental enrichment on the seizure pattern and behavior induced by PTZ in zebrafish . In addition, we aimed to identify factors that influence the zebrafish response in the light/dark test in order to access the anxiety like behavior. The height of the water column has shown critical for zebrafish in choosing between a black and a white compartment. Animals preferred the black side of the aquarium only in the lowest tested water column. Facing a tank with an inclined bottom that generates a deeper side than the other, again the height of the water column has shown significant. In this case the animals appeared to experience a paradigm between remain in the deeper compartment (when it was black or transparent aquarium) or in the black compartment (when the white side was set to be deeper). The light intensity used during the test also proved to be a decisive factor in zebrafish response in the light/dark test. Under an illumination of 70 lux and a depth of 4 cm have remained longer in the black compartment. Using a lighting of 100 lux, animals spend more time exploring the white compartment. When we use 200 lux lighting throughout the entire aquarium or 100 lux in the center of one side and 200 lux in the other side, animals show no preference for neither side. The seizure induced by PTZ in zebrafish was less severe in animals maintained in environmental enrichment than that presented by animals kept in standard aquariums. The environmental enrichment changes the exploratory pattern of zebrafish and prevents the changes observed in the locomotion of animals submitted to the seizure model with PTZ. The PTZ-induced seizure tends to change the social interaction of the zebra fish while the environmental enrichment prevented this behavioral change. The seizure by PTZ as well as exposure for a week on environmental enrichment, do not changed the anxiety-like behavior of zebrafish when tested in the light/dark test. Based on our findings, we conclude that environmental enrichment consists of an intervention with significant potential in the prevention and treatment of seizures, with potential to recover cognitive changes induced by epileptic seizures.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014 / Introdução: Quando um neuronio e ativado de forma intensa, desencadeia-se o aparecimento de genes de expressao imediata, dentre eles o c-fos. Este gene codifica uma proteina nuclear c-Fos, relacionada a diversas cascatas de sinais envolvidos em importantes processos bioquimicos como plasticidade neuronal, crescimento celular e mitose. Objetivos: Neste trabalho investigamos o padrao de expressao e do periodo refratario de c-Fos no cerebro de ratos e macacos apos estimulacao com pentilenotetrazol. Materiais e metodos: Foram utilizados 40 ratos (Wistar) e 40 macacos (Callithrix jacchus) sacrificados em diferentes tempos apos crise convulsiva. Os grupos para o mapeamento do padrao de expressao de c-Fos foram: grupo controle (animais sem crise); grupo PTZ 0,5h; 1, 2, 3, 6, 9 e 12h. Ja os grupos para o mapeamento do periodo refratario de c-Fos foram: PTZ1h/1h, PTZ3h/1h e PTZ6h/1h em ratos e PTZ6h/3h, PTZ 9h/3h e PTZ12h/3h nos macacos onde a primeira hora corresponde ao momento da aplicacao da 2ª dose de PTZ (apos a 1ª crise), e a 2ª hora correspondendo ao momento em que os animais foram sacrificados apos a 2ª crise. Foi feita analise do gene e proteina c-fos por meio do PCR em tempo real e imunohistoquimica no cortex motor, piriforme e cingulado. Resultados: Tantos ratos quanto macacos apresentaram inicio de expressao de c-Fos em 0,5h apos crise. No entanto, o padrao de expressao proteica entre esses animais foram distintos: em ratos, o pico de expressao se deu entre 1h e 2h apos a crise, retornando aos niveis basais apos 6h em todas as regioes. Nos macacos o pico de expressao foi de 1h a 3h apos a crise e retorno aos niveis basais de 9 a 12h. Em relacao ao mapeamento do periodo refratario de c-Fos, observamos: nos ratos um periodo refratario de expressao proteica com duracao de ate 6h, enquanto que os macacos exibem refratariedade em ate 12h apos o primeiro estimulo. Porem, nao houve diferenca de expressao genica de c-fos entre esses grupos, demonstrando um controle pos-transcricional do mecanismo de inducao da refratariedade.Conclusao: A diferenca do padrao de expressao da proteina nos roedores e primatas demonstra um aspecto funcional da bioquimica cerebral diferenciada entre as especies que pode nos ajudar a entender a maior complexidade cognitiva dos primatas em relacao aos roedores em vista da ampla relacao de c-Fos com tarefas cognitivas e de aprendizagem / Introduction: Intense activation of neurons triggers the appearance of immediate genes, including c-fos. This gene encodes a nuclear protein, c-Fos, that isrelated to various signal cascades involved in biochemical processes such as neuronal plasticity, cell growth and mitosis. Objective: Here we investigated the expression pattern and the refractory period of c-Fos in rats ́ and monkeys ́ brains, after stimulation with pentylenetetrazol. Methods: 55 rats (Wistar) and 50 monkeys (Callithrix jacchus) were sacrificed at various times after PTZ - induced seizure. The groups for mapping the c-fos expression pattern were: control group (animals without seizure); PTZ group: 0.5 h, 1, 2, 3, 6, 9 and 12h. The groups for mapping the c-fos refractory period were: PTZ1h/1h, PTZ3h/1h and PTZ6h/1h in rats and PTZ6h/3h, PTZ 9h/3h and PTZ12h/3h in monkeys. The first hour refers to the application time of the 2nd dose of PTZ after the first seizure and the 2nd hour refers to the time when the animals were sacrificed after the 2nd seizure. RNA and protein expression were assessed by real- time PCR and immunohistochemistry in motor, cingulate and piriform cortex. Results: Rats and monkeys already showed c-Fos expression at 0.5 h after seizure. Yet, the pattern of protein expression differed between rats and monkeys: in rats, the expression peaked in 1 to 2h after the seizure, returning to baseline in 6 hours in all regions. In monkeys, the expression peaked in 1 to 3h after the seizure and returned to basal levels only in 9 to 12h. Regarding the refractory period of c-Fos, we observed: in rats, a refractory period of protein expression during up to 6h, while monkeys exhibit refractoriness within 12 hours after the first stimulus. However, there were no differences in c-fos gene expression among these groups, which indicates a post - transcriptional control mechanism underlying the refractory period. Conclusion: The difference in the protein expression pattern in rodents and primates characterizes a functional aspect of brain biochemistry between these orders and my contribute for the more developed primate cognitive complexity as compared to rodents because of the relation of c-Fos with cognitive and learning tasks. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

As epilepsias são um conjunto de distúrbios que incorrem sobre o sistema nervoso central que apresentam como característica crises recorrentes causadas por descargas neuronais anormais, hipersicrônicas e que ocorrem de maneira transitória. Em todo o mundo, aproximadamente 1% da população (65 milhões de pessoas) tem epilepsia, sendo que países menos desenvolvidos apresentam uma maior incidência. Algumas crises epilépticas, como as convulsões, apresentadas por pacientes com epilepsia podem gerar prejuízos cognitivos como uma maior incidência de depressão, déficit de atenção, comprometimento da aprendizagem, entre outros transtornos. As crises epilépticas são também motivo de estigmatização, que em muitos casos, leva ao isolamento social. Por se tratar de um conjunto de transtornos que comprometem o funcionamento cerebral, o tratamento das epilepsias é complexo e variado, com respostas distintas entre os pacientes. O tratamento com fármacos antiepilépticos apresenta bons resultados e se mostra eficiente para a maioria dos pacientes. No entanto, uma parcela dos pacientes não responde ao tratamento com fármacos antiepilépticos, necessitando de outras intervenções para cessar as crises e mesmo, reverter os danos causados por elas. Os tratamentos não farmacológicos mais comumente utilizados envolvem dietas, estimulação neural e remoção cirúrgica da área epileptogênica. O tratamento com exercício físico e com o enriquecimento ambiental em modelos animais de epilepsia em roedores têm se mostrado eficazes na prevenção do surgimento e também na redução do número de crises. Neste contexto, o objetivo da presente tese foi avaliar os efeitos do enriquecimento ambiental sobre o padrão de crise epiléptica e sobre o comportamento do peixe zebra submetido a crises epilépticas induzidas por PTZ, além de identificar fatores que influenciam a resposta do peixe zebra no teste de claro/escuro visando acessar o comportamento tipo ansiedade, tendo em vista que os testes presentes na literatura apresentam discrepâncias quanto a preferência neste modelo. A altura da coluna de água se mostrou determinante na escolha do peixe zebra quando exposto a um compartimento branco e outro preto, com os animais preferindo o compartimento preto apenas na menor coluna de água testada. Frente a um aquário com o fundo inclinado que gera um compartimento mais profundo do que o outro, mais uma vez a altura da coluna da água se mostrou relevante, mas neste caso os animais pareceram enfrentar um paradigma entre permanecer no compartimento mais profundo (quando este era preto ou no aquário transparente) ou permanecer no compartimento preto (quando o lado branco foi configurado para ser mais profundo). A intensidade luminosa utilizada também se mostrou um parâmetro determinante na resposta do peixe zebra no teste de claro/escuro. Com uma iluminação de 70 lux e uma profundidade de 4 cm os animais permaneceram mais tempo no compartimento preto. Utilizando 100 lux de iluminação os animais passam mais tempo explorando o compartimento branco. Quando utilizamos 200 lux de iluminação ou 100 lux no centro de um compartimento e 200 lux no outro lado do aquário, os animais não apresentam preferência por nenhum dos lados. A crise epiléptica induzida por PTZ em peixe zebra se mostrou menos intensa nos animais que forma mantidos a um aquário contendo enriquecimento ambiental do que aquela apresentada por animais mantidos em aquários padrão. O enriquecimento ambiental gera alteração do padrão exploratório do peixe zebra e previne as alterações observadas na locomoção dos animais submetidos ao modelo de crises induzidas por PTZ. As crises induzidas por PTZ tende a alterar a interação social do peixe zebra, enquanto o enriquecimento ambiental previne tal mudança comportamental. As crises induzidas por PTZ, assim como, a exposição por uma semana ao modelo de enriquecimento ambiental, não alteram o comportamento tipo ansioso do peixe zebra quando testado no teste de claro/escuro. Com base nos nossos achados, podemos concluir que o enriquecimento ambiental se configura em uma intervenção com potencial importante na prevenção e no tratamento de crises epilépticas, além de apresentar potencial para recuperar alterações cognitivas geradas pelas crises epilépticas. / Epilepsies are a group of disorders that affects the central nervous system, which have in common recurrent seizures that occur transiently and are caused by abnormal and hypersynchronic neuronal discharges. Throughout the world, about 1% of the population (65 million people) have epilepsy, whereas less developed countries have a higher incidence. Seizures presented by patients with epilepsy can lead to cognitive impairments as a higher incidence of depression, attention deficit, learning impairment, among other disorders. Seizures also generate stigmatization, which in many cases leads to social isolation. Since the cause of epilepsy is multifactorial, the treatment is complex and varied, with different responses between patients. Treatment with antiepileptic drugs gives good results being effective for most patients. However, a number of patients do not respond to treatment with AEDs, requiring further intervention to end the crisis and even reverse the damage caused by them. The non-pharmacological treatments most commonly used involve diets, neural stimulation and surgical removal of the epileptogenic area. Treatment with physical exercise and environmental enrichment have shown to be effective in preventing the onset and in reducing the number of seizures in rodents. In this context, the objective of this thesis was to evaluate the effects of environmental enrichment on the seizure pattern and behavior induced by PTZ in zebrafish . In addition, we aimed to identify factors that influence the zebrafish response in the light/dark test in order to access the anxiety like behavior. The height of the water column has shown critical for zebrafish in choosing between a black and a white compartment. Animals preferred the black side of the aquarium only in the lowest tested water column. Facing a tank with an inclined bottom that generates a deeper side than the other, again the height of the water column has shown significant. In this case the animals appeared to experience a paradigm between remain in the deeper compartment (when it was black or transparent aquarium) or in the black compartment (when the white side was set to be deeper). The light intensity used during the test also proved to be a decisive factor in zebrafish response in the light/dark test. Under an illumination of 70 lux and a depth of 4 cm have remained longer in the black compartment. Using a lighting of 100 lux, animals spend more time exploring the white compartment. When we use 200 lux lighting throughout the entire aquarium or 100 lux in the center of one side and 200 lux in the other side, animals show no preference for neither side. The seizure induced by PTZ in zebrafish was less severe in animals maintained in environmental enrichment than that presented by animals kept in standard aquariums. The environmental enrichment changes the exploratory pattern of zebrafish and prevents the changes observed in the locomotion of animals submitted to the seizure model with PTZ. The PTZ-induced seizure tends to change the social interaction of the zebra fish while the environmental enrichment prevented this behavioral change. The seizure by PTZ as well as exposure for a week on environmental enrichment, do not changed the anxiety-like behavior of zebrafish when tested in the light/dark test. Based on our findings, we conclude that environmental enrichment consists of an intervention with significant potential in the prevention and treatment of seizures, with potential to recover cognitive changes induced by epileptic seizures.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-06T00:18:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 319875.pdf: 1757870 bytes, checksum: c9ef7faaa36479defa0ea1027117f86f (MD5) Previous issue date: 2013 / Quando organismos entram em contato com uma fonte de perigo, uma ameaça ou uma situação desagradável, mecanismos comportamentais e neuroendócrinos de defesa são ativados para proteger e reduzir possíveis danos ao indivíduo. Após um evento estressante, hormônios como a corticosterona são liberados em grandes quantidades, modulando processos de memória e aprendizado relacionados ao evento traumático. Concentrações muito baixas de corticosterona também têm demonstrado interferir nos processos de formação e expressão de memórias aversivas. Para compreender os mecanismos envolvidos na formação e expressão destas memórias, muitos estudos têm utilizado condicionamentos aversivos como modelo experimental. No presente estudo, o pentilenotetrazol (PTZ) foi empregado como um estímulo aversivo relevante (estímulo incondicionado; EI) e apresentado em associação com um odor neutro (estímulo condicionado 1; EC1) para promover o condicionamento olfatório aversivo (COA). Desta forma, o propósito do presente estudo foi verificar o papel do glicocorticoide exógeno, dexametasona, na formação e na expressão da memória aversiva condicionada ao odor (condicionamento de 1ª ordem) promovida pelo PTZ e condicionada ao contexto (condicionamento de 2ª ordem) promovida pelo odor condicionado. Para isto, a dexametasona, um agonista seletivo dos receptores glicocorticoides (GR), foi administrada 60 min antes da aquisição e da expressão do COA e/ou do condicionamento contextual aversivo (CCA). Os resultados obtidos demonstraram que os níveis baixos de corticosterona, induzidos pela supressão do eixo HPA por dexametasona, foram capazes de prejudicar tanto a formação como a expressão da memória aversiva condicionada ao odor. Entretanto, embora a dexametasona tenha prejudicado a formação da memória contextual aversiva, a dexametasona não foi capaz de impedir a expressão da resposta defensiva frente ao contexto condicionado. Ainda, quando o CCA já foi estabelecido e a dexametasona foi administrada antes da expressão da resposta defensiva condicionada ao contexto, não se observou quaisquer prejuízos na expressão da resposta defensiva frente ao contexto. Entretanto, ao se injetar dexametasona 60 min antes da aquisição e da expressão do CCA (condicionamento de 2ª ordem), a expressão da resposta defensiva relacionada ao contexto condicionado (teste EC2) foi prejudicada. Assim, o presente trabalho demonstrou que a dexametasona é capaz de prejudicar a aquisição/formação e a expressão da memória olfatória aversiva promovida pelo PTZ. Entretanto, o prejuízo na expressão da resposta defensiva relacionada ao contexto condicionado (condicionamento de 2ª ordem) foi observado apenas quando a dexametasona foi administrada antes da aquisição e da expressão da memória contextual aversiva, evidenciando diferenças sutis entre o processamento da memória aversiva de 1ª e 2ª ordem neste modelo experimental. <br>

As epilepsias são um conjunto de distúrbios que incorrem sobre o sistema nervoso central que apresentam como característica crises recorrentes causadas por descargas neuronais anormais, hipersicrônicas e que ocorrem de maneira transitória. Em todo o mundo, aproximadamente 1% da população (65 milhões de pessoas) tem epilepsia, sendo que países menos desenvolvidos apresentam uma maior incidência. Algumas crises epilépticas, como as convulsões, apresentadas por pacientes com epilepsia podem gerar prejuízos cognitivos como uma maior incidência de depressão, déficit de atenção, comprometimento da aprendizagem, entre outros transtornos. As crises epilépticas são também motivo de estigmatização, que em muitos casos, leva ao isolamento social. Por se tratar de um conjunto de transtornos que comprometem o funcionamento cerebral, o tratamento das epilepsias é complexo e variado, com respostas distintas entre os pacientes. O tratamento com fármacos antiepilépticos apresenta bons resultados e se mostra eficiente para a maioria dos pacientes. No entanto, uma parcela dos pacientes não responde ao tratamento com fármacos antiepilépticos, necessitando de outras intervenções para cessar as crises e mesmo, reverter os danos causados por elas. Os tratamentos não farmacológicos mais comumente utilizados envolvem dietas, estimulação neural e remoção cirúrgica da área epileptogênica. O tratamento com exercício físico e com o enriquecimento ambiental em modelos animais de epilepsia em roedores têm se mostrado eficazes na prevenção do surgimento e também na redução do número de crises. Neste contexto, o objetivo da presente tese foi avaliar os efeitos do enriquecimento ambiental sobre o padrão de crise epiléptica e sobre o comportamento do peixe zebra submetido a crises epilépticas induzidas por PTZ, além de identificar fatores que influenciam a resposta do peixe zebra no teste de claro/escuro visando acessar o comportamento tipo ansiedade, tendo em vista que os testes presentes na literatura apresentam discrepâncias quanto a preferência neste modelo. A altura da coluna de água se mostrou determinante na escolha do peixe zebra quando exposto a um compartimento branco e outro preto, com os animais preferindo o compartimento preto apenas na menor coluna de água testada. Frente a um aquário com o fundo inclinado que gera um compartimento mais profundo do que o outro, mais uma vez a altura da coluna da água se mostrou relevante, mas neste caso os animais pareceram enfrentar um paradigma entre permanecer no compartimento mais profundo (quando este era preto ou no aquário transparente) ou permanecer no compartimento preto (quando o lado branco foi configurado para ser mais profundo). A intensidade luminosa utilizada também se mostrou um parâmetro determinante na resposta do peixe zebra no teste de claro/escuro. Com uma iluminação de 70 lux e uma profundidade de 4 cm os animais permaneceram mais tempo no compartimento preto. Utilizando 100 lux de iluminação os animais passam mais tempo explorando o compartimento branco. Quando utilizamos 200 lux de iluminação ou 100 lux no centro de um compartimento e 200 lux no outro lado do aquário, os animais não apresentam preferência por nenhum dos lados. A crise epiléptica induzida por PTZ em peixe zebra se mostrou menos intensa nos animais que forma mantidos a um aquário contendo enriquecimento ambiental do que aquela apresentada por animais mantidos em aquários padrão. O enriquecimento ambiental gera alteração do padrão exploratório do peixe zebra e previne as alterações observadas na locomoção dos animais submetidos ao modelo de crises induzidas por PTZ. As crises induzidas por PTZ tende a alterar a interação social do peixe zebra, enquanto o enriquecimento ambiental previne tal mudança comportamental. As crises induzidas por PTZ, assim como, a exposição por uma semana ao modelo de enriquecimento ambiental, não alteram o comportamento tipo ansioso do peixe zebra quando testado no teste de claro/escuro. Com base nos nossos achados, podemos concluir que o enriquecimento ambiental se configura em uma intervenção com potencial importante na prevenção e no tratamento de crises epilépticas, além de apresentar potencial para recuperar alterações cognitivas geradas pelas crises epilépticas. / Epilepsies are a group of disorders that affects the central nervous system, which have in common recurrent seizures that occur transiently and are caused by abnormal and hypersynchronic neuronal discharges. Throughout the world, about 1% of the population (65 million people) have epilepsy, whereas less developed countries have a higher incidence. Seizures presented by patients with epilepsy can lead to cognitive impairments as a higher incidence of depression, attention deficit, learning impairment, among other disorders. Seizures also generate stigmatization, which in many cases leads to social isolation. Since the cause of epilepsy is multifactorial, the treatment is complex and varied, with different responses between patients. Treatment with antiepileptic drugs gives good results being effective for most patients. However, a number of patients do not respond to treatment with AEDs, requiring further intervention to end the crisis and even reverse the damage caused by them. The non-pharmacological treatments most commonly used involve diets, neural stimulation and surgical removal of the epileptogenic area. Treatment with physical exercise and environmental enrichment have shown to be effective in preventing the onset and in reducing the number of seizures in rodents. In this context, the objective of this thesis was to evaluate the effects of environmental enrichment on the seizure pattern and behavior induced by PTZ in zebrafish . In addition, we aimed to identify factors that influence the zebrafish response in the light/dark test in order to access the anxiety like behavior. The height of the water column has shown critical for zebrafish in choosing between a black and a white compartment. Animals preferred the black side of the aquarium only in the lowest tested water column. Facing a tank with an inclined bottom that generates a deeper side than the other, again the height of the water column has shown significant. In this case the animals appeared to experience a paradigm between remain in the deeper compartment (when it was black or transparent aquarium) or in the black compartment (when the white side was set to be deeper). The light intensity used during the test also proved to be a decisive factor in zebrafish response in the light/dark test. Under an illumination of 70 lux and a depth of 4 cm have remained longer in the black compartment. Using a lighting of 100 lux, animals spend more time exploring the white compartment. When we use 200 lux lighting throughout the entire aquarium or 100 lux in the center of one side and 200 lux in the other side, animals show no preference for neither side. The seizure induced by PTZ in zebrafish was less severe in animals maintained in environmental enrichment than that presented by animals kept in standard aquariums. The environmental enrichment changes the exploratory pattern of zebrafish and prevents the changes observed in the locomotion of animals submitted to the seizure model with PTZ. The PTZ-induced seizure tends to change the social interaction of the zebra fish while the environmental enrichment prevented this behavioral change. The seizure by PTZ as well as exposure for a week on environmental enrichment, do not changed the anxiety-like behavior of zebrafish when tested in the light/dark test. Based on our findings, we conclude that environmental enrichment consists of an intervention with significant potential in the prevention and treatment of seizures, with potential to recover cognitive changes induced by epileptic seizures.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctora en Ciencias Farmacéuticas / La epilepsia del lóbulo temporal (ELT) se desarrolla de manera progresiva durante la epileptogénesis, después de la cual se producen crisis epilépticas espontáneas. Para su estudio, se necesitan modelos animales bien caracterizados de este proceso, que permitan aclarar los mecanismos moleculares subyacentes, entre los cuales se encuentra el rol del óxido nítrico (NO), al cual la literatura ha dado roles controversiales. En esta tesis, se utilizó como modelo experimental el kindling farmacológico con pentiléntetrazol (PTZ), que consiste en la administración de 10 dosis subconvulsivantes de PTZ, día por medio. Este modelo fue caracterizado conductual y electroencefalográficamente. Posteriormente, se realizaron experimentos con moduladores de los niveles corticales de NO. Se analizaron conductualmente 3 dosis de PTZ (20, 30 y 40 mg/Kg) durante los días de inyección. El grado de crisis máximo alcanzado mostró que la intensidad de las crisis aumenta conforme aumenta la dosis de PTZ administrada. Además, se observó que a dosis bajas (20 mg/Kg) el aumento de la intensidad de las crisis evoluciona lentamente y no llega a grados 5 y 6 durante los 20 días que dura el kindling, lo que la hizo elegible para la caracterización electroencefalográfica de este modelo. Se analizaron registros de electroencefalograma (EEG), tanto durante los días en que se inyectó PTZ (20 mg/kg) como en los días de no inyección (intermedios a éstas) y, a continuación, 25 días después de la última dosis de PTZ, cuantificando el número, la duración y el perfil espectral de las descargas epilépticas. Los niveles de óxido nítrico fueron modulados localmente en la corteza cerebral. El número de descargas epileptiformes aumentó durante el kindling, así como 25 días después de su finalización, lo que revela la inducción de un proceso epileptogénico auto-sostenible. Las descargas epilépticas se caracterizaron por un aumento en las frecuencias de la banda theta (4-8 Hz), las que se asocian con crisis de tipo ausencia. Sin embargo, durante kindling, cuando la intensidad de las crisis epilépticas aumenta, la potencia espectral de la banda theta disminuyó progresivamente; mientras que, el poder de frecuencias más altas (banda beta bajo) aumentó. El NO en la corteza cerebral inhibió el número y la amplitud de las descargas epilépticas. La caracterización electroencefalográfica de del kindling con PTZ proporciona un valioso modelo para detectar con precisión las consecuencias de las intervenciones terapéuticas en epileptogénesis, especialmente las dirigidas a detener este proceso. La producción local de óxido nítrico en la corteza cerebral podría ser útil para contrarrestar los efectos deletéreos y la propagación de las descargas epilépticas / Temporal lobe epilepsy (TLE) is developed in a progressive manner during epileptogenesis, after which spontaneous seizures occur. To study epileptogenesis, well-characterized animal models of this process are necessary to clarity underlying molecular mechanisms, among which nitric oxide (NO) has a controversial role throughout the literature. In this thesis, a pharmacological kindling model was used by means of administration of 10 subconvulsive doses of pentylenetetrazole (PTZ), every other day. The characterization of this epileptogenesis model was monitored by behavioral and electroencephalographic recordings. Subsequently, NO levels in the cerebral cortex were modulated. PTZ kindling was performed with three doses (20, 30 and 40 mg/Kg) to analyze behaviors during injection days. The maximum degree of seizure recorded each day shows that seizures intensity rises along the days of the protocol. In addition, at low PTZ doses (20 mg/kg), the seizure intensity increased slowly through the protocol, without reaching grades 5 or 6 during the 20 days of the kindling processmaking it a suitable dose for the electroencephalographic characterization of this model. Electroencephalogram recordings (EEG) were analyzed, both during injection and inter-injection days. In addition, EEG recordings were performed 25 days after the last PTZ dose. The number, duration and spectral profile of epileptic discharges. Nitric oxide levels were modulated locally in the cerebral cortex. The number of epileptiform discharges increased during the kindling protocol, and 25 days after its completion, revealing the induction of a self-sustaining epileptogenic process. Epileptic discharges were characterized by an increase in theta band frequency (4-8 Hz) associated with absence-like seizure. However, during the kindling protocol, when the intensity of seizures increases, the spectral power of the theta band decreases progressively, while the power of higher frequencies (low beta band) is increased. NO in cerebral cortex inhibited the number and amplitude of epileptic discharges. The electroencephalographic characterization of this PTZ kindling protocol provides a valuable model to detect precisely consequences of therapeutic interventions on epileptogenesis, especially those targeted towards stopping this process. Local production of nitric oxide in the cerebral cortex could be useful to counteract the deleterious effects and the propagation of epileptic discharges

Ciclooxigenase (COX) é a enzima marca-passo na rota metabólica onde o ácido araquidônico é convertido em prostaglandinas. COX-2 é a isoforma que é induzida em sítios de lesão/inflamação e expressa constituivamente em alguns poucos tecidos, como o sistema nervoso central. Tem sido sugerido que a COX-2 tem um papel importante em várias doenças neurodegenerativas, incluindo epilepsia. Neste estudo nós testamos se o celecoxib, um inibidor seletivo da COX-2 (0,2; 2 ou 20 mg/kg, p.o.) protege contra as convulsões, carbonilação de proteínas e inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidas por pentilenotetrazol (PTZ), um agente convulsivante clássico que tem sido largamente usado para estudo da epilepsia e na busca de novos compostos com atividade anticonvulsivante. A administração de celecoxib (2 mg/kg) atenuou as convulsões comportamentais e eletrográficas e a inibição da atividade da Na+,K+- ATPase induzidas por PTZ no hipocampo e córtex cerebral de ratos, sugerindo um papel facilitatório para COX-2 nos efeitos do PTZ. Já que existem evidências que a PGE2 é um mediador chave na via de sinalização da COX-2, nós decidimos investigar o efeito da administração intracerebroventricular de anticorpos anti-PGE2 (4 μg/2 μl, i.c.v.) sobre os episódios convulsivos e inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidas por PTZ. A administração de anticorpos anti- PGE2 atenuou as convulsões comportamentais e eletrográficas e a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidas por PTZ no hipocampo e córtex cerebral de ratos. Em outro experimento, nós mostramos que a administração intracerebroventricular de PGE2 (100 ng/2 μl, i.c.v.) não causou convulsões per se, mas induziu o aparecimento de convulsões eletrográficas em combinação com uma dose subconvulsivante de PTZ (20 mg/kg, i.p.), reforçando um importante papel para PGE2 nas convulsões induzidas por PTZ. Em conjunto estes dados suportam um papel facilitatório para a via COX-2/PGE2 nas convulsões e inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidas por PTZ. / Cyclooxygenase (COX) is the rate-limiting enzyme in the metabolic pathway where arachidonic acid is converted to prostaglandins. COX-2 is the isoform of cyclooxygenase which is inducible at injury/inflammation sites and expressed constitutively in a few tissues, such as the central nervous system. It has been suggested that COX-2 plays a role in several disorders, including convulsive behavior. In this study we tested whether celecoxib, a selective COX-2 inhibitor (0.2, 2 or 20 mg/kg, p.o.) protects against the convulsions, protein carbonylation and inhibition of Na+,K+- ATPase activity induced by pentylenetetrazol (PTZ; 60 mg/kg, i.p.), a classical convulsant agent that has been fairly used for the study of epilepsy and screening of new compounds with antiepileptic activity. The systemic administration of celecoxib (2 mg/kg) attenuated PTZ-induced behavioral and electroencephalographic seizures and Na+,K+-ATPase activity inhibition in the hippocampus and cerebral cortex of rats, suggesting a facilitatory role for COX-2 on the PTZ-induced effects. Since there is a bulk of evidence showing that PGE2 is a key mediator in COX-2 signaling, we decided to investigate the effect of the intracerebroventricular administration of anti-PGE2 antibodies (4 μg/2 μl, i.c.v.) on the convulsive episodes and inhibition of Na+,K+- ATPase activity induced by PTZ. Administration of anti-PGE2 antibodies attenuated PTZ-induced behavioral and electroencephalographic seizures and Na+,K+-ATPase activity inhibition in the hippocampus and cerebral cortex of rats. In a reverse approach, we showed that intracerebroventricular administration of PGE2 (100 ng/2 μl, i.c.v.) did not cause electrographic alterations per se, but elicits electroencephalographic convulsions if given in combination with a subconvulsant dose of PTZ (20 mg/kg, i.p.), further suggesting an important role for this prostaglandin in the convulsant effects of PTZ. Collectively, these data support a facilitatory role for the COX-2/PGE2 pathway in PTZ-induced convulsions and Na+,K+-ATPase activity inhibition.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Indivíduos com epilepsia do lobo temporal (ELT) apresentam heterogeneidade na resposta à farmacoterapia que resulta, em parte, de diferenças fisiológicas que podem ser decorrentes de fatores pré-existentes tais como fatores genéticos. Em muitos pacientes com ELT, o prognóstico para o controle das convulsões é satisfatório, no entanto, uma significativa proporção de indivíduos não tem bom prognóstico ou sofrem de epilepsia fármaco-resistente. Outra questão importante a respeito dos indivíduos com epilepsia reside no fato de serem mais susceptíveis em desenvolver determinadas comorbidades, tais como síndromes psiquiátricas, ansiedade e depressão. A soma desses fatores demonstra uma grande heterogeneidade entre os indivíduos que sofrem dessa condição médica. Essa diferente predisposição basal pode tornar os indivíduos mais susceptíveis à epilepsia, à fármaco-resistência e até mesmo às doenças psiquiátricas associadas. Assim sendo, baseados na separação a priori de animais submetidos ao teste do labirinto em cruz elevado, neste trabalho avaliamos a susceptibilidade a precipitação das crises em doses sublimiares e convulsivas testadas em dois modelos experimentais: pilocarpina (Pilo) e pentilenotetrazol (PTZ). No modelo da Pilo, não verificamos diferenças na susceptibilidade ao status epilepticus (SE), nem maior mortalidade e nem maior frequência de crises espontâneas e recorrentes (CER) nos animais caracterizados como ansiosos quando comparados aos não ansiosos. Por outro lado, observamos que no mesmo modelo, utilizando-se doses sublimiares de Pilo, os animais ansiosos apresentaram uma maior probabilidade em desenvolver SE quando comparados aos animais não ansiosos. Os animais que apresentaram uma maior frequência de CER também apresentaram uma maior expressão de neuropeptídeo Y (NPY) em regiões associadas ao desenvolvimento de crises epilépticas. Os animais injetados com Pilo, mas que não desenvolveram SE (NSE), apresentaram alterações comportamentais e neuroanatômicas quando comparados às condições basais. Sendo assim, o uso desses animais pode ser uma excelente ferramenta para o estudo de alterações neuroanatômicas e funcionais que estão presentes na epileptogênese. Já no modelo de PTZ, não detectamos diferenças entre os animais ansiosos e os não ansiosos. Portanto, esse estudo permite estabelecer uma associação entre ansiedade e susceptibilidade à epilepsia do lobo temporal. No entanto, esta associação parece ser específica para determinado modelo experimental. / Subjects with temporal lobe epilepsy (TLE) present an heterogeneous response to pharmacotherapy. This heterogeneity results from physiological differences that might be caused by preexisting factors such as genetic ones. In many patients with TLE, the prognostic for controling the seizures is satisfactory. A significant proportion of individuals however do not have a good prognostic or suffers from a pharmaco-resistant epilepsy. Another important issue about the individuals with epilepsy is that they´re more susceptible to present some comorbities, such as psychiatric syndromes, anxiety and depression. The sum of these factors demonstrates a great heterogeneity between the individuals that suffer from this medical condition. This different baseline predisposition might turn the individuals more susceptible to epilepsy, pharmaco-resistance and even to associated psychiatric diseases. Therefore, using an initial screening in which animals were submitted to the elevated plus-maze, in the present work we subsequently evaluated the susceptibility to the precipitation of seizures with subthreshold and convulsive doses tested in two different experimental models: pilocarpine (Pilo) and pentilenotetrazole (PTZ). In the Pilo model, in that induction of status epilepticus (SE) leads to epilepsy, we weren´t able to identify differences in the susceptibility to SE, mortality rate or frequency of spontaneous recurrent seizures (SRS) in those animals characterized as anxious when compared to the non-anxious animals. In the other hand, we could observe that in the same model, when tested with subthreshold doses, anxious animals presented a greater likelihood to develop SE when compared to the non-anxious ones. Those animals that presented a greater frequency of SRS also showed a greater neuropeptide Y (NPY) expression in a number of brain regions associated to seizures. Those animals that were injected with Pilo, but didn’t present SE (NSE), had neurobehavioral and neuroanatomical alterations when compared to baseline conditions. We thus propose the use of these NSE animals might be an excellent tool for studying the neuroanatomical and functional alterations seen in epileptogenesis. For the PTZ model, we couldn´t identify differences betwen the anxious and non-anxious animals. Thus, this study allowed us to establish an association between anxiety and temporal lobe epilepsy that seems specific to the experimental model. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

O pentilenotetrazol (PTZ) é um agente convulsivo amplamente utilizado em modelos animais para investigações envolvendo crises convulsivas. Embora haja um crescente número de estudos envolvendo zebrafish adulto e convulsão, não há até o momento uma caracterização comportamental detalhada do modelo de indução de crises por PTZ neste animal. Portanto, o objetivo deste estudo foi realizar uma caracterização detalhada das manifestações comportamentais no modelo de convulsão induzida por PTZ em zebrafish adulto. Grupos de 12 animais foram submetidos, por imersão, a distintas diferentes concentrações de PTZ (5, 7.5, 10 e 15 mM). O comportamento convulsivo foi observado durante 20 minutos. Os animais apresentaram os seguintes escores comportamentais: (0) nados curtos; (1) aumento na atividade natatória e na abertura opercular; (2) movimentos erráticos e acelerados; (3) movimentos circulares; (4) convulsão clônica; (5) convulsão tônica; (6) morte. Os animais expostos a diferentes distintas concentrações de PTZ apresentaram diferentes distintos perfis convulsivos, intensidades de convulsão e latência para chegar aos escores. Apenas os animais imersos na concentração de 15 mM apresentaram maior tempo para retornar ao comportamento normal após a exposição ao PTZ. A mortalidade foi de 33% e 50% para as concentrações de 10 mM e 15 mM, respectivamente. No intuito de avaliar abordagem perfil comportamental frente ao pré-tratamento de um fármaco anticonvulsivo, 12 animais foram expostos a diazepam (DZP) por 40 min e após expostos ao PTZ (10 mM). O tratamento com DZP atenuou a severidade da convulsão, mas não o tempo necessário para retornar ao comportamento normal. Levando em consideração que este modelo baseia-se na imersão direta do animal a uma solução de PTZ, avaliamos também as concentrações cerebrais deste agente convulsivo. Além disso, investigamos também uma possível correlação entre a concentração cerebral de PTZ, o tempo e a concentração de exposição. Os resultados decorrentes da exposição dos animais a 5 e 10 mM de PTZ, apontam para uma correlação tempo e concentração dependentes. Os resultados deste trabalho demonstram uma caracterização comportamental detalhada ao longo do tempo de exposição ao PTZ, além de avaliar pela primeira vez a intensidade de convulsão, tempo de retorno ao comportamento normal e mortalidade dos animais. Além disso, pela primeira vez foram determinadas as concentrações cerebrais deste composto neste modelo de convulsão em zebrafish adulto. Por fim, espera-se que tais ferramentas comportamentais e de quantificação cerebral deste composto possam ser úteis em futuras investigações translacionais e estudos que tenham como objetivo melhor compreender esta desordem. / Pentylenetetrazole (PTZ) is a common convulsant agent used in animal models to investigate the mechanisms of seizures. Although adult zebrafish have been recently used to study epileptic seizures, a thorough characterization of the PTZ-induced seizures in this animal model is missing. The goal of this study was to perform a detailed temporal behavior profile characterization of PTZ-induced seizure in adult zebrafish. The behavioral profile during 20 min of PTZ immersion (5, 7.5, 10, and 15 mM) was characterized by stages defined as scores: (0) short swim, (1) increased swimming activity and high frequency of opercular movement, (2) erratic movements, (3) circular movements, (4) clonic seizure-like behavior, (5) fall to the bottom of the tank and tonic seizure-like behavior, (6) death. Animals exposed to distinct PTZ concentrations presented different seizure profiles, intensities and latencies to reach all scores. Only animals immersed into 15 mM PTZ showed an increased time to return to the normal behavior (score 0), after exposure. Total mortality rate at 10 and 15 mM were 33% and 50%, respectively. Considering all behavioral parameters, 5, 7.5, 10, and 15 mM PTZ, induced seizures with low, intermediate, and high severity, respectively. Pretreatment with diazepam (DZP) significantly attenuated seizure severity. Finally, the brain PTZ levels in adult zebrafish immersed into the chemoconvulsant solution at 5 and 10 mM were comparable to those described for the rodent model, with a peak after a 20-min of exposure. The PTZ brain levels observed after 2.5-min PTZ exposure and after 60-min removal from exposure were similar. Altogether, our results showed a detailed temporal behavioral characterization of a PTZ epileptic seizure model in adult zebrafish. These behavioral analyses and the simple method for PTZ quantification could be considered as important tools for future investigations and translational researches.