L’organisation mondiale de la santé estime que le choléra entraîne 100, 000 décès par an pour environ 4 millions de cas recensés, plaçant ainsi cette maladie comme un enjeu de santé publique majeur. Cette infection est causée par Vibrio cholerae, une bactérie à Gram négatif vivant en milieu aquatique. Face à cette agression, l’épithélium intestinal et les bactéries du microbiote agissent comme une barrière, en exprimant notamment des peptides antimicrobiens (PAM). V. cholerae, comme de nombreux pathogènes, montre une résistance accrue aux PAM. Malgré une avancée constante sur la compréhension des mécanismes de résistances bactériens aux PAM, de nombreuses inconnues demeurent, principalement en raison des techniques de mutagénèse aléatoire utilisées pour leur identification. L’objectif de cette étude est d’identifier de nouveaux mécanismes de résistance impliqués dans la résistance de V. cholerae aux PAM. Grâce à des expériences de séquençage par spectrométrie masse suivi d’études bio-informatiques, nous avons identifié les protéines OmpV et Lap comme des candidates intéressantes pour être impliquées dans la résistance de V. cholerae. Alors que la souche V. cholerae A1552 délétée du gène ompV (DompV) ne semble pas présenter de défaut de croissance ou de perméabilité, nos résultats ont montré une diminution des concentrations minimales inhibitrices en différents PAM tels que LL-37. Les tests fonctionnels semblent suggérer l’implication des vésicules de sécrétion dans le mécanisme de d’OmpV face à LL-37 chez V. cholerae. / According to the World Health Organization, cholera remains a significant health problem, causing 100,000 death per 4 millions infections per year. V. cholerae, the etiologic agent of cholera and a Gram-negative bacterium, is generally transmitted via contaminated food or water. During infection, the microbiota and intestinal epithelium acts as a barrier by producing antimicrobial peptides (AMP). Resistance to AMP has emerged as a virulence factor in pathogens and specifically in V. cholerae. As AMP are considered as novel molecular therapeutic agents, it is truly important to better understand strategies of resistance of V. cholerae. The aim of this study is to identify unknown mechanisms involved in V. cholerae resistance to AMP. For this purpose, after protein sequencing by mass spectrometry (MS-MS) and bioinformatics, we identified the OmpV porin, member of the outer membrane protein family and the Lap protease as new protein candidates for strategies of resistance. We characterized the V. cholerae A1552 strain deleted for ompV (DompV). We confirmed OmpV implication in AMP resistance by minimum inhibitory concentration and did not observed any differences in growth or permeability in the presence of AMP between the wild-type (wt) and the (DompV) strains. The work presented here suggest an implication of outer membrane vesicules in V. cholerae resistance mechanisms to some AMP as LL-37.

Vibrio cholerae, l’agent étiologique du choléra, est une bactérie adaptée à l’environnement aquatique et, dans le cadre infectieux, à la colonisation du petit intestin humain. L’environnement intestinal est un milieu a priori hostile aux bactéries externes, à cause de son environnement anaérobie et de la présence des effecteurs du système immunitaire. Capable de produire un biofilm dans ces deux niches écologiques, V. cholerae est capable de persister dans des conditions défavorables et de résister aux molécules antimicrobiennes, y compris les peptides antimicrobiens (PAM). J’ai d’abord étudié la résistance aux antimicrobiens de V. cholerae dans des conditions expérimentales représentatives de l’intestin. Ensuite, j’ai caractérisé, quantitativement et qualitativement, la résistance à la polymyxine B (PmB) des biofilms de V. cholerae, exposés à des concentrations sous-inhibitrices ou létales de ce PAM. Nos résultats suggèrent que la résistance aux PAM de V. cholerae est influencée par la disponibilité de l’oxygène dans le milieu. Je propose également que des concentrations létales de PmB peuvent stimuler un mécanisme de résistance exclusif aux biofilms matures. Les différences soulevées par nos investigations mettent en perspective l’importance d’adapter les conditions expérimentales aux caractéristiques réelles de l’environnement infectieux lors des études de résistances aux antimicrobiens. / Vibrio cholerae, the etiological agent of cholera, is a bacterium that is adapted to the aquatic environment and, in the infectious setting, to the colonization of the small intestine. The intestinal environment is at first glance hostile to external bacteria, due to its anaerobic conditions and the presence of the effectors of the immune system. Capable of producing a biofilm in its two ecological niches, V. cholerae is quite capable of persisting in unfavorable conditions and of resisting antimicrobial molecules, including antimicrobial peptides (AMPs). I first investigated the antimicrobial resistance of V. cholerae under experimental conditions representative of the intestine. Then, I characterized, quantitatively and qualitatively, the antimicrobial resistance of V. cholerae biofilms to Polymyxin B (PmB), at sub-inhibitory or lethal concentrations of this AMP. Our results suggest that resistance to PmB in V. cholerae is influenced by oxygen availability in the medium. I also propose that lethal concentrations of PmB may promote a resistance mechanism exclusive to mature biofilms. The differences raised by our investigations put into perspective the importance of adapting laboratory conditions to the actual features of the infectious environment when investigating antimicrobial resistance.

Les chromogranines (Cgs) sont une famille de protéines acides exprimées dans les granules des cellules neuroendocrines et immunitaires. Plusieurs peptides dérivés des Cgs présentent des activités antimicrobiennes. L’objectif de ma thèse est d’évaluer l’interaction hôte-pathogène et ensuite de développer un polymère antimicrobien avec insertion du peptide antimicrobien cateslytin (CTL).Dans une première partie, nous avons évalué l’aptitude de la leukotoxine LukE/D à induire la sécrétion des neutrophiles et rôle des protéases bactériennes à dégrader les peptides dérivés de la CgA. Les neutrophiles activés sécrètent de nombreux composés que nous avons identifiés. De plus, la dégradation des PAMs dérivés de la CgA par les protéases de S.aureus a été déterminée. Sur tous les PAMs testés, CTL est le seul qui tue S.aureus et résister à dégradation. Par ailleurs, CgA et CgB sont dégradés par la protéase Glu-C pour produire de nouveaux fragments sans activité antibactérienne, mais d’activité antifongique.Dans une deuxième partie, nous avons décidé de préparer un revêtement conjugué à CTL. CTL-C est utilisé pour préparer des films avec le dépôt alterné de CHI et HA-CTL-C. Par la suite nous avons synthétisé HAFITC-CTL-C and HAFITC pour analyser leur interaction. HAFITC-CTL-C est rapidement détectable dans le cytoplasme sans provoquer la lyse cellulaire. De plus, les films contenant CTL-C ne sont pas toxiques pour les fibroblastes gingivaux humains.En conclusion, CTL est le seul peptide antimicrobien dérivé de la CgA qui peut tuer S.aureus et résiste à la dégradation protéolytique, ce qui est de bon augure pour de nouvelles études visant à développer des biomatériaux antimcrobiens. / Chromogranins (Cgs) are a family of acidic proteins, expressed in secretory granules of neuro-endocrine and immune cells. Several Cgs derived peptides express antimicrobial activity. Current study was aimed to evaluate host-pathogen interaction and ultimately to develop antimicrobial polymer with insertion of cateslytine (CTL).In first part, stimulatory ability of leukotoxin LukE/D to induce neutrophils secretions and role of bacterial proteases to degrade CgA-derived AMPs was evaluated. Activated neutrophils secrete various components which were identified. Later by using antimicrobial assays, several fractions were found active and later discussed with respect to proteomic analysis. Additionally, degradation of CgA derived AMPs by S. aureus proteases was demonstrated. Out of various AMPs tested, CTL was only that can kill S. aureus and resist protease degradation. Furthermore, CgA and CgB are processed by Glu-C protease to produce new fragments lacking antibacterial activity but presenting antifungal activity.Secondly, we aimed to prepare CTL conjugated biomaterial coating. CTL-C was used to prepare PEM films with alternative deposition of CHI and HA-CTL-C and evaluated for antimicrobial activities. Later on, we synthesized HAFITC-CTL-C and HAFITC to analyze their interaction. HAFITC-CTL-C was readily detectable in cytoplasm without provoking cell lysis. Moreover CTL-C inserted PEM films are non-toxic to human gingival fibroblast cells.In conclusion, CTL is the only CgA-derived AMP that can kill S. aureus and resistant to proteolytic degradation, which is a promising feature for further studies in order to develop antimicrobial biomaterials.

Nous avons étudié le rôle de l'immunité innée de la peau lors de la transmission des Borrelia (agent infectieux de la borréliose de Lyme) par son vecteur, une tique dure du genre Ixodes. Nous avons montré que la salive de tique et la protéine salivaire Salp15 inhibent la réaction inflammatoire (production de chimiokines et de peptides antimicrobiens) des kératinocytes induite par Borrelia. Cet effet anti- " alarmine " de la salive de tique contribue probablement à créer un environnement cutané local favorable à la transmission de Borrelia. Nous avons montré que Borrelia induit également au niveau des fibroblastes cutanés la transcription de nombreux gènes proinflammatoires. Nous avons observé un effet toxique direct de la salive de tique sur les fibroblastes cutanés : cet effet dose-dépendant est de nature protéique mais non lié à la protéine Salp15. Ces résultats indiquent que les fibroblastes jouent un rôle important dans l'inflammation cutanée induite par Borrelia.

Les chromogranines (Cgs) sont une famille de protéines acides exprimées dans les granules des cellules neuroendocrines et immunitaires. Plusieurs peptides dérivés des Cgs présentent des activités antimicrobiennes. L'objectif de ma thèse est d'évaluer l'interaction hôte-pathogène et ensuite de développer un polymère antimicrobien avec insertion du peptide antimicrobien cateslytin (CTL).Dans une première partie, nous avons évalué l'aptitude de la leukotoxine LukE/D à induire la sécrétion des neutrophiles et rôle des protéases bactériennes à dégrader les peptides dérivés de la CgA. Les neutrophiles activés sécrètent de nombreux composés que nous avons identifiés. De plus, la dégradation des PAMs dérivés de la CgA par les protéases de S.aureus a été déterminée. Sur tous les PAMs testés, CTL est le seul qui tue S.aureus et résister à dégradation. Par ailleurs, CgA et CgB sont dégradés par la protéase Glu-C pour produire de nouveaux fragments sans activité antibactérienne, mais d'activité antifongique.Dans une deuxième partie, nous avons décidé de préparer un revêtement conjugué à CTL. CTL-C est utilisé pour préparer des films avec le dépôt alterné de CHI et HA-CTL-C. Par la suite nous avons synthétisé HAFITC-CTL-C and HAFITC pour analyser leur interaction. HAFITC-CTL-C est rapidement détectable dans le cytoplasme sans provoquer la lyse cellulaire. De plus, les films contenant CTL-C ne sont pas toxiques pour les fibroblastes gingivaux humains.En conclusion, CTL est le seul peptide antimicrobien dérivé de la CgA qui peut tuer S.aureus et résiste à la dégradation protéolytique, ce qui est de bon augure pour de nouvelles études visant à développer des biomatériaux antimcrobiens.

Nous avons étudié le rôle de l'immunité innée de la peau lors de la transmission des Borrelia (agent infectieux de la borréliose de Lyme) par son vecteur, une tique dure du genre Ixodes. Nous avons montré que la salive de tique et la protéine salivaire Salp15 inhibent la réaction inflammatoire (production de chimiokines et de peptides antimicrobiens) des kératinocytes induite par Borrelia. Cet effet anti- « alarmine » de la salive de tique contribue probablement à créer un environnement cutané local favorable à la transmission de Borrelia. Nous avons montré que Borrelia induit également au niveau des fibroblastes cutanés la transcription de nombreux gènes proinflammatoires. Nous avons observé un effet toxique direct de la salive de tique sur les fibroblastes cutanés : cet effet dose-dépendant est de nature protéique mais non lié à la protéine Salp15. Ces résultats indiquent que les fibroblastes jouent un rôle important dans l’inflammation cutanée induite par Borrelia. / We studied the role of the skin innate immunity during the transmission of Borrelia (the infectious agent of Lyme borreliosis) by its vector, a hard tick belonging to the genus Ixodes. We showed that tick saliva and its protein Salp15 both inhibate Borrelia-induced inflammatory reaction of keratinocytes. The antialarmin effect of tick saliva ensure a favorable environment for Borrelia. We also showed that Borrelia induce a strong inflammatory response in dermal fibroblasts. We also demonstrate a dose-dependent lytic effect of tick salivary gland extracts on dermal fibroblasts and that this cytotoxic effect was of proteinaceous nature and not related to Salp15. These results indicate that dermal fibroblasts could be considered as central mediators in immune cell recruitment to the skin site of Borrelia invasion.

Les protéines membranaires en hélices alpha forment le tiers des protéines codées par notre génome. D’autres protéines membranaires sont formées typiquement de feuillets bêta. Leur fonction varie de la formation de pores, la transmission de signaux à l’activité antibiotique. Elles sont aussi capables de transporter de larges cargos comme les protéines ou les acides nucléiques au travers de la membrane. Récemment, les peptides ont émergé comme un moyen prometteur pour le transport de médicaments vers leurs cibles.Les protéines membranaires peuvent être synthétisées chimiquement ou exprimées et marquées isotopiquement dans les bactéries, isolées, purifiées et reconstituées dans les bicouches lipidiques hydratées. Elles présentent une variété de configurations en interagissant avec ces bicouches lipidiques. Ceci dépend de la composition et de l’épaisseur de ces bicouches. L’orientation des bicouches lipidiques est maintenue mécaniquement en les disposant entre des plaques de verre. La RMN du solide des échantillons orientés est un des moyens possibles pour accéder à la topologie des peptides associés à des membranes phospholipidiques. Les échantillons sont difficiles à exprimer dans les bactéries en grande quantités et possède une solubilité réduite en dehors des membranes. En outre leur taille est trop importante pour la RMN du liquide et il est difficile de les cristalliser. Un des inconvénients majeur de la spectroscopie RMN est sa faible sensibilité. Cela résulte du faible moment magnétique nucléaire qui résulte en un décalage Zeeman faible et donc une polarisation réduite. Par ailleurs, l’intensité du signal RMN dépend de plusieurs facteurs comme la quantité d’échantillon la polarisation et le champ magnétique B0. Et le temps d’acquisition de certaines expériences peut être très long. Le but de ce projet est d’obtenir plus de signal des protéines membranaires. Dès lors, nous avons développé une cryosonde DNP (dynamic nuclear polarization) / RMN du solide. La DNP est une technique ingénieuse qui est utilisée pour le transfert de polarisation des noyaux hautement polarisés à des noyaux moins polarisés par irradiation microonde. Les microondes vont exister sélectivement les électrons qui transfèreront leur polarisation à l’ensemble des protons voisins, le signal proton peut ainsi être augmenté de 660 fois.Pour cela la cryosonde DNP RMN du solide qui opère à 100 K et 9,4 T a été utilisée. Une sonde est la pièce mécanique qui maintient l’échantillon dans le centre magnétique de l’aimant du spectromètre. C’est une antenne modulable qui irradie et détecte des champs radiofréquence. La pièce centrale de la sonde est une bobine solénoïdale ou une bobine en forme de selle enveloppant l’échantillon. La faisabilité de ces expériences DNP a été validée sur les échantillons orientés en rotation à l’angle magique. Ces expériences ont été menées sur des échantillons enroulés dans un rotor. Même si leur orientation par rapport au champ magnétique B0 est perdue, une valeur d’augmentation de 17 a été obtenue.[...] / Helical membrane proteins comprise one third of the expressed proteins encoded in a typical genome. Other membrane proteins are typically beta sheets. Their function varies from pore formation, signaling to antimicrobial activity. They are also capable of transporting large cargo such as proteins or nucleic acids across the cell membrane. Recently, peptides have emerged as promising tools in drug delivery. Membrane proteins can be synthesized chemically or expressed and isotopically labeled in bacteria, isolated, purified and reconstituted into fully hydrated lipid bilayers. The bilayer orientation is kept mechanically by putting them between glass plates. While interacting with these bilayers they exhibit a variety of configurations depending on the lipids composition and thickness. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (NMR) on oriented bilayers is one way to access the topology of peptides associated with phospholipid membranes. Oriented membrane protein are difficult to study with analytical techniques because of their poor solubility outside the lipid membrane, difficulty of expression in bacteria in big quantities, difficulty to crystallize, and they are too large for solution NMR study. The intensity of an NMR signal depends on several factors such as polarization P and magnetic field magnitude B0. One of the major drawbacks of NMR spectroscopy is low sensitivity. This is caused by the small magnetic moment of the nuclear spins which results in a modest Zeeman splitting of the nuclear spin energy levels and therefore in a limited Boltzmann Polarization. The aim of this project is to obtain a better signal from membrane proteins. Thus a Low temperature (LT) solid state NMR with Dynamic Nuclear Polarization (DNP) probe head was created. DNP is an ingenious technique that is used to transfer polarization from highly polarized targets to less polarized nuclei using microwave irradiation. Microwaves will excite selectively the electron spins which will transfer their polarization to the pool of proton nuclei, the proton NMR signal can be enhanced by 660 times. A probe head for DNP enhanced solid state NMR at 100 K and 9.4 T is described. A probe head includes the mechanical piece that holds the sample in the magnetic center of the NMR magnet. It is a tunable antenna that irradiates and detects the rf fields used in NMR. The centerpiece of the probe is the solenoidal or saddle coil surrounding the sample. The feasibility of such a DNP experiment is proven on magic angle oriented sample spinning. These experiments are conducted on oriented samples wrapped into a rotor. Through their orientation with regards to B0 is lost, enhancement values as high as 17 are obtained. [...]

L'enveloppe cellulaire des bactéries à Gram négatif constitue la première ligne de défense contre les antibiotiques. Sous l’effet, d’une part, de la faible perméabilité de la membrane externe qui s'oppose à la pénétration des agents antibactériens, d’autre part des pompes d'efflux qui favorisent leur expulsion, elle empêche nombre de composés potentiellement actifs in vitro d'atteindre leur cible, limitant l’effet antibactérien. Un enjeu important pour restaurer l’activité de ces molécules est de trouver une stratégie pour en augmenter la concentration intracellulaire. L'objectif de cette thèse est de développer des métallodrogues comme nouvelle stratégie de vectorisation de drogues dans les cellules. Cette stratégie repose sur l’association d'une drogue active in vitro, et d’un ligand auxiliaire ayant des propriétés perméabilisantes ou inhibitrices de pompe d’efflux, dans un complexe qui jouera le rôle de chaperone. Les agents antibactériens utilisés sont des inhibiteurs (dérivés d’acides hydroxamiques) de peptide déformylase (PDF) et de méthionine aminopeptidase (MetAP) développés au laboratoire. Tout d’abord, une étude globale de la stratégie de vectorisation a été réalisée (i) étude de stabilité de métallodrogues modèles : en utilisant un acide hydroxamique fluorescent, nous avons montré que, seules, des métallodrogues à Co(III), à la différence de celles à Cu(II) et Fe(III), satisfaisaient aux conditions de stabilité compatibles avec les conditions de tests biologiques. (ii) Etude de la libération de la drogue : nous avons établi par une étude RMN 1H et UV-vis qu’en milieu tampon pH = 7,4, la libération de la drogue se faisait par échange de ligand avec un thiol exogène. Récemment, une nouvelle série d’inhibiteurs de PDF a été synthétisée au laboratoire. Elle est basée sur un squelette hétérocyclique à 5 chaînons fonctionnalisé par une chaîne en C4, puis via un espaceur monocarboné, à un acide hydroxamique. Les meilleurs résultats ont été obtenus avec un oxadiazole (AT002 16 µg/ml sur E. coli en présence de perméabilisant PMBN). Au cours de cette thèse, pour améliorer la lipophilie, des groupements aromatiques ont été fixés sur cet hétérocycle. Les MICs sur la souche d’E. coli sauvage n’ont pas été améliorées mais en présence de PMBN, le dérivé présentant la meilleure activité est le composé AT015 (2 µg/ml sur E. coli en présence de PMBN) qui a donc été choisi pour concevoir des métallodrogues. La métallodrogue réunit autour d’un métal deux parties: (i) un ligand auxiliaire fonctionnalisé via un espaceur par un perméabilisant peptidique analogue de peptide antimicrobien ou par un modulateur de l’efflux (ii) un acide hydroxamique inhibiteur de PDF. Au cours de la SAR réalisée en faisant varier la drogue, le ligand auxiliaire et le métal, nous avons montré que les meilleures métallodrogues permettent d’améliorer l’activité de la drogue sur la souche d’E. coli sauvage d’un facteur 16. Un des ligands auxiliaires fonctionnalisé par un tétrapeptide présente, seul, une activité sur une souche d’E. aerogenes résistante aux fluoroquinolones. Sur ce cas, l’activité biologique a été reliée, par des expériences de mapping par fluorescence, à son accumulation intracellulaire, en utilisant un analogue fluorescent de ce composé. / The gram negative bacterias’ cell envelopes are the first line of defense against antibiotics. First thanks to the low permeability of the external membrane that prevents the penetration of the antibiotics, but also thanks to the efflux pumps that help expelling the antibiotics from the cell. These mechanisms prevent many compounds, potentially active in vitro, from reaching their targets, thus limiting the antimicrobial effect. To increase the molecules’ intracellular concentration is one of the means to restore their activity. This thesis’ objective is to develop metallodrugs as a new drug vectorization strategy in cells. We here associate an active drug in vitro and an auxiliary ligand with permeabilization or efflux pumps inhibition abilities in a complex playing the role of a chaperone. We used peptide deformylase (PDF) and methionine aminopeptidase (MetAP) inhibitors (derived from hydroxamic acids) developed at the laboratory as antimicrobial agents. I’ll begin with a global study of the vectorization strategy we’ve adopted (i) Stability study of the metallodrugs models: using a fluorescent hydroxamic acid, we showed that only Co(III) metallodrugs are in agreement with the stability conditions compatible with the biological tests, in opposition with the Cu(II) and Fe(III) ones. (ii) Drug release study: we showed in 1H NMR and UV-vis studies that in a buffer solution pH 7.4, a ligand exchange with an exogenous thiol is responsible for the drug release. Recently, a new series of PDF inhibitors was synthesized at the laboratory. It is composed of a 5 membered heterocyclic skeleton functionalized by a chain in C4 followed by an hydroxamic acid via a monocarbonated spacer. The best results were obtained with an oxadiazole (AT002 16 µg/ml with E. coli and PMBN as permeabilizing agent). During this thesis, to enhance lipophilicity, we attached aromatic groups on the heterocycle. CMIs on the E. coli strain have not been increased but the compounds displaying the best activity in presence of PMBN (AT015, 2 µg/ml with E. coli and PMBN) was chosen to conceive metallodrugs. The metallodrug is composed of a metal center and two other parts: (i) an auxiliary ligand functionalized via a spacer by a permeabilizing peptide, an antimicrobial peptide analogue, or by an efflux modulator. (ii) An hydroxamic acid PDF inhibitor. We showed that the best metallodrugs enhance the drug activity on the wild E.coli strain by a 16 factor, with the SAR we realized, changing the drug, the auxiliary ligand and the metal. One of the auxiliary ligands functionalized by a tetrapeptide show an activity on a fluoroquinolone-resistant E. aerogenes strain while alone. Utilizing a fluorescent analogous of this compound, we linked the biological activity to its intracellular accumulation with fluorescence mapping experiments.

La résistance aux polymyxines chez P. aeruginosa résulte en partie de la modification du lipide A par addition de 4-amino-aL-arabinose (L-Ara4N), due à l'expression de l'opéron arnBCADTEF-ugD (arn), activée par au moins 6 systèmes de régulation à deux composants (S2C). Nous avons mis en évidence que P. aeruginosa était capable de s'adapter de manière transitoire à la présence de fortes concentrations de polymyxines (8 x CMI) aussi bien in vitro que in vivo dans un modèle murin d'infection pulmonaire aiguë. La délétion de l'opéron arn chez la souche sauvage n'a pas modifié la capacité d'adaptation de P. aeruginosa. Afin d'identifier les gènes impliqués dans le processus adaptatif, le transcriptome global du mutant PAOl/z«;-Aar«-ATCS délété des principaux S2C (parRS, pmrAB, cprRS eiphoPQ) et de l'opéron arn a été réalisé en présence de différentes concentrations de colistine par RNA-Seq. Deux nouveaux mécanismes ont ainsi été identifiés. L'un repose sur l'expression de l'opéron mmsAB codant des enzymes du catabolisme des acides gras et l'autre fait intervenir le facteur sigma alternatif AlgU. Seule la délétion conjointe du gène algW participant à l'activation de AlgU et des opérons arn, mmsAB, pmrAB, parRS, phoPQ et cprRS a permis d'abolir complètement la résistance adaptative à la colistine. Par ailleurs, nous avons mis en évidence le rôle des vésicules de membrane externe (OMVs) dans la séquestration de l'antibiotique, dont la production semble régulée au moins par AlgU et le PQS. Ces travaux offrent des perspectives intéressantes pour l'identification de nouvelles cibles antibactériennes et pour l'amélioration de l'effet bactéricide des polymyxines. / Resistance to polymyxins in Pseudomonas aeruginosa involves the addition of 4-amino-L-arabinose (Ara4N) to LPS phosphates, thanks to an enzymatic modification due to the operon named arnBCADTEF-ugD (arn) whose expression is activated by at least 6 two component regulatory Systems (TCS). We demonstrated that P. aeruginosa was able to resist in a transient way to high concentrations of polymyxins (8x MIC) in vitro and in vivo in a mice lung infection model. Arn operon deletion in the wild type strain did not modify the ability to adapt to polymyxins. In order to identify gènes involved in adaptive resistance, we performed RNA-seq transcriptomes of quintuple mutant PAO\lux-Aaw-ATCS exposed to different concentrations of colistin or non exposed. Two new mechanisms were identified. The first one is based upon mmsAB operon encoding fatty acid catabolism enzymes and the second one is due to the sigma factor AlgU. Only the deletions of algW%enz involved in AlgU activation and arn, mmsAB, pmrAB, parRS, phoPQ and cprRS operons completely abolished the adaptive process. We also demonstrated the role of outer membrane vesicles in the sequestration of colistin whose production is regulated by AlgU and PQS. This study provides knoweldge essential for the design of novel strategies aimed at tackling the adaptive resistance to polymyxins.

L’analyse microbiologique pour confirmer l’absence de bactéries dans des échantillons biologiques normalement sains, comme le sang, est une routine dans de nombreux laboratoires. En effet, la présence de bactéries dans le sang, appelée bactériémie, peut avoir des conséquences très graves, voire mortelles pour le patient. Le protocole standard pour la détection des bactériémies repose jusqu’ici sur l’enrichissement des échantillons sanguins prélevés sur les patients lors de l’hémoculture, afin d’obtenir une population suffisante pour analyse. La lenteur de ce procédé retarde ainsi de parfois plusieurs jours le diagnostic et donc l’adaptation du traitement antibiotique administré au patient. Ces dernières décennies, des techniques comme l’identification par spectrométrie de masse ou les analyses moléculaires, ont permis de diminuer le délai requis pour identifier les pathogènes en cause. Dans ce contexte, l’emploi de biocapteurs est également une alternative. Ce travail propose d’inclure des sondes à large spectre dans un capteur optique par imagerie SPR (résonance de plasmons de surface). Ce système est déjà développé pour la reconnaissance spécifique de pathogènes au cours de leur croissance dans le sang. Les nouveaux ligands proposés et évalués sont les peptides antimicrobiens (PAM). Ces courts peptides cationiques et amphiphiles, présentent l’avantage d’un large spectre d’interaction couplé à une haute stabilité (chimique, thermique et séchage) comparativement aux anticorps employés jusqu’ici. Leur immobilisation sur des prismes SPRI permet d’évaluer simultanément l’affinité de plusieurs PAM à la même souche bactérienne. Les biocapteurs ainsi préparés ont permis de détecter des souches pathogènes d’Escherichia coli et Staphylococcus aureus en milieu de culture simple, comme en plasma et en sang dilué au milieu d’hémoculture. Le système obtenu permet la détection des pathogènes présents à une concentration initiale de l’ordre de 1 UFC.ml-1, en moins de 24 heures et quel que soit le milieu. Enfin, la mise en place d’analyses statistiques multidimensionnelles a abouti à une classification cohérente des espèces ciblées en milieu simple, comme en sang. Ces résultats montrent le potentiel de ce système pour parvenir à développer un biocapteur à large spectre capable à la fois de détecter mais aussi d’identifier par affinité croisée des pathogènes bactériens. / Microbiological analysis to confirm the absence of bacteria in normally sterile biological samples, such as blood, is routine in many laboratories. The presence of bacteria in blood, called bacteremia, can have very serious, and even fatal consequences for the patient. So far, the standard protocol for their detection has been based on the enrichment of blood samples collected from patients, thanks to blood culture, in order to obtain a sufficient population for analysis. These procedures are time consuming which sometimes lead to delays in diagnosis and subsequent adaptation of antibiotic treatments by several days. In recent decades, techniques such as mass spectrometry identification or molecular analyses have reduced the time required to identify the pathogens involved. In this context, the use of biosensors is another promising alternative. This work proposes to include wide spectrum probes in an optical sensor using SPR imaging (surface plasmon resonance). This system is already developed for the specific recognition of pathogens during their growth in the blood. The new ligands we propose to evaluate are antimicrobial peptides (AMP). These short, cationic and amphiphilic peptides have the advantage of having a broad spectrum of interaction with bacteria, coupled with high stability (chemical, thermal and drying), especially compared to the antibodies used so far in this technique. Their immobilization on SPRI prisms allows the simultaneous evaluation of the affinity of several AMP to the same bacterial strain. The biosensors based on AMP were able to detect pathogenic strains of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in simple culture medium, such as plasma and diluted blood in blood culture medium. The system obtained allows the detection of pathogens present at an initial concentration of about 1 CFU.ml-1, in less than 24 hours and in all assayed media. Finally, the implementation of multidimensional statistical analyses has resulted in a consistent classification of targeted species, in simple culture medium, such as blood. These results show the potential of this system to develop a wide-spectrum biosensor capable of both detecting and cross-referencing bacterial pathogens.