L’insecte phytophage Riptortus pedestris, appartenant au sous-ordre des Hétéroptères, est un ravageur notoire de cultures agricoles en Asie du sud-est qui se nourrit préférentiellement de plants de soja. Cette punaise est associée à une bactérie symbiotique du genre Burkholderia nommée Burkholderia insecticola, localisée dans une région spécifique de l’intestin de l’insecte appelée la région M4. Cette région M4, organisée en cryptes, constitue l’organe symbiotique dans lequel le symbiote prolifère de manière extracellulaire. Cette interaction favorise la croissance et le développement de la punaise. Récemment, il a été montré que Riptortus produit des peptides antimicrobiens au sein des cryptes, appelés “crypt-specific cysteine-rich peptides” ou peptides CCR pour lesquels le symbiote est particulièrement résistant. Il a été proposé que les peptides antimicrobiens de l’hôte,incluant les peptides CCR, participent à la colonisation spécifique de l’organe symbiotique par B. insecticola. Dans ce travail, une approche Tn-seq a été utilisée pour identifier les gènes bactériens impliqués dans la résistance aux peptides antimicrobiens et dans la symbiose. Dans un premier temps, la robustesse de la méthode Tn-seq a été évaluée en identifiant le génome essentiel de B. insecticola. Puis dans un second temps, les facteurs bactériens impliqués dans la résistance aux peptides antimicrobiens ont été caractérisés via une approche gènes-candidats et l’approche Tn-seq. Dans une dernière partie, une expérience de Tn-seq in vivo a permis d’évaluer l’ampleur du goulot d’étranglement sur la population symbiotique lors de l’infection de l’organe symbiotique et d’identifier les facteurs symbiotiques impliqués dans la colonisation de R. pedestris. / The phytophagous insect Riptortus pedestris, belonging to the Heteroptera suborder, is a notorious crop pest in South-Eastern Asia which feeds preferentially on soybean plants. This bean bug is associated with a bacterial symbiont, a specific Burkholderia species named Burkholderia insecticola, located in the M4 region of the insect’s midgut. This M4 region is organized in crypts and constitutes the symbiotic organ where the symbiont proliferates extracellularly. This interaction promotes the growth and the development of the bean bug. Recently, it was demonstrated that Riptortus produces antimicrobial peptides in the midgut crypts called crypt-specific cysteine-rich peptides (CCR) for which the bacterial symbiont demonstrates a high resistance profile. It was proposed that host antimicrobial peptides, including the CCR peptides, contribute to the specific colonization of the symbiotic organ by B. insecticola. In this work, a Tn-seq approach was used to find bacterial fitness genes involved in antimicrobial peptide resistance and symbiosis. First, the robustness of the Tn-seq method was assessed by identifying the essential genome of B. insecticola. Second, the bacterial factors for antimicrobial peptide resistance were characterized, based on both a candidate-gene and the Tn-seq approach. Finally, a Tn-seq in vivo experiment was performed to reveal the infection bottleneck effect on the symbiotic population and to identify the bacterial symbiosis factors for the colonization of R. pedestris.

Lors de la prise d'un repas sanguin par le moustique Aedes (Ae) aegypti, le virus de la dengue (DENV) est transmis à l'homme avec la salive du moustique. Ce mélange complexe est en partie déposé dans le compartiment cutané extravasculaire lors de la piqûre de moustique. Il est donc important de prendre en compte la triade virus-vecteur-hôte vertébré dans les mécanismes de transmission de ce virus à l'hôte vertébré. Des analyses de génomique et protéomique des glandes salivaires d'Ae. Aegypti infectées ou non par le DENV nous ont permis de mettre en évidence dans les glandes salivaires de moustiques infectés, la surexpression d'un gène codant pour un peptide antimicrobien (PAM) cationique. Nous avons démontré, que ce PAM possède une activité antibactérienne et antivirale contre les virus de la dengue et du chikungunya. Nos travaux soulignent l'importance chez les invertébrés, du compartiment « glandes salivaires » dans la réponse immunitaire innée du moustique. Nous avons également démontré que les kératinocytes humains sont des cellules permissives pour le DENV et que l'infection de ces cellules stimule la réponse immunitaire innée antivirale. Nos travaux démontrent que des extraits de glandes salivaires d'Ae. Aegypti augmentent l'infection du virus de la dengue dans les kératinocytes humains. Nous avons par la suite identifié une protéine salivaire d'Ae. Aegypti (34kDa), qui augmente l'infection du DENV en supprimant la production d'interféron. L'ensemble de ces travaux ont permis de contribuer aux connaissances sur la transmission du DENV, mais aussi d'identifier de nouvelles cibles potentielles pour le contrôle de la réplication virale. / Dengue virus (DENV) transmission is initiated when a blood-feeding Aedes (Ae) aegypti mosquito injects saliva, together with the virus, into the epidermis of its mammalian host. Studies of DENV should, therefore, take into account the triad virus-vector-vertebrate host. We have used functional genomic and proteomic analyses, of the salivary glands of female Ae. Aegypti, to demonstrate that this compartment harbors a potent immune response against DENV, represented by the production of an antimicrobial peptide (AMP). This AMP was found to exert, in addition to its anti-bacterial activity, an anti-viral activity against DENV and Chikungunya. Our data demonstrate, for the first time, the permissiveness of human epidermal keratinocytes to DENV infection. Remarkably, DENV replication in keratinocytes contributes to the establishment of anti-viral innate immunity that might occur shortly after the mosquito bite. To investigate the role of Ae. aegypti saliva in DENV transmission to man, primary human keratinocytes were infected with DENV in the presence of Ae. aegypti salivary gland extract. We show that Ae. aegypti saliva enhances dengue virus infection of human keratinocytes by suppressing innate immune responses. Furthermore, we have found a 34-kDa protein, in the saliva of Ae.aegypti, that strongly enhances DENV replication by suppressing type-I IFN production. This study provides new insights into the role of Ae. aegypti salivary glands and saliva in DENV transmission. The data presented here provide novel targets for the control of DENV replication in mammalian hosts.

L'utilisation excessive d'agents antifongiques, aggravée par la pénurie de nouveaux médicaments introduits sur le marché, provoque l'accumulation de phénotypes de multi-résistance de nombreuses souches fongiques. Dans ce contexte alarmant, le développement de nouvelles molécules alternatives aux agents antifongiques conventionnels constitue un enjeu majeur de santé publique afin de prévenir l’émergence de nouvelles résistances fongiques pour limiter les problèmes socio-économiques. Dans ce contexte, la cateslytine (CTL), un peptide naturel issu de la maturation endogène de la chromogranine A, et déjà décrit comme un agent antimicrobien efficace contre de nombreux agents pathogènes, dont Candida albicans, présente un intérêt particulier. Dans la présente étude, nous avons ainsi comparé l'activité antimicrobienne de deux conformations de CTL, L-CTL et D-CTL contre différentes souches de Candida. Nos résultats démontrent que D-CTL est l'agent antifongique le plus efficace et le plus sûr. De plus, contrairement à L-CTL, D-CTL n'est pas dégradé par les protéases sécrétées par Candida albicans et est également stable dans la salive. La vidéo-microscopie révèle une invasion rapide de Candida albicans par D-CTL, et démontre l’importance de la division cellulaire pour la propagation de D-CTL d'une cellule mère à une cellule fille. La microscopie électronique en transmission permet d’illustrer la perméabilisation de la membrane fongique induite par les deux peptides. Enfin, nos résultats révèlent un effet antifongique additif de la combinaison entre D-CTL et le voriconazole, un agent antifongique de référence dans le traitement des infections liées à Candida. En conclusion, D-CTL peut être considéré comme un agent antifongique efficace, sûr et stable et pourrait être utilisé seul ou en association avec le voriconazole pour traiter les infections orales liées à Candida et servir dans le futur à l’élaboration de biomatériaux actifs. / The excessive use of antifungal agents, compounded by the shortage of new drugs being introduced into the market, is causing the accumulation of multi-resistance phenotypes in many fungal strains. Consequently, new alternative molecules to conventional antifungal agents are urgently needed to prevent the emergence of fungal resistance. In this context, Cateslytin (CTL), a natural peptide derived from the processing of Chromogranin A, has already been described as an effective antimicrobial agent against several pathogens including Candida albicans. In the present study, we compared the antimicrobial activity of two conformations of CTL, L-CTL and D-CTL against various strains of Candida. Our results show that D-CTL was the most efficient and safe antifungal agent. Moreover, in contrast to L-CTL,D-CTL was not degraded by proteases secreted by Candida albicans and was also stable in saliva. Using video-microscopy, we also demonstrated that D-CTL can rapidly enter Candida albicans, but is unable to spread within a yeast colony unless from a mother cell to a daughter cell during cellular division. Besides, transmission electron microscopy illustrated the permeabilization of the fungal membrane induced by both peptides. Finally, we revealed that the antifungal activity of D-CTL could be synergized by voriconazole, an antifungal of reference in the treatment of Candida related infections. In conclusion, D-CTL can be considered as an effective, safe and stable antifungal and could be used alone or in a combination therapy with voriconazole to treat Candida associated infections including oral candidosis.

La vie en société présente des avantages écologiques et évolutifs, mais augmente les risques de transmission de pathogènes. Pour faire face à ce problème, les insectes sociaux ont développé plusieurs mécanismes de défenses comportementales et physiologiques, et en plus utilisé la protection fournie par des organismes tiers. C'est ainsi que des abeilles et des fourmis se servent de substances antimicrobiennes d'origine végétale ou des fourmis possèdent des bactéries productrices d'antibiotiques. La fourmi est un insecte qui, par définition, ne peut vivre que dans sa société avec des congénères avec lesquels elle entretient des relations nombreuses comme des léchages interindividuels et des échanges en bouche à bouche (appelés trophallaxies). Dans la première partie de la thèse, nous avons étudié les altérations comportementales des ouvrières de la fourmi Camponotus fellah après le déclenchement d'une réaction immunitaire. Nous avons posé l'hypothèse que si les relations sociales sont aussi coûteuses que les défenses immunitaires physiologiques, l'individu devrait être confronté à un choix : où investir son énergie ? Au contraire, suite à une réaction immunitaire les fourmis ont augmenté leur taux de trophallaxie et aucun signe d'isolement de l'ouvrière malade ne fut observé. Ce résultat met en évidence l'importance des relations sociales pour la guérison de l'individu et qui peuvent même avoir une fonction prophylactique. La deuxième partie a été consacrée à l'étude d'un endosymbiote primaire de C. fellah, une bactérie du genre Blochmannia. Cet endosymbiote a un rôle nutritif qui a été déjà montré chez d'autres espèces de Camponotus. Nous avons envisagé qu'il ait aussi d'autres fonctions comme : favoriser le système immunitaire de la fourmi, favoriser le développement des nouvelles colonies et participer à la formation de l'odeur coloniale. Nous avons d'abord décrit cette nouvelle bactérie par des techniques de biologie moléculaire. Ensuite, nous avons pu montrer qu'elle favorise la réponse immunitaire des fourmis en augmentant l'encapsulation de particules étrangères. Elle contribue à une plus grande production de larves, aboutissant à une plus grande quantité d'ouvrières. Nous n'avons pas mis en évidence de lien entre la quantité de bactéries et celle d'hydrocarbures cuticulaires, bien que leur élimination par un antibiotique entraînait une surproduction de ces hydrocarbures, probablement une réponse liée au stress. Plus généralement, ces travaux montrent de nouvelles fonctions des endosymbiotes, qui ont probablement contribué au succès écologique de ce groupe de fourmis hautement diversifié et très répandu.

Les peptides lasso sont des peptides synthétisés par les bactéries selon la voie ribosomale et qui subissent des modifications post-traductionnelles, leur conférant une topologie remarquable incluant un nœud moléculaire. Ils possèdent un cycle macrolactame N-terminal, dans lequel est insérée et piégée la queue C- terminale. Cette topologie est stabilisée par des contraintes stériques et/ou des ponts disulfure. Leurs propriétés biologiques (antagonistes de récepteurs, inhibiteurs d'enzymes pouvant leur conférer des propriétés antivirales ou antibactériennes) et la très grande stabilité de leur structure "lasso" leur confèrent un fort attrait biotechnologique. Ce travail de thèse s'inscrit dans le contexte de compréhension des éléments de séquence gouvernant la topologie et l'activité de ces peptides, à travers le développement de méthodes spectroscopiques. Les relations structure/activité d'un peptide lasso antibactérien produit par Escherichia coli, la microcine J25 (MccJ25) ont été examinées. Une mutagenèse dirigée sur le précurseur a permis de générer des variants de MccJ25, dont la topologie (structure en lasso ou cyclique-branchée) a été déterminée par LC-MS/MS, digestion par la carboxypeptidase Y, et pour certains par RMN. L'activité antibactérienne contre Salmonella enterica a été mesurée. Les éléments gouvernant le piégeage stérique de la queue C-terminale dans le cycle macrolactame ont été identifiés. Les résidus situés sous le cycle (Tyr20, Gly21) et la taille du cycle sont critiques pour la topologie et l'activité antibactérienne, tandis que la réduction de la taille de la boucle Tyr9-Ser18 au-dessus du cycle ou l'allongement de la queue C- terminale Tyr20-Gly21 sous le cycle ne perturbent pas la topologie en lasso, mais ont des effets sur l'activité, allant de la réduction à la suppression. Nous avons isolé et caractérisé un nouveau peptide lasso produit par Streptomyces sviceus découvert par exploration des génomes, la svicéucine. La structure tridimensionnelle du peptide a été déterminée d'après les données de RMN en solution. Ce peptide présente un cycle macrolactame de 9 résidus dans lequel est piégée la queue C-terminale, la structure étant stabilisée par deux ponts disulfures cycle-queue, Cys1/Cys13 et Cys7/Cys19. Ce nouveau peptide s'apparente à des peptides lasso antimicrobiens et anti-HIV comme RP 71955. Il possède une activité antimicrobienne contre des bactéries à Gram positif. Enfin, une étude spectroscopique de différents peptides lasso nous a permis de décrire des signaux caractéristiques des régions structurales de peptides lasso. L'étude de la dynamique de MccJ25 par relaxation de spin 15N en RMN montre une certaine inhomogénéité de la mobilité interne de ses résidus selon leur position dans la structure " lasso ". En outre, l'étude par dichroïsme circulaire de MccJ25, de la svicéucine et de la capistruine (peptide lasso produit par Bhurkholderia thailandensis), a révélé que certains peptides lasso présentent une bande positive autour de 220 nm, caractéristique de la topologie lasso

La CgA est une pro-hormone stockée dans les granules de sécrétion et elle subit une maturation protéolytique conduisant à la formation d’un très grand nombre de peptides dérivés. La Chromofungine (Chr: CgA47-66) et la Cateslytine (Ctl: CgA344–358) possèdent des propriétés antimicrobiennes. Staphylococcus aureus est un pathogène très virulent qui provoque un très grand nombre de graves infections cliniques et il représente une des causes principales des infections nosocomiales et la destruction du tissu endocardiaque après implantation de valve cardiaque. La première partie de l’étude nous avons montré que la Chr induise un effet inotropique négatif sans changement de la pression coronarienne. L’activation de la voie de signalisation AKT/eNOS/cGMP/PKG est responsable de cet effet de Chr. Nous avons aussi montré que Chr agit comme un agent de post-conditionnement contre les effets négatifs de l’ischémie/reperfusion, a responsables de cette cardio-protection impliquent les cascades de signalisation PI3K, RISK, MitoKATP et miRNA-21. Dans le but d’élaborer un nouveau revêtement de valves cardiaques le peptide D*T*Ctl se révèle intéressant dans des conditions non oxydantes car (1) il présente une activité antimicrobienne contre S. aureus; (2) en présence de S. aureus il permet par clivage protéolytique de libérer le peptide Ctl actif. Une première expérience réalisée in vivo a montré le rôle de Ctl pour combattre l’infection à S. aureus au niveau systémique et au niveau cardiaque, mais aussi assurer la protection du myocarde. / CgA is a pro-hormone costored in secretory granules and numerous cleavage products of this protein have been identified. Chromofungin (Chr: CgA47-66) and Cateslytin (Ctl: CgA344–358) are peptides that display antimicrobial activities.Staphylococcus aureus is an opportunistic pathogen and the leading cause of a wide range of severe clinical infections and one of the most important cause of hospital-acquired infections and leading infective cause of destruction of endocardial tissue after implantation of prosthetic heart valve. The first part of the study, we found that Chr induced negative inotropic effects without changing coronary pressure. The AKT/eNOS/cGMP/PKG pathway mediated this action. We also found that Chr acted as a postconditioning agent against ischemia/reperfusion damages. Cardioprotection involved PI3K, RISK pathway, MitoKATPand miRNA-21. In order to develop a new coating of cardiac valves, the peptide D*T *Ctl proves to be useful under non-oxidizing conditions because (1) it exhibits antimicrobial activity against S. aureus; (2) in the presence of S. aureus, it allows proteolytic cleavage to release the active Ct1 peptide.In the last part of this thesis we showed in vivo the antibacterial role of Ctl against S. aureus infection at the systemic and cardiac levels, but also its cardioprotective action.

Les peptides antimicrobiens sont considérés comme une nouvelle classe prometteuse d'agents anti-infectieux. Afin de développer de nouveaux agents efficaces et non toxiques, des stratégies de conception rationnelle peuvent être utilisées. Dans cette perspective, nous avons utilisé une approche computationnelle pour concevoir trois peptides synthétiques ([I5, R8] MP, EcDBS1R6 et PaDBS1R1). En déterminant la concentration minimale inhibitrice, nous avons montré que tous les peptides sont actifs contre les bactéries Gram-négatif et -positif. Seul [I5, R8] MP a montré une activité antifongique. La mesure de la concentration de peptide provoquant 50 % de mortalité cellulaire a permis de montrer que les peptides étaient faiblement ou non hémolytiques, sans toxicité vis-à-vis des cellules embryonnaires rénales humaines HEK-293. La cinétique bactéricide a révélé que PaDBS1R1 et [I5, R8] MP tuent rapidement E. coli en comparaison à S. aureus et que EcDBS1R6 élimine rapidement les deux souches. Des études de perméabilisation et de dépolarisation combinées à de la microscopie électronique à haute résolution (FEG-SEM) ont montré un mécanisme membranolytique des peptides. L'analyse de la structure des peptides par spectroscopie de dichroïsme circulaire et résonance magnétique nucléaire, ainsi que par modélisation moléculaire lors de leur interaction avec une membrane modèle, révèle une conformation en hélice alpha amphipatique. En conclusion, notre étude indique que l'évaluation structurale et fonctionnelle de peptides antimicrobiens synthétiques conçus de manière rationnelle représente une stratégie prometteuse pour le développement de nouveaux agents antimicrobiens. / Antimicrobial peptides (AMPs) have been considered as a potential novel class of antimicrobial compounds. In order to generate new potent and non-toxic antimicrobial agents, rational design strategies may be employed. In this view, we used a computational method to design three synthetic AMPs ([I5, R8] MP, EcDBS1R6 and PaDBS1R1). By determining the minimum inhibitory concentration, we found that all the peptides were active against Gram-negative and -positive bacteria. Only [I5, R8] MP was found to display antifungal activity. The determination of the peptide concentration producing 50% of cell lysis revealed low or no hemolytic activity, with no cytotoxicity towards human embryonic kidney cells HEK-293. During time-kill assays more rapid bactericidal effects were observed for PaDBS1R1 and [I5, R8] MP against E. coli compared to S. aureus. For the peptide EcDBS1R6, identical killing curves were obtained for both bacterial strains. Membrane permeabilization and depolarization studies combined with field emission gun scanning electron microscopy (SEM-FEG) revealed that a membranolytic mechanism occurs for these peptides. When analyzed by circular dichroism and nuclear magnetic resonance microscopy or by molecular dynamics simulations during interaction with a membrane model, peptides were shown to adopt an amphipathic alpha-helical conformation. In conclusion, our results indicate that the structural and functional evaluation of rationally designed synthetic AMPs represents a promising strategy for the development of potent novel antimicrobial agents.

La démonstration du rôle de la CDT (« Cytolethal Distending Toxin ») de Helicobacterhepaticus dans le développement de l’hépatocarcinome murin fait de cette toxine un candidatpertinent dans l'activation de processus pro-cancéreux. Comme la toxine CagA de Helicobacterpylori, la sous-unité active CdtB de la CDT pourrait être une oncoprotéine. Nous avons étudié lerôle de la CdtB des Hélicobacters dans l’inflammation et la carcinogenèse digestive via unestratégie lentivirale d’expression constitutive ou conditionnelle de la CdtB ou de son mutant pourl’activité DNase. Nous avons réalisé une étude du transcriptome et montré que la CdtB deH. hepaticus induisait une réponse inflammatoire en surexprimant des cytokines, chimiokines,peptides antimicrobiens et en activant la voie du NF-κB des cellules épithéliales. La CdtB réguleégalement l’expression et la localisation nucléaire du facteur de transcription et oncogène MafB.Ces résultats ont été confirmés pour la CdtB de Helicobacter pullorum. Des expériencesd'infection des cellules avec des souches sauvages et mutées pour la CDT (deH. hepaticus & H. pullorum) ont permis de valider les résultats obtenus et de les attribuer à laCdtB et notamment à son activité DNase. Nous avons aussi développé un nouveau modèle dexénogreffes de cellules épithéliales inductibles pour l’expression de la CdtB de H. hepaticus.Dans ce modèle, la CdtB, en plus de ses effets déjà connus, retarde la croissance tumorale,induit l’apoptose, la sénescence et la surexpression du marqueur nucléaire de prolifération,Ki-67, suggérant la survie cellulaire. L’ensemble de ces résultats fournit de nouveaux argumentsen faveur du potentiel oncogénique de la CDT. / The demonstration of the role of the Cytolethal Distending Toxin (CDT) of Helicobacter hepaticusin the development of hepatocarcinoma in mice, makes this toxin a relevant candidate in theactivation of precancerous processes. As in the case of the CagA toxin of Helicobacter pylori, theCdtB active subunit of CDT could be an oncoprotein. We studied the role of Helicobacter CdtB ininflammation and digestive carcinogenesis using a lentiviral strategy for constitutive or conditionalexpression of the CdtB subunit or its corresponding DNase mutant. We conducted a study of thetranscriptome and showed that CdtB induced an inflammatory response by overexpressingcytokines, chemokines, antimicrobial peptides and activating the NF-kB pathway in epithelialcells. The CdtB also regulated the expression and nuclear localization of the transcription factorand oncogene MafB. These results were confirmed for the CdtB of Helicobacter pullorum.Infection of cells with wild type strains and the corresponding CDT-mutant strains (of H. hepaticus& H. pullorum) were used to validate the results and to attribute the effects to the CdtB and, inparticular, to its DNase activity. We also developed a novel epithelial cell xenograft model toevaluate the inducible expression of H. hepaticus CdtB. In this model, the CdtB, in addition to itspreviously well-known effects, delayed tumor growth, induced apoptosis, senescence and theoverexpression of nuclear proliferation marker, Ki-67, suggesting cell survival. All of these resultsprovide new arguments in favor of the oncogenic potential of the CDT.

Les peptides antimicrobiens (PAMs) sont des effecteurs de l'immunité innée et exercent leur activité microbicide sur un spectre de microorganismes. Au niveau de l'intestin, leur sécrétion est directement impliquée dans les processus homéostatiques existant entre un hôte et son microbiote. Ces dernières années, plusieurs études ont démontré une corrélation entre le niveau d'expression des PAMs et la susceptibilité des individus à différentes pathologies. Les PAMs peuvent être exprimés constitutivement ou de manière inductible. Dans les deux cas, les mécanismes de régulation (épi)génétique pour contrôler leur expression sont méconnus.Le but de ces travaux de thèse a été d'étudier la composante (épi)génétique des régulations contrôlant l'expression des gènes codant les PAMs. Utilisant un modèle de cellules épithéliales intestinales humaines exposées à des molécules inhibitrices de l'activité d'enzymes modifiant la chromatine, et stimulées par la bactérie Escherichia coli, nous avons identifié l'importance du processus d'acétylation dans l'expression des ces gènes. Nous avons montré que l'inhibition des enzymes de la famille des histones déacétylases augmente significativement le niveau d'induction des gènes antimicrobiens comme la béta-défensine-2, sans impacter celui des gènes pro-inflammatoires comme l'interleukine 8. Enfin, nous avons étudié le mécanisme moléculaire sous-jacent à cette observation, notamment le rôle du facteur de transcription NF- B et celui de l'histone acétyltransférase p300. Ces travaux démontrent l'existence d'un mécanisme (épi)génétique permettant de réguler différentiellement le niveau d'induction des gènes antimicrobiens et pro-inflammatoires. / Antimicrobial peptides (AMPs) are conserved molecules of the innate immune system and actively kill a wide variety of microorganisms. In the intestine AMPs secreted by the epithelium protect against pathogens and support homeostasis with the microbiota. Their importance becomes clear, as their expression has been correlated with susceptibility to infection and a multitude of severe pathologies. Some AMPs are expressed constitutively, while others are inducible. The regulation of inducible AMPs expression is widely undiscovered. The role of chromatin remodeling and histone modifications, as an additional regulatory level to transcription factor activation, in the expression of inducible genes is becoming more and more clear. The aim of this work was to investigate the (epi)genetic mechanisms, which are involved in the regulation of AMPs gene expression in the intestine. By the use of specific inhibitors of chromatin modifying enzymes, in an in vitro model of intestinal epithelial cells challenged with Escherichia coli strains, we discovered the importance of acetylation in the regulation of these genes. Inhibition of histone deacetylase enzymes significantly enhanced the bacteria-induced expression of the beta-defensin-2 and other AMPs, while the expression of the interleukin 8 and other inflammatory genes was not influenced. Furthermore, we detailed the molecular mechanism, especially involvement of the transcription factor NF-κB and the histone acetyltransferase p300 in this observation. This discovery presents a mechanism of (epi)genetic enhancement of AMPs expression, dissociated from the pro-inflammatory response.

Les peptides antimicrobiens (PAMs) représentent des composants importants de l`immunité innée. Ils sont présents dans la plupart des organismes multicellulaires et constituent la première ligne de défense contre les infections. Ils possèdent un large éventail d`activités, une non-toxicité contre les cellules de l`hôte et des effets synergiques avec les antibiotiques conventionnels. Par conséquent, ils peuvent être d`excellents candidats dans le développement de nouveaux antibiotiques pour lutter contre la résistance de microorganismes. Concernant les PAMs dérivés de la chromogranine A (CgA), la cateslytine (Ctl) présente des activités antimicrobiennes directes et des propriétés immunomodulatrices. Dans ma thèse, j`ai cherché à caractériser l`épipeptide D-Ctl, où tous les résidus en conformation-L ont été remplacés par des résidus en conformation-D. Tout d`abord, la stabilité dans les surnageants bactériens et des dosages de l`activité antimicrobienne ont été réalisés, ainsi que l`analyse de viabilité des cellules et des dosages des cytokines libérées par les cellules immunitaires. L`efficacité de D-Ctl a été comparée à celle de L-Ctl contre des souches bactériennes, puis les CMIs ont été déterminées et comparées dans le cas de combinaisons avec des antibiotiques conventionnels, afin de montrer un effet synergique et/ou additif. De plus, D-Ctl ne déclenche pas de résistance chez E. coli. Des tests de cytotoxicité ont été effectués sur plusieurs types de lignées cellulaires et de PBMCs. Les effets inflammatoires aussi ont été testés. Ensuite, le modèle bactérien E. coli MDR a été utilisé pour des analyses physico-chimiques, telles que la microscopie à épifluorescence, la spectroscopie ATR-FTIR et la microscopie à force atomique. Enfin, le brevet D-Ctl a été déposé en 2016 sous le numéro EP 16306539.4 « Nouveau peptide de cateslytine en conformation D ». En conclusion, D-Ctl est capable de tuer rapidement un large spectre de micro-organismes, et il pourrait potentialiser l`effet antimicrobien de plusieurs antibiotiques. / Antimicrobial peptides (AMPs) represent important components of innate immunity. They are present in most multicellular organisms and constitute the first line of defense against infections. They exhibit a large spectrum of activities, a non-toxicity against host cells and synergistic effects with conventional antibiotics. Therefore, they can be as excellent candidates in the development of new antibiotics to fight pathogens resistance. Concerning to AMPs derived from chromogranin A (CgA), Cateslytin (Ctl) represents a new antibiotic, which displays direct antimicrobial activities and immunomodulatory properties. In my thesis, I aimed to characterize the epipeptide D-Ctl, where all (L-conformation) residues were replaced by (D-conformation) residues. Firstly, antimicrobial assays were performed, cells viability, immune assays, and the stability in bacterial supernatant was tested. The efficiency of D-Ctl was compared with L-Ctl against bacterial strains, then MICs were determined and compared with combinations in presence of classical antibiotics in order to show synergistic or/and additive effect. Moreover, D-Ctl does not trigger resistance in E. coli. Also, cytotoxicity assays were performed on several types of cell line and PBMCs. Inflammatory effects were tested too. Then, bacterial model E. coli MDR was used for physicochemical analysis such as epifluorescence microscopy, ATR-FTIR spectroscopy and atomic force microscopy. Finally, D-Ctl patent has been deposited in 2016 under the number EP 16306539.4 “New D-configured cateslytin peptide”. To conclude: D-Ctl is able to rapidly kill a broad spectrum of microorganisms, and it could potentiate the antimicrobial effect of several antibiotics.