Les peptides antimicrobiens sont considérés comme une nouvelle classe prometteuse d'agents anti-infectieux. Afin de développer de nouveaux agents efficaces et non toxiques, des stratégies de conception rationnelle peuvent être utilisées. Dans cette perspective, nous avons utilisé une approche computationnelle pour concevoir trois peptides synthétiques ([I5, R8] MP, EcDBS1R6 et PaDBS1R1). En déterminant la concentration minimale inhibitrice, nous avons montré que tous les peptides sont actifs contre les bactéries Gram-négatif et -positif. Seul [I5, R8] MP a montré une activité antifongique. La mesure de la concentration de peptide provoquant 50 % de mortalité cellulaire a permis de montrer que les peptides étaient faiblement ou non hémolytiques, sans toxicité vis-à-vis des cellules embryonnaires rénales humaines HEK-293. La cinétique bactéricide a révélé que PaDBS1R1 et [I5, R8] MP tuent rapidement E. coli en comparaison à S. aureus et que EcDBS1R6 élimine rapidement les deux souches. Des études de perméabilisation et de dépolarisation combinées à de la microscopie électronique à haute résolution (FEG-SEM) ont montré un mécanisme membranolytique des peptides. L'analyse de la structure des peptides par spectroscopie de dichroïsme circulaire et résonance magnétique nucléaire, ainsi que par modélisation moléculaire lors de leur interaction avec une membrane modèle, révèle une conformation en hélice alpha amphipatique. En conclusion, notre étude indique que l'évaluation structurale et fonctionnelle de peptides antimicrobiens synthétiques conçus de manière rationnelle représente une stratégie prometteuse pour le développement de nouveaux agents antimicrobiens. / Antimicrobial peptides (AMPs) have been considered as a potential novel class of antimicrobial compounds. In order to generate new potent and non-toxic antimicrobial agents, rational design strategies may be employed. In this view, we used a computational method to design three synthetic AMPs ([I5, R8] MP, EcDBS1R6 and PaDBS1R1). By determining the minimum inhibitory concentration, we found that all the peptides were active against Gram-negative and -positive bacteria. Only [I5, R8] MP was found to display antifungal activity. The determination of the peptide concentration producing 50% of cell lysis revealed low or no hemolytic activity, with no cytotoxicity towards human embryonic kidney cells HEK-293. During time-kill assays more rapid bactericidal effects were observed for PaDBS1R1 and [I5, R8] MP against E. coli compared to S. aureus. For the peptide EcDBS1R6, identical killing curves were obtained for both bacterial strains. Membrane permeabilization and depolarization studies combined with field emission gun scanning electron microscopy (SEM-FEG) revealed that a membranolytic mechanism occurs for these peptides. When analyzed by circular dichroism and nuclear magnetic resonance microscopy or by molecular dynamics simulations during interaction with a membrane model, peptides were shown to adopt an amphipathic alpha-helical conformation. In conclusion, our results indicate that the structural and functional evaluation of rationally designed synthetic AMPs represents a promising strategy for the development of potent novel antimicrobial agents.

La comparaison de site peut-elle vérifier l’hypothèse: «Les origines biosynthétiques des produits naturels leurs confèrent des activités biologiques»? Pour répondre à cette question, nous avons développé un outil modélisant les propriétés accessibles au solvant des sites de liaison. La méthode a montré des aspects intéressants, mais elle souffre d’une sensibilité aux coordonnées atomiques. Cependant, des méthodes existantes nous ont permis de prouver que l’hypothèse est valide pour la famille des flavonoïdes. Afin d’étendre l’étude, nous avons développé un procédé automatique capable de rechercher des structures d’enzymes de biosynthèse de produits naturels disposant de sites actifs capables de lier une molécule de petite taille. Nous avons trouvé les structures de 117 enzymes.Les structures nous ont permis de caractériser divers modes de liaison substrat-enzyme, nous indiquant l’empreinte biologique des produits naturels ne correspond pas toujours au modèle « clé- serrure ». / Can computational binding site similarity tools verify the hypothesis: “Biosynthetic moldings give potent biological activities to natural products”? To answer this question, we designed a tool modeling binding site properties according to solvent exposure. The method showed interesting characteristics but suffers from sensitivity to atomic coordinates. However, existing methods have delivered evidence that the hypothesis was valid for the flavonoid chemical class. In order to extend the study, we designed an automated pipeline capable of searching natural products biosynthetic enzyme structures embedding ligandable catalytic sites. We collected structures of 117 biosynthetic enzymes. Finally, according to structural investigations of biosynthetic enzymes, we characterized diverse substrate-enzyme binding-modes, suggesting that natural product biological imprints usually do not agree with the “key-lock” model.

Les micro-organismes ont la capacité de s'adapter rapidement aux différentes contraintes environnementales ou métaboliques, mais le mécanisme détaillé et les principes de cette réponse adaptative en micro-organisme sont mal compris aux niveaux génétiques, biochimiques et métaboliques. Ici, une souche de E. coli a évolué avec un titre élevé de 1,3-propanediol a été sélectionné et cette souche a été analysée comme un exemple pour la découverte de ce processus d'évolution adaptative. La technologie de séquençage comparatif du génome entier a été utilisée pour identifier les mutations génétiques dans le chromosome et le plasmide portant les gènes codant pour la voie de production de 1,3-propanediol a également été séquencée. Quatre mutations ont été trouvées dans le chromosome et ils sont Ipd, glpR, dhak, nagD - promoteur. Une mutation a été trouvée dans le gène GGP2, qui est situé dans le plasmide. Toutes les mutations ont été en outre caractérisées par analyse génétique et inverse biochimique et leur influence dans le réseau métabolique sont aussi découverts. Nous avons démontré que tous les cinq mutations individuellement peuvent augmenter le taux de croissance et la production de 1,3 -propanediol. Selon le profil de fermentation de la souche évolué, l’accumulation d'acétate entravé la croissance de la souche et de l'augmentation de 1,3-propanediol titre. Pour optimiser la production de 1,3- propanediol, un nouveau catalyseur a été développé pour la co-production de 1,3-propanediol avec de l'acétone au lieu de l'acétate, parce que l'acétone a une plus grande valeur et est moins toxique que l'acétate. Les deux voies de l'acétate, dépendantes et indépendantes, ont été testées pour la co-production de 1,3-propanediol et l'acétone dans des conditions anaérobies. Pour la voie de l'acétate dépendante, en modifiant le niveau d'expression de l'acétate kinase cette voie était active dans des conditions anaérobies dans E. coli. Pour la voie de l'acétate indépendant, une courte chaîne acyl-CoA thioestérase candidat a été sélectionné et caractérisé, mais son activité doit encore être améliorée en utilisant l'évolution adaptative ou la sélection in vitro. Pour l'évolution adaptative, le réseau métabolique était rationnel conçu pour forcer de flux de carbone à la production d'acétone, ce qui va augmenter la possibilité et l'efficacité de la sélection d'une thioestérase avec une affinité et une activité élevée à l'acétoacétyl -CoA au cours du processus d’évolution adaptative. Pour la sélection in vitro, un système de bio-sensor a été développé afin de simplifier la méthode de sélection d'une thioestérase mutant avec une grande capacité de catalyser l'acétoacétyl -CoA in vitro. / Microorganisms have the ability to adapt rapidly to different environmental or metabolic constraints, but the detailed mechanism and the principles of this adaptive response in microorganism is poorly understood at the genetic, biochemical, and metabolic levels. Here, the glycerol pathway from S. cerevisiae and the B12-independent C. butyricum 1,3-PD pathways were introduced into E. coli and its central metabolic network was restructured to couple the production of 1.3-propanediol to the growth of the microorganism. This strain was grown in conditions favouring adaptive evolution for around 1000 hours. An evolved population was selected under optimal conditions in mineral medium. Comparing with the original strain, it can convert glucose to 1.3-PD at high molar yield (94 %) and its productivity was also significantly increased. Comparative whole genome sequencing technology was used to identify the genetic mutations and five mutating genes lpd, glpR, dhaK, nagD and GPP2 were discovered. All the mutations were further analysed and characterized to disclose their changes after the evolution and to elucidate their influence in the whole metabolic engineering network. To optimize the production of 1.3-PD further, we plan to convert the co-production of acetate to acetone. Indeed, the 1.3 propanediol production was hampered by the acetate inhibition on growth, and acetone is a valuable product which is less toxic thyan acetate. Both the acetate-dependent and independent pathways were tested to produce acetone and some modifications to adapt the global metabolic network were performed. Several strategies were applied to ameliorate the performance of acetone production. Finally, the bottleneck of the acetate-dependent acetone pathway under anaerobic condition was indentify and the acetate-independent acetone pathway still need to be improve with the selection of an evolved or mutant enzyme with high short-chain acyl-CoA thioesterase activity.

Les cavités sont le lieu privilégié des interactions d’une protéine avec ses ligands, et sont donc déterminantes pour sa fonction, elle-même aussi influencée par la dynamique de la protéine. Peu de méthodes permettent d’étudier en détail la dynamique des cavités malgré leur intérêt notamment pour le criblage virtuel. Les cavités d’une protéine définissent un ensemble très labile. Ainsi, suivre une cavité le long d’une trajectoire est ardu car elle peut être sujette à des divisions, fusions, disparitions et apparitions. Je propose une méthode pour résoudre cette question afin d’exploiter la dynamique des cavités de façon systématique et rationnelle, en classifiant les cavités selon les groupes d’atomes les entourant. J’ai identifié les paramètres procurant les meilleurs critères de suivi des cavités. Pour caractériser les évolutions principales de la géométrie des cavités en relation avec la dynamique de la protéine, j’ai développé une méthode basée sur l’Analyse en Composantes Principales. Cette méthode peut être utilisée pour sélectionner ou construire des conformations à partir de la forme de leurs cavités. Deux exemples d’applications sont traitées : la sélection de conformations ayant des cavités de géométries diverses et l’étude de l’évolution des cavités de la myoglobine lors de la diffusion du monoxyde de carbone. Ces deux méthodes ont été utilisées pour trois projets de criblage virtuel ciblant l’ADN-gyrase de M tuberculosis, la subtilisine 1 de P vivax et GLIC, homologue procaryote des récepteurs pentamériques humains. Les molécules sélectionnées à l’aide de ces méthodes ont permis d’identifier une molécule active contre la subtilisine et quatre effecteurs de GLIC. / Cavities are the prime location of the interactions between a protein and its ligands, and thus are crucial for its functions, together with its dynamics. Although cavities have been studied since the seventies, specific studies on their dynamical behavior only appeared recently. Few methods can tackle this aspect, despite its interest for virtual screening and drug design. Protein cavities define an extremely labile ensemble. Following one cavity along a trajectory is therefore an arduous task, because it can be subjected to several events of fusions, divisions, apparitions and disappearances. I propose a method to resolve this question, thus enabling systematic and rational dynamical exploitation of protein cavities. This method classify cavities using the atom groups around them, using algorithms and parameters that I identified as giving best results for cavity tracking. To characterize the main directions of evolution of cavity geometry, and to relate them with the dynamics of the underlying structure, I developed a method based on Principal Component Analysis (PCA). This method can be used to select or build conformations with given cavity shapes. Two examples of applications have been treated: the selection of conformations with diverse cavity geometries, and the analysis of the myoglobin cavity network evolution during the diffusion of carbon monoxide in it. These two methods have been used in three projects involving virtual screening, targeting M. tuberculosis DNA-gyrase, P vivax subtilisin 1 and GLIC, an procaryotic model of human pentameric ligand-gated ion channel. These methods allowed us to identify an inhibitor of subtilisin 1 and four effectors of GLIC.

La Caspase-2 (CASP-2) est singulière de par ses multiples rôles physiologiques et par son implication dans les processus neurodégénératifs aigus et chroniques. Dans ce contexte, des études récentes ont contribué à sa validation en tant que cible thérapeutique potentielle de la maladie d’Alzheimer. Par conséquent, le développement d’inhibiteurs spécifiques constituerait des outils pharmacologiques qui permettraient de mieux appréhender ses rôles dans la physiologie et pathologie du neurone. Les inhibiteurs de Caspases actuels sont majoritairement des séquences tétra ou pentapeptidiques qui reproduisent les motifs préférentiellement reconnus par ces enzymes. Dans le cadre de ce travail de thèse, trois stratégies d’identification d’inhibiteurs ont été suivies ; (i) une approche de conception rationnelle de peptides ciblant le site actif, (ii) conception in silico de peptides de l’interface de dimérisation, (iii) criblage aléatoire et rationnel de petites molécules organiques. Parmi ces stratégies, l’inhibition du site actif s’est révélée être la plus fructueuse. Nous avons ainsi pu démontrer que des variations du résidu Alanine en P2 sur un motif VDVAD permettaient d’améliorer les paramètres de sélectivité et d’efficacité. Sur ce constat une série de peptides « LJ » avec des mécanismes d’inhibition variés a été développée. Deux composés LJ2 et LJ3, ont démontré d’excellents paramètres d’inactivation et de sélectivité envers la CASP-2. Dans des réseaux de neurones reconstruits in vitro, LJ2 et LJ3 présentent un effet synaptoprotecteur. Ces travaux de thèse ouvrent donc le champ à de nouvelles perspectives sur le plan fonctionnel ainsi que sur le plan thérapeutique. / Caspase-2 (CASP-2) is unique among Caspases since its involved in a plethora of physiological processes and in severe and chronic neurodegenerative processes. In this context, recent studies have indicated that CASP-2 is a potential therapeutic target for Alzheimer’s disease. It is therefore necessary to develop specific inhibitors which would constitute pharmacological tools to better understand the role of this protease in the physiology and pathology of the neuron. The current Caspases inhibitors are mostly tetra or pentapeptide sequences that reproduce the patterns preferentially recognized by these enzymes. During this thesis project, we used three identification strategies ; (i) a rational design approach of peptides targeting the active site, (ii) in silico design of peptides of the dimerization interface, (iii) rational an random screening of small organic molecules. Among these strategies, inhibition of the active site has been shown to be the most productive one. We have been able to demonstrate that the variation of the Alanine residue in P2 on the pattern VDVAD increased efficiency and selectivity parameters. Based on this observation, a serie of peptides “LJ” with various inhibitory mechanisms has been developed. Two compounds LJ2 and LJ3, demonstrated excellent inactivation and selectivity parameters toward CASP-2. In neuronal networks reconstructed in vitro, LJ2 and LJ3 protect against synapse loss. This thesis project opens the field to new perspectives on the functional level as well as on the therapeutic plan.

L'objectif de cette thèse consiste à inhiber la voie de signalisation liée aux protéines Ras, très fréquemment impliquée dans les tumeurs humaines, en concevant des inhibiteurs d'interactions protéine-protéine. Au sein de cette voie, la protéine RasGAP joue un rôle particulier, à la fois régulateur négatif et effecteur de Ras. La cible thérapeutique constituée par le domaine SH3 de la protéine RasGAP avait déjà été identifiée par plusieurs équipes (Tocqué et al., 1997). Plus récemment, notre laboratoire a complété ces travaux par l'identification des protéines Aurora comme partenaires de RasGAP-SH3. En collaboration avec Aptanomics, en mettant en oeuvre la technique des aptamères peptidiques, nous avons apporté une nouvelle validation de cette cible : nous avons obtenu par un crible double-hybride de nouvelles protéines synthétiques (aptamères) interagissant spécifiquement avec le domaine SH3 de RasGAP, et dont l'expression dans des cellules tumorales provoque une diminution de la capacité à former des colonies et de la viabilité cellulaire. Afin d'amorcer une démarche de conception rationnelle d'inhibiteurs de ce SH3, nous avons synthétisé les peptides exposés à la surface de ces aptamères et responsables de leur interaction avec RasGAP-SH3. Nous avons ensuite mesuré l'affinité de ces peptides pour RasGAP-SH3 par anisotropie de fluorescence. Nous avons ainsi obtenu un peptide cyclique dont l'affinité pour le domaine SH3 est de l'ordre de quelques centaines de nanomolaire, et dont nous avons déterminé l'empreinte sur ce domaine enrichi en 15N par RMN, en nous appuyant sur la structure du domaine, déjà résolue au laboratoire (Yang et al., 1994). Les données structurales que nous avons obtenues devraient permettre, dans un court délai, de proposer des modifications de ces peptides, afin d'augmenter l'affinité de nos inhibiteurs et de les vectoriser pour leur conférer une activité sur cellules tumorales en culture. Enfin, ces peptides, rendus fluorescents par leur couplage à un fluorophore, vont être utilisés comme ligands de référence dans un crible de chimiothèque à haut débit, afin de découvrir de petites molécules inhibitrices du domaine SH3 de RasGAP.

Avec plus d’un million et demi de morts chaque année, la tuberculose reste aujourd’hui la seconde cause de mortalité liée à un agent infectieux. De plus l’organisation mondiale de la santé (OMS) a estimé en 2011 qu’un tiers de la population mondiale était porteuse du bacille Mycobacterium tuberculosis responsable de la maladie. Depuis la fin des années 1980, une recrudescence du nombre de cas de tuberculose est observée à l’échelle mondiale. Cette recrudescence est due à la fois à l’apparition de souches résistantes, mais également à l’épidémie de VIH qui est un facteur de prédisposition au déclenchement de la maladie.En 2000, le répresseur transcriptionnel mycobactérien EthR a été identifié comme étant un régulateur clé dans la bioactivation de l’éthionamide (ETH), un antituberculeux utilisé pour le traitement de seconde intention. En 2009, l’inhibition de ce répresseur par le développement de molécules « drug-like » a permis de potentialiser l’activité de l’éthionamide d’un facteur 3 chez la souris infectée et a permis de valider cette cible pour une future approche thérapeutique.Ce travail repose sur la découverte et l’optimisation de nouveaux inhibiteurs de ce répresseur transcriptionnel mycobactérien, à partir d’une petite molécule appelée « fragment » qui a été cocristallisée avec la protéine. Par la combinaison d’un criblage in silico, d’un criblage in vitro des touches identifiées, de l’étude des structures radiocristallographiques des complexes ligands/protéines et de la chimie médicinale, le développement de trois approches complémentaires dites « fragmentgrowing », « fragment-merging » et « fragment-linking » a permis de développer des composés présentant de fortes activités. Ces résultats permettront très prochainement de sélectionner une nouvelle molécule issue de ce travail dans la perspective de nouveaux essais sur le modèle murin. / Tuberculosis (TB) remains the leading cause of death due to a single infective agent with more than 1.5 million people killed each year. In 2011, the world health organization (WHO) estimated that one third of the world’s population is infected with Mycobacterium tuberculosis, the pathogen responsible for the disease. This phenomenon may be due to an explosive escalation of TB incidence that occurred in the 1980s due to the emergence of both resistant strains and HIV epidemic.In 2000, EthR, a mycobacterial transcriptional repressor, was identified as a key modulator of ethionamide (ETH) bioactivation. ETH is one of the main second-line drugs used to treat drug resistant strains. In 2009, it was shown that co-administration of ETH and drug-like inhibitors of EthR was able to boost ETH activity threefold in a mouse-model of TB-infection, thus validating the target for a new therapeutic strategy.This work deals with the discovery and optimisation of new EthR inhibitors, based on a small molecule, called a “fragment”, co-crystallized with the protein. We combined in silico screening, in vitro evaluation of the hit compounds, study of co-crystal structures and medicinal chemistry to develop three complementary approaches called “fragment growing”, “fragment merging” and “fragment linking” that led to the discovery of very potent inhibitors. Based on these results, we are currently selecting a potential candidate for new in vivo experiments.

La fructose-1,6-bisphosphate aldolase de classe I est une enzyme glycolytique (EC 4.1.2.13) qui catalyse le clivage réversible du fructose-1,6-bisphosphate (FBP) en dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P). Des années de recherche sur FBP aldolase ont permis d’identifier les résidus impliqués dans son mécanisme réactionnel, ont tracé en grande partie les coordonnées de la réaction, ont révélé de nouvelles fonctions dites « moonlighting », et ont validé l’aldolase comme une cible attrayante pour des applications anti-glycolytiques tel que le cancer. Il existe néanmoins des questions en suspens relatives à ces activités que nous avons étudiées. Tout d'abord, la trajectoire détaillée de l'aldéhyde relatif à sa liaison au site actif allant jusqu’à la formation du lien carbone-carbone par condensation aldolique est indéfini. Pour élucider les détails moléculaires liés à ces événements, nous avons déterminé des structures cristallographiques à hautes résolution de l’aldolase de classe I chez Toxoplasma gondii, qui porte une identité de séquence élevée avec l’aldolase humaine (57%), en complexe avec l’intermédiaire ternaire de pré-condensation. Le complexe ternaire révèle un mode de liaison non-productive inhabituel pour G3P dans une configuration cis qui permet l’alignement de l'aldéhyde à proximité du nucléophile naissant. La configuration compétente pour la condensation aldolique provient d'une transposition cis-trans de l'aldéhyde qui produit une liaison hydrogène courte permettant la polarisation de l'aldéhyde et le transfert de proton au niveau de Glu-189. Nos résultats informent les chimistes synthétiques qui cherchent à développer l’aldolase comme biocatalyseur pour des réactions stéréo-contrôlées. Le rôle présumé de l’aldolase dans la production du méthyglyoxal (MGO), un métabolite dicarbonyle hautement réactif qui génère des « advanced glycation end products » (AGES) a également été étudié structurellement et enzymatiquement. Une enquête structurelle cristallographique de MGO générée par décomposition enzymatique chez l’aldolase de classe I a révélé que, contrairement aux indications préliminaires, l'apparition hypothétique de MGO et de phosphate inorganique (Pi) résultant de la décomposition enzymatique de DHAP dans le site actif de l’aldolase est mieux interprétée par une population mixte de DHAP et de molécules d'eau. Une étude enzymatique a révélé que la décomposition spontannée des trioses-phosphate est une source majeure de la production de MGO, alors qu’une production catalysée par l’aldolase est peu concluante. L’identification des sources de production de MGO continue d'être une priorité afin de développer des stratégies pour atténuer les manifestations cliniques de pathologies associées au MGO. La FBP aldolase est également reconnu pour ses activités « moonlighting » - du fait qu’elle effectue plus d'une activité sans rapport avec sa fonction glycolytique. Divers partenaires de l’aldolase sont rapportés dans la littérature, y compris les adhésines de surface cellulaire chez les parasites apicomplexes, dans lequel l’aldolase exécute une fonction d'échafaudage entre le complexe actomyosine et les adhésines - une interaction qui est décisive pour la motilité et l'invasion des cellules hôte. Le mode de liaison de cette interaction a été étudié et nos résultats sont compatibles avec une liaison au site actif. Les détails précis de cette interaction ont des implications thérapeutiques, étant donné que le ciblage de celui-ci réduit l'invasion des cellules hôte par les parasites. Enfin, l’aldolase de classe I est de plus en plus reconnu pour son potentiel comme cible anti-glycolytique dans les cellules qui sont fortement tributaires du flux glycolytique, comme les cellules cancéreuses et les parasites protozoaires. Le développement de nouveaux inhibiteurs de haute affinité est donc non seulement avantageux pour des études mécanistiques, mais représente un potentiel pharmacologique sans fin. Nous avons développé une nouvelle classe d’inhibiteurs de haute affinité de type inhibition lente et avons déterminé la base moléculaire de leur inhibition grâce à des structures cristallographiques à haute résolution et par un profilage enzymatique. Cette étude, qui combine plusieurs disciplines, y compris la cristallographie, enzymologie et chimie organique, souligne l'intérêt et l'importance d'une approche multidisciplinaire. / Class I Fructose-1,6-bisphosphate aldolases are glycolytic enzymes (EC 4.1.2.13) that catalyze the reversible cleavage of fructose-1,6-bisphosphate (FBP) to dihydroxyacetone phosphate (DHAP) and glyceraldehyde-3-phosphate (G3P). Years of research on FBP aldolases has identified residues implicated in the reaction mechanism, mapped the greater part of the reaction coordinates, and revealed novel moonlighting functions. Further, FBP aldolase is recognized as an attractive target for anti-glycolytic applications such as cancer. There are nevertheless outstanding questions related to these activities that were investigated in this thesis. First, the detailed trajectory of the reaction mechanism from aldehyde binding in the active site to carbon-carbon bond formation by aldol condensation is undefined. To elucidate the molecular details related to these events, we solved high-resolution crystallographic structures of native class I aldolase from Toxoplasma gondii, which has a high sequence identity with human aldolase (57 %), in complex with the pre-condensation ternary intermediate. The ternary complex reveals a condensation-incompetent binding mode for G3P in a cis-configuration that aligns the aldehyde alongside the nascent nucleophile. The productive aldol-competent configuration arises from a cis-trans rearrangement of the aldehyde that produces a short hydrogen bond required for polarization of the aldehyde and coincident proton transfer at Glu-189. Our results inform synthetic chemists seeking to develop aldolases for stereo-controlled reactions in biosynthetic applications. The suspected role of aldolase in methylglyoxal (MGO) production, a highly reactive dicarbonyl metabolite that produces advanced glycation end-products (AGES) was also probed structurally and enzymatically. A crystallographic structural investigation of MGO generated by enzymatic decomposition in class I aldolase revealed that, contrary to preliminary indications, the appearance of MGO and inorganic phosphate (Pi) resulting from enzymatic decomposition of DHAP in the active site of aldolase is more appropriately modeled by a mixed population of DHAP and water molecules. Enzymatic investigation revealed triose-phosphate decomposition to be a major source of MGO production, whereas production by aldolase did not exceed assay background levels. Identifying the main sources of MGO production continues to be a priority for mitigating the clinical manifestations of MGO-derived pathologies. FBP aldolase is also recognized for its moonlighting properties – performing more than one activity unrelated to the glycolytic function. Diverse aldolase partners are reported, including cell surface adhesins in apicomplexan parasites, in which aldolase performs a bridging function between the actomyosin complex and the cytoplasmic domain of the adhesins – an interaction that is crucial for motility and host-cell invasion. The binding mode of this interaction was investigated and our results are consistent with active site binding. The precise details of aldolase-adhesin binding has therapeutic implications, since targeting of the latter reduces host-cell invasion by parasites. Finally, class I aldolase is gaining prominence as an anti-glycolytic target in cells that are highly dependent on glycolytic flux, such as cancer cells and protozoan parasites. Developing new high-affinity inhibitors for these enzymes is therefore not only advantageous for mechanistic studies, but has endless pharmacological potential. We developed a novel class of high-affinity aldolase inhibitors, bisphosphonates, and determined the molecular basis of their inhibition with high-resolution crystallographic structures and enzymatic profiling. This study, which combined several disciplines, including crystallography, enzymology, and organic chemistry, underscores the interest and significance of a multidisciplinary approach.