Bacteria have exhibited a remarkable capacity to become resistant to commonly used antibacterial compounds obliging the researchers to find new target to kill them. Peptidoglycan, a polymer which is completely specific to the bacterial world and the enzymes, is an ideal target. Peptidoglycan is formed by linear glycan chains composed of alternating N-acetylmuramic acid (MurNAc) and N-acetylglucosamine (GlcNAc) residues cross-linked by short peptides. Among the multitude of enzymes of degradation of the peptidoglycane, the N-acetylmuramyl-L-alanine amidase have the capacity to break the bond between the peptide and the lactyl grouping of MurNAc wearing this peptide. The subject of this work was to study AmiD, a N-acetylmuramyl-L-alanine amidase from E.coli. For that purpose, two carbohydrates 1,6-anhMurNAc with a protective group at the fourth position have been synthesised on gram scale in seven steps. After that, we have realized a structural study at the level of the peptide chain by miming the structure of the peptidoglycane. First, different amide compounds have been prepared. In a second time, we have synthesised carbohydrate compounds with one, two and three amino acids in the peptide chain. Finally, two carbohydrates with a triazole in the peptide chain have been prepared by click chemistry from a synthesised azoture precursor. All compounds have been synthesised with a chromatic group at the end of the peptide chain in order to facilitated the HPLC detection of the residue after hydrolysis by AmiD. Substrates studies, inhibition studies and kinetic studies have been realised with these carbohydrates. This work present also the first results of the synthesis of 1,6-anhydro-4-fluoroMurNAc, a possible inhibitor of bacterial growth. If the peptide chain contains a minimum of dipeptide residue (L-Ala--D-Glu), our results pointed that AmiD is able to cleave the amide bond between the lactyl group of the MurNAc and the -amino group of L-Ala. In the presence of a tripeptide chain (L-Ala--D-Glu-L-Lys) higher hydrolysis rates have been observed. Furthermore, the m-A2pm found in the natural substrate of AmiD can be replaced by L-Lys which facilitates the synthesis of the MurNAc derivatives.

Lors des deux dernières décennies, Enterococcus faecalis a émergé comme une cause majeure d'infections nosocomiales. E. faecalis est une des rares bactéries presque complètement résistante à l'un des composés les plus importants et les plus répandus du système immunitaire inné : le lysozyme. C'est donc l'étude des causes de cette résistance qui nous a intéressé au cours de ce travail de thèse. Nous avons identifié deux gènes nommés EF0783 et EF1843, potentiellement impliqués dans la résistance au lysozyme. Les protéines codées par ces gènes partagent respectivement des homologies avec une O-acétyltransférase du peptidoglycane (OatA) de Staphylococcus aureus et une N-acétylglucosamine déacétylase (PgdA) de Streptococcus pneumoniae. Nous avons construit les mutants correspondants (DEF0783 et DEF1843) et le double mutant DEF0783-DEF1843. Nous avons montré que la mutation de EF0783 entraînait la perte des groupements O-acétyles du peptidoglycane ainsi qu'une diminution de la résistance au lysozyme. Par contre, aucun effet sur la résistance au lysozyme n'a été associé au gène EF1843. De plus, la délétion de EF0783 et/ou de EF1843 affecte significativement la capacité d'E. faecalis à survivre dans des macrophages murins. Bien que EF0783 soit effectivement impliqué dans la résistance au lysozyme, la Oacétylation et la dé-N-acétylation ne sont pas les principaux mécanismes conférant les hauts niveaux de résistance au lysozyme à E. faecalis. Des expériences pour identifier d'autres facteurs expliquant cette résistance au lysozyme sont à envisager.

Streptococcus pneumoniae, pathogène majeur de la sphère oro-pharyngée, résiste fréquemment aux antibiotiques de la famille des ?-lactamines généralement administrés dans les infections associées à ce pathogène. Les cibles de ces antibiotiques sont des enzymes responsables de la biosynthèse du peptidoglycane bactérien, les Penicillin-Binding Proteins (PBP) dont la structure du site actif est modifiée dans le cas de souches résistantes aux antibiotiques. Dans un premier temps, la résolution de la structure à haute résolution par cristallographie des rayons X de PBP1b, une des trois PBP bifonctionnelles du pneumocoque, a mis en évidence un phénomène de réorganisation structurale du site actif de la molécule en fonction de son interaction avec un pseudo-substrat de la réaction. Ce résultat nous a permis de proposer que l'ouverture du site actif joue un rôle clef lors du processus de division cellulaire. Dans un deuxième temps, nous avons résolu les structures de complexes entre PBP1b et de nouvelles molécules inhibitrices, ce qui permet d'ouvrir la voie de la mise au point rationnelle de nouveaux médicaments. Pour finir, nous avons caractérisé le domaine glycosyltransférase de PBP1b ,qui représente une nouvelle cible moléculaire pour le développement de nouveaux antibactériens, notamment par diffusion de rayons X aux petits angles (SAXS). Cette approche originale nous a permis de proposer un modèle d'organisation et de repliement de ce domaine au sein de ces protéines.

Les interactions cellules épithéliales-bactéries peuvent conduire à l'établissement d'une tolérance vis-à-vis des bactéries commensales ou à l’élimination des bactéries pathogènes par le système immunitaire. La détection des bactéries est une étape indispensable à l’orientation de cette réponse. Contrairement aux mammifères, la reconnaissance des bactéries chez la drosophile repose principalement sur la détection d’un composant de la paroi bactérienne, le peptidoglycane (PG), par une famille de récepteurs, les "PeptidoGlycan Recognition Receptors" (PGRPs). Chez la drosophile, le PG des bactéries intestinales extracellulaires peut pénétrer dans les entérocytes et aussi traverser l’épithélium intestinal. Dans l’intestin la détection du PG est régionalisée, elle implique en fonction des domaines deux récepteurs PGRPs distincts (PGRP-LC et PGRP-LE). L'activation de ces PGRPs déclenche une même voie de signalisation NF-kB et conduit à la production de peptides antimicrobiens. La sur-activation de cette voie peut être néfaste pour l'hôte, son intensité est notamment contrôlée par des PGRPs à activité enzymatique qui clivent le PG pour le rendre non immunogène.Au cours de ma thèse, j’ai développé des outils visant à étudier le double mode de détection du PG dans l’intestin. J’ai également testé si les transporteurs de la famille SLC15 étaient impliqués dans le trafic cellulaire du PG. Une partie de ma thèse a aussi été consacrée à préciser le rôle des PGRPs catalytiques dans la réponse immunitaire. / Bacterial interactions with the host epithelium can lead to the establishment of a tolerance regarding commensal bacteria or to the triggering of an immune response to eliminate pathogenic bacteria. The detection of bacteria is an essential step in the orientation of this response. In contrast to mammals, the bacteria recognition in Drosophila is mainly based on the detection of a bacterial wall component, peptidoglycan (PG), by a family of receptors, the PeptidoGlycan Recognition Receptors (PGRP). In Drosophila, the PG of extracellular intestinal bacteria can enter the enterocytes and also cross the intestinal epithelium. In the intestine, the detection of PG is regionalized and involves, depending on the domains, two distinct PGRP receptors (PGRP-LC and PGRP-LE). The activation of these PGRPs leads to the activation of the same NF-kB signaling pathway and triggers the production of antimicrobial peptides. The over-activation of this pathway can be harmful to the host, and therefore its intensity is controlled by PGRP proteins which have an enzymatic activity that degrades the elicitor activity of PG.During my thesis, I have generated tools to study the dual mode of PG detection in the intestine. I also tested whether the carriers of the SLC15 family were involved in PG cell trafficking. Part of my thesis was also devoted to clarify the role of catalytic PGRPs in the immune response.

L'étape finale de biosynthèse du peptidoglycane est catalysée par les D,D-transpeptidases (PBPs), l'une des cibles principales des antibiotiques de type beta-lactame. Récemment, il a été montré qu'une nouvelle classe d'enzymes, les L,D-transpeptidases (LDts), permet de contourner l'inhibition des PBPs. Ces LDts ont été identifiées tant dans des bactéries résistantes aux beta-lactames que dans des formes dormantes de Mycobacterium tuberculosis. Les seuls beta-lactames capables de les inhiber, les carbapénèmes, forment une liaison covalente avec la cystéine catalytique des LDts. Ni le mécanisme de cette inactivation, ni la spécificité de ces enzymes pour les carbapénèmes ne sont toutefois expliqués à ce jour. Le but du présent travail consiste en l'investigation par RMN du mécanisme d'acylation des LDts par ces antibiotiques. Dans ce contexte, la première partie de cette thèse s'intéresse à la compréhension actuelle de l'émergence de ce phénomène de résistance. La seconde partie traite des principes de la RMN et des implémentations développées pour étudier la structure, la thermodynamique et la dynamique des LDts. La troisième et dernière partie démontre le succès de l'approche RMN dans l'étude des diverses étapes de la réaction d'acylation, à travers une étude détaillée de l'apoenzyme, de complexes non covalents avec différents beta-lactames, et de l'enzyme acylée par un carbapénème. Au cours de cette étude, la structure du site actif de l'apoenzyme de Bacillus subtilis a été affinée par rapport à une étude cristallographique antérieure. Pour cette enzyme et son pendant chez Enterococcus faecium, nous avons démontré que la spécificité pour les carbapénèmes n'intervient pas au stade de la formation du complexe non covalent. Pour finir, la formation de la liaison covalente entre LDt et carbapénème induit un réarrangement conformationnel substantiel et une augmentation de la flexibilité de l'enzyme. / The final cross-linking step of the peptidoglycan synthesis is usually catalyzed by D,D-transpeptidases (PBPs), one of the main targets of beta-lactam antibiotics. Recently, it was shown that these PBPs can be by-passed by a novel class of enzymes, the L,D-transpeptidases (LDts), identified in beta-lactam-resistant bacteria as well as in dormant forms of Mycobacterium tuberculosis. The only beta-lactams enable to inactivate these enzymes belong to the carbapenem class. The beta-lactam ring of this antibiotic family then covalently binds the catalytic cysteine of the LDt. Neither the mechanism of this reaction nor the specificity for carbapenems are yet understood. The aim of the present work is to investigate the acylation mechanism of LDts with carbapenems by NMR. In this context, the first part of this thesis focuses on the current biological understanding of the emergence of this resistance pathway. The second part deals with the NMR principles and the implementations developed to study the structure, thermodynamics and dynamics of LDts. The third part demonstrates that NMR is successful in studying all the steps of the acylation reaction. For this purpose, the LDt apoenzyme, the non-covalent complex with various beta-lactams, and the LDt-carbapenem acylenzyme were thoroughly investigated. The structure of the active site of the Bacillus subtilis apoenzyme was refined with respect to a previous crystallographic study. For the latter and the Enterococcus faecium enzymes, we showed that the carbapenem specificity does not occur at the stage of the non-covalent binding. In contrast to non-covalent interactions, the formation of the covalent bond between LDts and carbapenems induces substantial conformational rearrangement and increased flexibility in the enzyme.

Le peptidoglycane (PG) est le composé majeur de la paroi des bactéries à Gram positif. Il est constitué de chaines de sucres, formées de l’alternance de N-acétyl-glucosamine (GlcNAc) et d’acide N-acétyl-muramique (MurNAc) et reliées entre elles par des chaines peptidiques. Cette structure confère à la bactérie une grande résistance mais aussi une certaine flexibilité qui lui permettent de grandir et de se diviser tout en gardant sa forme. Cette dualité entre rigidité et flexibilité est assurée par un équilibre entre l’activité des enzymes qui polymérisent le PG, les protéines liant la pénicilline (PBP), et de celles qui l’hydrolysent, les hydrolases du PG (PGH). Pendant ou après sa synthèse, la structure du PG peut subir différentes modifications, qui vont moduler l’activité des enzymes de synthèse et dégradation du PG. Au cours de ce travail, nous avons caractérisé les modifications structurales du PG chez deux espèces de lactobacilles et étudié leur rôle fonctionnel. Nous avons identifié la première amidotransférase responsable de l’amidation de l’acide méso-diaminopimélique et montré l’influence de cette modification sur l’activité d’une PGH, la L,D-carboxypeptidase DacB, ainsi que sur la synthèse du PG septal par les PBPs chez Lactobacillus plantarum. Nous avons ensuite mis en évidence pour la première fois une O-acétylation des GlcNAc en plus de l’O-acétylation des MurNAc, ces deux modifications étant réalisées par deux O-acétyl-transférases distinctes, OatA et OatB, qui jouent des rôles antagonistes dans le contrôle de l’activité des PGHs chez L. plantarum. Nous avons aussi révélé l’implication de l’O-acétyl-transférase OatA dans le contrôle de la septation. Enfin, nous avons montré l’influence de l’O-acétylation des MurNAc du PG sur les propriétés anti-inflammatoires d’une souche de Lactobacillus casei. / Peptidoglycan (PG) is the major component of the gram positive cell wall. It is composed of glycan chains formed by the polymerization of the N-acetylglucosamine-N-acetyl muramic acid heterodimer, and cross-linked by peptidic stem. This structure confers high resistance to the bacterial cell wall but also some flexibility allowing growth and shape maintenance. This duality between rigidity and flexibility is the result of a steady-state between the PG polymerizing enzymes, the penicillin binding protein (PBP) and the PG hydrolases (PGH). More or less concomitantly with its synthesis, certain modifications can occur on PG structure that will modulate the activity of PG synthesis and degradation enzymes.During this work, we have characterized the PG structural modifications in two lactobacilli species and studied their functional role. We have identified the first amidotransferase involved in meso-diaminopimelic acid amidation and shown the influence of this modification on the activity of the L,D-carboxypeptidase, DacB, and also on the septal PG synthesis by the PBP in Lactobacillus plantarum. Then, we have highlighted for the first time, the presence of O-acetylation on GlcNAc in addition to O-acetylation on MurNAc. These two modifications are catalyzed by two dedicated O-acetyltransferases, OatB and OatA respectively, that control PGH activity in an antagonistic way. We have also demonstrated the implication of the OatA O-acetyltransferase in septation control. Finally, we have shown the influence of PG MurNAc O-acetylation on the anti-inflammatory properties of a Lactobacillus casei strain.

A l’instar des D,D-transpeptidases de la famille des protéines de liaison à la pénicilline (PLP), les L,D-transpeptidases catalysent la formation des ponts interpeptidiques du peptidoglycane. Chez un mutant de Enterococcus faecium, la totalité du peptidoglycane est synthétisée par les L,D-transpeptidases entrainant une résistance à toutes les β-lactamines à l’exception des carbapénèmes. Le peptidoglycane de Mycobacterium tuberculosis étant majoritairement synthétisé par des L,D-transpeptidases, ces enzymes sont une cible potentielle pour le développement de nouveaux traitements de la tuberculose. Les objectifs de cette thèse sont de comprendre la spécificité des L,D­transpeptidases pour les carbapénèmes et d’identifier les sites de fixation des précurseurs du peptidoglycane à ces enzymes. Les résultats montrent que l’oxyanion formé lors de l’attaque du cycle β-lactame des carbapénèmes par la cystéine active est stabilisé dans le site actif des L,D­transpeptidases. Cette stabilisation combinée à l’absence d’hydrolyse de l’acylenzyme conduisent à l’inactivation rapide, totale et irréversible des L,D­transpeptidases par les carbapénèmes. La structure de l’acylenzyme indique que ces propriétés sont indépendantes de la nature de la chaine latérale des antibiotiques qui pourrait être optimisée. La localisation de l’accepteur d’acyle dans la Poche II de Ldtfm ainsi que des interactions supplémentaires avec les chaines glycanes du peptidoglycane montrent que d’autres sites que celui ciblé par les β­lactamines, mimes du donneur d’acyle, sont des cibles pour le développement de nouveaux antibiotiques qui pourraient agir en synergie avec les β­lactamines. / L,D-transpeptidases, as D,D-transpeptidases belonging to the penicillin-binding protein (PBP) family, catalyse the last cross-links step of peptidoglycan biosynthesis. The peptidoglycan of an Enterococcus faecium mutant is exclusively cross-linked by L,D-transpeptidases leading to resistance to all β-lactams except the carbapenems. Since peptidoglycan cross-links are predominantly synthesized by L,D-transpeptidases in Mycobacterium tuberculosis these enzymes are potential targets for chemotherapy of tuberculosis. The aims of the thesis are to identify the kinetic features that account for the specificity of L,D-transpeptidases for carbapenems and to characterise the binding sites for the peptidoglycan precursors in these enzymes. Our results show that the oxyanion resulting from nucleophilic attack of carbapebems by the catalytic cysteine is stabilized into the active site of L,D-transpeptidases. This stabilisation, combined to the absence of hydrolysis of the acylenzyme, leads to the rapid, total and irreversible inactivation of L,D-transpeptidases by carbapenems. Resolution of the acylenzyme structure shows that these kinetic features are independent from the carbapenem side chain that could be modified to optimize the antibiotics. The binding of the acyle acceptor has been identified in Pocket II of Ldtfm that is distinct from the binding site for β-lactams (Pocket I), which mimic the acyle donor. This site and additional peptidoglycan binding sites reveal additional targets for development of new antibiotics that might act in synergy with β-lactams.

L’émergence de bactéries multirésistantes aux antibiotiques est la conséquence de leur utilisation à mauvais escient au cours de ces dernières décennies. Ce phénomène constitue un problème de santé publique majeur, et face à cette urgence sanitaire, il est nécessaire de trouver rapidement de nouveaux agents antibactériens.Les colicines, au regard de leurs propriétés antimicrobiennes intrinsèques, constituent des candidats intéressants. Naturellement produites par E. coli dans le but de tuer des souches compétitrices de la même espèce ou d’espèces apparentées, elles exercent en général leur activité cytotoxique par le biais d’une activité ionophorique ou nucléasique. Parmi les nombreuses colicines connues à ce jour, la colicine M (ColM) est la seule à interférer avec la voie de biosynthèse du peptidoglycane, macromolécule essentielle et spécifique au monde bactérien. En effet, une fois dans le périplasme de E. coli, la ColM clive le lipide II, dernier précurseur de la voie de biosynthèse du peptidoglycane, conduisant de ce fait à la lyse bactérienne. Plusieurs homologues de la ColM ont été identifiés chez d’autres genres bactériens (Pseudomonas, Pectobacterium et Burkholderia) mais aucune cytotoxicité croisée n’a été mise en évidence à ce jour, d’où un spectre d’action restreint pour les membres de cette nouvelle famille d’enzymes antibactériennes.Ce travail traite de l’étude structurale et biochimique de la ColM et de certains de ses homologues. L’étude structurale de différents variants de la PaeM, homologue issu de P. aeruginosa, a permis d’identifier une molécule d’eau conservée au sein du site actif qui joue probablement un rôle central dans le mécanisme catalytique de cette famille d’enzyme. L’expression des homologues de la ColM issus de Pseudomonas et de Pectobacterium, directement dans le périplasme de E. coli, a permis de démontrer leur activité lytique, prouvant ainsi le grand potentiel de ces bactériocines en tant qu’alternatives aux antibiotiques. Enfin, la construction de plusieurs colicines chimères entre la ColM et ses homologues, capables de dégrader le lipide II in vitro et d’induire la lyse d’E. coli suite à leur expression périplasmique, ouvre la voie à de futurs espoirs thérapeutiques. / The misuse of antibiotics during the last decades led to the emergence of multidrug resistant pathogenic bacteria. This phenomenon constitutes a major public health issue. Given that urgency, the finding of new antibacterials in the short term is crucial.Colicins, due to their antimicrobials properties, constitute good candidates. They are protein toxins produced by E. coli to kill competitors belonging to the same or related species. In most cases, they exhibit their cytotoxic activity through an ionophoric or nucleasic activity. Among the twenty colicins known to date, colicin M (ColM) is the only one known to interfere with peptidoglycan biosynthesis. It develops its lethal activity in the E. coli periplasm, in three steps deeply linked to its structural organization in three domains. Once in the periplasm, ColM degrades the lipid II, i.e. the last precursor in the peptidoglycan biosynthesis pathway, in two products that cannot be reused, thereby leading to cell lysis. Several ColM homologues have been identified in other bacterial genera, such as Pseudomonas, Pectobacterium and Burkholderia, but no cross activity has been shown to date, explaining the narrow antibacterial spectrum displayed by the members of this new family of antibacterial enzymes.This work deals with the structural and biochemical study of ColM and some of its homologues. Structural studies on several variants of PaeM, the ColM homologue from P. aeruginosa, led to identify a conserved water molecule in the active site, probably playing a central role in the catalytic mechanism of this enzyme family. Moreover, expression of ColM homologues from Pseudomonas or Pectobacterium species directly in the E. coli periplasm showed that all these homologues were able to induce E. coli cell lysis, thus demonstrating the great potential of these bacteriocins as an alternative to antibiotics. Following these results, several chimera colicins were created between ColM and its homologues, which were shown to degrade lipid II in vitro and to induce E. coli cell lysis after their periplasmic expression, opening the way to future new therapeutic options.

Les enzymes de la famille Mur (MurA-MurG) sont essentielles pour la survie bactérienne, car elles catalysent les étapes cytoplasmiques de la biosynthèse du peptidoglycane, la principale composante de la paroi cellulaire. En outre, les Murs métabolisent des molécules qui sont absentes chez les eucaryotes, et ces enzymes sont structurellement et biochimiquement tractables. Cependant, malgré le fait que nombreux inhibiteurs anti-Mur ont été développés, un nombre tres réduit de ces molécules ont montré une activité antibactérienne prometteuse, ce qui a incité l'hypothèse selon laquelle, dans le cytoplasme bactérien, les enzymes Mur peuvent exister dans un complexe où les sites actifs sont à proximité, bloquant donc l'accès de petites molécules venant de l'extérieur. Cette hypothèse est soutenue par l'observation selon laquelle, dans de nombreux organismes, les gènes codant pour les enzymes Mur sont présents dans un seul opéron, souvent dans le même ordre; en outre, souvent des paires de gènes sont fusionnées pour générer un seul polypeptide, préconisant la possibilité que des complexes entre ces enzymes pourraient être formés dès qu'ils sont synthétisés. Nous avons obtenu les premières informations structurales et fonctionnelles sur la forme fusionnée MurE-MurF, présente dans le pathogène humain Bordetella pertussis, et nous avons montré qu'elle interagit avec la glycosyltransférase périphérique MurG, ce qui suggère la présence d'un complexe enzymatique ternaire. De façon intéressante, nous avons constaté que MurG de B. pertussis est capable de s'associer avec elle-même et de former différentes espèces oligomériques. Cette découverte pourrait renforcer le rôle de MurG en tant que protéine agissant comme une plateform capable d'ancrer d'autres enzymes Mur à la face interne de la membrane cytoplasmique bactérienne. Nos resultats pourront également être explorés pour comprendre le rôle potentiel de MurG en tant que régulateur de l'activité des enzymes de synthèse du PG. Ces résultats passionnants ouvriront le chemin vers la compréhension du mecanisme d’interaction des enzymes Mur dans le cytoplasme bactérien et pourraient permettre l'emploi éventuel des Murs comme cibles de facto pour développer de nouveaux antibiotiques. / Enzymes of the Mur family (MurA-MurG) are essential for bacteria, since they catalyse the cytoplasmic steps of peptidoglycan biosynthesis, the major component of bacterial cell wall; they metabolize molecules that do not exist in eukaryotes, and are structurally and biochemically tractable. However, despite the fact that many anti-Mur inhibitors have been developed, few of these molecules have shown promising antibacterial activity, which has prompted the hypothesis that within the bacterial cytoplasm Mur enzymes may exist in a complex where the active sites are in closed proximity, blocking small molecule access from the outside. This suggestion is supported by the observation that in many organisms, genes encoding Mur enzymes are present in a single operon, often in the same order, and often pairs of genes are fused to generate a single polypeptide, advocating the possibility that complexes between these enzymes could be formed as soon as they are synthesized. We have obtained the first structural and functional information on the MurE-MurF fused form, present in the human pathogen Bordetella pertussis, and shown that it interacts with the peripheral glycosyltransferase MurG, suggesting the presence of a ternary enzymatic complex. Interestingly, we have found that B. pertussis MurG is able to self-associate and form different oligomeric species. This finding could strengthen the hypothesis of MurG as a scaffold protein capable of anchoring other Murs to the inner face of bacterial inner membrane, but could be also further explored to understand its potential role as a regulator of the activity of PG synthesis enzymes. These exciting results will open the path towards the understanding of how Mur enzymes interact within the bacterial cytoplasm, and could permit the eventual employment of Mur enzymes as de facto targets for novel antibiotic development.

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