A maior parte dos insetos possui uma estrutura anatômica em forma de filme (membrana peritrófica, MP) composta de quitina e proteínas (peritrofinas), que separa o alimento do epitélio do intestino médio. A MP protege o epitélio de microorganismos e da abrasão, e possui outras funções baseadas no fato de que a MP promove a compartimentalização de enzimas, que incluem: aumento da eficiência digestiva através da diminuição da taxa de excreção das enzimas e de outros mecanismos postulados que são testados nesta tese. A síntese das peritrofinas é mais conhecida do que a da quitina componente da MP, tornando desejável um esforço no detalhamento dessa última. Foram realizadas a caracterização e expressão de genes de S. frugiperda que codificam uma peritrofina e enzimas responsáveis pela síntese e degradação de quitina (quitina sintases 1 (SfCHS1) e 2 (SfCHS2), e quitinase (SfCHI), respectivamente). As sequências dos cDNAs correspondentes foram determinadas através da amplificação de fragmentos de PCR que se sobrepõem. Os padrões de expressão dos genes envolvidos no metabolismo da quitina da MP foram analisados durante o desenvolvimento do inseto por RT-PCR. SfCHS2 é expresso no intestino médio durante os estágios de alimentação da larva, enquanto que SfCHI é expresso durante as fases de pós-alimentação, pré-pupa, e pupa. Ambos os genes são predominantemente expressos na região anterior no intestino médio com um gradiente decrescente de expressão ao longo do tubo digestivo. A citolocalização da quitina revelou que o polissacarídeo está presente somente quando SfCHS2 é expresso e não há quitina no intestino médio quando SfCHI é expresso. Esses resultados levaram a formulação da hipótese de que SfCHS2 é responsável pela síntese da quitina da MP durante o estágio larval e SfCHI degrada a quitina da MP durante a muda larva-pupa, sugerindo padrões inversos de expressão desses genes. Em Spodoptera frugiperda, Tenebrio molitor e Musca domestica é possível prever o sítio de secreção das enzimas digestivas (ventrículo anterior, médio ou posterior) a partir da distribuição antero-posterior das enzimas no espaço endoperitrófico. Também foi possível mostrar, usando vários modelos experimentais, que a separação de compartimentos luminais pela MP: a) impede a inibição de despolimerazes por remover oligômeros do espaço endoperitrófico; b) evita a inibição de oligômero hidrolases restringindo-as ao espaço ectoperitrófico e impedindo que entrem em contato com o alimento e c) anula a inibição de enzimas envolvidas na digestão terminal presentes na superfície do epitélio, impedindo que o alimento entre em contato com elas. / Most insects have a film-like anatomical structure (peritrophic membrane, PM) composed of chitin and proteins (peritrophins), which separates food from midgut tissue. It protects the epithelium against food abrasion and microrganisms and has other functions based on compartmentalization of enzymes, which include: increasing digestive efficiency by decreasing enzyme excretion and by other mechanisms that were tested in this thesis. The peritrophin synthesis is less known than PM chitin synthesis, which needs to be better understood. The characterization and expression of S. frugiperda genes encoding a peritrophin and enzymes responsible for the synthesis and degradation of chitin, chitin synthases 1(SfCHS1) and 2 (SfCHS2), and chitinase (SfCHI), respectively, were analysed. Sequences of corresponding cDNAs were determined by amplification of overlapping PCR fragments and the expression patterns of chitin metabolism genes were analyzed during insect development by RT-PCR. SfCHS2 is expressed in the midgut during the feeding stages, whereas SfCHI is expressed during the wandering and pupal stages. Both genes are predominantly expressed in the anterior portion of the midgut with a decreasing gradient of transcript levels in the medial and posterior portions. Chitin staining revealed that the polysaccharide is present in the PM only when SfCHS2 is expressed. There is little or no chitin in the midgut when SfCHI is expressed. These results support the hypothesis that SfCHS2 is responsible for PM chitin synthesis during the larval stage and SfCHI for PM chitin degradation during larval-pupal molting, suggesting inverse patterns of expression of these genes. The secretion site (anterior, middle or posterior midgut) of digestive enzymes can be predicted in Spodoptera frugiperda, Tenebrio molitor and Musca domestica based on enzyme activity distribution along the endoperitrophic space. We also have shown, using several experimental models, that the luminal compartment separation by PM: a) avoid the polimer hidrolases inhibition by removing oligomer from endoperitrophic space; b) decrease the oligomer hidrolases inhibition by restricting them to the ectoperitrophic space (by avoiding their contact with food); and c) block the inhibition of enzymes located at the cell surface involved in terminal digestion by avoiding their contact with food.

Os insetos possuem uma película que reveste o intestino médio (membrana peritrófica, MP), que é composta por quitina e proteínas (peritrofinas). Além de possuir as funções de proteção contra abrasão causada pela comida e contra microrganismos, a MP possui algumas funções específicas que dependem do fato de que essa estrutura compartimentaliza o lúmen do intestino médio em duas regiões denominadas espaço endoperitrófico e espaço ectoperitrófico. As funções específicas da MP são baseadas em evidências indiretas e incluem o impedimento da ligação não específica de comida na superfície celular, o decréscimo na excreção das enzimas digestivas através da sua reciclagem e, em insetos mais evoluídos, o impedimento de oligômero- e dímero-hidrolases de penetrarem no espaço endoperitrófico. As proteínas da membrana microvilar intestinal e uma peritrofina (proteína da membrana peritrófica) de Spodoptera frugiperda foram isoladas e utilizadas para a produção de anticorpos em coelho. Esses anticorpos, juntamente com um anticorpo anti-amilase de Tenebrio molitor (que reconhece as amilases de S. frugiperda), foram utilizados em estudos de imunocitolocalização realizados com a ajuda de anticorpos secundários acoplados a uma proteína fluorescente ou a partículas de ouro coloidal. Os resultados mostraram que a peritrofina de S. frugiperda é secretada pelas células colunares da região anterior do intestino médio através de vesículas que se destacam das microvilosidades (secreção microapócrina). As vesículas com dupla membrana (uma da própria vesícula e a outra da microvilosidade) tornam-se vesículas com membrana simples através da fusão entre membranas e, nesse processo, a peritrofina e parte da amilase e tripsina são liberadas. As membranas remanescentes das vesículas, ainda contendo proteínas microvilares, amilase e tripsina ligadas, são incorporadas a um material com consistência de gel que forma parte da MP. Larvas alimentadas com calcoflúor tiveram a sua MP desestruturada e, em razão disso, perderam o gradiente decrescente antero-posterior de tripsina e quimotripsina observado ao longo do intestino médio das larvas controle. Esse gradiente é presumivelmente formado por um contrafluxo de fluidos (no espaço entre a MP e o epitélio) que permite a reciclagem de enzimas. / Insects have a film-like anatomical structure (peritrophic membrane, PM) which lines the midgut. It is composed of chitin and proteins (peritrophins). Besides the functions of protection against food abrasion and microrganisms, PM has specific functions that depend on the fact that this structure compartimentalizes the midgut lumen into an endoperitrophic and an ectoperitrophic space. Knowledge on these specific functions are based only in indirect evidence and include: prevention of non-specific food binding onto cell surface; prevention of enzyme excretion by allowing enzyme recycling and restriction of oligomer hydrolases to ectoperitrophic space. A peritrophin from Spodoptera frugiperda PM, as well as microvillar proteins from S. frugiperda anterior midgut, were isolated and used to raise antibodies in a rabbit. These antibodies, a Tenebrio molitor anti-amylase antibody that cross-reacts with S. frugiperda amylases, and wheat-germ aglutinin were used in immunolocalization experiments performed with the aid of confocal fluorescence and immunogold techniques. The results showed that the peritrophin is secreted by anterior midgut columnar cells in vesicles that pinched-off the microvilli (microapocrine secretion). The resulting double membrane vesicles become single membrane vesicles by membrane fusion, releasing peritrophin and part of the amylase and trypsin. The remaining vesicle membranes (still containing microvillar proteins and membrane-bound amylase and trypsin) are incorpored into a jelly-like material associated with PM. Calcofluor-treated larvae lacking a PM were shown to lose the trypsin and chymotrypsin decreasing gradient observed along the midgut of control larvae. This gradient is thought to be formed by a countercurrent flux of fluid (in the space between PM and midgut cells) that powers enzyme recycling.

A maior parte dos insetos possui uma estrutura anatômica em forma de filme (membrana peritrófica, MP) composta de quitina e proteínas (peritrofinas), que separa o alimento do epitélio do intestino médio. A MP protege o epitélio de microorganismos e da abrasão, e possui outras funções baseadas no fato de que a MP promove a compartimentalização de enzimas, que incluem: aumento da eficiência digestiva através da diminuição da taxa de excreção das enzimas e de outros mecanismos postulados que são testados nesta tese. A síntese das peritrofinas é mais conhecida do que a da quitina componente da MP, tornando desejável um esforço no detalhamento dessa última. Foram realizadas a caracterização e expressão de genes de S. frugiperda que codificam uma peritrofina e enzimas responsáveis pela síntese e degradação de quitina (quitina sintases 1 (SfCHS1) e 2 (SfCHS2), e quitinase (SfCHI), respectivamente). As sequências dos cDNAs correspondentes foram determinadas através da amplificação de fragmentos de PCR que se sobrepõem. Os padrões de expressão dos genes envolvidos no metabolismo da quitina da MP foram analisados durante o desenvolvimento do inseto por RT-PCR. SfCHS2 é expresso no intestino médio durante os estágios de alimentação da larva, enquanto que SfCHI é expresso durante as fases de pós-alimentação, pré-pupa, e pupa. Ambos os genes são predominantemente expressos na região anterior no intestino médio com um gradiente decrescente de expressão ao longo do tubo digestivo. A citolocalização da quitina revelou que o polissacarídeo está presente somente quando SfCHS2 é expresso e não há quitina no intestino médio quando SfCHI é expresso. Esses resultados levaram a formulação da hipótese de que SfCHS2 é responsável pela síntese da quitina da MP durante o estágio larval e SfCHI degrada a quitina da MP durante a muda larva-pupa, sugerindo padrões inversos de expressão desses genes. Em Spodoptera frugiperda, Tenebrio molitor e Musca domestica é possível prever o sítio de secreção das enzimas digestivas (ventrículo anterior, médio ou posterior) a partir da distribuição antero-posterior das enzimas no espaço endoperitrófico. Também foi possível mostrar, usando vários modelos experimentais, que a separação de compartimentos luminais pela MP: a) impede a inibição de despolimerazes por remover oligômeros do espaço endoperitrófico; b) evita a inibição de oligômero hidrolases restringindo-as ao espaço ectoperitrófico e impedindo que entrem em contato com o alimento e c) anula a inibição de enzimas envolvidas na digestão terminal presentes na superfície do epitélio, impedindo que o alimento entre em contato com elas. / Most insects have a film-like anatomical structure (peritrophic membrane, PM) composed of chitin and proteins (peritrophins), which separates food from midgut tissue. It protects the epithelium against food abrasion and microrganisms and has other functions based on compartmentalization of enzymes, which include: increasing digestive efficiency by decreasing enzyme excretion and by other mechanisms that were tested in this thesis. The peritrophin synthesis is less known than PM chitin synthesis, which needs to be better understood. The characterization and expression of S. frugiperda genes encoding a peritrophin and enzymes responsible for the synthesis and degradation of chitin, chitin synthases 1(SfCHS1) and 2 (SfCHS2), and chitinase (SfCHI), respectively, were analysed. Sequences of corresponding cDNAs were determined by amplification of overlapping PCR fragments and the expression patterns of chitin metabolism genes were analyzed during insect development by RT-PCR. SfCHS2 is expressed in the midgut during the feeding stages, whereas SfCHI is expressed during the wandering and pupal stages. Both genes are predominantly expressed in the anterior portion of the midgut with a decreasing gradient of transcript levels in the medial and posterior portions. Chitin staining revealed that the polysaccharide is present in the PM only when SfCHS2 is expressed. There is little or no chitin in the midgut when SfCHI is expressed. These results support the hypothesis that SfCHS2 is responsible for PM chitin synthesis during the larval stage and SfCHI for PM chitin degradation during larval-pupal molting, suggesting inverse patterns of expression of these genes. The secretion site (anterior, middle or posterior midgut) of digestive enzymes can be predicted in Spodoptera frugiperda, Tenebrio molitor and Musca domestica based on enzyme activity distribution along the endoperitrophic space. We also have shown, using several experimental models, that the luminal compartment separation by PM: a) avoid the polimer hidrolases inhibition by removing oligomer from endoperitrophic space; b) decrease the oligomer hidrolases inhibition by restricting them to the ectoperitrophic space (by avoiding their contact with food); and c) block the inhibition of enzymes located at the cell surface involved in terminal digestion by avoiding their contact with food.

Os insetos possuem uma película que reveste o intestino médio (membrana peritrófica, MP), que é composta por quitina e proteínas (peritrofinas). Além de possuir as funções de proteção contra abrasão causada pela comida e contra microrganismos, a MP possui algumas funções específicas que dependem do fato de que essa estrutura compartimentaliza o lúmen do intestino médio em duas regiões denominadas espaço endoperitrófico e espaço ectoperitrófico. As funções específicas da MP são baseadas em evidências indiretas e incluem o impedimento da ligação não específica de comida na superfície celular, o decréscimo na excreção das enzimas digestivas através da sua reciclagem e, em insetos mais evoluídos, o impedimento de oligômero- e dímero-hidrolases de penetrarem no espaço endoperitrófico. As proteínas da membrana microvilar intestinal e uma peritrofina (proteína da membrana peritrófica) de Spodoptera frugiperda foram isoladas e utilizadas para a produção de anticorpos em coelho. Esses anticorpos, juntamente com um anticorpo anti-amilase de Tenebrio molitor (que reconhece as amilases de S. frugiperda), foram utilizados em estudos de imunocitolocalização realizados com a ajuda de anticorpos secundários acoplados a uma proteína fluorescente ou a partículas de ouro coloidal. Os resultados mostraram que a peritrofina de S. frugiperda é secretada pelas células colunares da região anterior do intestino médio através de vesículas que se destacam das microvilosidades (secreção microapócrina). As vesículas com dupla membrana (uma da própria vesícula e a outra da microvilosidade) tornam-se vesículas com membrana simples através da fusão entre membranas e, nesse processo, a peritrofina e parte da amilase e tripsina são liberadas. As membranas remanescentes das vesículas, ainda contendo proteínas microvilares, amilase e tripsina ligadas, são incorporadas a um material com consistência de gel que forma parte da MP. Larvas alimentadas com calcoflúor tiveram a sua MP desestruturada e, em razão disso, perderam o gradiente decrescente antero-posterior de tripsina e quimotripsina observado ao longo do intestino médio das larvas controle. Esse gradiente é presumivelmente formado por um contrafluxo de fluidos (no espaço entre a MP e o epitélio) que permite a reciclagem de enzimas. / Insects have a film-like anatomical structure (peritrophic membrane, PM) which lines the midgut. It is composed of chitin and proteins (peritrophins). Besides the functions of protection against food abrasion and microrganisms, PM has specific functions that depend on the fact that this structure compartimentalizes the midgut lumen into an endoperitrophic and an ectoperitrophic space. Knowledge on these specific functions are based only in indirect evidence and include: prevention of non-specific food binding onto cell surface; prevention of enzyme excretion by allowing enzyme recycling and restriction of oligomer hydrolases to ectoperitrophic space. A peritrophin from Spodoptera frugiperda PM, as well as microvillar proteins from S. frugiperda anterior midgut, were isolated and used to raise antibodies in a rabbit. These antibodies, a Tenebrio molitor anti-amylase antibody that cross-reacts with S. frugiperda amylases, and wheat-germ aglutinin were used in immunolocalization experiments performed with the aid of confocal fluorescence and immunogold techniques. The results showed that the peritrophin is secreted by anterior midgut columnar cells in vesicles that pinched-off the microvilli (microapocrine secretion). The resulting double membrane vesicles become single membrane vesicles by membrane fusion, releasing peritrophin and part of the amylase and trypsin. The remaining vesicle membranes (still containing microvillar proteins and membrane-bound amylase and trypsin) are incorpored into a jelly-like material associated with PM. Calcofluor-treated larvae lacking a PM were shown to lose the trypsin and chymotrypsin decreasing gradient observed along the midgut of control larvae. This gradient is thought to be formed by a countercurrent flux of fluid (in the space between PM and midgut cells) that powers enzyme recycling.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TicianaMLA.pdf: 543419 bytes, checksum: 8d1c551389143e2634c1d0451175ecef (MD5) Previous issue date: 2007-09-28 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Plodia interpunctella (Indian meal moth) is a cosmopolitan pest that attacks not only a wide range of stored grain as well other food products. Due to its economic importance several researches have focused in a method with ability to control this pest with few or no damage to the environment. The study of digestive enzymes inhibitors, lectins and chitin-binding proteins, has often been proposed as an alternative to reduce insect damage. In this study we report the major classes of digestive enzymes during larval growth in P. Interpunctella, being those proteinases actives at pH 9.5 and optimum temperature of 50 oC to both larvae of the 3rd instar and pre-pupal stage of development. In vitro and zymogram assays presented the effects of several inhibitors, such as SBTI, TLCK and PMSF to intestinal homogenate of 3rd instar larvae of 62%, 92% and 87% of inhibition and In pre-pupal stage of 87%, 62 % and 55% of inhibition, respectively. Zymograms showed inhibition of two low molecular masses protein bands by TLCK and that in presence of SBTI were retarded. These results are indicative of predominance of digestive serine proteinases in gut homogenate from Plodia interpunctella larvae. This serine proteinase was then used as a target to evaluate the effect of SBTI on larvae in in vivo assay. Effect of SBTI on mortality and larval mass was not observed at until 4% of concentration (w/w) in diets. Chitin, another target to insecticidal proteins, was observed by chemical method. Moreover, optic microscopy confirmed the presence of a peritrophic membrane. Established this target, in vivo effect of EvV, a chitin binding vicilin, evaluated during the larval development of P. interpunctella and was obtained a LD50 of 0,23% and WD50 of 0,27% to this protein. Mechanism of action was proposed through of the in vivo digestibility of EvV methodology. During the passage through the larval digestive tract was observed that EvV was susceptible to digestive enzymes and a reactive fragment, visualized by Western blotting, produced by digestion was recovered after dissociation of the peritrophic membrane. The bound of EvV to peritrophic membrane was confirmed by immunohystochemical assays that showed strong immunofluorescent signal of EvV-FITC binding and peritrophic membrane. These results are a indicative that vicilins could be utilized as potential insecticide to Plodia interpunctella and a control methods using EvV as bioinsecticide should be studied to reduce lost caused by storage insect pests / Plodia interpunctella (tra?a-indiana-da-farinha) ? uma praga cosmopolita que ataca n?o somente uma ampla gama de produtos armazenados, mas tamb?m outros produtos aliment?cios. Devido a sua import?ncia econ?mica v?rias pesquisas t?m sido realizadas com o intuito de identificar um m?todo capaz de controlar esta praga sem danos ao ambiente. O estudo de inibidores de enzimas digestivas, lectinas e prote?nas que se ligam ? quitina tem sido proposto como uma alternativa para controlar o dano causado por estes insetos. Neste estudo alvos espec?ficos para inibidores de enzimas e prote?nas ligantes ? quitina foram identificados nas larvas desta praga. Para isso, durante o desenvolvimento de larvas de P. interpunctella as classes de enzimas digestivas alvos foram identificadas por ensaios de atividade in vitro e SDS-PAGE, pH e temperatura ?timos avaliados para a indica??o de poss?veis prote?nas inibidoras para a principal classe de proteinase detectadas no intestino das larvas. Outro alvo para prote?nas delet?rias foi indicado pela identifica??o da membrana peritr?fica por ensaios qu?micos de detec??o de quitina e por microscopia de luz. Durante o per?odo de desenvolvimento as larvas de P. interpunctella, alimentadas com uma dieta baseada em baga?o de cana, passaram por 5 ?nstares e pelo est?gio pr?-pupal. A maior atividade proteol?tica (UA/intestino) foi detectada no est?gio pr?-pupal, enquanto que a maior atividade proteol?tica espec?fica (UA/mg prote?na) foi observada no terceiro ?nstar, utilizando azocase?na como substrato a pH 9,5 e a 50?C. A inibi??o das proteinases presentes no homogenato intestinal de larvas de terceiro ?nstar foi mais evidente quando inibidores de proteinases ser?nicas (SBTI, TLCK e PMSF, com 96%, 89% e 20% de inibi??o, respectivamente) foram utilizados nos ensaios. No est?gio pr?-pupal, a maior inibi??o observada foi com SBTI (96%), TLCK (81 %) e TPCK (20%), indicando a predomin?ncia de atividade enzim?tica de proteinases ser?nicas a pH 9,5 no intestino de Plodia interpunctella. Por zimograma foi observada inibi??o de bandas de menor massa molecular por TLCK e um atraso na corrida eletrofor?tica dessas bandas causado por SBTI. Quando avaliado o efeito in vivo de SBTI no desenvolvimento larval, n?o foi observada mortalidade e nem efeito na massa das larvas sobreviventes. Estabelecido o segundo alvo de atua??o, baseado na liga??o ? quitina, bioensaios usando a vicilina EvV foram realizados, onde um LD50 de 0,23% e um WD50 de 0,27% foram estabelecidos para esta prote?na delet?ria. O mecanismo de a??o foi verificado por ensaios de digestibilidade de EvV durante a passagem pelo trato intestinal larval, sendo observado o envolvimento de um fragmento reativo, observado por imunodetec??o, no efeito delet?rio da vicilina. A liga??o de EvV ? membrana peritr?fica foi comprovada atrav?s de ensaios de imunohistoqu?mica. Estes resultados apontam para uma vicilina ligante ? quitina que pode vir a ser utilizada como bioinseticida para Plodia interpunctella

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O lÃtex vegetal à produzido e estocado em sistemas de canais formados por cÃlulas altamente especializadas, os laticÃferos. Uma caracterÃstica marcante destes fluidos à a presenÃa de sistemas proteolÃticos complexos. Muitos estudos relatam que proteÃnas de defesa contra insetos e fungos sÃo encontradas em lÃtex. No entanto, alguns insetos sobrepÃem esta defesa e alimentam-se de plantas laticÃferas, como Pseudosphinx tetrio e Danaus plexippus, ambas da ordem Lepidoptera. As bases bioquÃmicas da resistÃncia de insetos Ãs proteÃnas defensivas do lÃtex ainda nÃo sÃo amplamente elucidadas. Esta problemÃtica foi abordada neste trabalho. Inicialmente a atividade proteolÃtica do extrato intestinal de P. tetrio foi caracterizada e avaliada sua capacidade de degradar as proteÃnas do lÃtex de sua planta hospedeira, Plumeria rubra, bem como de plantas laticÃferas nÃo hospedeiras (Calotropis procera e Cryptostegia grandiflora). AlÃm disso, foi avaliado se inibidores de proteases de fluidos laticÃferos (C. procera, P. rubra e Cr. grandiflora) inibem as proteases intestinais de P. tetrio e D. plexippus e vice-versa. Em adiÃÃo, foi analisado o efeito de enzimas laticÃferas sobre a membrana peritrÃfica (MP) de D. plexippus. As proteases intestinais de P. tetrio sÃo predominantemente do tipo serÃnica e suas atividades sÃo maiores em pHs bÃsicos. O extrato intestinal de P. tetrio rapidamente e completamente digeriu as proteÃnas do lÃtex de sua planta hospedeira e de C. procera, bem como digeriu parcialmente as proteÃnas do lÃtex de Cr. grandiflora. Larvas de D. plexippus se desenvolveram plenamente quando alimentadas com dieta artificial contendo 1% das fraÃÃes proteicas dos lÃtex de plantas nÃo hospedeiras. Ensaios in vitro indicaram que ambos, extratos intestinais e lÃtex das espÃcies em estudo, possuem inibidores de proteases serÃnicas e cisteÃnicas. Inibidores provenientes dos fluidos laticÃferos em estudo inibiram a atividade proteolÃtica dos extratos intestinais de ambas as larvas. Entretanto, anÃlise in vivo demonstrou que estes inibidores nÃo afetam o desenvolvimento de D. plexippus. Somente o extrato intestinal de D. plexippus apresentou atividade inibidora de proteases do lÃtex de sua planta hospedeira (Calotropis procera). Apenas discretas mudanÃas foram observadas no perfil proteico das MPs de D. plexippus submetidas Ãs fraÃÃes proteicas dos fluidos laticÃferos in vivo, enquanto que o tratamento in vitro resultou em danos mais acentuados. A partir dos resultados obtidos conclui-se que proteÃlise e a inibiÃÃo de proteÃlise fazem parte do sistema defensivo das larvas especialistas em plantas laticÃferas e de suas plantas hospedeiras. Embora inibidores de proteases de fluidos laticÃferos sejam capazes de inibir as proteases intestinais das larvas (in vitro), in vivo, a habilidade das proteases intestinais em prontamente digerir as proteÃnas do lÃtex parece ser crucial para a sobreposiÃÃo da defesa vegetal. / Plant latex is produced and stored in channels formed by highly specialized cells structures. A remarkable feature of these fluids is the presence of complex proteolytic systems. Many studies report that latex possesses a variety of defense proteins against insects and fungi. However, some insects overlap this defense and feed on latex-producing plants, for example Pseudosphinx tetrio and Danaus plexippus, both of the order Lepidoptera. The biochemical aspects of insect resistance to latex defense proteins are still not widely elucidated. This issue was addressed in this work. Initially, the proteolytic activity of Pseudosphinx tetrio gut was characterized and evaluated in its ability to degrade latex proteins of its host plant (Plumeria rubra) and non-host plants (Calotropis procera e Cryptostegia grandiflora). Furthermore, we assessed whether protease inhibitors from latex fluids (C. procera, P. rubra and Cr. grandiflora) inhibit intestinal proteases from P. tetrio and D. plexippus and vice versa. The effect of latex enzymes on peritrophic membrane (PM) of D. plexippus was also assessed. Intestinal proteases from P. tetrio are predominantly of serine type and their activities are higher in basic pHs. P. tetrio gut proteases rapidly and completely digested latex proteins of its host plant and C. procera and partially digested proteins from Cr. grandiflora. D. plexippus larvae were not affected when fed on artificial diet containing latex proteins (1%) from non-host plants. In vitro assays detected serine and cysteine peptidase inhibitors in both gut homogenates and latex fluids. Protease inhibitors from latex inhibited the proteolytic activity of gut homogenates of both larvae. Nevertheless, in vivo analysis demonstrated that latex inhibitors do not affect the development of D. plexippus. Only the gut homogenate from D. plexippus showed inhibitory activity towards proteases latex from its host plant (Calotropis procera). Slight changes were observed in the protein profile of the PMs from D. plexippus subjected to latex protein fractions in vivo, whilst in vitro treatment resulted in more severe damage. This study concludes that proteolysis and inhibition of proteolysis are involved in the defensive systems of both caterpillars and their host plants. Even though latex peptidase inhibitors inhibit gut peptidases (in vitro), the ability of gut peptidases to promptly digest latex proteins (in vivo) regardless of their origin seems to be a pivotal event favoring caterpillars overcoming plant defense.