Thesis (Masters Diploma (Medical Technology)--Cape Technikon, Cape Town, 1995 / The objective of the present study vvas primarily to determine vvhether modifications to the existing osmium tetroxide/potassium ferrocyanide method could be used as a general ultrastructural glycogen stain and whether this glycogen, vvhen so contrasted, differed in appearance in different tumours, such as Evving's sarcoma, Leiomyosarcoma, Rhabdomyosarcoma and Hepatocellular carcinoma. Normal skeletal muscle and liver were used to obtain a standard for the appearance of glycogen, and then, with diagnostic criteria in mind, the four glycogen-rich tumours, mentioned above vvere examined to determine the appearance, distribution and amount of glycogen present in them. Modifications to the osmium tetroxide/potassium ferrocyanide (OPF) method consisted of raising the concentration of the ferrocyanide, and using no en bloc or thin section staining by any uranyl salt solutions, because solutions of uranyl salts leaches glycogen from tissue. This procedure resulted in extremely electron-dense intracellular glycogen being retained, vvhich aided diagnosis of the these tumours. At high magnification. (>X30000) there vvas no morphological difference betvveen the glycogen particles in the various tumours, so these particles as such could not be used as a diagnostic criterion. Existing methods for the demonstration of myeloperoxidase and platelet peroxidase vvere modified to obtain more precise localization of the diaminobenzidine (DAB) reaction product. Different anti-coagulants, one of which was heparin and a modified fixation procedure vvas follovved.

Neste trabalho é apresentado um estudo da imobilização da enzima horseradish peroxidase (HRPO) em matriz polimérica através de dois métodos diferentes. O primeiro consiste em um método de uma etapa, no qual a HRPO é imobilizada por eletropolimerização de pirrol em meio aquoso com eletrodo de platina – técnica esta denominada entrapment – visando a confecção de biossensores enzimáticos para a detecção amperométrica de peróxido de hidrogênio (H2O2). A matriz polimérica com a enzima imobilizada foi analisada por reação colorimétrica, confirmando as afirmações de alguns autores sobre a baixa quantidade de enzima imobilizada, e FTIR mostrando espectros bastante semelhantes entre os filmes de polipirrol (PPy) puro e de PPY + HRPO. Foram realizados estudos do efeito das concentrações de monômero, enzima e eletrólito, assim como dos parâmetros eletroquímicos para a otimização da preparação do biossensor. Os valores dos parâmetros otimizados serviram de referência para o estudo do segundo método de imobilização, no qual é utilizado um anticorpo específico para a enzima HRPO, o V3.5R3, imobilizado via entrapment com a HRPO inoculada ao sistema através da imersão do substrato formado (PPy-V3.5R3) em uma solução de HRPO. Os dois métodos de confecção dos biossensores para a determinação quantitativa de H2O2 são comparados: em relação ao parâmetro comportamento linear, verificou-se uma faixa de concentração de 0 a 15 mmol/L de H2O2 para o método via entrapment, enquanto que através do método com inoculação foi verificado um comportamento linear de 2 a 8 mmol/L de H2O2. Em relação à resposta do biossensor, tem-se para a concentração de 8 mmol/L de H2O2, uma corrente de aproximadamente 600 nA utilizando biossensores preparados pelo método de entrapment e 300 nA pelo método com inoculação. Apesar do baixo desempenho da imobilização do anticorpo V3.5R3 para a detecção de H2O2, o sucesso na imobilização de diferentes biocomponentes e o desenvolvimento de mecanismos como a inoculação amplia o espectro de possibilidades para o estudo de biossensores. / In this work is presented a study of the immobilization of the enzyme horseradish peroxidase (HRPO) in polymeric matrix by two different methods. The first one consist in a one-step method, in which the HRPO is immobilized by electropolymerization of pyrrole in aqueous solution onto platin electrode – techniques denominated entrapment – aiming the confection of enzymatic biosensors for the amperometric detection of hydrogen peroxide (H2O2). The polymeric matrix with the immobilized enzyme (substrate PPy-HRPO) was analyzed by colorimetric reaction, confirming the affirmations of some authors about the low quantities of enzymatic immobilization, and FTIR, what shows very similar specters for the polypyrrole (PPy) film and the PPy + HRPO. Studies of the concentrations of monomer, enzyme and electrolyte, as well as of the electrochemical parameters, have been carried through for the optimization of the biossensor. The values of the optimized parameters were used as reference for the study of the second immobilization method, in which is used a specific antibody for enzyme HRPO, the V3.5R3, immobilized via entrapment. The HRPO is, then, inoculated to the system by immersion of the PPy-V3.5R3 substrate in HRPO solution. The results of the biossensores confectioned by the two methods are compared: about the linear behavior it was verified a range of concentration form 0 to 15 mmol/L of H2O2, while through the second method was verified a linear range of 2 to 8 mmol/L of H2O2. About the signal response, for the same concentration of 8 mmol/L of H2O2, an electric current of 600 nA was reached, against 300 nA with the biosensors constructed by the second method. Although the low performance of the immobilization of the antibody V3.5R3 for the H2O2 detection, the success in different biocomponents immobilization and the development of mechanisms as the inoculation increases the possibilities specter for biosensors research.

Neste trabalho é apresentado um estudo da imobilização da enzima horseradish peroxidase (HRPO) em matriz polimérica através de dois métodos diferentes. O primeiro consiste em um método de uma etapa, no qual a HRPO é imobilizada por eletropolimerização de pirrol em meio aquoso com eletrodo de platina – técnica esta denominada entrapment – visando a confecção de biossensores enzimáticos para a detecção amperométrica de peróxido de hidrogênio (H2O2). A matriz polimérica com a enzima imobilizada foi analisada por reação colorimétrica, confirmando as afirmações de alguns autores sobre a baixa quantidade de enzima imobilizada, e FTIR mostrando espectros bastante semelhantes entre os filmes de polipirrol (PPy) puro e de PPY + HRPO. Foram realizados estudos do efeito das concentrações de monômero, enzima e eletrólito, assim como dos parâmetros eletroquímicos para a otimização da preparação do biossensor. Os valores dos parâmetros otimizados serviram de referência para o estudo do segundo método de imobilização, no qual é utilizado um anticorpo específico para a enzima HRPO, o V3.5R3, imobilizado via entrapment com a HRPO inoculada ao sistema através da imersão do substrato formado (PPy-V3.5R3) em uma solução de HRPO. Os dois métodos de confecção dos biossensores para a determinação quantitativa de H2O2 são comparados: em relação ao parâmetro comportamento linear, verificou-se uma faixa de concentração de 0 a 15 mmol/L de H2O2 para o método via entrapment, enquanto que através do método com inoculação foi verificado um comportamento linear de 2 a 8 mmol/L de H2O2. Em relação à resposta do biossensor, tem-se para a concentração de 8 mmol/L de H2O2, uma corrente de aproximadamente 600 nA utilizando biossensores preparados pelo método de entrapment e 300 nA pelo método com inoculação. Apesar do baixo desempenho da imobilização do anticorpo V3.5R3 para a detecção de H2O2, o sucesso na imobilização de diferentes biocomponentes e o desenvolvimento de mecanismos como a inoculação amplia o espectro de possibilidades para o estudo de biossensores. / In this work is presented a study of the immobilization of the enzyme horseradish peroxidase (HRPO) in polymeric matrix by two different methods. The first one consist in a one-step method, in which the HRPO is immobilized by electropolymerization of pyrrole in aqueous solution onto platin electrode – techniques denominated entrapment – aiming the confection of enzymatic biosensors for the amperometric detection of hydrogen peroxide (H2O2). The polymeric matrix with the immobilized enzyme (substrate PPy-HRPO) was analyzed by colorimetric reaction, confirming the affirmations of some authors about the low quantities of enzymatic immobilization, and FTIR, what shows very similar specters for the polypyrrole (PPy) film and the PPy + HRPO. Studies of the concentrations of monomer, enzyme and electrolyte, as well as of the electrochemical parameters, have been carried through for the optimization of the biossensor. The values of the optimized parameters were used as reference for the study of the second immobilization method, in which is used a specific antibody for enzyme HRPO, the V3.5R3, immobilized via entrapment. The HRPO is, then, inoculated to the system by immersion of the PPy-V3.5R3 substrate in HRPO solution. The results of the biossensores confectioned by the two methods are compared: about the linear behavior it was verified a range of concentration form 0 to 15 mmol/L of H2O2, while through the second method was verified a linear range of 2 to 8 mmol/L of H2O2. About the signal response, for the same concentration of 8 mmol/L of H2O2, an electric current of 600 nA was reached, against 300 nA with the biosensors constructed by the second method. Although the low performance of the immobilization of the antibody V3.5R3 for the H2O2 detection, the success in different biocomponents immobilization and the development of mechanisms as the inoculation increases the possibilities specter for biosensors research.

Submitted by Leonardo Freitas (leonardo.hfreitas@ufpe.br) on 2015-04-08T19:57:48Z No. of bitstreams: 2 Tese Luciana de Oliveira.pdf: 1908204 bytes, checksum: d106719829e859b269968dc234a2c86c (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T19:57:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese Luciana de Oliveira.pdf: 1908204 bytes, checksum: d106719829e859b269968dc234a2c86c (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2009-07-03 / CAPES; PPBio; CNPq; DAAD / Os fungos compreendem um grupo heterogêneo de microrganismos, atuando como sapróbios, parasitas e simbiontes. Como sapróbios, podem viver em diversos ambientes, especialmente no solo. Este trabalho teve como objetivos o isolamento, identificação e atividade enzimática (lacase e peroxidase) de fungos filamentosos do solo do Vale do Catimbau, semi-árido pernambucano. Quatro coletas de solo foram feitas durante os períodos chuvosos (2) e de estiagem (2). Foram identificadas 87 espécies de fungos filamentosos pertencentes aos fungos anamorfos (74), Zygomycota (8) e Ascomycota (6). Penicillium e Aspergillus predominaram com 28 e 18 espécies, respectivamente. Aspergillus fumigatus, A. versicolor, A. terreus, Fusarium solani, Penicillium commune, P. decumbens, P. restrictum, P. verruculosum e P. waksmanii foram classificados como abundantes. Não foram observadas diferenças significativas entre as unidades formadores de colônia em relação aos períodos chuvoso e de estiagem e às superfície e profundidade do solo. O Índice de Diversidade de Shannon-Wiener foi de 4,84 bits por indivíduo. Das espécies identificadas, Pestalotiopsis palustris e Pestalozziella artocarpi estão sendo citadas pela primeira vez para as Américas do Sul e Latina, respectivamente. Trinta e duas espécies foram testadas quanto à atividade enzimática, onde 22 e 27 foram positivas para a lacase e peroxidase, respectivamente. Chaetomium globosum apresentou melhor atividade lacase, enquanto Pithomyces chartarum revelou melhor atividade para peroxidase. O pH ótimo para atividade lacase foi 3,0 em Pithomyces chartarum e, 4,5 em C. pallescens para peroxidase. A temperatura ótima foi observada em C. globosum foi 70ºC por 60 min para lacase e, 50ºC por 60 min em Mirothecium roridum para peroxidase. Curvularia pallescens, Pestalotiopsis palustris, Pestalozziella artocarpi e Scopulariopsis chartarum estão sendo citadas como primeiro registro com atividade para fenoloxidases. Os resultados desta pesquisa indicam que os fungos anamórficos predominam no solo do Vale do Catimbau e que as espécies testadas quanto a produção de fenoloxidases são promissoras para a biotecnologia.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5247_1.pdf: 1165059 bytes, checksum: 9c567a374ca895213d958b48c86f895f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Neste trabalho são relatados os resultados obtidos na síntese, caracterização e aplicação de discos de álcool polivinílico-glutaraldeídopolianilina- glutaraldeído (PVAG-PANIG) como suporte para imobilização das enzimas peroxidase (EC 1.11.1.7) e tripsina (EC 3.4.21.4). A produção dos discos do compósito foi obtida pelo gotejamento de uma solução de álcool polivinílico 2% (p/v) e glutaraldeído 3,6 % (v/v) sobre poços de uma microplaca contendo 120 μL de HCl 3,0 mol LP -1 P, posteriormente, seguido pela síntese química de polianilina sobre a superfície dos discos, utilizando persulfato de amônio como agente oxidante, e pela ativação do compósito com glutaraldeído 2,5% (v/v). A composição do suporte PVAG-PANIG foi investigada mediante análises por espectros de infravermelho de transmitância e absorção por UVvisível e análise termogravimétrica. A superfície do material foi observada em microscopia eletrônica de varredura e em estudos de porosidade pela técnica de adsorção/desorção de nitrogênio e as propriedades condutimétricas foram obtidas utilizando o método padrão de quatro pontas. O compósito apresentou alta hidrofilicidade, baixa porosidade e baixa condutividade elétrica a temperatura ambiente. A imobilização de peroxidase resultou num derivado capaz de remover compostos fenólicos semelhantemente à ação executada pela enzima nativa, com a vantagem da sua reutilização por sete vezes consecutivas. O disco de PVAG-PANIG-tripsina foi capaz de hidrolisar caseína continuamente, produzindo peptídeos de tamanhos diversos.

Orientador: Glaucia Maria Pastore / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-02T09:38:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maciel_HermelindaPenhaFreire_D.pdf: 24290756 bytes, checksum: 2fba3bc59cedd41dca9373a8b0b5822c (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: O objetivo desta pesquisa foi realizar uma revisão bibliográfica sobre a importância e aplicação de peroxidase de plantas. As peroxidases são relatadas como enzimas muito estáveis ao calor, presentes em muitas frutas e em várias partes dos vegetais. Estas enzimas são encontradas na forma de complexos de isoenzimas e causam alterações na coloração natural dos alimentos e sabor desagradável. As peroxidases apresentam inúmeras aplicações em análises de alimentos, análises clínicas e biológicas, e em conjunto com outras enzimas na conservação de certos alimentos. Ainda existe um grande universo de frutas tropicais, folhas e outras partes da planta, fontes de peroxidase, que podem ser investigadas visando a aplicação industrial. As peroxidases podem catalisar a oxidação de grande variedade de fenóis e aminas aromáticas, que ocorrem naturalmente em tecidos de plantas. Esta capacidade é largamente usada na indústria de alimentos como agente esterilizante e pode conduzir à determinação dos valores de perda nutricional e deteccão do surgimento de compostos tóxicos como hidroperóxidos, epóxidos e aldeídos. A peroxidase pode ainda indicar a presença de hidrogênios e peróxidos orgânicos liberados no meio ambiente, originados de procedimentos industriais, que podem contaminar água potável e a natureza. Métodos convencionaispara determinaçãode peróxido de hidrogênio estão sendo atualmente adaptados para avaliação com a enzima peroxidase como sensor (biossensor). / Abstract: The aim of this research was to review the importance and application of the plant peroxidases. The peroxidases are reported to be one of the most heat stable group of enzymes present in many fruits and vegetables. These enzymes are a complex family of severaI isoenzymes, whose action results in discoloration and off-flavours in foods, but are also used in food, biological and clinical analyses, as well as in food conservation, combined with the action of other enzymes. A lot of tropical fruits and vegetables have to be biochemically characterized with respect to their peroxidases. These enzymes can catalyse the oxidation of a large number of phenols and a aromatic amines which occur naturally in plant tissues. It is widely used in food industry as a sterilizing agent and when present in the final products can indicate the loss of nutritional value and appearance of toxic compounds such as hydroperoxides, epoxides and aldehydes hydrogen. The peroxidase can also indicates the presence of organic peroxides released in the environment from industrial processes and during the ozonation of drinking water. Conventional methods for the determination of hydrogen peroxide have been investigated with a peroxidase enzyme sensor (biosensor). / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-11-06T16:16:39Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 391486 bytes, checksum: de3b1df495a766daeae83c581ee31b38 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-06T16:16:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 391486 bytes, checksum: de3b1df495a766daeae83c581ee31b38 (MD5) Previous issue date: 2013-03-26 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Foi caracterizada a atividade específica das enzimas peroxidase (POD) e polifenoloxidase (PPO), bem como o perfil isoenzimático das enzimas POD, PPO e xiquimato desidrogenase (SKDH) e os compostos fenólicos solúveis totais de três regiões do palmito de pupunha (Bactris gasipaes Kunth) nomeadas: Região 1 = 2o entrenó do palmito caulinar, Região 2 = região meristemática e Região 3 = porção do palmito nobre contíguo à região meristemática. A região meristemática apresentou as maiores médias de atividade enzimática da POD e PPO. O perfil isoenzimático revelou uma isoforma da POD e PPO e duas da SKDH, em todas as regiões, com maiores expressões também na região meristemática, na qual foi encontrada maior concentraçãode compostos fenólicos. Rodelas de palmito nobre da porção contígua à região meristemática foram minimamente processadas e tratadas com metabissulfito de sódio 0,5% e conservadas a 5 oC por 11 dias. Avaliaram-se a cor instrumental, atividade enzimática da POD e PPO e os compostos fenólicos solúveis totais. A aplicação do metabissulfito de sódio 0,5% reduziu a atividade enzimática da POD e da PPO em 35 e 70%, respectivamente, durante o período de conservação, e aumentou o teor de compostos fenólicos solúveis, implicando não oxidação desses compostos. Variações na coordenada b* foram observadas entre o 7° e o 11° dia no palmito não tratado, evidenciando tendência ao amarelecimento da superfície das rodelas, sem aumento na sua concentração de carotenoides. Não foi notada variação na coordenada L* durante todo o período de conservação das rodelas não tratadas e tratadas com metabissulfito de sódio, evidenciando-se a ausência de escurecimento. Conclui-se que a ausência de escurecimento do palmito de pupunha está associada à natural e reduzida atividade enzimática da POD e PPO e à presença de uma única isoenzima da POD e PPO. O amarelecimento do tecido pode implicar evidência visual da oxidação dos substratos fenólicos pelas enzimas POD e PPO, todavia a ser verificada experimentalmente. / The specific activities of peroxidase (POD) and polyphenol oxidase (PPO) were characterized and the isoenzyme profile of POD, PPO and shikimate dehydrogenase (SKDH) and total soluble phenolics assessed for three regions of heart of palm (Bactris gasipaes Kunth.) named: Region 1 = 2nd internode of palm stem, region 2 = meristematic section, and region 3 = section of the palm contiguous to the meristematic tissues named ‘noble’ portion or ‘heart’. It was observed that the meristematic region had the highest levels of POD and PPO activities. The isoenzyme profiles revealed one isoform of POD and PPO and two of SKDH, in all regions, with the highest expressions also in the meristematic region, where phenolic compounds were found in higher concentration. Slices of the noble portion were minimally processed, treated with 0.5% sodium metabisulfite and stored at 5 °C for 11 days. Instrumental color, enzymatic activity of POD and PPO and total soluble phenolic compounds were evaluated. The addition of 0.5% sodium metabisulfite reduced the activities of POD and PPO by 35% and 70%, respectively, during the cold storage period and increased the content of soluble phenolic compounds not involving oxidation of these compounds. Variations in coordinate b* were observed from the 7th to the 11th day in the untreated slices, showing tendency to surface yellowing, however no increasein carotenoid levels was observed. Variations in the L* value were not observed throughout the storage period in either treated or untreated slices, showing no browning. It is concluded that the absence of browning in Pupunha heart-of-palm is associated with the presence of a single isoenzyme of POD and PPO, and the reduced activity of these enzymes. The yellowing of the tissue surface at the later storage period could involve visual evidence of reactions other than oxidation of phenolic substrates by enzymes POD and PPO, however to be verified experimentally.

Orientador: Jorge Vega / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T01:42:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Benatti_LucianaBenjamim_M.pdf: 648528 bytes, checksum: e64800b7819ae055ed02ec8072ec8b26 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Foram estudadas três variedades de cana-de-açúcar com diferentes graus de sensibilidade à infecção pelo vírus do amarelecimento foliar (VAFCA). As plantas mais sensíveis quando infectadas pelo VAFCA apresentam amarelecimento da nervura principal na parte abaxial, e quando o sintoma está em estádio avançado, também mostram o avermelhamento na parte adaxial da mesma nervura. Quando as variações ambientais são maiores, principalmente quando há queda da temperatura, a intensidade de sintomas é significantemente maior. A infecção viral também causa a diminuição no crescimento da planta. Análises com microscopia de epifluorescência mostraram que em algumas amostras infectadas havia um acúmulo de material fluorescente no interior do floema, sítio de localização do VAFCA. A análise comparativa entre as variedades mostrou que este material fluorescente aparecia quase que exclusivamente em folhas com sintomas da variedade sensível, SP 71-6163. Testes histoquímicos usando o reagente de Neu indicaram que o material fluorescente presente no floema é rico em flavonóides, e provavelmente insolúvel. Sabe-se que um dos mecanismos acionados na defesa de plantas contra patógenos é o aumento da atividade de peroxidases. Em testes quantitativos de três enzimas peroxidásicas diferentes foi verificado aumento significativo na atividade da siringaldazina peroxidase (SPX) apenas em plantas sensíveis, da variedade SP 81-3250, infectadas pelo VAFCA. Quanto às outras enzimas, guaiacol peroxidase (GPX) e ascorbato peroxidase (APX), as atividades sofreram poucas modificações nas variedades estudadas. Também foram feitos testes de localização da SPX, com siringaldazina como substrato e de peroxidases genéricas, com o 4-cloro-naftol como substrato. Nestes testes foi verificado que há atividade da SPX no interior do floema e nas células epidérmicas e subepidérmicas, em plantas sadias e infectadas da variedade SP 81-3250, e em folhas com e sem sintoma da SP 71-6163. Já na variedade tolerante, SP 70-1143, a atividade desta enzima foi baixa e às vezes nula. Quanto às peroxidases genéricas, houve também atividade no tecido floemático e nas células epidérmicas e subepidérmicas, mas a atividade foi similar em todas as folhas analisadas estando elas sadias ou infectadas com ou sem sintoma. Foi possível fazer uma correlação nas diferentes variedades entre concentrações de vírus e prováveis mecanismos de defesa estudados. Plantas tolerantes apresentaram muitos feixes infectados, nunca apresentam material fluorescente no floema e possuem baixa atividade SPX. Já a variedade mais sensível possui poucos feixes infectados, acúmulo de material fluorescente em folhas com sintoma, e atividade relativamente alta de SPX. Esta resposta provavelmente representa a ativação de mecanismos de defesa, que embora limitem o espalhamento do vírus na hospedeira, desencadeiam um processo que no final é mais danoso para a planta, induzindo o amarelecimento e reduzindo o crescimento / Abstract: Three varieties of sugarcane with different degrees of sensibility to infection by sugarcane yellow leaf virus (ScYLV) were studied. ScYLV belongs to the Luteovirus family. By definition they are confined to phloem tissue and one of the symptoms that can appear is the yellowing of the leaves. The more sensitive plants show the yellowing of the mid-rib on the abaxial face when infected by the ScYLV and red coloring on the same rib on the adaxial face at advanced stages. During larger environmental changes, especially temperature decreases, the symptoms may be considerably intensified. The virus infection also dimished plant growth. Epifluorescence microscopy analyses demonstrated that in some infected materials the accumulation of fluorescence material occurred inside the phloem, where the ScYLV was located. A comparative study of different varieties revealed that the fluorescent material appeared almost exclusively in leaves of the sensitive variety, SP 71-6163, showing symptoms of infection. Histochemicals testes using Neu¿s reagent indicated the fluorescent material present in the phloem to be rich in flavonóide, and probably insoluble. It is know that one of plant¿s defense mechanisms against pathogenic agents is the increase of peroxidases activities. Three different peroxidases were assayed: guaiacol peroxidase (GPX), syringaldazine peroxidase (SPX) and ascorbato peroxidase (APX). A significant increase in the SPX activity was found only in sensitive plants of the variety SP 81-3250, infected by ScYLV. The other peroxidase activities did not show significant variations in the varieties studied, probably because the plant infection was chronic. Tests to localize the SPX were made with syringaldazine as substrate and for the generic peroxidases with 4-chloro-naftol as substrate. Localization tests showed the existence of activities of SPX in the phloem, epidermis and subepidermis, in healthy and infected plants of the variety SP 81-3250. the same situation was observed in leaves of SP 71-6163 with and without symptoms. On the other hand, in the tolerant variety, SP 70-1143, the activity of SPX was low and sometimes null. The generic peroxidase activity was also localized in phloem tissue as well as in cells of the epidermis and subepidermis, but the activity was similar in all types of leaves analyzed healthy or infected with or without symptoms. It was possible to relate the quantity of virus to the probable defense mechanisms for the different varieties studied. Tolerant plants showed many infected vascular bundles, never presented fluorescent material in the phloem and possessed low activity of SPX. The most sensitive variety showed few infected vascular bundles, accumulation of fluorescent material ion the phloem of leaves with symptoms and high PX activity. This response probably represents the activation of defense mechanisms that limit the spread of the virus in the host. However, these mechanisms also trigger a process that is more harmful to the plant, inducing yellowing and growth reduction / Mestrado / Biologia Vegetal / Mestre em Biologia Vegetal

Hemoproteins are a very important class of enzymes in nature sharing the essentially same prosthetic group, heme, and are good models for exploring the relationship between protein structure and function. Three important hemoproteins, chloroperoxidase (CPO), horseradish peroxidase (HRP), and cytochrome P450cam (P450cam), have been extensively studied as archetypes for the relationship between structure and function. In this study, a series of 1D and 2D NMR experiments were successfully conducted to contribute to the structural studies of these hemoproteins. During the epoxidation of allylbenzene, CPO is converted to an inactive green species with the prosthetic heme modified by addition of the alkene plus an oxygen atom forming a five-membered chelate ring. Complete assignment of the NMR resonances of the modified porphyrin extracted and demetallated from green CPO unambiguously established the structure of this porphyrin as an NIII-alkylated product. A novel substrate binding motif of CPO was proposed from this concluded regiospecific N-alkylation structure. Soybean peroxidase (SBP) is considered as a more stable, more abundant and less expensive substitute of HRP for industrial applications. A NMR study of SBP using 1D and 2D NOE methods successfully established the active site structure of SBP and consequently fills in the blank of the SBP NMR study. All of the hyperfine shifts of the SBP-CN- complex are unambiguously assigned together with most of the prosthetic heme and all proximal His170 resonances identified. The active site structure of SBP revealed by this NMR study is in complete agreement with the recombinant SBP crystal structure and is highly similar to that of the HRP with minor differences. The NMR study of paramagnetic P450cam had been greatly restricted for a long time. A combination of 2D NMR methods was used in this study for P450cam-CN- complexes with and without camphor bound. The results lead to the first unequivocal assignments of all heme hyperfine-shifted signals, together with certain correlated diamagnetic resonances. The observed alternation of the assigned novel proximal cysteine β-CH2 resonances induced by camphor binding indicated a conformational change near the proximal side.

PrnB is a heme-containing enzyme, which catalyzes the ring rearrangement reaction of 7-chlorotryptophan to produce 3-(3-Chloro-2-nitrophenyl)pyrrole. This thesis describes the initial isolation and characterization of PrnB, the second enzyme associated with the pyrrolnitrin biosynthetic pathway in Burkholderia ambifaria. Additionally, alternative peroxidase reactivity was used to study how amino-acids bind to the substrate binding pocket of PrnB. The peroxidase activity of PrnB was measured using three different peroxidase activity assays at various pH values. The peroxidase data was compared to similar studies with the classic peroxidase, Horseradish peroxidase (HRP). Generally, PrnB showed weak peroxidase reactivity. However this weak reactivity was an experimental handhold, where tryptophan and other substrate binding events can be explored using classic inhibition steady-state kinetics. The rate of 2-aminophenol oxidation by PrnB was used as a model assay to monitor how molecules such as L-tryptophan, L-alanine, indole, L-phenylalanine, and L-tyrosine interact with the PrnB active site.