Tübingen, Univ., Diss., 2005.

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / El Virus Diarrea Viral Bovina (VDVB) infecta al ganado biungulado generando considerables pérdidas productivas y reproductivas. Análisis filogenéticos segregan al VDVB en dos genotipos dentro del género Pestivirus, VDVB genotipo 1 (VDVB-1) y VDVB genotipo 2 (VDVB-2). Análisis filogenéticos posteriores han demostrado la existencia de subgrupos dentro de los dos genotipos. Al menos 15 subgrupos para el VDVB-1 (de a hasta o) y dos subgrupos para el VDVB-2 (a y b) han sido identificados. Estudios previos han demostrado que en el ganado de Chile se han aislado los subgrupos VDVB-1a, VDVB-1b, VDVB-1i, VDVB-1j y VDVB-2a en bovinos, VDVB-1b, VDVB-1j y VDVB-2a en camélidos sudamericanos y VDVB-1j en ovinos y caprinos. Para conocer si existen diferencias antigénicas entre aislados chilenos del VDVB de los subgrupos VDVB-1j obtenidos de ovinos y caprinos, frente a aislados chilenos del VDVB de los subgrupos VDVB-1j y VDVB-1b obtenidos de bovinos, VDVB-2a obtenidos de camélidos sudamericanos y frente a cepas de referencia del subgrupo VDVB-1a, se produjeron sueros policlonales en conejos mediante inoculaciones de los aislados y cepas de referencia. Con los sueros inmunes se realizaron pruebas de seroneutralización cruzada enfrentando cada suero con los virus homólogos y heterólogos. Los resultados demostraron que no hubo diferencias antigénicas significativas entre los aislados virales de ovinos, caprinos y bovinos del subgrupo VDVB-1j, y que hubo diferencias antigénicas significativas entre los virus de los subgrupos VDVB-1j, VDVB-1b, VDVB-2a y VDVB-1a. Esta es la primera identificación antigénica de aislados de VDVB obtenidos de ovinos y caprinos de Chile, que puede tener implicaciones importantes en la epidemiología de la VDVB y debería ser considerada en programas de inmunización, prevención de infecciones dentro o entre especies y en el empleo de virus y sueros hiperinmunes como materiales de diagnóstico en los laboratorios / proyecto FONDECYT Nº 1080130

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Virus Diarrea Viral Bovina (VDVB) está ampliamente distribuido a nivel mundial y afecta tanto a rumiantes domésticos (bovinos, caprinos, ovinos, etc.) como silvestres (ñu, jirafa, búfalo, etc.), siendo una de las principales causas de pérdidas económicas en el ganado bovino, debido principalmente a problemas reproductivos. El VDVB presenta una alta variabilidad genómica, que se manifiesta en sus características biológicas y antigénicas. La manifestación clínica de la enfermedad también presenta importantes diferencias, que van desde cuadros subclínicos (la mayoría de los casos) hasta presentaciones con un 100% de mortalidad. Estas diferencias se deben a una serie de factores, tanto del virus como del hospedador, siendo uno de los factores importantes la virulencia del aislado viral, que se asocia a la eficiencia replicativa del VDVB. El objetivo de esta Memoria de Título fue determinar la eficiencia replicativa de diez aislados del VDVB, obtenidos de bovinos naturalmente infectados con diferentes manifestaciones clínicas y pertenecientes a los distintos genotipos y subgenotipos presentes en Chile, ocho pertenecientes al genotipo 1 (VDVB1a, 1b, 1i y 1j) y dos al genotipo 2 (VDVB2a). Para ello, se determinó la cinética de multiplicación viral en cultivos de células Madin-Darby Bovine Kidney y la eficiencia replicativa se estimó ocupando los siguientes indicadores: Producción máxima de viriones (DICT50/ml) (P), Período de multiplicación viral (horas) (T), Velocidad de síntesis de viriones (V), en que V=P/T y la Pendiente durante la fase exponencial de la multiplicación viral (M). De acuerdo a los indicadores, los virus de los subgenotipos 1a y 1j tendrían una alta eficiencia replicativa, principalmente por la capacidad de completar su ciclo infectivo a 12 horas post-infección y los menores tiempos para concluir la multiplicación viral. Por otra parte, los virus del subgenotipo 1b y 1i serían los virus con la menor eficiencia replicativa, considerando su baja producción máxima de viriones, velocidad de síntesis de virus infecciosos y la pendiente durante la fase exponencial de la multiplicación viral

Las poblaciones de rebeco pirenaico (Rupicapra pyrenaica) situadas en el Pirineo central y oriental se han reducido drásticamente debido a sucesivos brotes de enfermedad asociados a un Virus de la Enfermedad de la Frontera (BDV en sus siglas en inglés) desde el año 2001. Sin embargo, la enfermedad observada no presenta las características clásicas de la Enfermedad de la Frontera, descrita en las especies domésticas. La presente investigación tiene como objetivo investigar la patogenia de la enfermedad asociada al BDV del rebeco (ch-BDV) en rebecos infectados de manera natural y en tres especies infectadas experimentalmente: rebeco pirenaico, oveja y cerdo. En primer lugar, investigamos la excreción, distribución y cuantificación del ch-BDV en los órganos de rebecos infectados de manera natural. El suero y los tejidos analizados fueron positivos mediante RT-PCR y aislamiento vírico en todos los animales estudiados. Los hisopos nasal, oral y rectal, así como la orina fueron también positivos mediante RT-PCR en casi todas las muestras analizadas, confirmando que el virus se elimina al ambiente a través de las vías de excreción analizadas. El estudio serológico no detectó anticuerpos en ningún rebeco utilizando técnicas de ELISA y seroneutralización. El estudio genético de la región no codificante 5’ confirmó que el virus pertenecía al grupo BDV-4, tal y como se había descrito anteriormente en los brotes de enfermedad. La presencia de un feto positivo al ch-BDV mediante RT-PCR sugiere que sea posible la existencia de animales persistentemente infectados. El objetivo de la infección experimental en el rebeco pirenaico fue la reproducción en condiciones experimentales de la enfermedad observada en los rebecos salvajes. Siete rebecos (cinco seronegativos y dos seropositivos a anticuerpos frente a BDV) fueron inoculados con una cepa BDV aislada de un rebeco de campo infectado. Tres animales más se mantuvieron como controles. Los cinco rebecos seronegativos infectados presentaron una viremia desde el día 2 post-inoculación (pi) hasta la muerte del animal o el fin del experimento en el día 34 pi, y desarrollaron anticuerpos neutralizantes a partir del día 18 pi. Los rebecos virémicos presentaron un descenso en el recuento leucocitario, especialmente significativo en los neutrófilos. Las lesiones más significativas se observaron en el encéfalo y órganos linfoides, que presentaron una meningoencefalitis no supurativa y una moderada depleción linfoide generalizada, respectivamente. De manera similar a los rebecos infectados de manera natural, los rebecos de este experimento también presentaron virus en hisopo nasal, saliva y heces, hecho que explicaría la elevada capacidad de transmisión horizontal observada en las poblaciones de rebecos salvajes afectadas por las epizootias. Esta infección experimental confirma que el ch-BDV es el agente etiológico primario de la enfermedad que ha afectado a las poblaciones de rebeco en los últimos años en el Pirineo. La Enfermedad de la Frontera en las ovejas cursa con un cuadro sintomático leve o subclínico, aunque se han descrito brotes de enfermedad con elevada mortalidad. En la infección experimental de oveja valoramos la susceptibilidad de esta especie al ch-BDV. No se observaron signos clínicos ni lesiones histopatológicas en los corderos inoculados aunque el BDV se detectó en suero entre los días 4 y 10 pi. Todos los corderos infectados mostraron anticuerpos neutralizantes a partir del día 21 pi. La conclusión principal de esta infección experimental fue que el ch-BDV infecta la oveja vía oro-nasal, desarrollando en ésta una respuesta humoral que elimina el virus. El BDV infecta diferentes especies animales. Previamente a la infección experimental en cerdo, habíamos detectado jabalíes con anticuerpos frente a BDV en las zonas del Pirineo donde se habían producido los brotes de enfermedad en rebeco. El objetivo principal de la infección experimental en el cerdo fue estudiar bajo condiciones experimentales los efectos del ch-BDV y la dinámica de la infección en esta especie. Los cerdos infectados mostraron una viremia desde el día 3 hasta el 14 pi, a partir del cual los animales desarrollaron una repuesta humoral. No se observó sintomatología clínica ni lesiones histológicas. Esta infección experimental demostró la susceptibilidad del cerdo al ch-BDV, lo que podría representar un problema en el diagnóstico de la Peste Porcina Clásica en el jabalí. / Since 2001 several outbreaks of disease associated with BDV infection have been reported in the Pyrenees (North-Eastern Spain), affecting Pyrenean chamois (Rupicapra pyrenaica) and entailing a major population reduction. However, the clinical disease observed in the affected chamois was not the typical one described in domestic animals. The present research aims to investigate the pathogenesis of the disease associated to chamois-BDV (ch-BDV) in naturally-infected chamois and in three experimental animal models: pig, sheep and Pyrenean chamois. The shedding, distribution and quantification of ch-BDV in the organs of naturally infected chamois was investigated as a previous step to the experimental challenges in the three animal models. Sera and all tissue samples were positive to RT-PCR and virus isolation in all studied chamois. Also, nasal, oral and rectal swabs and urine were RT-PCR positive in almost all analyzed samples, confirming that the virus is shed through the main excretion routes. In addition, sera were tested for BDV antibodies using an ELISA and seroneutralization tests, with negative results. Sequence analysis of the 5’ untranslated region (5’-UTR) confirmed that this virus was grouped into the BDV-4 genotype as reported in previous studies. The observation of a RT-PCR positive foetus in an adult female suggests that persistently infected animals could be possible. The aim of the experimental infection in Pyrenean chamois was to reproduce the disease reported in chamois in the field and to study it under experimental conditions. Seven chamois (five seronegative and two seropositive against BDV) were inoculated with a BDV isolated from a naturally-infected chamois and three animals were kept as controls. The five seronegative infected chamois were viraemic from day 2 post inoculation (pi) until the day they died or the end of the experiment on day 34 pi, and developed neutralizing antibodies from day 18 pi until the end of the study. There was also a progressive decline in their white blood cell counts, especially marked in the neutrophil count. The most consistent histopathological lesions were in brain and lymphoid tissues, where non-suppurative meningoencephalitis and generalized moderate lymphocyte depletion were observed, respectively. Like naturally infected chamois, experimentally infected animals also contained high doses of BDV in main putative excretion routes, which would explain the high transmission rate of the infection in free-ranging chamois populations in the Pyrenees. This experimental infection in chamois confirms that BDV is the primary agent of the disease that has been affecting chamois populations in recent years in the Pyrenees. Clinical manifestations of Border Disease in healthy sheep acutely infected are mild or unapparent, but a few outbreaks with high mortality have been reported. Sheep were experimentally infected with ch-BDV and examined the susceptibility to the infection of this species. Clinical signs or histological lesions were not observed in inoculated lambs but BDV was detected in sera from the infected group from day 4 pi to day 10 pi. All infected lambs showed neutralizing antibodies at day 21 pi. Therefore, ch-BDV can infect domestic sheep through the oro-nasal route, developing a humoral response that completely eliminates the virus. It is well documented that BDV can infect domestic and feral swine. In a previous study, seropositive wild boars against BDV were detected from the Pyrenees areas where chamois epizootics occurred. For this reason, experimentally the effects and dynamics of ch-BDV infection in domestic pig were studied. In this challenge all infected pigs were viraemic from day 3 to 14 pi, when all animals developed an antibody response. Clinical signs or histological lesions were not observed. Thus, the susceptibility of domestic swine to ch-BDV was demonstrated, representing a potential challenge to the monitoring of CSFV in wild swine populations.

Zugl.: Giessen, Univ., Diss., 2005

Univ., Diss., 2005--Giessen

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniversitet, 2009. / Härtill 5 uppsatser.

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Se evalúa la hipótesis que camélidos sudamericanos (CS) introducidos en la Región Metropolitana de Chile estén infectados con pestivirus. Para realizar el aislamiento viral se tomaron muestras de 79 CS (42 alpacas vivas, 30 llamas vivas, una llama muerta, un feto de llama abortado, cuatro guanacos vivos y un guanaco muerto) procedentes de cinco rebaños sospechosos de estar infectados con pestivirus. Las muestras se inocularon en cultivos primarios de células de pulmón fetal bovino libre de virus diarrea viral bovina (VDVB) y se hicieron cinco pasajes antes de ser analizados por las pruebas de inmunofluorescencia directa e inmunoperoxidasa indirecta para detectar la presencia de antígenos de pestivirus. Para la caracterización molecular un fragmento de la región no traducida 5’ (5’- UTR) del ARN de cada aislado fue amplificado por transcripción reversa de reacción en cadena de las polimerasas (RT-PCR) y tratado con las enzimas de restricción Pst I, Bgl I y Xho I para identificar la especie de los virus Los resultados muestran que 37 CS (17 alpacas, 16 llamas y cuatro guanacos de los cinco rebaños) estaban infectados con pestivirus. Todos los aislados fueron no citopatogénicos. El VDVB genotipo 1 (VDVB-1) fue aislado de 6 alpacas y VDVB genotipo 2 (VDVB-2) fue aislado de 11 alpacas, 16 llamas y 4 guanacos. Los aislados virales fueron obtenidos de 14 alpacas sanas, 3 alpacas que abortaron, 13 llamas sanas, dos llamas con aborto, una llama muerta sin antecedentes clínicos y tres guanacos con enfermedad respiratoria y uno muerto con enfermedad respiratoria. Se concluye que alpacas, llamas y guanacos de la Región Metropolitana de Chile están infectados con VDVB-1 y VDVB-2 / Proyecto Fondecyt 1981193

A Diarréia Viral Bovina (BVD) provoca grandes perdas econômicas na pecuária mundial, é causada pelo vírus da diarréia viral bovina (BVDV), vírus que apresenta diversidade genética e antigênica entre as estirpes o que provavelmente influencia no diagnóstico. Com a proposta de verificar a presença de anticorpos, sua mensuração e neutralização cruzada frente quatro estirpes do vírus, amostras de 1500 bovinos não vacinados contra BVDV, sendo 519 de 15 rebanhos do Estado de Minas Gerais (MG), 499 de cinco rebanhos do Mato Grosso do Sul (MS) e 482 de cinco rebanhos de São Paulo (SP), foram testadas pela técnica de virusneutralização (VN) com as seguintes estirpes citopatogênicas: BVDV-1 (NADL estirpe americana e IBSP-11 isolado nacional) e BVDV-2 (VS-253 estirpe americana e IBSP-1020 isolado nacional). Dos 1500 animais, a variação da frequência de sororreagentes ao BVDV foi de 66,07% a 68,67%, ao analisar os diferentes grupos de animais, de acordo com o estado, a maior frequência de anticorpos foi obtida no MS, seguida por MG e SP, independente da estirpe utilizada na VN. O isolado nacional do genótipo 2, IBSP-1020 foi a estirpe que resultou em maior detecção de reagentes em MG e MS, enquanto que em SP foram as estirpes do genótipo 1. A avaliação dos resultados com as quatro estirpes revelou 73,27% (1099/1500) de animais reagentes a pelo menos um dos vírus, enquanto que, 57,60% (864/1500) foram reagentes aos quatro vírus, simultaneamente, ou seja, estes animais produziram anticorpos que reagiram com todas as estirpes em questão. Os títulos de anticorpos variaram de 10, valor mínimo de detecção da prova, a 5120, sendo que a maior parte dos animais apresentou títulos entre 40 e 160, os títulos observados nos animais de SP foram mais baixos com relação aos animais dos outros estados. A avaliação dos títulos de anticorpos de cada animal, comparando o resultado das estirpes duas a duas, revelou diferença na maioria das situações. Conclui-se que, houve alta frequência de ocorrência de bovinos reagentes ao BVDV, que variou de acordo com o sistema de criação e manejo dos rebanhos. Além disso, a utilização de mais de uma estirpe viral, independente do genótipo ou do local de origem do isolado, aumentou a sensibilidade de detecção de animais sororreagentes na VN. Foi evidenciada neutralização cruzada entre todas as estirpes estudadas. Os resultados reforçam a importância de selecionar estirpes representativas das regiões a serem estudadas para inclusão na VN, visando aumentar a sensibilidade do diagnóstico. / The bovine viral diarrhea (BVD) causes great economic losses in livestock worldwide, is caused by bovine viral diarrhea virus (BVDV), which presents genetic and antigenic diversity among strains which probably influences the serological diagnosis. For the proposal to verify the presence and titers of antibodies and cross-neutralization against four strains of virus, samples from 1,500 bovines naturally infected with BVDV, from the States of Minas Gerais (MG), Mato Grosso do Sul (MS) and São Paulo (SP) were tested by the virus-neutralization test (VN), against four cytopathic strains: BVDV-1 (NADL - American strain and IBSP-11 Brazilian isolate) and BVDV-2 (VS-253 - American strain and IBSP-1020 - Brazilian isolate). Of the 1,500 animals, the range from 66.07% to 68.67%, were reactive to BVDV, and the increased frequency of antibodies was obtained in the state of MS, followed by MG and SP, independent of the BVDV strain used in the VN. The national isolate of the genotype 2, IBSP-1020 strain showed highest detection of reagents in MG and MS states, while in SP were the strains of genotype 1. The results with the four strains showed that 73.27% (1,099/1,500) of animals positive to at least one virus, whereas 57.60% (864/1,500) were simultaneously reactive to the four viruses, in other words that is, these animals produced antibodies that cross reacted against all strains in question. The titers of antibodies ranged from 10, the minimum value of detection of VN, to 5120, and that most animals were between 40 and 160 titers. In comparison of antibodies titers among states was observed that animals in SP presented lowest antibody titer that other states. The evaluation of titers of antibodies in each animal, comparing the results of two by two strains showed statistical difference in most situations. It is concluded that there was a high frequency of occurrence of bovine reagents to BVDV, which varied according to the system of rasing and management of herds. Moreover, the use of different viral strains, independently of genotype or place of origin of isolate, increased the sensitivity of detection of seropositive animals in the VN. Cross-neutralization was observed among all strains studied. To increase the sensitivity of diagnosis it is important to select for VN the strains representative of the regions to be studied.

Os herpesvírus bovinos tipo 1 (BoHV-1) e tipo 5 (BoHV-5) e o vírus da diarreia viral bovina (BVDV), são causas importantes de prejuízos sanitários e econômicos na bovinocultura. Estes agentes têm sido eventualmente detectados em búfalos (Bubalus bubalis) embora o papel desses vírus na biologia dessa espécie seja ainda desconhecido. A produção de búfalos vem se desenvolvendo expressivamente no Brasil, onde esses animais são mantidos frequentemente próximos ou associados à criação de bovinos. Como parte inicial de um projeto mais amplo sobre infecções por BoHV-1, BoHV-5, BuHV-1 e BVDV em búfalos, o presente estudo objetivou analisar a presença de anticorpos neutralizantes e genomas virais em amostras de soros bubalinos coletados em rebanhos do Estado do Rio Grande do Sul. Foram examinados 339 soros de animais maiores de 12 meses, de ambos os sexos, de diferentes raças e tipo de exploração. Os animais não eram vacinados para quaisquer vírus de interesse na pesquisa e se apresentavam sem alterações clinicamente aparentes na ocasião da coleta. Para a detecção de anticorpos neutralizantes, as amostras de soro foram examinadas através do teste de soroneutralização (SN) frente a diferentes amostras de herpesvírus: BoHV-1.1 (amostra LA) , BoHV-5b (amostra A663) e BuHV-1 (amostra b6). Cento e oito destas amostras foram examinadas adicionalmente frente ao BoHV-1.1 (amostra EVI123/98) e BoHV-1.2a (amostra SV265/96), para permitir uma avaliação da sensibilidade da SN utilizando como vírus de desafio todas as variantes disponíveis de BoHV-1 e BoHV-5. A sensibilidade da SN foi menor quando considerados os resultados obtidos com cada um dos vírus separadamente. Quando os resultados positivos frente a amostra LA, SV265/96 e A663 foram somados, a prova se apresentou mais sensível. Apesar disso, a SN não permitiu a identificação dos vírus que efetivamente haviam infectado os animais, devido ao elevado grau de reatividade cruzada. Para a verificação da circulação de pestivírus, foram realizados testes de SN utilizando a amostra “Oregon C24V” de BVDV-1 como vírus de desafio. Das 176 amostras analisadas, 19 (10,8 %) apresentaram anticorpos neutralizantes reagentes com o vírus utilizado. Paralelamente, para a detecção de genomas de pestivírus, foi desenvolvida uma reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) capaz de detectar os três tipos conhecidos de BVDV (1, 2 e 3) e otimizada para o exame das amostras de soros bubalinos. Cinco amostras (2,8 %) continham genomas virais, sugerindo a ocorrência de prováveis infecções persistentes nos animais, semelhante ao que ocorre em bovinos. Os resultados obtidos evidenciam a circulação de herpesvírus e pestivírus nas populações bubalinas analisadas. Mais estudos são necessários para definir quais os agentes efetivamente causadores de infecções nesta espécie animal. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), 5 (BoHV-5) and bovine viral diarrhoea virus (BVDV) are major causes of sanitary and economic losses in cattle. These agents have been eventually detected in water buffaloes (Bubalus bubalis), although their role in host species biology is unknown. Buffalo production has had significant increase in Brazil, where these animals are often kept close to or in association with cattle. As part of a wider project on infections with BoHV-1, BoHV-5, BuHV-1 and BVDV in buffaloes, the present study aimed to examine the occurrence of neutralizing antibodies in buffaloes serum samples collected in farms from Rio Grande do Sul State. Three hundred and thirty nine serum samples were collected from animals with ages above 12 months, of both genders, of different races and under different management practices. The animals were not vaccinated for any virus studied in the present study and were all clinically healthy at the time of sample collection. For neutralizing antibodies detection, serum samples were tested in serum neutralization (SN) tests against different herpesviruses: BoHV-1.1 (strain LA), BoHV-5b (strain A663) e BuHV-1 (strain b6). One hundred and eight of theses samples were additionally examined with BoHV-1.1 (strain EVI123/98) and BoHV-1.2 (strain SV265/96), to compare SN sensitivity using all available variants of BoHV-1 and BoHV-5 as challenge viruses. The SN sensitivity was lower when results obtained with each virus were considered separately. Sensitivity was maximum when the positive results against strain LA, SV265/96 and A663 were added. Despite this, the SN did not allow the identification of the virus which had actually infected animals, in view of the high degree of antibody cross-reactivity. In order to assess the circulation of pestiviruses, SN tests were carried out using the sample "Oregon C24V" of BVDV-1 as challenge virus. Out of the 176 analyzed samples, 19 (10.8 %) presented neutralizing antibodies to pestivirus. At the same time, for the detection of genomes of pestiviruses, was developed a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) able to detect the three known types of BVDV (1, 2 and 3) and optimized for examining bubaline sera. Five samples (2.8 %) contained viral genomes, suggesting the occurrence of persistent infections in animals, analogous to what occurs in cattle. The results obtained confirm circulation of herpesvírus and pestiviruses in examined buffalo populations. Further studies are needed to define which of these viruses effectively infect this animal species.