published_or_final_version / abstract / Paediatrics and Adolescent Medicine / Doctoral / Doctor of Philosophy

Several biomarkers (cell viability and phagocytosis) based on earthworm (Lumbricus terrestris) immune cells (coelomocytes), together with whole-worm mortality (LC/LD50's), were used to assess a bioremediation attempt to reduce pentachlorophenol (PCP) toxicity in a former wood processing hazardous waste site (HWS).

Les cellules souches de la pulpe dentaire humaine (DPSCs) sont des cellules souches mésenchymateuses (MSCs) isolées de la pulpe dentaire. Les DPSCs sont capables de s’auto-renouveler et se différencier en plusieurs types cellulaires tel que les odontoblastes, les ostéoblastes, les chondrocytes, les neuroblastes et les adipocytes. Les propriétés immunitaires des DPSCs sont de plus en plus étudiées, elles hébergent des récepteurs de types Toll à la surface, possedent une activité immuno-modulatrice.Cependant, les propriétés immunitaires comme celles décrites dans les cellules immunitaires professionnelles telles que la phagocytose, la production de composés anti-microbiens et le nouveau concept « Trained immunity » pourraient être étudiées. une brève revue a été élaborée pour mettre en évidence l'ensemble des propriétés immunitaires des DPSCs décrites dans la littérature. Ensuite, expérimentalement, nous avons montré que les DPSCs pouvaient internaliser le pathogène bactérien Bartonella quintana. En outre, nous avons décrit la capacité des DPSCs à développer une immunité entrainée “trained immunity”. Il s’agit d’une mémoire inflammatoire concernant deux cytokines IL-6 et MCP-1. La stimulation des DPSCs avec le ligand bactérien LPS ou PGN induit une augmentation de l’expression et de la production de l'IL-6 et du PGN après un second stimulus. Dans l'ensemble, l'étude des propriétés immunitaires des DPSCs montre que ces dernières peuvent agir comme des cellules immunitaires. / Dental pulp Stem cells (DPSCs) are mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the dental pulp. DPSCs are able to self-renew and differentiate into several cell types such as odontoblasts, osteoblasts, chondrocytes, neuroblasts and adipocytes.The immune properties of DPSCs are being studied more and more, they harbor Toll-like receptor on the surface and have an immunomodulatory activity.However, immune properties such as those described in professional immune cells such as phagocytosis, production of antimicrobial compounds and the new concept "Trained immunity" could be studied.A brief review has been developed to highlight the set of immune properties of DPSCs described in the literature. Then, experimentally, we showed that DPSCs could internalize the bacterial pathogen Bartonella quintana.In addition, we have described the ability of DPSCs to develop trained immunity. It is an inflammatory memory concerning two cytokines IL-6 and MCP-1. Priming DPSCs with the bacterial ligand LPS or PGN induces an increase in the expression and production of IL-6 and PGN after a second stimulus.Overall, the study of the immune properties of DPSCs shows that DPSCs can act as immune cells.

A tolerância materno-fetal envolve, além do sistema imune, muitas peculiaridades quanto ao tipo de placenta e placentação. A placenta em bovinos é considerada não invasiva, e como conseqüência de uma implantação superficial, sem invasão endometrial, se estabelece uma barreira placentária complexa que se interpõe entre a circulação materna e fetal. Aliado a isso, a placenta um órgão que se encontra em constante diferenciação e proliferação celular além da alta atividade metabólica, fontes constantes de estresse e desafio para o sistema imune. Atuando nesse contexto, destacamos as proteínas de choque térmico (heat shock proteins HSP), proteínas que são expressadas em condições fisiológicas mas, em situações de estresse, sua expressão aumenta. Na placenta bovina já se constatou a expressão das HSP 60 e 70; contudo notou-se uma maior peculiaridade na expressão da HSP 60, que é maior no primeiro trimestre da gestação. Observando-se o perfil da presença e expressão dessa proteína na placenta bovina e, tendo em vista a característica desse órgão em apresentar populações leucocitárias funcionalmente distintas das do sangue periférico, levantou-se a hipótese da influência desta proteína sobre as células placentárias, particularmente sobre os leucócitos no processo de tolerância materno fetal. Desta forma, esse trabalho analisou a participação da HSP 60 em mecanismos imunes junto à alguns leucócitos placentários por meio de ensaio de proliferação pela técnica de CFSE, ensaio de fagocitose e ensaios bioquímicos como peroxidação lipídica; ciclo celular e potencial de membrana mitocondrial de células placentárias em cultivo. Nossos resultados mostraram que a HSP 60 não influencia a proliferação de linfócitos e outras células placentárias nas diversas condições testadas. Em contrapartida a HSP 60 aumenta a fagocitose e apoptose no terceiro terço gestacional, bem como a produção de radicais oxidados poliinsaturados e o potencial de membrana mitocondrial. Tendo em vista esses resultados, podemos observar que a HSP 60 nas células da placenta bovina possivelmente esteja modulando a cinética da ativação de mecanismos de sinalização de morte celular programada entre as células da placenta e o sistema imunológico. Esta hipótese assegura que, no concepto a termo, as variações hormonais e o sistema imune possam estar regulando o processo para o nascimento do feto. / The maternal-fetal tolerance involves, besides the immune system, many peculiarities regarding the type of placenta and placentation. The bovine placenta is considered not invasive and, as consequence of a superficial implantation without endometrial invasion, it establishes itself as complex barrier that interposes between the maternal and fetal circulation. In addition to that, placenta is an organ that undergoes continuous differentiation and cellular proliferation besides the high metabolic activity that represents a constant source of stress and challenge for the immune system. As an important component in this context, we highlight the heat shock proteins - HSP, that are usually expressed in physiological conditions but, in situations of stress, their expression increases. In the bovine placenta the expression of HSP 60 and 70 has already been verified; however HSP 60 showed a peculiar expression behavior, with higher staining in the first trimester of pregnancy. Considering the presence and expression profiles of HSP 60 in the bovine placenta allied to the particularity of presenting functional distinct leucocytes populations, a hypothesis was raised regarding the influence of this protein on the placental cells, particularly on the leucocytes in the process of fetal-maternal tolerance. Therefore, this work analyzed the role of HSP 60 in immune mechanisms related to some placental leucocytes by several approaches like proliferation assay by CFSE technique, phagocytosis assay and biochemical assays as lipoperoxidation; cell cycle phases and mitochondrial membrane potential of placental cells in culture. Our results showed that HSP 60 does not influence the proliferation of lymphocytes or any other placental cells in various conditions tested. On the other hand, HSP 60 increases phagocytosis and apoptosis in the third trimester, as well as the production of polyunsaturated oxide radicals and the mitochondrial membrane potential. In view of these results, we may infer that HSP 60 may be modulating the kinetics of activation mechanisms for signaling programmed cellular death between placental and immune cells. This hypothesis assures that, on the termed conceptus, the hormonal variation and the immune tolerance may be responsible for regulating the parturition process.

As doenças periodontais afetam os tecidos de suporte dos dentes e são desencadeadas por microrganismos que possuem a capacidade de invadir os tecidos periodontais. A evolução desta doença é influenciada pela resposta inflamatória e imunológica do hospedeiro e envolve a participação de diversos tipos celulares. Atualmente, existem evidências de que os mastócitos, além de outras funções, possuem a capacidade de eliminar bactérias, através da fagocitose. Assim sendo, este estudo teve por objetivo avaliar a capacidade fagocítica dos mastócitos frente ao periodontopatógeno A. actinomycetemcomitans, além de comparar sua capacidade fagocítica com a dos macrófagos, considerados fagócitos profissionais. Para este fim, foram realizados ensaios fagocíticos in vitro utilizando mastócitos e macrófagos murinos, desafiados ora com A. actinomycetemcomitans ora com Escherichia coli, opsonizados ou não, sob diferentes proporções célula: bactérias. Após 1 hora de desafio, as células foram coradas com laranja de acridina e avaliadas qualitativamente utilizando-se microscópio de varredura confocal a laser e quantitativamente através do microscópio de fluorescência convencional. Nossos resultados demonstraram que os mastócitos murinos se mostraram eficientes quanto a sua capacidade fagocítica frente a A. actinomycetemcomitans. Os valores percentuais de mastócitos com A. actinomycetemcomitans internalizados, na ausência de opsonização com complemento, foram maiores que aqueles na presença da opsonização, sugerindo a participação de receptores opsoninas-independentes no reconhecimento deste patógeno pelos mastócitos, além do receptor de complemento tipo 3 (CR3). Comparando os dois tipos celulares, verificou-se que ambas as células apresentaram importante atividade fagocítica contra A. actinomycetemcomitans, porém os valores percentuais de mastócitos com bactérias internalizadas sem complemento foram maiores que aqueles de macrófagos com bactérias internalizadas com complemento, em uma das proporções (1:10). Os resultados deste trabalho sugerem o papel dos mastócitos como fagócitos profissionais na patogênese da doença periodontal induzida por placa dentobacteriana. / Periodontal diseases affect the supporting tissues of the teeth and are triggered by microorganisms which are capable of invading periodontal tissues. The evolution of this disease is influenced by inflammatory and immune response of the host and involves the participation of different cell types. Currently, there is evidence that mast cells, among other functions, have the ability to eliminate bacteria by phagocytosis. Thus, this study aimed to evaluate the phagocytic ability of mast cells against the periodontopathogens A. actinomycetemcomitans, and compare with the phagocytic capacity of macrophages, which are considered professional phagocytes. Therefore, in vitro phagocytic assays were conducted using murine mast cells and macrophages, challenged with A. actinomycetemcomitans or Escherichia coli, at the same time, opsonized or not, under different proportions cell: bacteria. After 1 hour of challenge, cells were stained with acridine orange and qualitatively assessed by using a confocal laser scanning electron microscope and quantitatively by the conventional scanning fluorescence microscope. The results demonstrated that phagocytic ability of murine mast cells was effective against A. actinomycetemcomitans. The percentages of mast cells with A. actinomycetemcomitans internalized in the absence of opsonization with complement, were higher than those in the presence of opsonization, suggesting the involvement of opsonin-independent receptors in recognition of this pathogen by mast cells, as well as complement receptor type 3 (CR3). Comparing the two cell types, it was observed that both cells showed significant phagocytic activity against A. actinomycetemcomitans, however, the percentages of mast cells with internalized bacteria without complement were higher than those of macrophages with internalized bacteria with complement, in one of the proportions (1:10). The results suggest the role of mast cells as professional phagocytes in the pathogenesis of periodontal disease induced by dental plaque.

Crotalfina (CRF) é um peptídeo produzido do veneno da serpente Crotalus durissus terrificus com efeito antinociceptivo tipo opióide detectado apenas na presença de inflamação. Estudos sobre mecanismos de analgesia relatam a ação de opióides em células imunes e macrófagos são apontados como alvos para os efeitos destes. Este estudo caracterizou a ação da CRF sobre funções de macrófagos e avaliou a importância de seus receptores opióides nestas ações. Os resultados indicam que CRF inibe fagocitose, liberação de H2O2 e produção de NO• e TNF-a, modula IL-6 e estimula IL-1b por macrófagos residentes e inflamatórios. Ensaios de expressão e ativação mostram que macrófagos residentes expressam receptores opióides k seguido de m e d e macrófagos inflamatórios expressam receptores m seguido de k e d. A CRF interferiu, de maneira distinta, com a expressão destes receptores, dependendo do estado de ativação destas células. Antagonistas destes receptores bloquearam a ação da CRF, mostrando que este peptídeo possui ação imunomodulatória mediada por receptores opióides. / Crotalphine (CRF) is a peptide isolated from the venom of Crotalus durissus terrificus with type opioid antinociceptive effect only detected in the presence of inflammation. Studies on mechanisms of analgesia reported the action of opioids in immune cells and macrophages are considered as targets for these effects. This study characterized the action of CRF on functions of macrophages and assessed the importance of opioid receptors in these actions. The results indicate that CRF inhibits phagocytosis, release of H2O2 and production of NO• and TNF-a, modulates IL-6 and stimulates IL-1b production by resident and inflammatory macrophages. Expression and activation assays show that resident macrophages express k receptors followed by m and d. Inflammatory macrophages express m receptors followed by k and d. CRF interfered differently with the expression of these receptors, depending on the activation state of these cells. Antagonists of these receptors blocked the action of CRF, showing that this peptide has immunomodulatory action mediated by opioid receptors.

Leucotrienos (LTs) são mediadores lipídicos derivados do ácido araquidônico. Existem evidências que receptores da imunidade inata interagem com receptores para LTs amplificando funções efetoras de macrófagos. Investigamos se LTs modulam a fagocitose e a atividade microbicida via receptores Manose, Dectina -1 e PTX3 em macrófagos alveolares (AMs) e os mecanismos moleculares envolvidos. Nossos resultados mostram que: 1) AMs sintetizam LTs quando fagocitam C. albicans, Zy e Zy-PTX3; 2) LTs potencializam a fagocitose de C. albicans e Zy, mas não de Zy-PTX3. Este efeito dos LTs depende: do reconhecimento via receptor manose (LTB4) e Dectina-1 (LTD4); da integridade de lipid rafts; da ação em mecanismos de polimerização de actina; do aumento dos níveis de F-actina por inativação da Cofilina-1; da ativação das LIMKs, que regulam Cofilina-1; da ativação de PKC<font face=\"Symbol\">d e PI3K3) LTs aumentam a capacidade de AMs em matar C. albicans por ativação de NADPH oxidase. Em conjunto, mostramos que LTs potencializam programas de sinalização específicos para determinados PRRs. / Leukotrienes (LTs) are lipid mediators derived from arachidonic acid. There is evidence that innate immunity receptors and leukotrienes receptors interact and amplify macrophage effector functions. We investigated if LTs receptors modulate phagocytosis and microbicidal activity mediated by Mannose receptor, Dectin-1 and PTX3 in alveolar macrophages (AMs) and the molecular mechanisms involved. Our results showed that: 1) AMs produce LTs when stimulated with C.albicans, Zy, Zy-PTX3; 2) LTs enhance phagocytosis of C.albicans and Zymosan, but not Zy-PTX3. This is dependent on: recognition via mannose receptor (LTB4) and Dectin-1 (LTD4); integrity of lipid rafts; its action on actin polimerization mechanisms; enhancement of F-actin levels by induction of Cofilin-1 inactivation; activation of LIMKs that regulate Cofilin-1; activation of PKC<font face=\"Symbol\">d and PI3K3) LTs enhance killing of C.albicans by activation of NADPH oxidase. Taken together, our results showed that LTs specifically influence signaling programs of keys PRRs.

As poliaminas são essenciais para o controle dos mecanismos celulares nos seres vivos. A Migalina é uma acilpoliamina isolada de A. gomesiana com atividade microbicida contra E. coli, contudo, seu efeito imunomodulador é desconhecido. Sabendo que os mediadores imunes produzidos por macrófagos são críticos para a regulação da resposta imune, investigamos o efeito in vitro da Migalina sobre estas células. Demonstramos que a Migalina não induziu citotoxicidade, mas ativou iNOS, potencializando a síntese de nitrito. Aumentou a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">a, mas não de IL-12p40. IL-1<font face=\"Symbol\">b não foi detectada. Além disto, Inibiu a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">a e IL-12p40 induzida por LPS e quando associada à Polimixina B não alterou a síntese de TNF-<font face=\"Symbol\">a. Macrófagos deficientes de MyD88 não produziram TNF-<font face=\"Symbol\">a em resposta a Migalina, sugerindo que a sinalização mediada por TLR via MyD88 é requerida para a produção desta citocina. Comprovamos que a Migalina modula a atividade de macrófagos através de mediadores da resposta imune inata e pode ser explorada como estratégia no controle de infecções. / Polyamines are present in most living organisms. Mygalin is an acylpolyamine isolated from A. gomesiana that showed microbicide activity against E. coli, however, its immunomodulator effect has not been explored. Immune mediators produced by macrophages are essential for the regulation of immune responses. Our results showed that murine macrophages stimulated in vitro with Mygalin didnt induce cytotoxicity, but activated iNOS, inducing nitrite synthesis. The production of TNF-<font face=\"Symbol\">a was enhanced, but IL-12p40 was not. The presence of IL-1<font face=\"Symbol\">b was not detected. In higher concentrations, Mygalin inhibited significantly the production of IL-12p40 and TNF-<font face=\"Symbol\">a induced by LPS, and its association with Polymixine B did not altered the production profile of TNF-<font face=\"Symbol\">a. Macrophages deficient in MyD88 molecule activated with Mygalin did not induce the synthesis of TNF-<font face=\"Symbol\">a. Our results showed that Mygalin is capable of modulating the macrophage activity by inducing mediators of innate immune response and can be explored as a strategy in the studies to control pathogen infections.

O Histoplasma capsulatum (H.capsulatum) é um fungo dimórfico patogênico e responsável por graves lesões pulmonares, as quais se caracterizam pelo acúmulo de leucócitos ao redor do fungo, resultando na formação de granulomas. A infecção ocorre principalmente pela inalação de conídios ou pequenos fragmentos de micélio que alcançam os alvéolos, onde se transformam em leveduras, que é a forma patogênica do fungo. Na resposta imune do hospedeiro, as integrinas participam nos mecanismos fagocíticos, essenciais na resposta à histoplasmose. As 2integrinas contêm uma cadeia 2, também conhecida como CD18, comum a várias moléculas de adesão, e uma cadeia variável. Até o momento foram identificadas quatro cadeias distintas: L, a qual forma o dímero L2, também conhecido como LFA-1 (do inglês leukocyte function antigen-1) ou CD11aCD18; m, formando m2, chamado Mac-1 (do inglês macrophage differentiation antigen 1) ou CR3 (do inglês complement receptor 3) ou CD11bCD18; x, formando x2, CD11cCD18, gp150, 95 ou CR4 (do inglês complement receptor 4) e a cadeia d, formando d2, CD11dCD18. Neste trabalho, investigamos o papel da molécula CD18 em macrófagos alveolares (MAs) e macrófagos peritoneais (MPs) nas funções efetoras contra H. capsulatum e a relação do leucotrieno B4 (LTB4) nestas respostas. Inicialmente confirmamos que MAs e MPs provenientes dos animais CD18low, expressam baixa porcentagem de CD11bCD18 (CR3). Demonstramos que, como esperado, MAs e MPs de ambos os grupos fagocitam mais leveduras opsonizadas com complemento do que não opsonizadas. Surpreendentemente, MAs de animais CD18low fagocitam 136% mais leveduras opsonizadas do que MAs de C57BL/6. Também, MPs destes animais fagocitam aproximadamente 240% mais leveduras quando infectados com H. capsulatum e opsonizados, quando comparados aos MPs de C57BL/6. A adição de LTB4 aumenta a atividade fagocítica em 520% por MAs de animais C57BL/6 e 200% por MAs de CD18low, enquanto que a adição de LTB4 aumentou a fagocitose dos MPs de animais C57BL/6 em 600% vezes quando comparado aos MPs de CD18low. Este fenômeno foi inibido pela pré-incubação destas células com antagonista específico do receptor BLT1 apenas em animais C57BL/6. A adição de LTB4 na cultura de MPs reduziu a porcentagem de morte das leveduras apenas nos animais C57BL/6. Os animais CD18low produzem espontaneamente mais LTB4 e apresentaram um grande aumento na produção de óxido nítrico quando comparados aos animais C57BL/6. Pacientes acometidos pela Doença Granulomatosa Crônica (DGC) possuem deficiência congênita da molécula CD18. Células fagocíticas isoladas do sangue periférico de pacientes com DGC foram incubadas com leveduras opsonizadas e assim como macrófagos de animais deficientes de CD18, fagocitam mais leveduras opsonizadas (900%) ou não (300%), quando comparado com células de indivíduos sadios. Sugerimos que a molécula CD18 tem importante participação nos mecanismos efetores da imunidade inata, por mecanismo dependente de mediadores lipídicos, como o LTB4, no controle dos mecanismos de defesa contra H. capsulatum. / Histoplasma capsulatum (H. capsulatum) is a pathogenic dimorphic fungus and its infection is characterized by accumulation of leukocytes and granuloma formation. Infection occurs mainly by fungal inhalation that reaches the alveoli, which became yeast (the pathogenic form). in the immune response of host, integrins participate in phagocytic mechanisms, fundamental in the response against histoplasmosis.,8^2-integrin has a 02 chain known as CD18, usual to many adhesion molecules, and a variable a chain. Until the moment, it was identified four variable a chains: aL, that constitutes the dimer aL,82, also known as LFA-1 (leukocyte function antigen) or CD11aCD18; am forming the a^m,B^2 or Mac-1 (macrophage differentiation antigen 1) and CR3 (complement receptor 3) and CD11bCD18; ax, constituting the dimer Able CD11cCD18, gp150, 95 or CR4 (complement receptor 4) and ad chain, that constitutes a^d,8^2, CD11dCD18. In the present study, we sought to investigate the effect of CD18 in alveolar (AMs) and peritoneal macrophages (PMs) effecter functions against H. capsulatum and the relation of LTB^4 in those responses. We confirm that AMs and PMs of CD18\'°^W mice have low expression of ,32-integrin compared to wild type mice (WT). We demonstrate that, as expected, AMs and PMs from WT and CD18\'°^W, phagocytosed more complement (C)-opsonized yeasts than the unopsonized yeasts. Surprisingly, AMs from CD18\'°^Wmice phagocytosed 136% more (C)-opsonized yeasts than AMs obtained from WT. Also, PMs of CD18^b°^W mice phagocytosed 240% more (C)-opsonized yeasts than PMs of WT. The addition of LTB^4, increases the phagocytic activity by AMs of WT mice in 520% and by AMs from CD18\'°^W mice in 200%, while the addition of LTB^4 only increased the phagocytosis of C-opsonized H. capsulatum by PMs of C57BL/6 mice in 600%, when compaired with PMs from CD18\'°^W mice. This phenomenon was inhibited by pretreatment of these cells with an especific BLT1 receptor antagonist only in PMs from C57BU6 mice. The addition of LTB^4 in the culture of MPs reduced the percentage of death of yeasts in animals C57BL/6. CD18\'°^W mice, spontaneously produce more LTB^4 and showed a large increase in the production of nitric oxide when compared to C57BU6. Patients affected by Chronic Granulomatous Disease (DGC) have congenital deficiency of the CD18 molecule. Phagocytic cells isolated from peripheral blood of patients with DGC were incubated with C-opsonized yeasts and as well as macrophages from CD18\'°^W, phagocytosed more C-opsonized yeasts (900%) or not (300%) when compared with cells from healthy individuals.Therefore, we suggest that the CD18 molecule has important participation in the effector mechanisms of innate immunity, a mechanism dependent on lipid mediators such as LTB^4, to control these mechanisms in defense against H. capsulatum.

How do the brain and the immune system interact, and what are the consequences of this interaction on the physiology of an organism during infection? The main focus of my thesis is neuroimmune interaction, as studied in the following: (1) circadian regulation of immune system function, specifically phagocytosis by immune cells during bacterial infection; (2) the impact of circadian-regulated metabolism and feeding behavior on immunity and host tolerance of bacterial infection; and (3) immune system function in the context of Fragile X syndrome, a neurological disease known to cause circadian dysregulation. To investigate the interactions between these complex physiologies, I use the well-characterized and genetically tractable Drosophila melanogaster animal model. Each topic is briefly introduced in Chapter 1. Chapter 2 focuses on the body of work identifying the circadian regulation of the immune system, particularly phagocytosis, by immune cells during bacterial infection. Chapter 3 highlights findings regarding how diet and host metabolic state impact survival after infection. Chapter 4 illustrates phagocytic immune cell defects both systemically and in the brain in the Drosophila model of Fragile X syndrome. Lastly the conclusions discuss how these three works have built on our fund of knowledge of neuroimmune interactions and the future implications for these results.