Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les chimiokines sont des petites protéines qui régulent la migration et le "homing" des cellules leucocytaires. Elles jouent également un rôle clef dans le développement de certains cancers en régulant les phénomènes de prolifération, d'angiogenèse ou encore de migration des cellules métastatiques. À ce jour, environs 40 chimiokines et plus de 19 récepteurs appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) ont été répertoriés. De nombreuses études ont montré que les récepteurs liant les chimiokines pouvaient s'associer sous forme de complexes homo et hétéromériques. Les conséquences fonctionnelles associées à l'hétéromérisation sont diverses et fonction de la nature des récepteurs étudiés, du type de cellules sur lesquelles ces récepteurs sont exprimés et de l'expression relative des récepteurs. Cependant, le rôle physiologique exact de l’hétéromérisation des récepteurs aux chimiokines, et des RCPGs de manière générale, resteencore peu connu. Nous avons tenté de répondre à cette question dans ce travail de doctorat en étudiant plus particulièrement l’hétéromérisation de CXCR4 et CCR7 au cours du développement des lymphocytes B. Nous avons montré que le récepteur CXCR4 est exprimé à la surface des lymphocytes B à tous les stades de leur développement et qu’une diminution de l’expression de CXCR4s’opère lors de la transition du stade Pré-B vers les stades B immatures et matures. Cette transition s’accompagne d’une «uprégulation » du récepteur CCR7 qui est le plus fortement exprimé à la surface des lymphocytes B matures. Nous avons par ailleurs montré que la transition du stade Pré-B vers les stades B immatures et matures s’accompagne d’une forte inhibition de CXCR4, les cellules B matures étant totalement réfractaires à la migration dans un gradient de CXCL12. Cette perte totale de fonctionnalité ne pouvant pas s’expliquer par la diminution partielle de l’expression de CXCR4, nous avons testé si l’expression du récepteur CCR7 pouvait contribuer à la perte de fonction de CXCR4 observée. Dans un premier temps, nous avons comparé la capacité de CXCR4 à induire la chimiotaxie des lymphocytes B matures provenant de souris sauvages ou de souris CCR7KO déficientes pour l’expression de CCR7. Nous avons montré que l’absence de CCR7 permet de récupérer une migration significative des lymphocytes B matures dans un gradient de CXCL12. De manière intéressante, l’absence de CCR7 affecte spécifiquement la fonction de CXCR4 mais pas celle des récepteurs CXCR5 et CCR6 également exprimés à la surface des lymphocytes B matures. De plus, l’inhibition de CCR7 des lymphocytes B matures sauvages par des anticorps bloquant ne permet pas de reproduire l’effet de l’absence de CCR7. Ce résultat suggère que la signalisation du récepteur CCR7 ne serait pas impliquée. Nous avons également montré que l’absence de CCR7 s’accompagne d’un nombre plus important de lymphocytes B matures dans la moelle osseuse des souris CCR7KO, en parfait accord avec le rôle connu de CXCR4 dans la rétention des progéniteurs hématopoïétiques au sein de la moelle osseuse. Nous avonségalement montré que l’expression du récepteur humain CCR7 dans la lignée lymphocytaire Pré-B humaine Nalm-6 ou dans des cellules CHO-K1 exprimant le récepteur CXCR4 suffit à induire une perte de fonctionnalité de CXCR4. Tout comme pour les lymphocytes B maturesmurins, cette inhibition s’exerce en absence de toute stimulation de CCR7. Nous avons aussi montré que l’expression de récepteurs CCR7 mutants incapables de lier les chimiokines CCL19 et CCL21 (mutant CCR7NT) ou d’induire une signalisation (mutants CCR7D(R/A)Y et CCR7(N/A)PXXY) sont toujours capables d’induire l’inhibition de CXCR4, ce qui confirme qu’une signalisation CCR7 n’est pas nécessaire pour induire le phénomène de la régulation de CXCR4. Ce résultat montre aussi que les fonctions de signalisation et de régulation de CCR7peuvent être découplées.Nous avons également tenté d’identifier le mécanisme moléculaire associé à l’inhibition de CXCR4 par CCR7. Grâce à l’utilisation de biosenseurs BRET mesurant l’activation des protéines G, nous avons montré que l’expression de CCR7 inhibe fortement l’activation de la protéine Gαi2 connue pour jouer un rôle important dans la migration des lymphocytes. Ce résultat permet donc d’expliquer la perte de migration détectée dans les lymphocytes B coexprimant CXCR4 et CCR7. Cependant, nous avons aussi montré que l’expression de CCR7 n’empêche pas l’interaction physique de la protéine Gαi2 avec le récepteur CXCR4. Nous avons alors émis l’hypothèse que CCR7 exercerait son effetinhibiteur sur CXCR4 en interagissant physiquement avec lui et en altérant sa capacité à activer la protéine Gαi2. Nous avons montré par différentes techniques que le récepteur CCR7 interagit avec CXCR4 et que la conformation du complexe formé par CXCR4 et la protéineGαi2 est différente suivant que cette interaction a lieu au sein d’un homomère CXCR4/CXCR4 ou d’un hétéromère CXCR4/CCR7. L’ensemble de ces données suggère donc que l’hétéromérisation de CXCR4 avec CCR7 change la conformation du complexe CXCR4/Gαi2 et la capacité de CXCR4 à activer la protéine Gαi2. De manière intéressante, l’hétéromérisation de CXCR4 avec CCR7 inhibe également l’activation de la protéine Gαi1 mais pas celle de la protéine Gαi3. Ce résultat très intéressant suggère que l’hétéromérisation CXCR4/CCR7 ne serait pas simplement associée à une inhibition de la fonction de CXCR4 mais plutôt à une modulation de son profil d’activation. Cette hypothèse suggère donc que le récepteur CCR7 jouerait le rôle de modulateur allostérique endogène de CXCR4 capable de moduler l’activation de certaines voies de signalisation tout en en laissant d'autres fonctionnelles. Cependant, le manque de temps ne nous a pas permis de confirmer le maintiend’un signal dépendant de Gαi3 dans les cellules coexprimant CXCR4 et CCR7.L’ensemble de ces résultats suggèrent que le récepteur aux chimiokines CCR7 exercerait le rôle de modulateur allostérique de CXCR4 au cours du développement des lymphocytes B et que cette fonction nécessiterait l’interaction physique de CXCR4 et CCR7.À notre connaissance, ces résultats constituent la première indication que l’hétéromérisation de récepteurs aux chimiokines peut jouer un rôle dans un processus physiologique. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La mambaquarétine-1 (MQ-1), une toxine du mamba vert, est le tout premier peptide Kunitz à bloquer sélectivement l’activité du récepteur de type 2 à la vasopressine (V2R). Celui-ci contrôle la concentration finale des urines dans le rein. Impliqué dans plusieurs pathologies, son inhibition est actuellement considérée comme la meilleure stratégie thérapeutique dans le traitement de la polykystose rénale, une maladie génétique héréditaire. L’étude pharmacodynamique de MQ-1 sur des rats sains a confirmé son activité in vivo qui se traduit par un effet aquarétique dépendant de la dose. L’effet maximum est atteint 2 heures après injection intrapéritonéale et disparait avec un temps de demi-vie biologique variant de 1 à 4 heures selon la dose. L’administration quotidienne d’une faible dose a montré une accumulation de l’effet les trois premiers jours, avant un plateau, suggérant une activité résiduelle au-delà de 24 heures. Le criblage des trois autres venins de mambas ainsi qu’une analyse comparée des séquences peptidiques les plus proches dans les bases de données ont révélé l’existence d’un groupe phylogénétique de onze toxines Kunitz antagonistes de V2R. Une approche innovante, combinant tests de liaison de variants de MQ-1 et modélisation du complexe MQ-1-V2R, a permis de décrypter une partie du pharmacophore de la toxine. Les deux partenaires partagent une importante complémentarité ionique impliquant plusieurs boucles extracellulaires du récepteur, et une région hydrophobe de MQ-1 interagit au cœur de V2R à proximité de son site orthostérique supposé. Enfin, une première collaboration avec une industrie pharmaceutique a mis en évidence les points critiques à approfondir pour aboutir au développement thérapeutique de MQ-1. / Mambaquaretin-1 (MQ-1), a green mamba toxin, is the very first Kunitz peptide to selectively hinder the vasopressin type 2 receptor (V2R) activation. This receptor controls the final concentration of urine in kidneys. Involved in a number of pathologies, its inhibition is currently considered as the best therapeutic strategy in the treatment of polycystic kidney disease, a hereditary genetic disease. Pharmacodynamic study of MQ-1 carried out on healthy rats confirmed its in vivo activity which consists in inducing a dose-dependent aquaretic effect. Maximum effect is reached 2 hours after an intraperitoneal injection and disappears in a biological half-life ranging from 1 to 4 hours according to the dose. The daily injection of small quantities pointed to a cumulative effect over the first three days, leading to a plateau, which suggests a residual activity exceeding 24 hours. The screening of the three other mamba venoms along with a comparative analysis of the closest peptide sequences reported in databases revealed the existence of a phylogenetic group of eleven V2R antagonist Kunitz toxins. An innovative approach combining binding assays on MQ-1 variants and the modelling of the MQ-1-V2R complex has led to a partial deciphering of the pharmacophore of the toxin. The two partners share a significant ionic complementarity involving a number of extracellular loops of the receptor, and a hydrophobic region of MQ-1 interacts within V2R in the vicinity of its supposed orthosteric site. Lastly, a collaboration initiated with a pharmaceutical company brought out the need for the closer scrutiny of some crucial points to succeed in a therapeutic development of MQ-1.

RÉSUMÉ en françaisLes systèmes de délivrance de médicaments sont fortement investigués dans le but d’obtenir la meilleure efficacité thérapeutique et la plus faible toxicité possible. De nombreux systèmes existent à l’heure actuelle qu’ils soient mécaniques ou chimiques. Dans ce travail, nous nous sommes tout d’abord intéressés à une nouvelle approche basée sur la macropinocytose pour augmenter l’internalisation d’agents thérapeutiques aussi bien dans des cellules cibles de médicaments que dans des cellules souches mésenchymateuses d’origine musculaire (mdMSCs) actuellement de plus en plus étudiées comme nouveaux systèmes de délivrance. La macropinocytose est en effet une voie d’endocytose clathrine-indépendante permettant l’internalisation non sélective de fluide extracellulaire. Ce processus semble contribuer à l’agressivité des cancers en favorisant leur apport en nutriments, le recyclage de la membrane plasmatique et de ses récepteurs ainsi que l’internalisation d’exosomes. La macropinocytose est déclenchée notamment par l’activation des récepteurs epidermal growth factor receptor (EGFR) et platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) qui sont des marqueurs connus d’agressivité des gliomes. Au cours de ce travail, nous nous sommes demandé si la macropinocytose ne pourrait pas être utilisée pour améliorer l’internalisation d’agents chimiothérapeutiques dans les cellules de glioblastomes. Nous avons tout d’abord montré que l’expression des acteurs clés de la macropinocytose au niveau de leur ARNm est fortement altérée en fonction du grade de la tumeur en utilisant des bases de données publiques d’échantillons de tumeurs gliales humaines. Une « signature » basée sur l’expression de 38 gènes liés à la macropinocytose permet la discrimination des échantillons de glioblastomes, c’est-à-dire des tumeurs les plus agressives. Nous avons ensuite comparé les effets induits par le MOMIPP et le Vacquinol-1, deux inducteurs connus de macropinocytose, à ceux de l’Honokiol qui induit également une vacuolisation sévère au sein de cellules de gliomes. Malgré de fortes similarités morphologiques, l’Honokiol se distingue par l’induction de vacuoles provenant à la fois d’endocytose mais aussi du réticulum endoplasmique. Chacun des trois composés induit néanmoins une nette augmentation de l’internalisation de dextrans de 10 kDa. Le marquage à l’acridine orange suggère pourtant des différences dans le devenir des vacuoles induites par ces trois molécules. Il a récemment été démontré que le MOMIPP agit en empêchant la maturation des macropinosomes ce qui concorde avec notre observation d’une fusion avec les lysosomes qui serait très limitée. Si les trois molécules permettent bien d’augmenter également la concentration de témozolomide (traitement de référence) au sein des cellules de gliomes, leur impact sur l’internalisation de la doxorubicine est plus faible. L’augmentation de l’internalisation des médicaments par l’induction de macropinocytose ne semble donc pas toujours efficace et pourrait dépendre de leurs propriétés physico-chimiques ainsi que de leur voie d’internalisation basale. Étant donné que l’induction soutenue de macropinocytose peut également déclencher la mort cellulaire tant de cellules de glioblastome chimio-sensibles que chimio-résistantes, nous proposons d’envisager la macropinocytose dans des approches combinées pour bénéficier d’une augmentation de l’internalisation de médicaments et d’effets additifs/ synergiques. Comme les cellules souches mésenchymateuses sont intensément étudiées pour leur utilisation en tant que transporteur de médicaments en plus de leur potentiel intrinsèque pour la médecine régénérative, les effets de ces inducteurs de vacuolisation ont également été étudiés sur des mdMSCs. Ces dernières sont caractérisées par un niveau basal de macropinocytose plus élevé que les modèles de gliomes utilisés et elles semblent mieux répondre au Vacquinol-1 qui permet d’ailleurs d’augmenter plus efficacement la concentration intracellulaire en doxorubicine que le MOMIPP, avec une internalisation environ 2 fois plus importante qu’en absence de stimulation. Ces cellules pouvant être utilisées comme véhicule pour le transport de molécules ayant une faible biodisponibilité afin d’améliorer leur usage en clinique, nous avons ensuite évalué l’impact du chargement de mdMSCs avec de la curcumine, un polyphénol naturel bien connu pour ses propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires dont le potentiel clinique reste limité notamment par sa faible solubilité. Pour cette raison, l’utilisation du NDS27, un complexe de lysinate de curcumine et d’hydroxy-propyl-bêta-cyclodextrine qui présente une bien meilleure solubilité dans l’eau, a été préférée. Nous avons observé que l’internalisation de la curcumine, provenant du NDS27, dans les mdMSCs est concentration-dépendante et non temps-dépendante. De plus, elle ne peut pas être augmentée par l’utilisation d’inducteurs de macropinocytose. De plus amples investigations des effets de l’internalisation de la curcumine à partir du NDS27 en fonction de la concentration sur leur viabilité, prolifération, propriétés mésenchymateuses et leur fonction mitochondriale nous ont permis de montrer qu’un chargement de 2 h avec 7 µM de NDS27 était acceptable en vue de préserver la possibilité de bénéficier des mdMSCs en tant qu’agent de thérapie cellulaire régénérative en sus de leur aspect de délivrance. L’investigation du potentiel thérapeutique de telles mdMSCs chargées en curcumine pour traiter l’arthrose chez le cheval est toujours en cours. / SUMMARYDrug delivery systems are highly investigated with the aim to promote the best therapeutic efficacy and the lowest possible toxicity. Nowadays, several systems either mechanical or chemical exist. In this work, we were first interested in studying a new approach based on macropinocytosis to increase the internalisation of therapeutic agents in both target cells of drugs and skeletal muscle-derived mesenchymal stem cells (mdMSCs) currently more and more studied as new deliverance systems. Macropinocytosis is indeed a clathrin-independent endocytosis pathway allowing the nonselective internalisation of extracellular fluid. This process seems to contribute to cancer aggressiveness by favouriting nutrient supply, recycling of plasma membrane and its receptors, and exosome internalisation. Macropinocytosis may notably be triggered by epidermal growth factor receptor (EGFR) and platelet-derived growth factor receptor (PDGFR), two well-known markers of glioma aggressiveness. During this work, we wondered whether macropinocytosis could be used to improve the internalisation of chemotherapeutic agents into glioblastoma cells. We first showed that the mRNA expression levels of key actors of macropinocytosis are strongly altered according to the grade of the tumour using public datasets of human glioma tumour samples. A “signature” based on the expression of 38 macropinocytosis-related gene allows the discrimination of the glioblastoma samples, i.e. the most aggressive tumours. We next compared the effects induced by MOMIPP and Vacquinol-1, two well-known macropinocytosis inducers to those of Honokiol which also induces a severe vacuolisation within glioma cells. Despite high phase-contrast morphological similarities, Honokiol appeared different from the others by the induction of vacuoles from both endocytosis and endoplasmic reticulum origins. Each of the three compounds nevertheless induces a marked increase in 10 kDa dextran internalisation. Acridine orange staining however suggested differences in the fate of vacuoles induced by those three molecules. MOMIPP has recently been shown to prevent the macropinosomes maturation which is consistent with our observation ofthe lack of acridine orange staining of the vacuoles that may be attributed to a limited fusion with lysosomes. Although each of the three compounds allows nevertheless a marked increase of temozolomide (i.e. first-line treatment) concentration into glioma cells, their impact on the internalisation of doxorubicin is poor. The increased internalisation of drugs by inducing macropinocytosis does not seem to be always efficient and could depend on their physicochemical properties and their basal way of internalisation. Considering that sustained macropinocytosis induction may also trigger cell death of both chemo-sensitive and chemo-resistant glioblastoma cells, we proposefor future perspectives to consider macropinocytosis in combination approaches to benefit from an increased drug uptake and additive/synergistic effects. As mesenchymal stromal / stem cells are increasingly studied for their use as drug-carrier in addition to their intrinsic potential for regenerative medicine, the effects of these vacuolisation inducers were also studied on mdMSCs. These lasts are characterised by a higher basal level of macropinocytosis than the glioma models used in this work. They seem to better respond to Vacquinol-1 which allows to increase more efficiently the intracellular concentration of doxorubicin than MOMIPP, with an uptake approximatively 2-fold higher than without stimulation. Given that these cells can be used as vehicle to transport molecules with a poor bioavailability in order to improve their clinical usage, we evaluated the impact of the loading of mdMSCs with curcumin, a natural polyphenol well-known for its antioxidant and anti-inflammatory properties whose clinical potential remains limited notably by reason of its poor solubility. Therefore, the use of NDS27, a complex of curcumin lysinate and hydroxypropyl-beta-cyclodextrin displaying an increased solubility in aqueous solution, was preferred. We observed that the uptake of curcumin from NDS27 into mdMSCs is concentration-dependent and not time-dependent. Moreover, it cannot be improve using macropinocytosis inducers. Further investigations of the effects of curcumin internalisation from NDS27 depending on the concentration used on their viability, proliferation, mesenchymal properties and their mitochondrial function allowed us to show that a loading of 2 h with NDS27 at 7 µM seems acceptable to preserve the possibility to benefit from mdMSCs as a cellular therapy agent in addition to the delivery aspect. The investigation of the double potential therapeutic benefits of such curcumin-loaded mdMSCs to treat osteoarthritis in horses is still ongoing. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

The development of reliable and cost-saving methods to select pre-clinically new potential drugs with unknown and original mechanisms of action for cancer therapy has become crucial. Previous investigations demonstrated that infrared spectra of cancer cells exposed to well-known anticancer drugs used in the clinics provide a global fingerprint of all the metabolic modifications induced. Nowadays several natural products have been recognized for their medicinal values. Polyphenolic compounds constitute one of the largest groups of plant metabolites and many studies have demonstrated their anticancer properties at multiple steps of carcinogenesis. Taking into account the large diversity of polyphenolic structures in nature and their numerous targets against carcinogenesis, the step of selection becomes essential as it is virtually impossible to classify them using traditional classification techniques. While FTIR spectroscopy appears to have a definite potential to sort anticancer drugs on the basis of the metabolic modifications they induced, the present challenge in this thesis is to evaluate the drug-induced spectral changes in cancer cells on a larger scale. The coupling of FTIR spectroscopy with a high throughput screening extension could become a useful method to generate drug classifications based on the “modes of action”. In a first step, the IC50 was evaluated for each polyphenol to normalize all spectral experiments that will be carried out on breast cancer cells. The first experiments revealed dispersive artifacts (wide variations of absorbance distribution and Mie scattering effects) contributing to spectral measurements. To minimize them, the best option was covering uniformly the surface of spectral measurement with cells (detailed in chapter III). Once the protocol refined, it was applied to the study of MDA-MB-231 breast cancer cells exposed for 24 hrs to 15 polyphenols. Through unsupervised and supervised statistical analyses, a distinction between polyphenol treatments could be well established. Complex effects of polyphenols on cancer cells were revealed, suggesting that mechanisms specific to each polyphenol were evidenced by the whole infrared spectrum. Clustering of polyphenol-induced spectral signatures by Hierarchical Cluster Analysis indicates that some of the polyphenols share similar effects on MDA-MB-231 (detailed in chapter IV). This experiment was then extended to another breast cancer cell line, MCF-7. It demonstrated a cell line dependency to polyphenolic treatments. Finally a subcellular investigation of treated MCF-7 breast cancer cells in their live state was done using Raman imaging. A distinction between nucleus and cytoplasm of treated cells brought supplementary information regarding the effect of polyphenols, leading to subcellular biological assumptions on polyphenol effects. These results paves the way for a new classification based on infrared spectral signatures that reflect the overall chemical modifications experienced by the cells when exposed to drugs. / Le développement de méthodes fiables et peu cher pour sélectionner de potentiels nouveaux médicaments présentant un mécanisme d’action original et inconnu avant toute étape clinique devient crucial. De précédentes études ont pu démontrer que les spectres infrarouges de cellules cancéreuses exposées à des agents anticancéreux connus et utilisé dans le monde clinique fournissent une empreinte globale de toutes les modifications métaboliques induites. La spectroscopie infrarouge est un outil innovant qui semble prometteur pour offrir un aperçu global des processus biologiques et physiologiques qui sont menés par un médicament dans des cellules cancéreuses. De nos jours, de nombreux produits naturels ont été reconnus pour leurs propriétés médicinales. Les polyphénols constituent l’un des plus vastes groupes de métabolites végétaux et de nombreuses études ont démontré leurs propriétés anticancéreuses à de multiples étapes de la carcinogénèse. En prenant en compte la très grande diversité de structures polyphénoliques existantes dans la nature et leurs nombreuses cibles anti-tumorales, l’étape de sélection est devenue essentielle comme il est virtuellement impossible de les classifier grâce à des techniques de classification traditionnelles telles que les études –omiques. Dès lors, le défi de cette thèse est d’évaluer les variations spectrales induites par un polyphénol dans des cellules cancéreuses à une plus grande échelle. Le couplage de la spectroscopie IRTF avec une extension de criblage de haut débit pourrait devenir une méthode utile pour générer des classifications de molécules sur base de leur « modes d’action ». Dans un premier temps, la concentration qui inhibe 50% de la croissance des cellules cancéreuses fut déterminée pour chaque polyphénol et chaque lignée de cellules cancéreuses. Le traitement des cellules à cette concentration permet une normalisation interne des expériences réalisées ultérieurement en spectroscopie infrarouge. Une fois le protocole établi, la lignée MDA-MB-231 fut exposée durant 24 heures à 15 polyphénols différents. Au moyen d’analyses statistiques multivariées supervisées et non supervisées, une distinction parmi les polyphénols a pu être établie et des effets complexes des polyphénols sur les cellules cancéreuses ont pu être révélés, suggérant des mécanismes d’action spécifiques à chaque polyphénol mis en évidence par spectroscopie infrarouge. Finalement, une étude subcellulaire sur cellules vivantes fut réalisée par imagerie Raman sur une seconde lignée de cellules cancéreuses mammaires appelées MCF-7. Cela permis de compléter en partie l’information macroscopique offerte par la spectroscopie infrarouge par une information microscopique sur l’effet de certains polyphénols. Cette thèse a ouvert la voie pour de nouvelles techniques de classification d’agents anticancéreux basées sur la spectroscopie infrarouge, technique sensible à l’ensemble des modifications chimiques subies par des cellules. / Option Chimie du Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished