Le paludisme est causé par l'infection et la destruction des érythrocytes par les parasites protozoaires appartenant au genre Plasmodium. Au cours de son développement dans l'érythrocyte,Plasmodium falciparum requiert la biosynthèse massive de membranes dont les principaux constituants lipidiques sont des phospholipides. La phosphatidylcholine (PC) et la phosphatidyléthanolamine (PE) représentent à elles deux environ 80 % des lipides membranaires et l'inhibition de leur biosynthèse est létale pour le parasite. La PC et la PE sont synthétisées par le parasite, principalement via les voies de novo dépendantes de la CDP-choline et de la CDP-éthanolamine (ou voies de Kennedy) en utilisant respectivement la choline et l'éthanolamine comme précurseurs. Ces travaux de thèse se focalisent sur les deux enzymes CTP:phosphocholine etCTP:phosphoéthanolamine cytidylyltransférase (PfCCT et PfECT, respectivement), catalysant les étapes limitantes des voies de Kennedy. Chez Plasmodium, les CCT et ECT possèdent deux domaines cytidylyltransférases (CT) portant l'activité catalytique, séparés par une longue région de liaison. Pour la CCT, cette duplication est retrouvée seulement chez trois organismes, tous faisant partie du phylumdes Apicomplexes : Babesia, Theileria et Plasmodium, alors que la présence de deux domaines CT estune caractéristique retrouvée chez toutes les ECT étudiées à ce jour. La première partie de ce travail de thèse concerne la caractérisation biochimique et l'inhibition la PfCCT Nous avons montré que les deux domaines CT de la PfCCT sont actifs à l'inverse de la PfECT pour laquelle seul le domaine CTN-terminal est catalytiquement actif. A la suite d'un criblage virtuel basé sur la structure de l'enzyme,nous avons identifié un composé princeps capable d'inhiber l'activité de la PfCCT in vitro, la synthèse de PC et la croissance parasitaire. Ce premier composé actif (haut µM) représente une base pour l'optimisation future de nouveaux composés plus efficaces. Dans la deuxième partie de cette thèse,nous avons déterminé le mécanisme catalytique, la spécificité de liaison des ligands et l'organisation structurale de la PfECT grâce à la combinaison d'approches biochimiques et biophysiques. L'ensemble des résultats présentés dans ce manuscrit apportent un éclairage important concernant le fonctionnement de ces deux cibles potentielles et constituent des étapes essentielles à l'élaboration d'une approche thérapeutique. / Malaria is caused by the infection and destruction of red blood cells by protozoan parasitesbelonging to the genus Plasmodium. During its intra-erythrocytic development, Plasmodiumfalciparum requires massive biosynthesis of membranes which are mainly composed of phospholipids.Phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE) together represent about 80% of thetotal membrane lipids and inhibition of their biosynthesis leads to parasite death. PC and PE aresynthesized by the parasite's machinery mainly through the de novo CDP-choline and CDPethanolamine(Kennedy) pathways using respectively choline and ethanolamine as precursors. Thisstudy focuses on the rate limiting steps of these pathways catalyzed by CTP:phosphocholine andCTP:phosphoethanolamine cytidylytransferases (PfCCT and PfECT, respectively). In Plasmodiumspecies, both CCT and ECT contain two catalytic cores (CT domains) separated by a long linker.Interestingly, for CCT this feature is found only in three organisms, all from the phylum ofApicomplexa: Babesia, Theileria and Plasmodium, whereas the presence of two CT domains is ageneral feature in all ECTs known so far. The first part of this work consists in the biochemicalcharacterization of PfCCT and the investigation of its druggability. We showed that both PfCCT CTdomains are active and display similar kinetic parameters while only the N-terminal CT domain wasactive in PfECT. Subsequent to an in silico structure-based screening of compounds libraries, weidentified a PfCCT inhibitor able to inhibit PC synthesis as well as P. falciparum growth in vitro in thehigh µM range. This compound represents a first step toward the optimization of future more potentcompounds. In the second part of this study, we investigated the catalytic mechanism of PfECT anddeciphered its interactions with its ligands using biochemical, biophysical and structural approaches.Collectively, these results bring new insights into the biochemical and structural properties of thesetwo keys enzymes of the phospholipid metabolism in P. falciparum and pave the way for their futuredevelopment as potential drug target.

Les corps lipidiques (CLs) sont des organites de stockage de lipides neutres rencontrés dans des organismes très variés, depuis les procaryotes jusqu’aux organismes complexes (animaux, végétaux). La surface des CLs est constituée d’une monocouche de phospholipides (PLs) entourant un coeur hydrophobe dans lequel sont stockés les lipides neutres. La monocouche de PLs est associée plus ou moins étroitement avec des protéines structurales, capables de stabiliser les CLs et d’accompagner certaines de leurs modifications morphologiques. Dans les graines de plantes oléagineuses, les CLs sont stabilisés par les oléosines. Ces protéines contiennent le plus long domaine hydrophobe connu (70 résidus) situé entre deux extrémités N et C-terminales hydrophiles. Leur mode d’association avec les CLs n’est pas connu et la littérature fait état de résultats contradictoires concernant leur structure secondaire. Nous avons montré que les oléosines de graines d’Arabidopsis thaliana sont maintenues en solution par différentes catégories de surfactants, comme les détergents anioniques ou des polymères amphiphiles appelés amphipols (Apols). La détermination de la structure secondaire des oléosines maintenues en solution dans ces différents surfactants, par dichroïsme circulaire utilisant le rayonnement synchrotron, a mis en évidence des profils contrastés. Les détergents chargés augmentent le contenu en hélices α des oléosines alors que des proportions plus importantes de feuillets β sont observées avec le détergent zwitterionique (Foscholine-12) ou les Apols. Afin d’obtenir un profil structural modèle dans un système proche du naturel, nous avons réalisé une expression hétérologue d’une isoforme d’oléosine pour la cibler dans les CLs de Saccharomyces cerevisiae. Les CLs purifiés de levures restent intacts et contiennent une forte majorité de cette isoforme d’oléosine à leur surface. Nous avons été les premiers à montrer que les oléosines étaient repliées dans un tel environnement, avec un profil structural majoritairement β. Celui-ci se rapproche du profil observé en Foscholine-12. Ce détergent est par conséquent un outil de choix pour envisager des études structurales plus résolutives (structures tridimensionnelles). / Lipid Bodies (LBs) are neutral lipid storage organelles found in various organisms from procaryotic cells to complex organisms. These neutral lipids are packed into the core of the particle which is surrounded by a phospholipid monolayer. The surface of LBs is more or less tightly associated with structural proteins involved in their stabilization and able to assist modifications of their shape or size. In oleaginous seeds, LBs are stabilized by oleosins. These proteins contain the longest known hydrophobic domain (70 residues) flanked by hydrophilic N and C-termini. The way of association of these proteins with LBs is poorly known and secondary structure descriptions in the literature are contradictory. We have shown that Arabidopsis thaliana seed oleosins could be solubilized by various surfactants such as detergents or amphiphatic polymers called amphipols (Apols). Secondary structure determination of solubilized oleosins using synchrotron radiation circular dichroism gave contrasted profiles. Negatively charged detergents increase the α-helix content of oleosins whereas the zwitterionic detergent (Foscholine-12) or Apols allow higher proportions of β-sheets. In order to get closer to the natural environment of olesins, we have opted for the heterologous expression of one oleosin isoform in the yeast Saccharomyces cerevisiae. This approach allows the biological targeting and insertion of oleosins into cytosolic LBs. Purified yeast LBs remain intact and contain a large majority of oleosins at their surface. In this natural like environment, oleosins are folded and contain a majority of β-sheets. This secondary structure profile is close to that of oleosins solubilized by Foscholin-12, making it a suitable detergent for more resolutive structural studies (three-dimensional structures).

Le lipidome désigne la sous-fraction lipidique du métabolome d’une cellule, d’un tissu ou d’un organisme. Cependant, bien qu’appartenant au cadre général de la métabolomique, la lipidomique représente un champ d’investigation particulier en raison des spécificités fonctionnelles et métaboliques des lipides de même que de leurs propriétés physico-chimiques. L’analyse lipidomique représente un changement majeur d’échelle par rapport à l’analyse des lipides telle que pratiquée classiquement. L’objectif est ici d’atteindre l’échelle de l’espèce moléculaire lipidique en termes d’identification et de quantification afin de décrire l’ensemble des perturbations d’un réseau métabolique liées à un état physiologique ou pathologique. L’identification des classes et espèces repose sur principalement sur l’utilisation du couplage de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse. La quantification peut faire appel à la spectrométrie de masse quand la spécificité et des faibles limites de détection sont requises ou à l’utilisation de détecteurs « universels » ou détecteurs par nébulisation que sont le détecteur évaporatif à diffusion de la lumière (DEDL) ou le détecteur d’aérosol chargé (Corona®-CAD) quand l’objectif est de quantifier l’ensemble de la classe lipidique. / The lipidome means the lipid subfraction of a metabolome, of a cell, a tissue or an organism. Lipidomics represents a particular field of investigation because of the functional and metabolic specificities of lipids as well as their physico-chemical properties. Lipidomics analysis represents a major change of scale with respect to lipid analysis as practiced conventionally. The aim of this work is to reach across the lipid molecular species in terms of identification and quantification in order to describe all the perturbations of a metabolic network related to a physiological or pathological state. The identification of the classes and the specie is based mainly on the use of liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Quantification may use mass spectrometry when the specificity and low detection limits are required or the use of "universal" detectors that are nebulized detectors:evaporative detector light scattering (ELSD) or charged aerosol detector (CAD-Corona®) when the aim is to quantify the total lipid classes.

La Structuration des molécules d’eau à l’interface eau/vapeur d’eau fait l’objet de l’intérêt scientifique depuis des années. La plupart des études sont focalisées sur le bulk d’eau mais des études plus détaillées sur l’eau de surface sont nécessaires. De plus, les interfaces avec les alcanes sont intéressantes d’un point de vue biologique et industriel. Puisque pour des applications biologiques et industrielles les interfaces eau/air et eau/huile possèdent des médiateurs amphiphiles, l’influence d’une monocouche de tensioactif sur la structuration de la surface de l’eau mérite aussi une attention particulière.Dans cette thèse, plusieurs modèles atomistiques d’eau ont été sélectionnés. Des simulations de dynamique moléculaire classique ont été réalisées à 298K pour le bulk d’eau, des systèmes eau/vapeur d’eau et eau/alcane (C5-C9), ainsi que des systèmes eau/DLPC/vapeur d’eau et eau/DLPC/octane (DLPC : dilauroyl phosphatidylcholine). Plusieurs propriétés structurelles, ainsi que les moments dipolaires, la tension de surface et les liaisons hydrogène, du bulk d’eau et des couches de surface d’eau ont été examinées grâce à la fonction de distribution radiale et les diagrammes de Voronoi. L’objectif a été d’estimer l’impact de l’incorporation de la polarisabilité sur les propriétés de l’eau et de sélectionner un modèle optimal (qualité/temps de calcul) pour leur description, ainsi que d’enrichir les données existantes sur la structuration de l’eau à l’interface.Cette étude aborde la structuration de l’eau du bulk et de la surface à l’interface avec la vapeur d’eau ou des alcanes. Un des objectifs de ce travail a été d’évaluer la reproductibilité des données expérimentales en utilisant différents modèles et de s’assurer pour quelles propriétés l’utilisation d’un modèle polarisable est critique. De simples modèles polarisables basés sur les oscillateurs de Drude ont été testés afin de limiter le temps de calcul. Pour le bulk d’eau et les systèmes eau/vapeur d’eau, les modèles TIP4P, SWM4-NDP et COS/G2 ont été les plus performants. Dans la mesure où le modèle TIP4P produit des résultats commensurables avec les modèles polarisables, il a été utilisé pour la simulation des interfaces eau/alcanes (C5-C9). Les molécules à la surface sont organisées de manière plus compacte et moins ordonnée. Cette diminution de l’ordre est principalement due aux liaisons hydrogène qui sont deux fois plus nombreuses dans le bulk qu’en surface. Les analyses de Voronoi ont montré que la coordination tétraédrique n’est pas si claire et que des polyèdres plus complexes sont formés. Les couches de surfaces trouvées s’avèrent être formées de 2 sous-couches, interne et externe, avec des polarités inégales orientées de manières opposées, définissant des zones de charges résiduelles à l’interface.En plus des systèmes avec un contact direct entre l’eau et le fluide apolaire, des interfaces comportant des monocouches de lipides ont été modélisées. La compacité de l’eau de surface, déjà renforcée par la présence d’alcanes, a été augmentée davantage par l’introduction de lipide. Néanmoins, l’orientation de l’eau a été changée et la polarité de la surface inversée, équilibrée par les têtes lipidiques au lieu des sous-couches externes diffuses.Les résultats principaux de cette thèse de doctorat sont les suivants:1. Il a été montré que l’utilisation de modèles d’eau polarisable n’est pas nécessaire pour une évaluation correcte d’un certain nombre de propriétés, mais elle est critique pour les moments dipolaires et la tension de surface.2. Pour la première fois une analyse structurelle a été réalisée en utilisant les diagrammes de Voronoi et un ensemble de modèles d’eau démontrant la différence entre propriétés de l’eau liquide en bulk et en surface.3. Considérant le nombre limité de données existantes, l’étude d’une monocouche de DLPC solide condensée à l’interface eau/vapeur et eau/octane en utilisant différents modèles d’eau a été une contribution originale. / The structuring of water molecules at the water/vapour interface is an object of scientific interest for decades. Most of the existing theoretical studies are focused on bulk water but there is still need of a more detailed research on surface water. In addition, interfaces with alkanes are interesting as being instructive from both biological and industrial perspectives. Since in both bio- and industrial applications water/air and water/oil interfaces are mediated by amphiphiles, the role of a surfactant monolayer on surface water structuring deserves more attention as well.In the present Ph. D. thesis several atomistic water models were chosen and classical molecular dynamics simulations were carried out on bulk water, water/vapour and water/alkane (from pentane to nonane) systems, as well as on water/DLPC/vapour and water/DLPC/octane models, DLPC being dilauroyl phosphatidylcholine. In all cases the temperature was kept at 298 K. Several structural properties of bulk and surface water layers were examined by means of radial distribution functions and Voronoi diagrams. Dipole moments, surface tension and hydrogen bonding were tackled too. The objective was to estimate the impact of accounting for polarisability on the water properties of interest and to select a cost-efficient water model for describing them, as well as to add new data to the existing knowledge about interfacial water structuring.The study addresses the water structuring in bulk and surfacial water at the interface with vapour or alkanes of different chain length. One of the aims of the work was to assess the reproducibility of experimental data using an assortment of polarisable and non-polarisable water models and to check for which properties the utilisation of polarisable models is critical. Simple polarisable models based on Drude oscillators were tested in order to keep the computational costs low. For bulk water and water/vapour systems the models TIP4P, SWM4-NDP and COS/G2 performed the best. Since the TIP4P model produced results commeasurable with the polarisable ones, it was used predominantly further on to simulate water/alkane (C5-C9) interface and to quantify the structural parameters of water obtained from RDFs and Voronoi analyses. The molecules in this layer are organised in a more compact and less ordered manner. The ordering is owed mainly to hydrogen bonds which are twice as many in the bulk compared to the surface. The analysis of the Voronoi diagrams showed that the tetrahedral coordination was blurred and more complex polyhedra were formed. The surface layer was found to consist of two sublayers, inner and outer, with oppositely oriented unequal polarity, defining areas of residual charges at the interface.In addition to the systems with direct contact between water and non-polar fluids, interfaces mediated by lipid monolayers were modelled. The monolayer was meant to seam together the two phases. The compactness of the surfacial water, which was enhanced by the presence of alkanes, was tightened further by the lipid introduction. However, the water orientation was changed and the surfacial polarity was inverted, balanced by the lipid heads instead of the diffuse outer sublayer.The main contributions of the Ph.D. thesis are as follows:1. It is shown that the usage of a polarisable water model is not necessary for correct evaluation of a number of properties, but is critical for characteristics such as dipole moments and surface tension.2. For the first time a structural analysis has been made using Voronoi diagrams and an assortment of water models which demonstrates the difference between bulk and surfacial characteristics of liquid water.3. An original contribution is the study of a solid-condensed DLPC monolayer at the water/vapour interface utilising different water models and at the interface of water/octane, considering the limited experimental data available.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La recoverine et la GCAP-1 sont des protéines de la famille des neuroprotéines sensibles au calcium (NCS). Ces protéines sont N-myristoylées et possèdent des motifs EF-hand permettant la liaison du calcium. Elles participent à la phase de recouvrement de la phototransduction visuelle qui a lieu dans les segments externes des photorécepteurs. La liaison membranaire de la recoverine et de la GCAP-1 a été principalement étudiée à l'aide de films monomoléculaires de phospholipides. Nous proposons une méthode d'analyse qui permet d'identifier l'affinité des protéines aux monocouches de phospholipides. Cette méthode pourrait permettre d'identifier rapidement la liaison périphérique des protéines aux monocouches lipidiques. Nous encourageons son utilisation afin de déterminer si elle peut constituer les bases d'un modèle d'analyse plus général. La recoverine est une protéine extrinsèque amphitropique. En absence de calcium, le groupement acyle de la recoverine est enfoui dans une poche hydrophobe. Par contre, en présence de calcium, des réarrangements structuraux permettent l'extrusion de ce groupement myristoyle et induisent la liaison membranaire de la recoverine. Nous avons déterminé que la recoverine possède une forte affinité pour les monocouches de phospholipides anioniques. Cette affinité semble induite par la présence d'un cluster de charges positives situé à proximité du groupement myristoyle. De plus, la N-myristoylation semble être responsable d'une augmentation de la distribution latérale de la liaison membranaire de cette protéine. Ces travaux amènent maintenant à s'intéresser à l'influence de la teneur des membranes discales des photorécepteurs en phospholipides polyinsaturés sur la liaison membranaire de la recoverine. Sur la base d'une structure à haute résolution, il a été déterminé que la GCAP-1 ne possède pas un mécanisme de calcium-myristoyl switch fonctionnel. Toutefois, nous présentons une analyse des structures des protéines de la famille des NCS qui suggère que l'extrusion du groupement myristoyle de la GCAP-1 serait possible en présence de membranes. Nous avons montré qu'une fraction de ces groupements acyles s'insère dans les membranes. La GCAP-1 possède par ailleurs une forte affinité pour les phospholipides anioniques. Nous proposons un mécanisme d'activité pour cette protéine. Des études structurales seront nécessaires afin d'infirmer ou de confirmer ce mécanisme.

Cette thèse porte sur la caractérisation de différents systèmes membranaires et se divise en deux grandes parties. Une première partie traite des interactions entre des membranes modèles de phospholipides et des agents chimiothérapeutiques, les chloroéthylurées (CEU) et une deuxième partie présente un système membranaire, appelés nanoÉrythrosomes, utilisé potentiellement comme transporteur de molécules d'intérêt thérapeutique. Ces deux systèmes ont été caractérisés par un duo de méthodes spectrales soit la spectroscopie infrarouge et la résonance magnétique nucléaire. Plusieurs dérivés de CEU, différents de par leur structure et leur activité cytotoxique, ont été étudiés. Leurs interactions avec des membranes de phospholipides ont d'abord été étudiées par spectroscopie RMN des solides du deutérium afin de montrer l'effet de l'incorporation des CEU sur l'ordre conformationnel du phospholipide deutéré utilisé. Des mesures de l'écart quadrupolaire des deutérons de la chaîne acyle ont permis d'appuyer un modèle proposé pour l'incorporation des CEU dans des membranes modèles de phospholipides. Des systèmes similaires ont ensuite été étudiés par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (IRTF) afin de vérifier l'effet de ces molécules sur les chaînes acyle de phospholipides saturés et insaturés et ce, en présence et en absence de cholestérol. L'effet observé est fortement corrélé à la structure de la CEU et à son activité anticancéreuse. L'ensemble de ces travaux a également permis de montrer que l'effet des CEU les plus cytotoxiques est toujours présent à plus faible concentration. Dans la seconde partie de la thèse, le nanoÉrythrosome, système biologique composé de lipides et de protéines provenant de membranes de globules rouges, a été étudié comme système pur et recouvert de polyéthylène glycol de poids moléculaire de 2000 et 5000 g-mol"1 . Par le greffage de polyéthylène glycol à sa surface, le nanoÉrythrosome devient alors un système intéressant pour la libération de médicaments. La spectroscopie infrarouge a permis de caractériser ce système tant au niveau de sa portion lipidique que protéique en fonction de la température. La spectroscopie RMN des solides du phosphore-31 et la microscopie électronique ont permis quant à elles de démontrer que la présence de polyéthylène glycol diminue l'agrégation des nanoÉrythrosome entre eux.

Le lactosérum doux, un coproduit de l'industrie laitière, est principalement valorisé dans des applications alimentaires où les propriétés fonctionnelles et nutritionnelles de ses constituants sont exploitées. Or, pour de telles applications, la présence des phospholipides (PLs), des lipides résiduels, peut entraîner des limitations quant à l'utilisation du lactosérum. En outre, les PLs et les peptides issus de l'hydrolyse des protéines du lactosérum présentent des bioactivités rendant possible leur utilisation comme nutraceutiques, ce qui permettrait ainsi de viser de nouvelles voies de valorisation du lactosérum. De ce fait, l'objectif de cette thèse est de produire, de manière écoefficiente, des fractions phospholipidique et peptidique à partir du lactosérum doux en utilisant les procédés électrodialytiques. En effet, l'électrodialyse avec membranes bipolaires (ÉDMB) semble prometteuse pour délipider le lactosérum doux, alors que l'électrodialyse avec membranes d'ultrafiltration (ÉDUF) peut être utilisée pour séparer les peptides d'un hydrolysat protéique. Au cours de ces travaux, les premiers résultats obtenus ont démontré que, contrairement à la dilution appliquée après le traitement d'ÉDMB, le facteur de concentration du lactosérum avait un faible impact sur les taux de délipidation atteints et conséquemment sur la formation des complexes de lipoprotéines. Par ailleurs, les résultats ont permis de dégager un phénomène de précipitation protéique, qui dans ce cas, était influencé par le facteur de concentration. De ce fait, il ne semblait pas favorable d'utiliser un lactosérum fortement concentré pour le procédé de délipidation. Par la suite, différents facteurs de dilution subséquente au traitement d'ÉDMB ont été testés. Il a ainsi été démontré que les taux de délipidation atteignaient un plateau avec l'augmentation du facteur de dilution et que la formation des complexes de lipoprotéines était favorisée pour une réduction de la force ionique approchant 80 %. Pour la première fois, il a été possible de démontrer, dans le cadre de ces travaux, la faisabilité du procédé pour la récupération spécifique des PLs; une fraction phospholipidique, contenant notamment de la phosphatidylsérine et de la phosphatidyléthanolamine a pu être produite. De plus, afin de discriminer les différentes conditions testées, des scores d'écoefficience ont été utilisés, ce qui a permis de déterminer les conditions les plus prometteuses. Par ailleurs, comme la dilution réalisée après le traitement d'ÉDMB pour le procédé de délipidation du lactosérum doux entraînait certaines contraintes associées à l'augmentation des volumes produits, différents traitements ont été testés afin de remplacer la dilution (déminéralisation par électrodialyse conventionnelle et diafiltration). Ainsi, les résultats de cette étude ont démontré que la formation des complexes de lipoprotéines et conséquemment la récupération des PLs étaient tributaires non seulement de la réduction de la force ionique, mais aussi du retrait des cations divalents (calcium et magnésium, espèces ioniques pour lesquelles les PLs présentent des affinités). De ce fait, un procédé de délipidation combinant ÉDMB et électrodialyse conventionnelle apparaît comme étant la meilleure option pour produire une fraction phospholipidique. Pour terminer, un hydrolysat complexe de protéines du lactosérum a été séparé par ÉDUF à l'échelle semi-industrielle, dans l'optique de produire une fraction peptidique enrichie en peptides d'intérêt pour la santé humaine. Ainsi, la séparation, caractérisée par des paramètres de migration peptidique élevés, a permis de générer la production d'une fraction peptidique contenant 18 composés majoritaires (peptides). En plus de ces composés, la fraction renfermait aussi du lactose, ce qui a permis de mettre en évidence un phénomène de transfert de lactose au cours du procédé. Néanmoins, la fraction peptidique produite a démontré in vitro des activités inhibitrices de la dipeptidyl peptidase-IV et de l'enzyme de conversion de l'angiotensine supérieures à celles de l'hydrolysat initial, dû à la récupération de peptides bioactifs. Ainsi, le projet a permis de développer une voie de valorisation du lactosérum pour la production de fractions potentiellement bioactives utilisant les procédés électrodialytiques. Par ailleurs, ces procédés pourraient aisément être couplés : au cours d'une première phase, le lactosérum, serait délipidé, puis à la suite d'une concentration par ultrafiltration, le rétentat serait, dans une deuxième phase, hydrolysé et séparé par ÉDUF pour obtenir une fraction peptidique bioactive améliorée. Les travaux ont aussi donné l'opportunité d'enrichir les connaissances quant aux mécanismes reliés à la formation des complexes de lipoprotéines et aux phénomènes de migration et de colmatage pouvant se dérouler au cours des traitements d'ÉDMB et d'ÉDUF. / Sweet whey, a dairy coproduct, is mainly used in food applications, where its components' functional and nutritional properties are exploited. However, for such applications, phospholipids (PLs), residual lipids found in whey, may lead to limitations of its use. Furthermore, PLs and peptides from the hydrolysis of whey proteins demonstrate bioactivities that could make possible their use as nutraceuticals. Thereby, the objectives of this research was to ecoefficiently produce PL and peptide fractions from sweet whey using electrodialytic processes. Indeed, electrodialysis with bipolar membrane (EDBM) seems promising to defat sweet whey whereas electrodialysis with ultrafiltration membrane (EDUF) can be used to separate peptides from a hydrolysate. The first results obtained demonstrated that, unlike the dilution applied after EDBM treatment, the concentration factor of whey had a negligible impact on the defatting rates and consequently on the lipoprotein complex formation. Moreover, the results revealed a protein precipitation phenomenon, influenced by the concentration factor. Thereby, the use of a highly concentrated sweet whey was not favorable to the defatting process. There after, different dilution factors following EDBM treatment were tested. The defattingrates reached a plateau with the increase of the dilution factor and lipoprotein complex formation was favored by a decrease in ionic strength around 80 %. Moreover, it was possible to demonstrate that the process could be used to specifically recover PLs; a PL fraction containing mainly phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine was produced. Also, to compare the different conditions tested, ecoefficiency scores were used to determine the most favorable conditions. Furthermore, the dilution applied after EDBM treatment for the defatting process led to constraints relative to the large volumes produced. Demineralization by conventional electrodialysis and diafiltration were tested to replace the dilution step. Thus, the results obtained demonstrated that the lipoprotein complex formation and consequently the PL recovery was, not only due to the decrease in ionic strength, but also to the greater removal of divalent cations (calcium and magnesium, ionic species for which PLs have affinity). There by, a defatting process combining EDBM and conventional electrodialysis appeared to be the best option to produce a PL fraction. Finally, to produce a peptide fraction enriched with bioactive peptide, a complex whey protein hydrolysate was separated by EDUF at a semi-industrial scale. The separation was characterized by high peptide migration parameters and allowed to generate a peptide fraction containing 18 main components (peptides). Along with these components, lactose was also recovered in the peptide fraction due to a lactose transfer phenomenon during process. Nevertheless, the peptide fraction produced exhibited in vitro inhibiting activities against dipeptidyl peptidase-IV and angiotensin converting enzyme higher that the ones reported for the initial hydrolysate. Thus, this project allowed to valorize sweet whey by the production of potential bioactive fractions using electrodialytic processes. Moreover, these two processes could be combined. In a first phase, sweet whey would be defatted, then after a concentration by ultrafiltration, the retentate would be hydrolyzed and separated by EDUF to produce a peptide fraction with improved bioactivities. Furthermore, new knowledge was acquired regarding the mechanisms involved inlipoprotein complex formation and the migration and fouling phenomena that could occur during EDBM and EDUF treatments.

Depuis ces dernières décennies, le domaine des biomatériaux a connu un essor considérable, évoluant de simples prothèses aux dispositifs les plus complexes pouvant détenir une bioactivité spécifique. Outre, le progrès en science des matériaux et une meilleure compréhension des systèmes biologiques a offert la possibilité de créer des matériaux synthétiques pouvant moduler et stimuler une réponse biologique déterminée, tout en améliorant considérablement la performance clinique des biomatériaux. En ce qui concerne les dispositifs cardiovasculaires, divers recouvrements ont été développés et étudiés dans le but de modifier les propriétés de surface et d’améliorer l’efficacité clinique des tuteurs. En effet, lorsqu’un dispositif médical est implanté dans le corps humain, son succès clinique est fortement influencé par les premières interactions que sa surface établit avec les tissus et les fluides biologiques environnants. Le recouvrement à la surface de biomatériaux par diverses molécules ayant des propriétés complémentaires constitue une approche intéressante pour atteindre différentes cibles biologiques et orienter la réponse de l’hôte. De ce fait, l'élucidation de l'interaction entre les différentes molécules composant les recouvrements est pertinente pour prédire la conservation de leurs propriétés biologiques spécifiques. Dans ce travail, des recouvrements pour des applications cardiovasculaires ont été créés, composés de deux molécules ayant des propriétés biologiques complémentaires : la fibronectine (FN) afin de promouvoir l’endothélialisation et la phosphorylcholine (PRC) pour favoriser l’hémocompatibilité. Des techniques d’adsorption et de greffage ont été appliquées pour créer différents recouvrements de ces deux biomolécules sur un polymère fluorocarboné déposé par traitement plasma sur un substrat en acier inoxydable. Dans un premier temps, des films de polytétrafluoroéthylène (PTFE) ont été utilisés en tant que surface modèle afin d'explorer l'interaction de la PRC et de la FN avec les surfaces fluorocarbonées ainsi qu’avec des cellules endothéliales et du sang. La stabilité des recouvrements de FN sur l'acier inoxydable a été étudiée par déformation, mais également par des essais statiques et dynamiques sous-flux. Les recouvrements ont été caractérisés par Spectroscopie Photoéléctronique par Rayons X, immunomarquage, angle de contact, Microscopie Électronique de Balayage, Microscopie de Force Atomique et Spectrométrie de Masse à Ionisation Secondaire à Temps de Vol (imagerie et profilage en profondeur). Des tests d’hémocompatibilité ont été effectués et l'interaction des cellules endothéliales avec les recouvrements a également été évaluée. La FN greffée a présenté des recouvrements plus denses et homogènes alors que la PRC quant à elle, a montré une meilleure homogénéité lorsqu’elle était adsorbée. La caractérisation de la surface des échantillons contenant FN/PRC a été corrélée aux propriétés biologiques et les recouvrements pour lesquels la FN a été greffée suivie de l'adsorption de la PRC ont présenté les meilleurs résultats pour des applications cardiovasculaires : la promotion de l'endothélialisation et des propriétés d’hémocompatibilité. Concernant les tests de stabilité, les recouvrements de FN greffée ont présenté une plus grande stabilité et densité que dans le cas de l’adsorption. En effet, la pertinence de présenter des investigations des essais sous-flux versus des essais statiques ainsi que la comparaison des différentes stratégies pour créer des recouvrements a été mis en évidence. D'autres expériences sont nécessaires pour étudier la stabilité des recouvrements de PRC et de mieux prédire son interaction avec des tissus in vivo. / Over the past years, we have perceived the remarkable growth of the field of biomaterials, evolving from simple prosthetics to complex materials with specific bioactivities. Advances in materials science jointed with an improved understanding of biological systems have carried the ability to create synthetic materials, which would modulate and/or stimulate specific biological responses. In this way, it has been possible to greatly improving the performance of biomaterials. Indeed, when a dispositive is implanted in the human body, the clinical success of the biomaterial is influenced by the first interactions its surface establishes with the surrounding biological tissues and fluids. Regarding cardiovascular devices, various coatings have been investigated to modify the surface properties of stents and to improve their clinical efficacy. In this context, coating biomaterials with several molecules having complementary properties is an interesting approach to accomplish different biological targets. However, the elucidation of the interaction between those molecules will be relevant to predict the preservation of their specific properties on the biomaterial surface. In this work, coatings for cardiovascular applications were created containing two molecules with complementary properties: fibronectin (FN) to promote endothelialization and phosphorylcholine (PRC) for hemocompatibility. Adsorption and grafting techniques were used to achieve different coatings containing both molecules on stainless steel substrate previously coated with a fluorocarbon polymer deposited by plasma treatment. Polytetrafluoroethylene films were first used as model surfaces to explore the interaction of FN and PRC with fluorocarbon surfaces as well as with cells and blood. The stability of FN coatings on fluorocarbon/stainless steel substrates was accomplished through plastic deformation, static and under-flow dynamic tests. Coatings were characterized through X-Ray Photoelectron Spectroscopy, immunostaining, water contact angle, Scanning Electron Microscopy, Atomic Force Microscopy and Time of Flight Secondary Ion Mass Spectrometry (imaging and depth profiling analyses). The interaction of coatings with endothelial cells and blood was also assessed. Regarding FN coatings, those where the protein was grafted, presented denser and more homogeneous coatings. In the case of while PRC coatings, those adsorbed resulted in higher homogeneity than those where PRC was chemical activated during the grating process. Surface characterization of FN/PRC was correlated to the biological properties. Coatings where FN was first grafted followed by the adsorption of PRC exhibited the best results for cardiovascular applications: promotion of endothelialization and hemocompatibility properties. Concerning the stability tests, FN grafted exhibited higher stability than FN adsorbed. Indeed, the relevance of investigating under dynamic conditions (under-flow tests) versus static tests as wells as the comparison of different strategies to create coatings were evidenced. Further experiments are required to study the stability of PRC coatings and to enhance the mimicking of the biological environment in order to predict the interaction of the coatings with living tissues in vivo. / En los últimos años hemos sido testigos de un notable crecimiento en el ramo de biomateriales; hemos sido partícipes de la evolución de simples prótesis a materiales complejos con bioactividad específica. Los avances en ciencias de materiales, así como en la comprensión del funcionamiento de sistemas biológicos, han traído consigo la posibilidad de crear materiales sintéticos capaces de modular/estimular respuestas específicas del organismo vivo, con lo cual ha sido posible mejorar significativamente el desempeño clínico de distintos biomateriales. En lo que respecta a dispositivos cardiovasculares, diversos revestimientos han sido investigados para modificar las propiedades de la superficie de stents con el fin de mejorar su eficacia clínica. Efectivamente, cuando un dispositivo médico es implantado en un organismo vivo, su éxito clínico se verá fuertemente influenciado por las primeras interacciones que su superficie establecerá con los tejidos y fluidos biológicos de sus alrededores. La concepción de revestimientos de biomateriales con distintas moléculas con propiedades complementarias ha sido un enfoque interesante en los últimos años para alcanzar diferentes objetivos biológicos. La elucidación de la interacción de las diferentes moléculas entre sí, y con el substrato, tiene alta relevancia en lo que respecta a la predicción de la preservación de propiedades biológicas específicas a cada molécula en cuestión. En este trabajo, se han creado revestimientos para aplicaciones cardiovasculares que contienen dos moléculas con propiedades complementarias: fibronectina (FN) para promover la endotelialización y fosforilcolina (PRC) por sus propiedades de hemocompatibilidad. Con el fin de crear los diferentes revestimientos, se aplicaron distintas técnicas de adsorción y de enlaces químicos entre las dos moléculas bioactivas. Dichos revestimientos fueron creados sobre un polímero de fluorocarbono depositado por tratamiento con plasma sobre acero inoxidable. Durante los primeros trabajos, se utilizaron películas de politetrafluoroetileno como superficies modelo con el fin de explorar la interacción de FN y PRC con superficies de fluorocarbono así como con células y sangre. La estabilidad de los revestimientos de FN en substratos de acero inoxidable recubierto del polímero fluorocarbonado fue investigada por medio de pruebas de deformación, así como pruebas en condiciones estáticas y dinámicas (bajo flujo). Los revestimientos fueron caracterizados por medio de análisis en Espectroscopia Fotoelectrónica de Rayos X, inmunomarcado, ángulo de contacto, Microscopía Electrónica de Barrido, Microscopía de Fuerza Atómica y Espectrometría de Masa de Ionización Secundaria por Tiempo de Vuelo (éste último en análisis de imágenes y perfiles de profundidad). Igualmente, se realizaron pruebas de hemocompatibilidad, y se evaluó la interacción de los revestimientos con células endoteliales. Los revestimientos en los que la FN fue activada químicamente presentaron mayor densidad y homogeneidad que aquéllos donde la proteína fue simplemente adsorbida; mientras que la PRC adsorbida presentó mayor homogeneidad que aquélla que fue activada químicamente. La caracterización de superficie de los revestimientos de FN/PRC fue correlacionada con sus propiedades biológicas. Los revestimientos en los que la FN fue enlazada para posteriormente adsorber la PRC, mostraron los mejores resultados para aplicaciones cardiovasculares: promoción de la endotelialización y propiedades de hemocompatibilidad. En lo que respecta a las pruebas de estabilidad, la FN activada químicamente exhibió mayor estabilidad y revestimientos más densos incluso después de pruebas dinámicas bajo flujo. En efecto, gracias a estos experimentos, se logró poner de manifiesto la relevancia de la presentación de investigaciones de pruebas bajo flujo versus pruebas estáticas; de igual manera, fue posible poner en evidencia la relevancia de comparar diferentes estrategias en la creación de revestimientos con el fin de propiciar óptimas interacciones entre éstos y el organismo vivo. Como perspectivas y trabajos futuros, será requerido estudiar la estabilidad de los revestimientos de PRC, así como estudios biológicos más avanzados con el fin de predecir mejor la interacción de los revestimientos con tejidos in vivo.

Développer de nouvelles méthodes pour l'étude des interactions entre les membranes cellulaires et diverses molécules bioactives telles que des peptides, des protéines ou des médicaments est d’une grande importance. Ces interactions sont primordiales dans l’activité de ces composés et leur meilleure compréhension pourrait permettre, entre autres, la mise au point de nouveaux médicaments, l’amélioration de leur efficacité et la diminution de leur toxicité. La spectroscopie RMN des solides est une technique de choix pour l’étude de telles interactions. Plus spécifiquement, l’utilisation de sondes membranaires est courante et permet d’accéder à de nouvelles expériences. Le projet de thèse principal porte sur la synthèse et l’étude de phospholipides monofluorés pour leur validation comme sonde membranaire modèle en RMN des solides. Le fluor possède de nombreuses caractéristiques chimiques et spectroscopiques d’intérêt pour son utilisation pour l’étude de complexes de biomolécules en spectroscopie RMN. La présente thèse rapporte d’abord les travaux de synthèse de trois nouveaux analogues monofluorés de la dimyristoylphosphatidylcholine (F-DMPC), ayant un atome de fluor sur la chaîne acyle en position 2 du glycérol, dans le but de mimer les membranes eucaryotes. L’étude des propriétés de ces trois nouveaux F-DMPC, ainsi que de trois dérivés synthétisés antérieurement, réalisée principalement en spectroscopie infrarouge et en RMN des solides, est aussi présentée. Dans l’ensemble, les résultats ont montré que l’incorporation d’un atome de fluor à la DMPC induit des perturbations significatives, mais que des mélanges F-DMPC/DMPC composés d’au maximum 25% de phospholipides monofluorés se comportent de façon similaire aux membranes de DMPC. Afin de valider ce nouveau modèle, l’orientation de deux peptides antimicrobiens au comportement connu a été estimée dans des membranes contenant 25% de F-DMPC. Pour tous les F-DMPC, la RMN de l’azote-15 a montré que l’orientation des peptides n’était pas affectée par la présence de DMPC monofluorée. De tels mélanges pourraient ainsi être utilisés comme sonde membranaire pour l’étude d’interactions entre ces membranes et différentes molécules bioactives par RMN des solides. La thèse présente aussi le développement d’une méthodologie de synthèse flexible de phosphatidylglycérols. Puisque des chaînes acyle identiques ou différentes et de longueur variée peuvent être incorporées, cette méthodologie permettra d’accéder aux F-DMPG en vue de mimer les cellules procaryotes. Le second projet de thèse porte sur l’étude de nouveaux peptides modèles afin de mettre au point un outil pour évaluer l’épaisseur des membranes biologiques. Une série de peptides analogues au peptide antimicrobien synthétique MSI-103 ayant différentes longueurs, appelés KIAn, a d’abord été synthétisée et étudiée afin d’étudier l’importance du concept de décalage hydrophobe dans la formation de pores transmembranaires et l’activité des peptides. Cette étude a démontré que la longueur est un facteur clé dans l’activité de ces peptides : ils doivent être suffisamment longs pour traverser l’épaisseur hydrophobe des bicouches lipidiques. Toutefois, dans le design de la série KIAn, les peptides plus longs sont davantage chargés et ce facteur peut aussi affecter la tendance observée. Cette thèse rapporte donc les travaux menés afin de vérifier l’influence de la charge cationique des peptides KIAn dans leur activité. Deux nouvelles séries de peptides de longueur variable (14 à 28 acides aminés) et de charge globale constante (+7), appelées KIA(7)n et KIXAn, ont été synthétisées et analysées par différentes techniques (dichroïsme circulaire, tests biologiques, spectroscopie de fluorescence, RMN de l’azote-15). Cette étude a permis de confirmer l’importance du principe de décalage hydrophobe et l’absence d’effet dû à la charge des peptides dans leur activité. Elle a ainsi permis de valider l’utilisation de ces peptides comme règle moléculaire afin d’estimer l’épaisseur des bicouches lipidiques. / The development of new methodologies to investigate interactions between cell membranes and various bioactive molecules such as peptides, proteins or drugs is of primary importance. These interactions are essential for the activity of those compounds and a better understanding would allow, among others, the development of new drugs, the improvement of their efficiency and the reduction of their toxicity. Solid-state NMR spectroscopy is a method of choice to study membranes – molecules interactions. Specifically, using membrane probes is common and allows to access new experiments. The main project within this thesis focuses on the synthesis and study of monofluorinated phospholipids for their validation as model membranes probe in solid-state NMR. Fluorine possesses numerous chemical and spectroscopic characteristics of interest for its use to study biomolecule complexes in NMR spectroscopy. This thesis reports the synthesis of three new monofluorinated analogs of dimyristoylphosphatidylcholine (F-DMPC), having one fluorine atom located on the acyl chain at position 2 of the glycerol, with the goal of mimicking eukaryotic membranes. Property studies of these three new F-DMPCs and of three previously synthesized derivatives are also presented. Overall, the results have shown that the incorporation of a fluorine atom into DMPC perturbs significantly the membrane properties, but that F-DMPC/DMPC mixtures containing 25% F-DMPC or less behave in a similar way to DMPC membranes. To validate this new model, the orientation of two antimicrobial peptides having a known behaviour in the presence of DMPC membranes has been estimated in F-DMPC/DMPC (1/3) membranes. For all F-DMPC, 15N NMR has shown that peptide orientation is not affected by the presence of monofluorinated DMPC. Such mixtures can therefore be used as membrane probes to study interactions between them and various bioactive molecules with solid-state NMR. This thesis also presents the development of a new and flexible synthetic methodology of phosphatidylglycerols. As identical or different acyl chains with various lengths can be incorporated, this methodology will allow access to F-DMPG in order to mimic prokaryotic cell membranes. The second thesis project focuses on the study of new model peptides in order to develop a new tool to evaluate biological membrane thickness. A series of peptides analogues to the antimicrobial synthetic peptide MSI-103, having various lengths and called KIAn, have first been synthesized and studied to investigate the importance of the hydrophobic mismatch in the formation of pores and in the activity of these peptides. This study showed that peptide length is a key factor in their activity: the length must be sufficient to span the hydrophobic thickness of the lipid bilayers. However, the design of KIAn peptides implies that longer peptides are more charged and this factor can also influence the observed tendency. Therefore, this thesis reports our study aimed at verifying the influence of global cationic charge of KIAn peptides on their activity. Two new peptide series of various lengths (14 to 28 amino acids) and of constant global charge (+7), called KIA(7)n and KIXAn, have been synthesized and analyzed with several techniques (circular dichroism, biological tests, fluorescence spectroscopy and 15N NMR). This study confirmed the importance of hydrophobic mismatch and the absence of charge effect in the activity of these peptides. It also validated the use of these peptides as molecular rulers to estimate the hydrophobic thickness of lipid bilayers.