Développer de nouvelles méthodes pour l'étude des interactions entre les membranes cellulaires et diverses molécules bioactives telles que des peptides, des protéines ou des médicaments est d’une grande importance. Ces interactions sont primordiales dans l’activité de ces composés et leur meilleure compréhension pourrait permettre, entre autres, la mise au point de nouveaux médicaments, l’amélioration de leur efficacité et la diminution de leur toxicité. La spectroscopie RMN des solides est une technique de choix pour l’étude de telles interactions. Plus spécifiquement, l’utilisation de sondes membranaires est courante et permet d’accéder à de nouvelles expériences. Le projet de thèse principal porte sur la synthèse et l’étude de phospholipides monofluorés pour leur validation comme sonde membranaire modèle en RMN des solides. Le fluor possède de nombreuses caractéristiques chimiques et spectroscopiques d’intérêt pour son utilisation pour l’étude de complexes de biomolécules en spectroscopie RMN. La présente thèse rapporte d’abord les travaux de synthèse de trois nouveaux analogues monofluorés de la dimyristoylphosphatidylcholine (F-DMPC), ayant un atome de fluor sur la chaîne acyle en position 2 du glycérol, dans le but de mimer les membranes eucaryotes. L’étude des propriétés de ces trois nouveaux F-DMPC, ainsi que de trois dérivés synthétisés antérieurement, réalisée principalement en spectroscopie infrarouge et en RMN des solides, est aussi présentée. Dans l’ensemble, les résultats ont montré que l’incorporation d’un atome de fluor à la DMPC induit des perturbations significatives, mais que des mélanges F-DMPC/DMPC composés d’au maximum 25% de phospholipides monofluorés se comportent de façon similaire aux membranes de DMPC. Afin de valider ce nouveau modèle, l’orientation de deux peptides antimicrobiens au comportement connu a été estimée dans des membranes contenant 25% de F-DMPC. Pour tous les F-DMPC, la RMN de l’azote-15 a montré que l’orientation des peptides n’était pas affectée par la présence de DMPC monofluorée. De tels mélanges pourraient ainsi être utilisés comme sonde membranaire pour l’étude d’interactions entre ces membranes et différentes molécules bioactives par RMN des solides. La thèse présente aussi le développement d’une méthodologie de synthèse flexible de phosphatidylglycérols. Puisque des chaînes acyle identiques ou différentes et de longueur variée peuvent être incorporées, cette méthodologie permettra d’accéder aux F-DMPG en vue de mimer les cellules procaryotes. Le second projet de thèse porte sur l’étude de nouveaux peptides modèles afin de mettre au point un outil pour évaluer l’épaisseur des membranes biologiques. Une série de peptides analogues au peptide antimicrobien synthétique MSI-103 ayant différentes longueurs, appelés KIAn, a d’abord été synthétisée et étudiée afin d’étudier l’importance du concept de décalage hydrophobe dans la formation de pores transmembranaires et l’activité des peptides. Cette étude a démontré que la longueur est un facteur clé dans l’activité de ces peptides : ils doivent être suffisamment longs pour traverser l’épaisseur hydrophobe des bicouches lipidiques. Toutefois, dans le design de la série KIAn, les peptides plus longs sont davantage chargés et ce facteur peut aussi affecter la tendance observée. Cette thèse rapporte donc les travaux menés afin de vérifier l’influence de la charge cationique des peptides KIAn dans leur activité. Deux nouvelles séries de peptides de longueur variable (14 à 28 acides aminés) et de charge globale constante (+7), appelées KIA(7)n et KIXAn, ont été synthétisées et analysées par différentes techniques (dichroïsme circulaire, tests biologiques, spectroscopie de fluorescence, RMN de l’azote-15). Cette étude a permis de confirmer l’importance du principe de décalage hydrophobe et l’absence d’effet dû à la charge des peptides dans leur activité. Elle a ainsi permis de valider l’utilisation de ces peptides comme règle moléculaire afin d’estimer l’épaisseur des bicouches lipidiques. / The development of new methodologies to investigate interactions between cell membranes and various bioactive molecules such as peptides, proteins or drugs is of primary importance. These interactions are essential for the activity of those compounds and a better understanding would allow, among others, the development of new drugs, the improvement of their efficiency and the reduction of their toxicity. Solid-state NMR spectroscopy is a method of choice to study membranes – molecules interactions. Specifically, using membrane probes is common and allows to access new experiments. The main project within this thesis focuses on the synthesis and study of monofluorinated phospholipids for their validation as model membranes probe in solid-state NMR. Fluorine possesses numerous chemical and spectroscopic characteristics of interest for its use to study biomolecule complexes in NMR spectroscopy. This thesis reports the synthesis of three new monofluorinated analogs of dimyristoylphosphatidylcholine (F-DMPC), having one fluorine atom located on the acyl chain at position 2 of the glycerol, with the goal of mimicking eukaryotic membranes. Property studies of these three new F-DMPCs and of three previously synthesized derivatives are also presented. Overall, the results have shown that the incorporation of a fluorine atom into DMPC perturbs significantly the membrane properties, but that F-DMPC/DMPC mixtures containing 25% F-DMPC or less behave in a similar way to DMPC membranes. To validate this new model, the orientation of two antimicrobial peptides having a known behaviour in the presence of DMPC membranes has been estimated in F-DMPC/DMPC (1/3) membranes. For all F-DMPC, 15N NMR has shown that peptide orientation is not affected by the presence of monofluorinated DMPC. Such mixtures can therefore be used as membrane probes to study interactions between them and various bioactive molecules with solid-state NMR. This thesis also presents the development of a new and flexible synthetic methodology of phosphatidylglycerols. As identical or different acyl chains with various lengths can be incorporated, this methodology will allow access to F-DMPG in order to mimic prokaryotic cell membranes. The second thesis project focuses on the study of new model peptides in order to develop a new tool to evaluate biological membrane thickness. A series of peptides analogues to the antimicrobial synthetic peptide MSI-103, having various lengths and called KIAn, have first been synthesized and studied to investigate the importance of the hydrophobic mismatch in the formation of pores and in the activity of these peptides. This study showed that peptide length is a key factor in their activity: the length must be sufficient to span the hydrophobic thickness of the lipid bilayers. However, the design of KIAn peptides implies that longer peptides are more charged and this factor can also influence the observed tendency. Therefore, this thesis reports our study aimed at verifying the influence of global cationic charge of KIAn peptides on their activity. Two new peptide series of various lengths (14 to 28 amino acids) and of constant global charge (+7), called KIA(7)n and KIXAn, have been synthesized and analyzed with several techniques (circular dichroism, biological tests, fluorescence spectroscopy and 15N NMR). This study confirmed the importance of hydrophobic mismatch and the absence of charge effect in the activity of these peptides. It also validated the use of these peptides as molecular rulers to estimate the hydrophobic thickness of lipid bilayers.

Le lactosérum doux, un coproduit de l'industrie laitière, est principalement valorisé dans des applications alimentaires où les propriétés fonctionnelles et nutritionnelles de ses constituants sont exploitées. Or, pour de telles applications, la présence des phospholipides (PLs), des lipides résiduels, peut entraîner des limitations quant à l'utilisation du lactosérum. En outre, les PLs et les peptides issus de l'hydrolyse des protéines du lactosérum présentent des bioactivités rendant possible leur utilisation comme nutraceutiques, ce qui permettrait ainsi de viser de nouvelles voies de valorisation du lactosérum. De ce fait, l'objectif de cette thèse est de produire, de manière écoefficiente, des fractions phospholipidique et peptidique à partir du lactosérum doux en utilisant les procédés électrodialytiques. En effet, l'électrodialyse avec membranes bipolaires (ÉDMB) semble prometteuse pour délipider le lactosérum doux, alors que l'électrodialyse avec membranes d'ultrafiltration (ÉDUF) peut être utilisée pour séparer les peptides d'un hydrolysat protéique. Au cours de ces travaux, les premiers résultats obtenus ont démontré que, contrairement à la dilution appliquée après le traitement d'ÉDMB, le facteur de concentration du lactosérum avait un faible impact sur les taux de délipidation atteints et conséquemment sur la formation des complexes de lipoprotéines. Par ailleurs, les résultats ont permis de dégager un phénomène de précipitation protéique, qui dans ce cas, était influencé par le facteur de concentration. De ce fait, il ne semblait pas favorable d'utiliser un lactosérum fortement concentré pour le procédé de délipidation. Par la suite, différents facteurs de dilution subséquente au traitement d'ÉDMB ont été testés. Il a ainsi été démontré que les taux de délipidation atteignaient un plateau avec l'augmentation du facteur de dilution et que la formation des complexes de lipoprotéines était favorisée pour une réduction de la force ionique approchant 80 %. Pour la première fois, il a été possible de démontrer, dans le cadre de ces travaux, la faisabilité du procédé pour la récupération spécifique des PLs; une fraction phospholipidique, contenant notamment de la phosphatidylsérine et de la phosphatidyléthanolamine a pu être produite. De plus, afin de discriminer les différentes conditions testées, des scores d'écoefficience ont été utilisés, ce qui a permis de déterminer les conditions les plus prometteuses. Par ailleurs, comme la dilution réalisée après le traitement d'ÉDMB pour le procédé de délipidation du lactosérum doux entraînait certaines contraintes associées à l'augmentation des volumes produits, différents traitements ont été testés afin de remplacer la dilution (déminéralisation par électrodialyse conventionnelle et diafiltration). Ainsi, les résultats de cette étude ont démontré que la formation des complexes de lipoprotéines et conséquemment la récupération des PLs étaient tributaires non seulement de la réduction de la force ionique, mais aussi du retrait des cations divalents (calcium et magnésium, espèces ioniques pour lesquelles les PLs présentent des affinités). De ce fait, un procédé de délipidation combinant ÉDMB et électrodialyse conventionnelle apparaît comme étant la meilleure option pour produire une fraction phospholipidique. Pour terminer, un hydrolysat complexe de protéines du lactosérum a été séparé par ÉDUF à l'échelle semi-industrielle, dans l'optique de produire une fraction peptidique enrichie en peptides d'intérêt pour la santé humaine. Ainsi, la séparation, caractérisée par des paramètres de migration peptidique élevés, a permis de générer la production d'une fraction peptidique contenant 18 composés majoritaires (peptides). En plus de ces composés, la fraction renfermait aussi du lactose, ce qui a permis de mettre en évidence un phénomène de transfert de lactose au cours du procédé. Néanmoins, la fraction peptidique produite a démontré in vitro des activités inhibitrices de la dipeptidyl peptidase-IV et de l'enzyme de conversion de l'angiotensine supérieures à celles de l'hydrolysat initial, dû à la récupération de peptides bioactifs. Ainsi, le projet a permis de développer une voie de valorisation du lactosérum pour la production de fractions potentiellement bioactives utilisant les procédés électrodialytiques. Par ailleurs, ces procédés pourraient aisément être couplés : au cours d'une première phase, le lactosérum, serait délipidé, puis à la suite d'une concentration par ultrafiltration, le rétentat serait, dans une deuxième phase, hydrolysé et séparé par ÉDUF pour obtenir une fraction peptidique bioactive améliorée. Les travaux ont aussi donné l'opportunité d'enrichir les connaissances quant aux mécanismes reliés à la formation des complexes de lipoprotéines et aux phénomènes de migration et de colmatage pouvant se dérouler au cours des traitements d'ÉDMB et d'ÉDUF. / Sweet whey, a dairy coproduct, is mainly used in food applications, where its components' functional and nutritional properties are exploited. However, for such applications, phospholipids (PLs), residual lipids found in whey, may lead to limitations of its use. Furthermore, PLs and peptides from the hydrolysis of whey proteins demonstrate bioactivities that could make possible their use as nutraceuticals. Thereby, the objectives of this research was to ecoefficiently produce PL and peptide fractions from sweet whey using electrodialytic processes. Indeed, electrodialysis with bipolar membrane (EDBM) seems promising to defat sweet whey whereas electrodialysis with ultrafiltration membrane (EDUF) can be used to separate peptides from a hydrolysate. The first results obtained demonstrated that, unlike the dilution applied after EDBM treatment, the concentration factor of whey had a negligible impact on the defatting rates and consequently on the lipoprotein complex formation. Moreover, the results revealed a protein precipitation phenomenon, influenced by the concentration factor. Thereby, the use of a highly concentrated sweet whey was not favorable to the defatting process. There after, different dilution factors following EDBM treatment were tested. The defattingrates reached a plateau with the increase of the dilution factor and lipoprotein complex formation was favored by a decrease in ionic strength around 80 %. Moreover, it was possible to demonstrate that the process could be used to specifically recover PLs; a PL fraction containing mainly phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine was produced. Also, to compare the different conditions tested, ecoefficiency scores were used to determine the most favorable conditions. Furthermore, the dilution applied after EDBM treatment for the defatting process led to constraints relative to the large volumes produced. Demineralization by conventional electrodialysis and diafiltration were tested to replace the dilution step. Thus, the results obtained demonstrated that the lipoprotein complex formation and consequently the PL recovery was, not only due to the decrease in ionic strength, but also to the greater removal of divalent cations (calcium and magnesium, ionic species for which PLs have affinity). There by, a defatting process combining EDBM and conventional electrodialysis appeared to be the best option to produce a PL fraction. Finally, to produce a peptide fraction enriched with bioactive peptide, a complex whey protein hydrolysate was separated by EDUF at a semi-industrial scale. The separation was characterized by high peptide migration parameters and allowed to generate a peptide fraction containing 18 main components (peptides). Along with these components, lactose was also recovered in the peptide fraction due to a lactose transfer phenomenon during process. Nevertheless, the peptide fraction produced exhibited in vitro inhibiting activities against dipeptidyl peptidase-IV and angiotensin converting enzyme higher that the ones reported for the initial hydrolysate. Thus, this project allowed to valorize sweet whey by the production of potential bioactive fractions using electrodialytic processes. Moreover, these two processes could be combined. In a first phase, sweet whey would be defatted, then after a concentration by ultrafiltration, the retentate would be hydrolyzed and separated by EDUF to produce a peptide fraction with improved bioactivities. Furthermore, new knowledge was acquired regarding the mechanisms involved inlipoprotein complex formation and the migration and fouling phenomena that could occur during EDBM and EDUF treatments.

Le lait maternel est considéré comme l’aliment de référence pour le développement des nouveau-nés. Cependant dans le cas des grands prématurés qui ont des besoins nutritionnels particulièrement élevés, le lait maternel ne permet pas toujours d’apporter des quantités optimales pour certaines molécules, en raison de déficiences intrinsèques ou des conditions d’administration.Nous avons étudié les relations entre l’alimentation actuelle des mères et la composition en acides gras polyinsaturés de leur lait. Les laits maternels du Sud de la France et de la région Nord/Ouest présentent un déséquilibre de la composition en défaveur des acides gras polyinsaturés (AGPI) n-3 du lait, notamment en acide docosahexaénoïque (DHA). Ceci est en relation avec une consommation faible en poissons et produits de la mer, ainsi qu’une consommation importante d’AGPI n-6. Une deuxième partie du travail a porté sur la relation entre certaines molécules bioactives du lait et le développement intestinal des nouveau-nés. Le protocole de prise en charge nutritionnelle des nouveau-nés prématurés conduit à l’administration d’une faible quantité de molécules bioactives (AGPI n-3, phospholipides et plasmalogènes, sCD14, sphingomyélinase acide) ne permettant pas de couvrir les besoins, notamment en DHA, et probablement pas d’assurer une santé intestinale optimale pendant les premières semaines de vie. Un délai nécessaire pour atteindre la maturité digestive plus court est associé à la consommation d’AGPI pendant les deux premières semaines de vie, et de phospholipides (sphingomyéline et plasmalogènes) à partir de la deuxième semaine de vie. La consommation de sCD14 chez les enfants ne consommant que du lait de don est inversement corrélée au délai de maturité digestive. Nous avons constaté que cette molécule influence la réponse inflammatoire de cellules intestinales fœtales à une stimulation bactérienne chronique.Nous avons aussi étudié certaines propriétés physico-chimiques de laits d’espèces animales potentiellement intéressantes pour l’amélioration de la qualité des substituts ou des suppléments de lait et il apparait que le lait de chamelle présente des teneurs en sphingomyéline et plasmalogènes comparables à celles du lait humain. L’utilisation des traitements technologiques, comme la pasteurisation et l’homogénéisation, altère les propriétés du lait au niveau des teneurs en molécules bioactives (sCD14, sphingomyélinase acide) ainsi qu’au niveau de la structure du globule lipidique.En conclusion, ce travail ouvre la voie à une réflexion sur la formulation de nouveaux substituts et de suppléments de lait maternel à élaborer pour une meilleure prise en charge des nouveau-nés. / Human milk is considered as the gold standard to newborn development. However, in case of very preterm infants who have particularly high nutrients needs, it does not always provide optimal quantities of several bioactive molecules, due to composition or supply conditions.We investigated the relationship between current maternal nutrition and polyunsatured fatty acids (PUFA) composition of human milk. Human milk from mothers of South and North-West of France had imbalance PUFA composition to the detriment of n-3 PUFA, especially docosahexaenoic acid (DHA). This was linked to low consumption of fish and seafood products, and to an important n-6 PUFA intake.A second part of our work was focused on bioactive compounds of human milk and newborn intestinal development. Nutritional care of preterm infants leads to low intake of bioactive compounds (PUFA n-3, phospholipids and plasmalogens, sCD14, acid sphingomylinase), insufficient to cover the needs of HAD and to ensure optimal intestinal health during the first weeks of life. A shorter time to reach digestive maturity was associated with PUFA consumption during the first two weeks of life, and with phospholipids (sphingomyelin and plasmalogens) from the second week. sCD14 intake by preterm fed only with donor human milk was inversely correlated with digestive maturity time. This molecule influences the inflammatory response of fœtal intestinal cells to chronic bacterial stimulation.We had also investigated the physicochemical properties of milk from different animal species potentially interesting for improving infant formula or milk fortifier. Camel milk showed sphingomyelin and plasmalogen contents close to human milk. Technological treatments, such as pasteurisation or homogenisation, lead to alteration of milk properties, either in bioactive molecules content (sCD14, acid sphingomyelinase) or in fat globule structure.In conclusion, this work provides new possibilities for the conception of infant formula and fortifier to improve newborn care.

Les lipides polaires (LP) laitiers (~2% des lipides du lait) présentent un potentiel bioactif élevé, notamment lié à leur richesse en sphingomyéline (SM, ~25% des LP). Nos hypothèses sont que les LP laitiers peuvent exercer certains de leurs effets bénéfiques par l'intermédiaire de la SM, notamment sur l'intégrité de la barrière intestinale et le microbiote, ce qui pourrait contribuer à réduire l'inflammation métabolique. Nous avons testé à long terme in vivo l'impact de régimes hyperlipidiques (HF) supplémentés en LP laitiers. In vitro, nous avons étudié l'effet des LP laitiers et de la SM (laitière ou d'oeuf) sur l'expression génique des protéines de jonctions serrées. Nos travaux in vitro ont également permis de tester que l'interleurkine-8 (IL-8), impliquée dans la maturation de l'épithélium intestinal, serait un acteur des modifications intestinales en réponse aux LP laitiers et/ou à la SM. L'impact à court terme d'un gavage chez la souris avec des LP laitiers ou de la SM laitière a également été étudié. Après 8 semaines de régime HF supplémenté en LP laitiers (1,6%) les souris présentent un moindre gain de poids en comparaison au régime HF. Nous observons une augmentation de Bifidobacterium animalis pour le groupe contenant 1,1% de LP laitiers. Le groupe nourri avec une supplémentation de 1,6% de LP laitiers présente une diminution de Lactobacillus reuteri et des cryptes coliques plus profondes. Nous retrouvons également une plus forte teneur en acide gras spécifiques des LP laitiers (C23:0, C24:0 et C24:1, présents dans la SM laitière) dans les lipides fécaux. Ces acides gras sont corrélés à la teneur en Lactobacillus spp. Parmi les protéines de jonctions serrées impliquées dans la perméabilité paracellulaire, seule l'expression de ZO-1 tend à être augmentée dans le duodénum. In vitro, lorsque les cellules Caco-2/TC7 sont incubées avec des micelles mixtes supplémentées en SM pure, une augmentation de l'expression génique des protéines de jonctions serrées, ainsi qu'une augmentation de la concentration d'IL-8 en apicale et en basolatérale, sont observées. Ces effets sont également retrouvés avec la SM d'oeuf, contrairement aux LP laitiers totaux. L'incubation d'IL-8 recombinante humaine conduit à une augmentation de l'expression génique des protéines de jonctions serrées. Un gavage avec de la SM laitière pure chez la souris induit une augmentation de l'expression des homologues murins de l'IL-8 (KC et Mip-2). Cette étude suggère que les LP laitiers peuvent limiter la prise de poids induite par un régime HF et moduler le microbiote intestinal. La présence de produits d'hydrolyse spécifiques de la SM pourrait expliquer les effets sur le côlon et le microbiote intestinal. Les résultats in vitro, suggèrent un impact spécifique de la SM sur la barrière intestinale. L'IL-8 semble impliquée dans la régulation de l'expression des protéines de jonctions serrées. Ces résultats contribuent à expliquer les effets bénéfiques démontrés des LP laitiers. L'exploration mécanistique des effets directs et/ou indirects de la SM et de l'IL-8 sur la barrière intestinale reste à élucider / Interest is growing for the metabolic impact of milk polar lipids (MPL, ~2% of dairy lipids), which present a high bioactive potential, particularly related to their content in sphingomyelin (SM, ~ 25% of MPL). Our hypotheses are that MPL can exert some of their beneficial effects through SM, including the integrity of the intestinal barrier and the microbiota, which could contribute to reduce metabolic inflammation. We tested the metabolic impact of the addition of MPL in a high-fat (HF) diet in mice on the modulation of the intestinal barrier. In vitro, we studied the effect of SM (milk or egg) on tight junction protein We also tested in vitro, that interleurkin-8 (IL-8), which is involved in the maturation of the intestinal epithelium, is an actor of intestinal changes in response to MPL and/or MSM. The short-term impact in mice of MPL or milk SM was also studied. After 8 weeks of diet, the supplementation with 1.6% of MPL prevented the HF-diet-induced body weight gain. In caecal microbiota, addition of 1.1% of MPL induced a specific increase in Bifidobacterium spp., in particular B. animalis. The group fed with a 1.6% MPL-supplementation showed a specific decrease in Lactobacteria reuteri and colonic crypt depth were greatest. We also found a higher content of fatty acids specific of MPL (C23:0, C24:0 and C24:1, found in milk SM) in fecal lipids of mice. These fatty acids are correlated with Lactobacillus spp. Among the tight junction proteins involved in paracellular permeability, only the expression of ZO-1 tended to be increased in the duodenum. In vitro, when Caco-2/TC7 cells were incubated with mixed micelles supplemented with pure SM, an increase in the gene expression of tight junction proteins (ZO-1, occludin, JAM-1, claudin-1) and an increase in apical and basolateral IL-8 concentration were observed. These effects were also found with egg SM, unlike total MPL. Incubation of recombinant human IL-8 led to an increase in gene expression of tight junction proteins. Gavage with pure milk- SM in mice induced an increase in the expression of murine homologs of IL-8 (KC and Mip-2). Our results show that MPL can limit HF-induced body weight gain and modulate the abundance of beneficial bacteria of the gut microbiota. The presence of SM-specific hydrolysis products may explain the effects on the colon and gut microbiota. In vitro results suggest a specific impact of pure SM on the intestinal barrier. IL-8 appears to be involved in the regulation of tight junction protein expression. This can contribute to explain reported beneficial effects of MPL in mice regarding HF induced metabolic disorders. The mechanistic exploration of direct and / or indirect effects of SM and IL-8 on the intestinal barrier remains to be elucidated

Les bases fondamentales de la biologie suggèrent que tous les organismes actuels partagent un dernier ancêtre commun, le cenancêtre. Dès que la comparaison moléculaire des organismes des trois domaines du vivant (archées, bactéries et eucaryotes) est devenue possible, d’importants débats ont émergé sur l’habitat du cenancêtre, son rapprochement des origines de la vie, sa nature unique ou communautaire et ses relations avec les trois domaines du vivant. Cependant, jusqu’à il y a peu les informations disponibles sur les organismes modernes n’étaient pas suffisantes pour décrire précisément sa biologie. Notamment, la découverte chez les archées de membranes dont les composants principaux, les phospholipides, sont synthétisés par des mécanismes très différents de ceux des bactéries et les eucaryotes a conduit à proposer que chaque mécanisme de synthèse des phospholipides soit apparu indépendamment dans les lignées modernes. Dans ces hypothèses le cenancêtre aurait été dépourvu de phospholipides et, donc, de membranes. Cela met en cause la nature cellulaire du cenancêtre, qui semblait pourtant soutenue par d’autres indices indirects. Ces contradictions posent la question de l’existence de traces dans les organismes modernes d’une synthèse des phospholipides chez le cenancêtre. Dans cette thèse j’ai profité de l’explosion récente des données génomiques pour répondre à cette question. Il avait déjà montré que des membres de deux superfamilles protéiques universelles pouvaient avoir synthétisé de façon non spécifique chez le cenancêtre les énantiomères de glycérol phosphate servant d’ossature aux phospholipides. Les phospholipides archéens sont composés d’isoprénoïdes et les bactériens et eucaryotes d’acides gras. J’ai donc étudié l’évolution des voies de synthèse de ces molécules ainsi que celle de l’assemblage de tous les composants dans des phospholipides. Mes résultats montrent que la voie de synthèse des isoprénoïdes des eucaryotes et une voie hypothétique de synthèse des acides gras chez les archées avaient probablement des ancêtres moins spécifiques chez le cenancêtre. Une partie au moins de la machinerie d’assemblage des phospholipides semble aussi avoir été présente chez le cenancêtre.Ceci suggère que le cenancêtre avait probablement des mécanismes peu spécifiques de synthèse des phospholipides et que les différences entre les membranes actuelles sont dues à la spécialisation de la machinerie ancestrale dans chaque lignée. Mes observations soulignent aussi l’importance d’étudier le cenancêtre à partir des informations issues des organismes actuels pour éviter toute confusion avec les origines de la vie. / The main bases of Biology suggest that all extant organisms share a last common ancestor, namely the cenancestor. As soon as the comparison of molecular characters of organisms representative of the whole diversity of life became possible, hot debates emerged about the environmental conditions in which the cenancestor lived, its closeness to the origins of life, its single or community nature and its relationships with the three domains of life (Archaea, Bacteria and Eucarya). However, available information about current organisms was for a long time inadequate to precisely describe the biology of this organism. For instance, the observation that the main archaeal membrane components, called phospholipids, are synthesized by different means than their bacterial/eukaryotic counterparts was proposed to reveal that modern phospholipid biosynthesis pathways emerged late in independent lineages and were, therefore, absent in the cenancestor. This hypothesis argued that the cenancestor had no lipid membranes, so it could not be a cellular organism although other indirect clues indicated the opposite. These contradictions raise the question of the presence in modern organisms of traces that the cenancestor had a phospholipid biosynthesis machinery.In this dissertation, I took advantage from the recent accumulation of genomic data to address this issue. Previous work had shown that the members of two universal protein superfamilies could be present in the cenancestor to carry out the non-specific synthesis of the glycerol phosphate enantiomers that are the backbones of modern phospholipids. Bacterial and eukaryotic phospholipids use fatty acids whereas archaeal phospholipids are made up of isoprenoids. Thus, I studied the evolution of the metabolic pathways that synthesize these molecules and build up the phospholipids from their components. My results show that the eukaryotic isoprenoid biosynthesis pathway and a hypothetical archaeal fatty acid biosynthesis pathway are likely to have had less specific ancestors in the cenancestor. In addition, the phospholipid assembly machinery was also probably present in the cenancestor.These results suggest that the cenancestor was likely able to enzymatically synthesize its phospholipids by means less specific than modern ones. Dissimilarities in modern membrane phospholipids would result from the specialization of each biosynthesis system in each lineage. My work also stresses the fact that the cenancestor should be described on the basis of the comparison of modern organisms to avoid frequent confusions between the cenancestor and the origins of life.

L'épilepsie affecte environ 1% de la population. Il s'agit d'une maladie où les crises d'épilepsie surviennent de façon spontanée et imprévue. La prise en charge de ces crises peut se faire par des antiépileptiques, mais dans environ 20 à 30% des cas, les épilepsies ne répondent pas ou peu aux médicaments. Il s'agit alors d'épilepsies pharmacorésistantes. Un des traitements de recours utilisé pour la prise en charge de ces épilepsies est le régime cétogène. Le régime cétogène consiste à apporter une large quantité de lipides, pour une faible quantité de protéines et de glucides. Le régime possède des propriétés anticonvulsivantes, décrites chez l'Homme et le rongeur, mais les mécanismes d'action restent inconnus à ce jour. Plusieurs mécanismes ont été suggérés tels que : les propriétés anticonvulsivantes des corps cétoniques, la modulation de la neurotransmission, la modulation de l'excitabilité cérébrale via la modulation de canaux ioniques tels que les KATP. L'implication des acides gras poly-insaturés (AGPI) a également été suggérée. Ceux-ci pourraient moduler la fluidité membranaire, l'activité des canaux ioniques ou encore les voies de l'inflammation. Notre hypothèse de travail a été d'explorer des voies supposées être impliquées dans les propriétés anticonvulsivantes du régime cétogène. Nous nous sommes intéressés aux AGPI et à l'activation des récepteurs nucléaires PPAR-alpha (peroxisome proliferator-activated receptor alpha) en comparaison au régime cétogène. Nous avons utilisé un modèle murin d'état de mal épileptique (lithium-pilocarpine) et l'induction de crises épileptiques avec mesure du seuil au pentylènetétrazole.<br />Dans un premier temps, nous avons administré per-os, pendant 4 semaines un mélange d'AGPI contenant 70% d'oméga-3 et 25% d'oméga-6 à des rats Wistar. Les animaux ayant reçu la complémentation alimentaire par des AGPI présentaient une augmentation du seuil au PTZ comparable à celle obtenue chez les animaux ayant reçu un régime cétogène. Les animaux supplémentés par les AGPI ou ayant reçu le régime cétogène présentaient des variations plasmatiques en AGPI concernant l'acide arachidonique, l'acide alpha linolénique et l'acide eicosapentaenoïque. Aucune modification du statut nutritionnel ou des phospholipides cérébraux membranaires n'était retrouvée. Dans un second temps, nous avons administré pendant 14 jours de la nourriture contenant 0,2% de fénofibrate (agoniste des récepteurs PPAR-alpha) à des rats Wistar. Le traitement par 0,2% de fénofibrate conduisait à augmenter le seuil au PTZ et retarder le début de l'état de mal épileptique dans le modèle lithium-pilocarpine. Ces résultats étaient comparables à ceux obtenus avec le régime cétogène. En revanche le traitement associant le régime cétogène et le fénofibrate ne conduisait pas à moduler le seuil au PTZ chez les animaux.<br />Ces travaux ont permis de montrer que les AGPI ont des propriétés anticonvulsivantes, comparables à celles du régime cétogène. Ces propriétés anticonvulsivantes ont également été retrouvées suite à l'activation des récepteurs nucléaires PPAR-alpha par le fénofibrate. Les propriétés anticonvulsivantes portées par les AGPI ne sont pas liées à une variation de la composition des membranes cellulaires cérébrales en phospholipides. Les récepteurs nucléaires PPAR-alpha modulent quant à eux de nombreuses voies (métaboliques, inflammatoires, stress oxydant) via des variations d'expression génique et peuvent être activés par les AGPI. L'implication de ces différentes voies dans l'efficacité anticonvulsivante du fénofibrate, reste à explorer. Ces résultats, s'ils sont confirmés par des études complémentaires dans d'autres modèles, laissent penser qu'une simplification du régime cétogène pourrait être envisagée via l'utilisation des AGPI et/ou via l'activation des récepteurs nucléaires PPAR-alpha

L'immobilisation de protéines ancrées à des lipides à l'interface air-eau ou solide-eau permet aux protéines d'interagir avec des molécules en solution. Dans le cas des cadhérines, protéines d'adhérence cellulaire, ce système mime la surface d'une cellule. Les interactions entre domaines extracellulaires de cadhérines nécessitent la présence d'ions calcium. Des monocouches de C-cadhérine et de VE-cadhérine formées à la surface de l'eau ont été étudiées en variant la concentration en calcium de la solution. La densité massique surfacique apparente de protéines a été évaluée par ellipsométrie. Le profil de densité électronique des monocouches a été déterminé par réflectivité des rayons X en ncidence rasante. Les résultats obtenus suggèrent que les cadhérines forment des complexes antiparallèles pouvant en partie être dissociés par l'appauvrissement de la solution en calcium. La résonance des plasmons de surface a permis d'évaluer la densité de molécules déposées sur un substrat solide.

Les protéines kinases sont responsables de la phosphorylation des protéines, une modification post-traductionnelle qui contrôle ainsi de manière très efficace et presque instantanée une multitude de processus cellulaires. Elles sont impliquées dans la régulation des voies métaboliques dans les organismes permettant leurs adaptations aux changements environnementaux. Chez les procaryotes, l'existence de sérine/thréonine et tyrosine kinases est resté pendant longtemps un sujet de controverse. Cependant, au cours des deux dernières décennies, de nombreuses études ont montré que ces types de phosphorylation (Ser/Thr/Tyr) existent chez les bactéries et sont impliqués dans la régulation d'une grande variété de processus biologiques. En plus de protéines kinases apparentés à des enzymes eucaryotes, les bactéries ont également des protéines kinases spécifiques n’ayant aucune ressemblance structurale avec des protéines eucaryotes ce qui, lorsqu’elles sont essentielles, les qualifient en tant que cible pour de nouveaux agents antimicrobiens. YdiB est une nouvelle protéine kinase bactérienne de Bacillus subtilis. La localisation d’YdiB a été étudiée par immunofluorescence révélant sa présence à proximité de la membrane plasmique. L'interaction d’YdiB avec les phospholipides a été étudiée par des essais de flottation et résonance plasmonique de surface. Ceci révèle la présence d'une interaction stable et forte entre la kinase et deux phospholipides: la phosphatidylsérine et la phosphatidyléthanolamine. En outre, la constante d'affinité (KD) entre YdiB et la phosphatidylsérine a été identifiée et est de l’ordre de 13.3x10-9 M. De plus, ces deux phospholipides, ainsi que leur têtes polaires, sont capables d'induire de manière significative l'autophosphorylation d’YdiB.Par ailleurs, le rôle d’YdiB dans la croissance bactérienne en particulier lors d’un stress oxydant a également été étudié dans la souche sauvage et dans le mutant ∆ydiB. Dans des conditions de stress oxydant, la souche ∆ydiB est incapable de survivre alors qu’une complémentation conditionnelle de ce mutant a permis de restaurer un profil de croissance normale de la bactérie. Cela révèle le rôle important joué par YdiB dans la résistance bactérienne au stress oxydant. En outre, des protéines impliquées dans la résistance au stress oxydant comme la superoxide dismutase F (SodF) et superoxide dismutase A (SodA) ont été testés comme substrats potentiels pour YdiB. Par des tests de trans-phosphorylation, nous avons pu montrer que SodA pourrait être un substrat potentiel pour YdiB expliquant ainsi son implication dans la résistance au stress oxydatif dans Bacillus subtilis. / Protein kinases are responsible of protein phosphorylation, a post-translational modification and a very effective and almost instantaneous control of a multitude of cellular processes. They are involved in the regulation of metabolic pathways in living organisms enabling their adaptation to environmental changes. In prokaryotes, the existence of serine/threonine and tyrosine kinases was, for a long time, a subject of controversy. However, over the past two decades, many studies have shown that these types of phosphorylation (Ser/Thr/Tyr) do exist in bacteria and are involved in the regulation of a wide variety of biological processes. In addition to protein kinases related to eukaryotic enzymes, bacteria also have some specific protein kinases having no structural resemblance to their eukaryotic homologues which, if essential, made them a possible target for new antimicrobial agents. YdiB is a novel bacterial protein kinase from Bacillus subtilis. In situ localisation of YdiB has been studied by immunofluorescence which reveals its presence near the plasma membrane. The interaction of YdiB with the membrane phospholipids was assessed by flotation assay and surface plasmon resonance demonstrating the presence of a stable and strong interaction between the kinase and two phospholipids: phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine. In addition, the affinity constant (KD) between YdiB and phosphatidylserine was found to be equal to 13.3 x 10-9 M. Moreover, these two phospholipids or just their charged headgroups were able to significantly induce the autophosphorylation of YdiB.On the other hand, the role of YdiB in the bacterial growth especially under oxidative stress was also studied in the wild-type strain and in ∆ydiB mutant. Under oxidative stress conditions, the deleted strain was unable to survive whereas a conditional complementation of ∆ydiB mutant was able to restore a normal growth profile for the bacterium. This reveals the important role played by YdiB in the bacterial resistance to oxidative stress. In addition, protein involved in the resistance to oxidative stress like Superoxide dismutase F (SodF) and superoxide dismutase A (Sod A) were tested as potential substrates for YdiB. Doing the trans-phosphorylation assay, we were able to prove that Sod B could be a potential substrate for YdiB thus explaining its involvement in the resistance to oxidative stress in Bacillus subtilis.

La demande en phospholipides ne cessent d'augmenter pour les applications alimentaires, cosmétiques et pharmaceutiques. A l'heure actuelle, les principales sources de phospholipides utilisées proviennent du soja et du jaune d’œuf. Elles sont obtenues par des procédés d'extraction utilisant des solvants organiques. Dans le contexte de la diversification des sources de phospholipides, d'une part, et le développement de techniques d'extraction plus respectueuses de l'environnement, d'autre part, l'ensemble des travaux réalisés a permis : 1) de valoriser les parties non comestibles de la coquille Saint Jacques comme une source de phospholipides, 2) d’identifier les étapes et les paramètres du procédé d'extraction par voie supercritique à l’aide de CO2 (pression, température, pourcentage de co-solvant, nature du co-solvant, type et dimension de réacteurs) sur les rendements d’extraction des phospholipides et la pureté des extraits obtenus, 3) d’étudier le développement d’un procédé supercritique continu couplant l’extraction de phospholipides d’une part et la formation de liposomes, d’autre part. / The demand in phospholipids is increasing because of their use in defferent domains, i.e. pharmaceutics, food industry, and cosmetics. Nowadays, the main sources of phospholipids come from soya and egg yolk classically extracted using organic solvents. The present work was undertaken in order to add value to waste products of fishery and to extract the lipids using a green technology. We developed an alternative green technique for lipid extraction based on the use of GRAS solvents as CO2 and ethanol. The extractions were carried out by flowing supercritical CO2. Varying the operating conditions (pressure, temperature, proportion and nature of the co-solvent, type of reactors) allowed obtaining extracts with different purities and contents in phospholipids. Finally, we explored the possibility of producing liposomes by coupling the phospholipid extraction using supercritical fluids and the vesicle formation in a continuous process.

Dans cette thèse de doctorat, la structure de membranes naturelles et modèles et leurs interactions avec des molécules biologiquement actives ont été étudiées au moyen de la réflectométrie de neutrons. Les lipides naturels ont été extraits de la levure Pichia pastoris, poussée en milieux deutéré et hydrogéné. L’analyse a montré que la quantité relative de phospholipides n’est pas affectée par le changement en composition isotopique du milieu de croissance. Cependant, les cellules de levures deutérées contiennent principalement des acides gras C18 :1 alors que le degré d’insaturation est plus élevé chez les levures hydrogénés. Diminuer la température du milieu de croissance permet d’augmenter le degré d’insaturation des acides gras chez les levures deutérées. Une analyse qualitative des sphingolipides a été réalisée et un protocole pour séparer les fractions phosphocholines et phosphoethanolamine a été établi.<p><p>La structure de bicouches composées des lipides de levures a été étudiée par réflectivité de neutrons. La bicouche composée de lipides deutérés polaires a une épaisseur similaire aux bicouches faites de phosphocholines C18:1 synthétiques. En présence de stérols, la rugosité aux interfaces entre les têtes polaires et les chaînes augmente. La bicouche composée de lipides polaires hydrogénés est plus mince que celle deutérée. Ceci est dû à la composition en acides gras beaucoup plus variée et du plus grand nombre d’insaturations. En présence de stérols, l’épaisseur de la bicouche hydrogénée augmente. <p>L’interaction de ces bicouches avec l’amphotéricine B (AmB) a été étudiée. L’AmB est un antifongique qui interagit fortement avec les membranes contenant de l’ergostérol et moins fortement avec des membranes contenant du cholestérol. Dans tous les cas, les molécules d’AmB forment une couche épaisse et diluée au dessus de la bicouche lipidique. En présence de stérols, les molécules d’AmB pénètrent dans la bicouche et change sa structure selon la composition en acide gras.<p><p>La structure de bicouches lipidiques de plante et leurs interactions avec des intermédiaires de synthèse ont aussi été étudiées par réflectivité de neutrons. Des mélanges ternaires de plantes étaient déposés sur silicium et des mélanges quaternaires sur saphir. L’épaisseur de la bicouche composée de mélange ternaire est de 38 Å, tandis que celle du mélange ternaire est de 28 Å, la différence venant probablement d’un effet de substrat. La présence de diacylglycérol (DAG) a comme conséquence d’augmenter l’aire par lipide, et ainsi de changer la conformation des têtes polaires. L’interaction des bicouches de lipide de plante avec l’acide phosphatidique (PA) dans le but d’observer un flip-flop possible a aussi été étudiée mais le PA a tendance à désorbé les bicouches du substrat et aucun mécanisme de flip flop n’a été détecté.<p><p>Finalement, la localisation d’une petite molécule, le resvératrol, dans des bicouches modèles a été étudiée. Le resvératrol est connu pour être responsable du « paradoxe français » qui est une corrélation inverse entre la consommation d’aliment gras et un faible taux de maladie cardiaque. Quand le resvératrol est adsorbé à partir de la phase liquide, il induit une réorganisation des têtes polaires. Quand il est déposé sur le substrat en présence des lipides, il est présent à l’interface entre les têtes polaires et les chaines.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished