Orientador: Luiz Antonio Viotto, Lireny Aparecida Guaraldo Gonçalves / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-08T12:01:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_CelioCordeirode_M.pdf: 881544 bytes, checksum: 6c45ab4e5ad2c564b48dc42ad6d29cb8 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O processo tradicional de degomagem remove principalmente os fosfolipídios presentes no óleo bruto de soja por hidratação e precipitação, seguida de agitação e separação por centrifugação. A remoção de fosfolipídios utilizando a separação por membranas é um processo que tem recebido muita atenção por parte de vários pesquisadores, por resultar em óleos de melhor qualidade com economia de energia e redução nos custos com tratamento de efluentes. O objetivo deste trabalho foi estudar a degomagem de óleo bruto de soja em miscela (4,6 kg de óleo bruto e 9,9 kg de hexano) utilizando uma unidade piloto de ultrafiltração com membranas cerâmicas de alumina com diâmetro médio de poro de 0,01 ?m de 19 e de 37 canais e de 0,05 ?m de 19 canais. Analisou-se a influência da pressão transmembrana (0,6 a 3,3 bar) e da velocidade tangencial (1,7 a 5,6 m/s) sobre o fluxo de permeado e o coeficiente de retenção de fósforo no óleo degomado. Verificou-se que para membranas de 0,01 ?m de 19 e 37 canais, pressões acima de 2,0 bar levaram a fluxos de até 70,9 kg/m2h e coeficiente de retenção de fósforo até 99,8% correspondente ao teor de fósforo no óleo degomado de 12,3 mg/kg dentro da especificação da indústria de refino. A degomagem com a membrana de 0,05 ?m realizada a 0,6 bar apresentou alto fluxo de permeado (até 133,93 kg/m2h), porém com óleo permeado com maior teor de fósforo para os padrões da indústria de refino. Também observou-se que as membranas com diâmetro médio de poro 0,01 ?m operando a baixas pressões (< 1,0 bar), independentemente das velocidades utilizadas apresentaram fluxos de até 38,53 kg/m2h e coeficiente de retenção de 98,5 %. Notou-se que o teor de fósforo no permeado aumentou com a redução da pressão transmembrana devido a menor compactação da camada gel polarizada e menor retenção de fosfolipídios e que o efeito da velocidade tangencial foi maior para a faixa de pressões mais alta / Abstract: The traditional degumming process removes mainly the phospholipids presents in the crude soybean oil by the precipitation and hydration, followed by agitation and separation by centrifugation. The removal of phospholipids using membranes separation is a process that has received much attention on the part from some researchers for presenting oils of better quality with energy economy and costs reduction with treatment of effluent. The objective of this work was to study the degumming of crude soybean oil micelle (4,6 kg of oil and 9,9 kg of hexane) using a unit pilot of ultrafiltration with alumina ceramic membranes of 0.01 μm pore diameter of 19 and 37 channels and 0.05 μm pore diameter of 19 channels. It was analyzed the transmembrane pressure influence (0,6 and 3,3 bar) and the tangential velocity on the flux and phosphorous retention in the degummed oil. It was verified that for 0.01μm pore diameter membranes of 19 and 37 channels, pressures above 2.0 bar had taken the flux up to 70.9 kg/m2h and phosphorous retention up to 99,8% correspondent to the phosphorous content in the degummed oil of 12,3 mg/kg insides the specification of the refining industry. The degumming with the membrane of 0.05 μm pore diameter presented high permeated flux (up to 133,93 kg/m2h), however with permeated oil with raised level of phosphorous for the standards of the refining industry. Also it was observed that the membranes with diameter of pore 0.01 μm operating in low pressures (< 1.0 bar), independently of the used velocity had presented flux up to 38.53 kg/m2h and retention of 98,5%. It noticed itself that the level of phosphorous in the permeated increase with the reduction of the transmembrane pressure due to of the lesser compacting of the polarization layer and the lesser retention of phospholipids, and that the effect of the tangential velocity was bigger in the higher pressures zone / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

A fosfolipase A2 (PLA2) é uma enzima chave no metabolismo dos fosfolípides de membrana e é um dos principais componentes envolvidos na sinalização celular. Alterações da atividade da PLA2 tem sido descritas no cérebro e no sangue (soro, plasma e plaquetas) de pacientes com diversas doenças neuropsiquiátricas. Neste estudo foi desenvolvido um ensaio radioenzimático para detectar em plaquetas, a atividade dos três principais grupos de PLA2, que são PLA2 secretórias ou PLA2 extracelular dependente de Ca 2+ (sPLA2); PLA2 citósólicas dependentes de Ca 2+ (cPLA2) e as PLA2 intracelulares independentes de Ca 2+ (iPLA2). Para confirmar a presença desses grupos da enzima em plaquetas, algumas variáveis foram testadas, como as diferenças de preferência ao ácido graxo como substrato, o requerimento de cálcio e a inibição seletiva com os inibidores Bromoenol lactone (BEL) e o Methyl Arachidonyl Fluorophosphonate (MAFP). Os resultados obtidos demonstram a presença dos três principais grupos de PLA2 (sPLA2, cPLA2, and iPLA2) em plaquetas. Estes achados sugerem o uso de plaquetas, uma amostra biológica de fácil acesso, como possível modelo periférico de neurônios para o estudo do metabolismo de fosfolípides. / Phospholipase A2 (PLA2) is a key-enzyme in the metabolism of membrane phospholipids and is one of the major components involved in cell signaling. Alterations of PLA2 activity have been reported in brains and blood cells in several neuropsychiatric diseases. In this study we developed a radio-enzymatic assay to detect in platelets the activity of the three main groups of PLA2, which are secretory PLA2 or extracellular calcium dependent PLA2 (sPLA2), cytosolic calcium dependent PLA2 (cPLA2) and intracellular calcium independent PLA2 (iPLA2). To confirm the presence of these PLA2 groups some variables were tested, such as differences in the preferred fatty acid substrate, calcium dependence, and selective inhibition with Bromoenol lactone (BEL) and Methyl Arachidonyl Fluorophosphonate (MAFP). Our findings demonstrate the presence of the three main groups of PLA2 (sPLA2, cPLA2, and iPLA2) in platelets. In addition, this study is in line with others suggesting that platelets, a typical biological sample, can be used as a peripheral model for neurons.

Nesse trabalho, estudou-se a incorporação da fosfatase alcalina de placa óssea de ratos em dois tipos de sistemas modelo que mimetizassem uma membrana celular: as monocamadas de Langmuir e os filmes Langmuir-Blodgett (LB), ambos formados com fosfolipídios. No intuito de se investigar o papel da âncora de glicosilfosfatidilinositol (GFI), covalentemente ligada ao grupo carboxi-terminal da cadeia polipeptídica, duas formas da enzima foram estudadas: uma com a âncora GFI intacta, solubilizada por ação de um tensoativo não-iônico, e a outra sem a parte hidrofóbica dessa âncora, clivada por ação de uma fosfolipase específica. A primeira forma enzimática foi chamada de FAT (fosfatase alcalina solubilizada por tensoativo), e a segunda de FAC (fosfatase alcalina clivada). Diferenças marcantes na atividade superficial foram observadas entre as duas formas. Comparativamente, a forma FAT adsorve mais rapidamente à interface ar/água que a forma FAC, que mostra um tempo de indução significativo. A incorporação da forma FAT às monocamadas de ácido dimiristoilfosfatídico (DMPA) também ocorre mais rapidamente que a forma FAC. No entanto, o uso de alta força iônica acelerou a adsorção da forma FAC à interface ar/água (com ou sem DMPA). Uma pressão de superfície de exclusão de 20mN/m foi encontrado para a forma FAC, enquanto para a forma FAT, essa pressão representa uma mudança no perfil das curvas pressão x tempo. Isso revelou que, devido à presença da âncora GFI, essa forma enzimática é capaz de incorporar às monocamadas de DMPA, mesmo em altas pressões de superfície. Isotermas superficiais de monocamadas mistas de DMPA e fosfatase alcalina também mostraram diferentes perfis para duas formas enzimáticas estudadas. Enquanto a forma FAT provoca uma alteração na compressibilidade em pressões de até 20mN/m, a forma FAC desloca a curva pressão x área para áreas mais elevadas. Tal fato foi explicado pelo fato da forma FAT incorporar na monocamada preferencialmente com a âncora GFI posicionada entre as cadeias apolares do DMPA, enquanto a forma FAC deva incorporar a cadeia polipeptídica à interface lipídica . Microscopias de fluorescência e no ângulo de Brewster revelaram que a forma FAT provoca agregação espontânea do DMPA na interface ar/água, levando a uma microeterogeneidade, na qual três fases distintas podem ser observadas. A obtenção de espectros de infravermelho na interface ar/água, associada com medidas de atividade catalítica in situ, revelou que a atividade da fosfatase alcalina é modulada pela capacidade de empacotamento interfacial, medida pelo módulo de compressibilidade superficial. Em 20mN/m, há uma reorganização molecular na interface, o que vai restringir a flexibilização da cadeia polipeptídicia, que estará voltada para a interface ar/água. No entanto, ao menos até 30mN/m, nenhuma alteração conformacional foi detectada, como revelada pelos espectros de infravermelho. Filmes LB mistos de DMPA e as duas formas de fosfatase alcalina revelaram que o empacotamento máximo de proteína depende da presença da âncora GFI. Dados usando microgravimetria, atividade enzimática, infravermelho, elipsometria, e microscopia de força atômica mostraram que a adsorção da âncora na interface posiciona o eixo maior do elipsóide, formador da cadeia polipeptídica, paralelamente à matriz lipídica. Na ausência da âncora GFI, o posicionamento da cadeia polipeptídica na interface é aleatório, e para um alto grau de empacotamento, as interações entre os resíduos de aminoácidos intermoleculares favorecerão o posicionamento do eixo maior do elipsóide em uma posição mais perpendicular à interface lipídica / Não consta

A temperatura é o fator ambiental mais importante que afeta a atividade de animais ectotérmicos, como peixes. Ajustes compensatórios à temperatura ocorrem em diferentes cursos temporais, que variam de menos de um minuto a mais de um mês, e as membranas são os primeiros alvos afetados pelas mudanças de temperatura, com resposta imediata dos componentes lipídicos a este desafio. Este trabalho teve como objetivo estimar a capacidade alostática (na estrutura e funções de membrana) no contexto das variáveis climáticas relevantes e caracterizar o âmbito e os mecanismos de mudança, incluindo os mecanismos que concedem tolerância a mudanças de temperatura agudas e crônicas. Juvenis de Steindachneridion parahybae uma espécie de peixe nativa ameaçada de extinção, foram progressivamente resfriados de 30° C a 24, 17 e 12 ° C, nas quais foram mantidas por até 5 dias no tratamento agudo e por até 30 dias no tratamento crônico. Os tecidos hepático, encefálico e branquial foram amostrados, com análises subsequentes das principais frações fosfolipídicas (fosfatidilcolina (FC) e fosfatidiletanolamina (FE) e análises posicionais de cada fração), atividade da Na+/ K+-ATPase e histomorfologia branquial. Os animais mantidos na temperatura mais baixa mostraram uma elevada taxa de mortalidade, provavelmente devido à proximidade desta temperatura ao limite térmico inferior para esta espécie. A atividade da Na+/ K+-ATPase se mostrou aumentada nas temperaturas mais baixas, corroborando o aumento das lesões morfológicas branquiais e massa de fígado para estas temperaturas. Em geral o perfil de ácidos graxos de FC mantiveram-se mais estáveis do que o observado para FE. O teste agudo aparentemente afetou consideravelmente C20-22n3 (FC hepática e sn-1 ; FE encefálica e hepática), enquanto que no teste crônico, C20-22n6 foi o grupamento mais afetado (FC e FE hepático em sn-2 e sn-1). O ensaio agudo mostrou um padrão de manutenção da estrutura de membrana cerebral, com uma diminuição de C20-22n3 hepática e aumento destes ácidos graxos no encéfalo durante o tratamento. Em ambos os tecidos e frações analisados foi possível detectar evidências significativas de reestruturação da membrana, mostrando que o Surubim do Paraíba foi capaz de proporcionar ajustes compensatórios em respostas de aclimatação. / Temperature is the most important environmental factor affecting the activity of ectothermic animals such as fish. Compensatory adjustments to temperature occur with time courses ranging from less than a minute to more than a month, and membranes are the first targets affected by change of temperature, and their lipid components respond immediately to this challenge. This project aimed to estimate the allostatic capacity (in membrane structure and function) in the context of relevant climate variables, and to characterize the scope and the defense mechanisms available, including those yielding tolerance to acute and chronic temperature shifts. Steindachneridion parahybae juveniles, an endangered native fish species, were progressively cooled from 30°C to 24, 17 and 12°C, in which they were maintained for up to 5 days in the acute trial and for up 30 days in the chronic trial. Brain, liver and branchial tissues were sampled, with subsequent analyses of the main phospholipids fractions (phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE), and the positional analyses of each fraction), Na+/K+-ATPase activity and histomorphology of gills. The animals maintained atlower temperature showed a high rate of mortality, probably because this temperature is near the lower thermal limit for this species. The activity of Na+ K+ATPase increased at lower temperatures, the same pattern observed for morphological injuries in gills and increased liver mass. Generally the fatty acid profiles of PC remained more stable than those in PE. The acute test apparently had affected considerably C20-22n3 (liver PC and sn-1 PC; PE in brain and liver), while for the chronic test, C20-22n6 was more affected (PC and PE liver on sn-2 and sn-1). The acute trial showed a pattern of maintenance of brain membrane structure, with a decrease of PE-associated C20-22n3 in the liver and an increase of these fatty acids in brain during the test. In both tissues and fractions analyzed it was possible to detect significant evidences of membrane restructuring, showing that the Surubim do Paraiba was able to provide compensatory adjustments in acclimation responses

O surfactante pulmonar é uma mistura complexa de fosfolipídios e proteínas, e encontra-se presente na interface ar-líquido dos alvéolos pulmonares. O seu papel principal é reduzir a tensão superficial para manter os alvéolos estáveis. A deficiência ou disfunção do surfactante leva ao colapso alveolar, provocando a falta de oxigenação que ocorre devido ao edema ou a resposta inflamatória nos pulmões. Em recém-nascidos, a imaturidade pulmonar, pela deficiência do surfactante, pode causar a Síndrome de Desconforto Respiratória (SDR). Nos adultos, a Síndrome de Desconforto Respiratório Agudo (SDRA) é a manifestação mais grave da Lesão Pulmonar Aguda (LPA), o tratamento para estas doenças inclui a utilização de surfactantes exógenos. Para entender a funcionalidade do surfactante é necessário caracterizá-lo biofisicamente. A principal característica observada neste estudo foi o espalhamento e recuperação do surfactante na subfase, para a interface ar-líquido. O espalhamento e recuperação foram quantificadas observando o trabalho feito em sucessivos ciclos de compressão e expansão na balança de Wilhelmy. Analisou-se o decaimento do trabalho ao longo dos ciclos até a sua estabilização. Os parâmetros obtidos neste ajuste do decaimento exponencial foram utilizados para a caracterização de dois surfactantes exógenos, o Curosurf® e o Survanta®. As comparações entre eles foram segundo a concentração, as subfases e das velocidades de barreira. O decaimento exponencial do trabalho nos ciclos só ocorreu para concentrações menores de surfactante. Quando em subfase de solução salina ocorreu a melhora na recuperação do surfactante para a interface ar-líquido, em comparação a subfase de água ultrapura. A melhor velocidade de barreira encontrada para otimização da recuperação do surfactante foi 120 mm/min. Foi observado nesse estudo que as propriedades de recuperação do Curosurf® foram melhores em relação ao Survanta®, os parâmetros se mostraram de acordo com os dados clínicos encontrados na literatura, a caracterização da dinâmica do surfactante foi feita de forma diferente de todos os métodos encontrados / Lung surfactant is a complex mixture of phospholipids and proteins, found at the airliquid interface of pulmonary alveoli. The main role is to reduce the surface tension to keep alveoli stable. Surfactant deficiency, or dysfunctional, leads to alveolar collapse, causes a lack of oxygen and it may be due to edema or inflammatory response in the lungs. In newborn babies, pulmonary immaturity, caused by surfactant deficiency, may cause Respiratory Distress Syndrome (RDS). In adults, the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS) is the gravest manifestation of Acute Lung Injury (ALI), and the treatment includes Mechanical Ventilation (MV) and exogenous surfactants. To understand surfactant functionality, it is necessary to characterize them biophysically. The main characteristic observed in this work was the mobility and recovery of surfactant in the subphase to the air-liquid interface. The mobility and recover were quantified observing the work done in successive cycles of compression and expansion in a Wilhelmy plate tensiometer. The work decay was analyzed over cycles until its stabilization. The parameters obtained for the exponential fitting of decay were used for characterization of two exogenous surfactants, Curosurf® and Survanta®. The comparisons between them were done under concentration, subphases and barrier speeds. The exponential decay of the cycle work only happened for lower concentrations of surfactant. Saline solution subphase improved the surfactant recovery to the air-liquid interface over ultrapure water subphase. A suitable barrier speed founded to optimize surfactant recovery was 120 mm/min. In this study were observed that recovery properties of Curosurf® were better than Survanta®, the parameters agrees with clinical data from the literature, and the dynamic characterization of surfactant was done of different way than founded methods

Orientador: Daniel Barrera Arellano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-19T21:15:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandes_GabrielDeschamps_M.pdf: 1854677 bytes, checksum: e57833484e8f9ad4a136187bed59d8d2 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Os fosfolipídios são definidos como o grupo de moléculas que contém um grupamento fosfato. Por apresentarem características anfipáticas, este grupo de moléculas se organiza naturalmente em bicamadas, originando as membranas dos seres vivos. Industrialmente são capazes de estabelecer interfaces óleo/água, possibilitando a formação e estabilização de emulsões. Este grupo de moléculas é bastante diverso quimicamente, sendo os principais componentes a fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, ácido fosfatídico e esfingomielina. A determinação e quantificação desses compostos é bastante laboriosa tanto nos meios industriais como acadêmicos, envolvendo, entre outras, etapas de digestão ácida e incineração. A espectrometria de massas desponta como uma técnica bastante favorável à análise de lipídios, englobando desde estudos clínicos até de biocombustíveis. Mais recentemente, as técnicas de espectrometria de massas com ionização ambiente facilitaram o acesso a este tipo de tecnologia, diminuindo os custos de implantação e principalmente de operação. A ionização ambiente por sonic-spray (EASI, easy ambient sonic-spray ionization) denota-se como uma técnica adequada à análise de lipídios, uma vez que não aplica alta voltagem e alta temperatura, prevenindo, portanto possíveis degradações destas moléculas. Este trabalho teve como objetivo, estudar a ionização de fosfolipídios (PL) e triacilgliceróis (TAG) frente à técnica EASI-MS, bem como, estudar a viabilidade técnica da caracterização de lecitinas comerciais por meio da técnica EASI-MS. Quanto à ionização dos lipídios, foi possível observar, nas condições de estudo, que dentro de uma mesma classe (PL ou TAG) a intensidade de ionização diminui com o aumento da cadeia dos ácidos graxos e aumenta com o aumento das insaturações. Para o estudo de caracterização foram utilizadas seis amostras de lecitina de soja comercial, obtidas por diferentes processos. As amostras foram diluídas em clorofórmio e submetidas à análise de EASI-MS, nos modos positivo e negativo. Nos espectros de EASI(+)-MS, os íons mais representativos foram os íons correspondentes à fosfatidilcolina e aos triacilgliceróis, enquanto que, nos espectros de EASI(-)-MS os íons mais representativos corresponderam à fosfatidiletanolamina, aos ácidos graxos livres e aos glicofosfolipídios. A técnica EASI-MS mostrou-se eficiente na caracterização das lecitinas comerciais. Sendo uma técnica rápida e que não exige preparo de amostra / Abstract: Phospholipids are defined as the group of molecules containing a phosphate grouping. As they have amphipathic characteristics, this group of molecules naturally organizes bilayer, origin the membranes of living organism and are able to establish an industrial oil / water interface, allowing the formation and stabilization of emulsions. This group of molecules is very chemically different; the main components are phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidic acid and sphingomyelin. The determination and quantification of these compounds is very laborious for the academic and industrial circles, involving, among others, several steps, like acid digestion and incineration. Mass spectrometry is emerging as a very favorable tool of lipids analysis, since clinical and biofuel studies. Recently, the techniques of ambient mass spectrometry have facilitated the access to this type of technology, reducing deployment costs and especially the operation. Easy ambient sonic-spray ionization (EASI) denotes as a suitable technique to analyze the lipids, since it does not apply high voltage and high temperature, and thereby prevent possible degradation of these molecules. This work aimed to study the ionization of phospholipids (PL) and triacylglycerols (TAG) in EASIMS technique, as well as studying the technical feasibility of the characterization of commercial lecithins by EASI-MS. On the lipid ionization, it was observed, under the conditions of the study, that within the same class (TAG or PL) the ionization intensity decreases with increasing of fatty acids chains and increases with increasing of unsaturation. For characterization studies were used six samples of commercial soy lecithin, obtained by different processes. Samples were diluted in chloroform and analyzed for EASI-MS in positive and negative ion modes. In the spectra of EASI (+)- MS, the most representing ions are corresponding to triglycerides and phosphatidylcholine, whereas in the spectra of EASI (-)-MS the most representative ions correspond to the phosphatidylethanolamine, the free fatty acids and glicophospholipidios. The EASI-MS technique was efficient in the characterization of commercial lecithins. As a fast technique and does not require sample preparation / Mestrado / Tecnologia de Alimentos / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Les peptides pénétrants (CPP) se caractérisent par deux propriétés : ils pénètrent dans l'espace intracellulaire et favorisent l'internalisation de cargaisons moléculaires auxquelles ils sont associés. Si les CPP sont très utilisés comme vecteurs en recherche fondamentale, la méconnaissance des mécanismes de pénétration et de leurs distributions intracellulaires limite leur utilisation thérapeutique. Il est admis que les CPP et leurs cargaisons sont internalisés par transport actif (endocytose) et par transport passif (translocation directe). J'ai étudié la translocation directe à l'échelle moléculaire en utilisant des membranes modèles. Les CPP usuels sont internalisés et permettent l'accumulation de cargaisons dans des vésicules unilamellaires. J'ai alors démontré que la translocation directe se déroule via la formation de complexes neutres et hydrophobes CPP-phospholipides.La pénétration intracellulaire des CPP est le plus souvent étudiée par microscopie confocale. J'ai démontré que des fortes concentrations locales de CPP induit une auto-inhibition de leur fluorophore. Cet artefact a conduit à des erreurs d'interprétation dans la littérature quant à la localisation des CPP. Un protocole permettant de révéler la fluorescence éteinte a été proposé et conduit à réévaluer la localisation subcellulaire des CPP ainsi que l'importance relative des mécanismes d'internalisation.Ces résultats ont permis de développer rationnellement de nouveaux vecteurs pénétrants : les oligoarginines acylées par des chaînes grasses dont des insaturations sont de stéréochimie cis. Leur internalisation passive particulièrement importante conduit à la libération de la cargaison dans le cytosol. / Cell penetrating peptides (CPPs) are short cationic sequences capable of shuttling bioactive cargoes into eukaryotic cells. If CPPs are common delivery tools in basic research, their therapeutic use is currently limited because their internalization mechanisms and intracellular distributions remain to be elucidated. In living cells there is evidence for both endocytosis of the CPPs and for “direct translocation”, an energy-independent uptake pathway. I analyzed the direct translocation phenomenon at the molecular level with model membranes. CPPs are internalized into large unilamellar vesicles and trigger the internalization of various cargoes. I then demonstrated that direct translocation occurs through membranes via the formation of a neutral and hydrophobic CPP-anionic phospholipids complex. CPPs internalization is mostly analyzed by confocal microscopy. I demonstrated that fluorescence self-quenching occurs if fluorescently labeled CPPs are locally too concentrated. This severe artifact led to misinterpretation of the subcellular distribution of CPPs. I developed a reliable procedure to avoid this artifact and ranked subcellular regions of living cells depending on their CPP concentration. As a result, I was able to rationalize the subcellular distribution of CPPs and to deduce their penetration mechanisms. The studies that I performed provided valuable information that I used to design a new family of delivery vectors: minimalist oligoarginines peptides acylated by unsaturated fatty acids (cis unsaturations). The direct translocation of these lipopeptides is particularly important yielding to an efficient delivery of a cargo inside the cytosol of living cells.

Le paludisme est causé par l'infection et la destruction des érythrocytes par les parasites protozoaires appartenant au genre Plasmodium. Au cours de son développement dans l'érythrocyte,Plasmodium falciparum requiert la biosynthèse massive de membranes dont les principaux constituants lipidiques sont des phospholipides. La phosphatidylcholine (PC) et la phosphatidyléthanolamine (PE) représentent à elles deux environ 80 % des lipides membranaires et l'inhibition de leur biosynthèse est létale pour le parasite. La PC et la PE sont synthétisées par le parasite, principalement via les voies de novo dépendantes de la CDP-choline et de la CDP-éthanolamine (ou voies de Kennedy) en utilisant respectivement la choline et l'éthanolamine comme précurseurs. Ces travaux de thèse se focalisent sur les deux enzymes CTP:phosphocholine etCTP:phosphoéthanolamine cytidylyltransférase (PfCCT et PfECT, respectivement), catalysant les étapes limitantes des voies de Kennedy. Chez Plasmodium, les CCT et ECT possèdent deux domaines cytidylyltransférases (CT) portant l'activité catalytique, séparés par une longue région de liaison. Pour la CCT, cette duplication est retrouvée seulement chez trois organismes, tous faisant partie du phylumdes Apicomplexes : Babesia, Theileria et Plasmodium, alors que la présence de deux domaines CT estune caractéristique retrouvée chez toutes les ECT étudiées à ce jour. La première partie de ce travail de thèse concerne la caractérisation biochimique et l'inhibition la PfCCT Nous avons montré que les deux domaines CT de la PfCCT sont actifs à l'inverse de la PfECT pour laquelle seul le domaine CTN-terminal est catalytiquement actif. A la suite d'un criblage virtuel basé sur la structure de l'enzyme,nous avons identifié un composé princeps capable d'inhiber l'activité de la PfCCT in vitro, la synthèse de PC et la croissance parasitaire. Ce premier composé actif (haut µM) représente une base pour l'optimisation future de nouveaux composés plus efficaces. Dans la deuxième partie de cette thèse,nous avons déterminé le mécanisme catalytique, la spécificité de liaison des ligands et l'organisation structurale de la PfECT grâce à la combinaison d'approches biochimiques et biophysiques. L'ensemble des résultats présentés dans ce manuscrit apportent un éclairage important concernant le fonctionnement de ces deux cibles potentielles et constituent des étapes essentielles à l'élaboration d'une approche thérapeutique. / Malaria is caused by the infection and destruction of red blood cells by protozoan parasitesbelonging to the genus Plasmodium. During its intra-erythrocytic development, Plasmodiumfalciparum requires massive biosynthesis of membranes which are mainly composed of phospholipids.Phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE) together represent about 80% of thetotal membrane lipids and inhibition of their biosynthesis leads to parasite death. PC and PE aresynthesized by the parasite's machinery mainly through the de novo CDP-choline and CDPethanolamine(Kennedy) pathways using respectively choline and ethanolamine as precursors. Thisstudy focuses on the rate limiting steps of these pathways catalyzed by CTP:phosphocholine andCTP:phosphoethanolamine cytidylytransferases (PfCCT and PfECT, respectively). In Plasmodiumspecies, both CCT and ECT contain two catalytic cores (CT domains) separated by a long linker.Interestingly, for CCT this feature is found only in three organisms, all from the phylum ofApicomplexa: Babesia, Theileria and Plasmodium, whereas the presence of two CT domains is ageneral feature in all ECTs known so far. The first part of this work consists in the biochemicalcharacterization of PfCCT and the investigation of its druggability. We showed that both PfCCT CTdomains are active and display similar kinetic parameters while only the N-terminal CT domain wasactive in PfECT. Subsequent to an in silico structure-based screening of compounds libraries, weidentified a PfCCT inhibitor able to inhibit PC synthesis as well as P. falciparum growth in vitro in thehigh µM range. This compound represents a first step toward the optimization of future more potentcompounds. In the second part of this study, we investigated the catalytic mechanism of PfECT anddeciphered its interactions with its ligands using biochemical, biophysical and structural approaches.Collectively, these results bring new insights into the biochemical and structural properties of thesetwo keys enzymes of the phospholipid metabolism in P. falciparum and pave the way for their futuredevelopment as potential drug target.

Fuel molecules are organic solvents that have disruptive effects on the bacterial membrane. This is a significant barrier in biofuel production, as it limits the fuel concentration that can be achieved through fermentation. One potential way of overcoming this barrier is to identify lipid compositions that can better withstand solvent stress, for which it is important to understand how organic solvents disrupt the membrane. Use of biophysical characterization techniques to quantify physical properties like fluidity and thickness will enable us to understand the mechanism by which solvents disrupt membranes. Native membranes are very complex, and we sought to develop in-vitro models for the membrane of the bacterium Bacillus subtilis that use pure phospholipids. Toward this goal, a number of the unusual B. subtilis fatty acids were synthesized, partial synthesis of the membrane phospholipids was achieved, and preliminary assessment of solvent effects on standard lipids was performed using a fluorescence technique.

Concerns about global warming have resulted in a surge of research into alternatives to fossil fuels. In recent years, biofuels have gained traction due to their low environmental impact. Biofuel production most commonly employs microorganisms to convert biomass to fuel for industrial and transportation applications. Compounds made in biofuel production, however, are toxic to cell membranes and disrupt their integrity, harming the microorganisms and limiting biofuel yield. A key to overcoming this challenge is understanding how fuels interact with microorganisms’ cell membranes, which perform a host of functions, including transport, cell recognition, transduction, and movement. Phospholipids are the cell membrane’s building blocks and provide the critical matrix to support these vital functions. This research sought to make in-vitro membrane phospholipid models of the bacterium Bacillus subtilis (a biofuel producer candidate), subject them to fuel stress and employ fluorescence techniques to understand how fuels affect membrane integrity.