A terapia fotodinâmica (TFD) é uma promissora técnica para o tratamento de câncer e de outras patologias. O tratamento baseia-se na ação de uma fonte de luz com o agente fotossensibilizador (FS) e o oxigênio molecular presente nas células, gerando espécies reativas de oxigênio que causam a morte celular. Uma das limitações atuais da técnica é a penetração da luz no tecido biológico. Entre os fotossensibilizadores mais empregados, estão os derivados de hematoporfirina, que são excitados da região do vermelho do espectro eletromagnético. Fotossensibilizadores vêm sendo desenvolvidos para iluminação com comprimentos de onda maiores, com o potencial de aumentar a profundidade de penetração e em conseqüência, o volume tecidual tratado. Outra opção para aumentar o volume tecidual de resposta utilizando derivados de hematoporfirina é a utilização de fontes de luz pulsada que, em comparação com a contínua, vem apresentado resultados significativos no estudo da TFD. Neste estudo, foi realizada a fotodegradação in vitro do fotossensibilizador comercial Photogem® (Moscou, Rússia) com tempos variando entre 0 e 40 minutos. Como fonte de luz contínua foi utilizado um laser de diodo (Eagle Heron Quantum Tech, Brasil), e como fonte de luz pulsada, foi utilizado um laser em regime de femtossegundos emitindo em 630 nm, 1 kHz, pulso < 70 fs (Ti:Sapphire Libra-S, Opera-VIS Coherent, USA). Para a coleta dos dados, foi utilizado um sistema de espectroscopia por fluorescência portátil composto por um espectrometro USB 2000, um laptop e sonda em Y para excitação e coleta da fluorescência do FS. Também foi realizada a TFD em fígados normais de ratos. Foram utilizados 18 animais, pesando entre 180 e 250g. Os animais foram divididos em 2 grupos. Ambos os grupos receberam 1,5 mg/kg de FS, e após 30 minutos foram iluminados com dose de energia de 150 J/cm2 e intensidade de 74 mW/cm2. Também foi realizado o estudo da penetração da luz utilizando macerado de figado de rato, e o mapeamento térmico durante a TFD com a fonte de luz CW e o laser pulsado. O estudo da taxa de fotodegradação do FS nos mostrou uma maior eficiência da fonte de luz pulsada para a degradação da molécula de Photogem®, enquanto que a taxa de degradação para o CW foi 6 vezes menor. O macerado mostrou que o coeficiente de penetração da luz CW e a luz pulsado são praticamente os mesmos, o que sustenta a análise com a intensidade média. O estudo in vivo mostra, através de uma análise histológica do perfil de necrose, que a fonte de luz pulsada alcança uma profundidade de necrose cerca de 2 vezes maior, em comparação com a fonte em regime contínuo, além de um melhor resultado em uma avaliação qualitativa da morfologia da região de necrose. Isto está relacionado com a alta intensidade dos pulsos emitidos pela fonte de luz pulsada com o tecido e o FS presente, promovendo o aumento na profundidade de necrose. / Photodynamic therapy (PDT) is a useful technique for the treatment of cancer lesions and other diseases. The treatment is based on the interaction of light with a photosensitizer agent (PS) and with molecular oxygen that is present in cells, which generates reactive oxygen species that promote cell death. One of the limitation factors of this technique is limited light penetration in biological tissue. Hematoporphyrin derivatives are among the most used photosensitizers. They are excited on the red region of the electromagnetic spectrum. New photosensitizers has been developed for the use with longer wavelengths, potentializing the increase of penetration depth and, hence, the volume of treated tissue. Another option to increase the volume of responding tissue in PDT studies is to use pulsed light sources, which has presented satisfactory results when compared to continuous (CW) light sources. In this study, in vitro photodegradation of Photogem® (commercial photosensitizer, Moscow, Russia) was performed, during irradiation times between 0 and 40 minutes. A diode laser (Eagle Heron Quantum Tech, Brazil) was used as CW light source, and a femtosecond laser (Ti:Sapphire Libra-S, Opera-VIS Coherent, USA) emitting in 630 nm (1 kHz, < 70 fs pulse) was used as a pulsed light source. Data collection was performed using a portable fluorescence spectroscopy system, including a spectrometer USB 2000 (Ocean Optics®, Palo Alto, CA), a laptop and a Y-type optical fiber probe for PS fluorescence excitation and collection. Photodynamic response was investigated in eighteen animals, weighting between 180 g and 250 g, which were divided in two groups. Both groups received 1.5 mg/kg of body mass of PS, and after thirty minutes were irradiated with light dose of 150 J/cm2 and 74 mW/cm2 for fluence rate. Light penetration was also investigated using rat liver macerate, and thermal monitoring during PDT as well, for both pulsed and CW light sources. The photodegradation rate study allowed us to observe a greater efficiency in Photogem® molecules degradation for the pulsed light source. For the CW irradiation, the degradation rate was 6 times lower. Macerate study showed that light penetration coefficient values for CW and pulsed were similar, which corroborates with the average intensity analysis. The depth of necrosis histological analysis showed that the pulsed light source allows depth of necrosis to be about 2x deeper when compared to CW source. Additionally, the pulsed source showed a better result in the qualitative evaluation of necrotic tissue morphology. This is related to the high intensity of the pulses emitted from the pulsed light source on the photosensitized tissue, promoting an increase in depth of necrosis.

A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) tem sido amplamente utilizada em Periodontia por permitir redução de periodontopatógenos, com ausência de efeitos sistêmicos colaterais e mínimas possibilidades de resistência bacteriana. Surge assim uma boa alternativa adjuvante para o tratamento da doença periodontal (DP), como para os pacientes com Síndrome de Down (SD) que possuem maior severidade e alta prevalência dessa doença. O objetivo desse estudo foi avaliar a efetividade da aPDT como adjuvante da raspagem e alisamento corono-radicular (RACR) em pacientes com SD. Foram realizadas avaliações dos parâmetros clínicos como: índice de placa (IP), índice gengival (IG), nível clínico de inserção (NCI), profundidade (PS) e sangramento à sondagem (SS) no período inicial e após 1 e 3 meses do tratamento. Para a aPDT, foi utilizado laser vermelho (658nm; 0,1W; 2229J/cm2; 10s por ponto), com o corante azul de metileno (AM) como agente fotossensibilizador na concentração de 100&#x3BC;g/ml, com tempo de pré-irradiação de 3 minutos, com repetidas sessões após 3,7 e 14 dias. As análises estatísticas foram realizadas com testes paramétricos e não paramétricos (p<0,05). Participaram desse estudo 33 pacientes com SD, randomizados aleatoriamente em dois grupos: C (RACR), composto por 6 mulheres e 11 homens (27±9,16 anos) e aPDT (realizadas associação da aPDT com a RACR), composta por 9 homens e 7 mulheres (27,12±9,74anos). Os pacientes são os principais responsáveis pela sua escovação (100%) com baixíssima ajuda pelos pais e/ou responsáveis na supervisão ou reforço da escovação (12,12%). Houve melhora de todos os índices periodontontais nos tempos inicias (baseline), como após 1 e 3 meses tanto para o grupo C (redução da PS de 0,97mm do baseline para 3 meses; redução do SS de 16,13% do baseline para 3 meses; redução do IP de 11,29% do baseline para 3 meses, redução do NCI de 0,09mm do baseline para 3 meses) e para o grupo aPDT (redução da PS de 1,56mm do baseline para 3 meses, redução do SS de 16,77% do baseline para 3 meses, redução do IP de 13,81% do baseline para 3 meses, redução do NCI de 0,13mm do baseline para 3 meses). Conclui-se que ambos os tratamentos resultaram em melhoras clínicas (PS, SS, IP, NCI) significantes no tratamento da doença periodontal em pacientes com SD. / Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) has been widely used in Periodontics to obtain reduction of periodontopathogenic bacteria with absence of systemic side effects and minimal bacterial resistance. Therefore, a good adjuvant alternative for periodontal disease (PD) treatment arises, especially for patients with Down syndrome (DS) who present greater severity and high prevalence of PD. The aim of this study was to evaluate the effectiveness of aPDT as an adjuvant of scaling and root planning (SRP) for treatment of PD in patients with DS. Periodontal clinical exam was evaluated by: plaque index (PI), gingival index (GI), clinical attachment loss (CAL), probing depth (PD) and bleeding on probing (BOP) in baseline, one and three-month treatment periods. The aPDT protocol was red laser (658nm; 0.1W; 2229J/cm2, 10s per point), methylene blue dye (MB), 100&#x3BC;g/ml, with a 3-minute preirradiation. aPDT sessions were repeated after 3, 7 and 14 days. Statistical analysis was performed using parametric and non-parametric tests (p<0.05). 33 patients with DS participated in this study, randomly assigned into two groups: C (SRP), composed of 6 women and 11 men (27 ± 9.16 years old) and aPDT (SRP + aPDT), composed of 9 men and 7 women (27.12 ± 9,74 years old). Patients were the main contributors to the brushing (100%) with very low support by parents and/or guardians in monitoring or enhancing brushing (12.12%). There was improvement of clinical parameters in baseline (B), and after 1 and 3 months for group C (reduction on PB of 0.97mm from baseline to 3 months; reduction on BOP of 16.13% from baseline to 3 months; reduction on PI of 11.29% from baseline to 3 months, reduction on CAL of 0.09mm from baseline to 3 months) and for the aPDT group (reduction on PB of 1.56mm from baseline to 3 months, reduction on BOP of 16.77% from baseline to 3 months, reduction on PI of 13.81% from baseline to 3 months, reduction on CAL of 0.13mm from baseline to 3 months). In conclusion, besides an improvement in periodontal condition, aPDT as an adjuvant of SRP did not enhance the clinical periodontal parameters in relation to SRP alone.

A terapia fotodinâmica (TFD) tem se apresentado nos últimos anos como uma alternativa para o tratamento de tumores cutâneos, viscerais e sistêmicos, demonstrando resultados promissores, tanto em estudos in vitro como in vivo. Trata-se de uma técnica simples e não invasiva. A terapia consiste na excitação de um fármaco fotossensibilizante por uma fonte de luz visível que depois de absorvida pela molécula, leva a produção espécies reativas de oxigênio (EROs) em presença do oxigênio molecular por uma sequencia de reações fotoquímicas. Nesse trabalho propõe-se a preparação, caracterização e detreminação da atividade fotodinâmica de uma nanoemulsão rica em colesterol e de lipossomas ultradeformáveis como novos sistemas de liberação para o fármaco fotossensibilizante cloro alumínio ftalocianina (PcAlCl), comparando com um sistema clássico de lipossoma convencional. Como modelo celular foram utilizadas células de glioblastoma (U87MG) e de melanoma (B16F10). As formulações apresentaram características desejáveis como reprodutibilidade, tamanho de partícula, estabilidade curto e em longo prazo e deformidade adequados para a utilização como meio de veiculação da PcAlCl. Pela análise dos estudos fotofísicos de rendimento quântico de fluorescência (?F), tempo de vida de fluorescência (?) e rendimento quântico de oxigênio singleto (??) da PcAlCl em etanol e incorporada nas formulações, pode-se observar que a incorporação a um veículo de liberação melhorou as características da PcAlCl. Nos estudos em células nenhum dos sistemas apresentou citotoxicidade na ausência de luz, mas apresentaram um aumento da atividade fotodinâmica da PcAlCl de até 80% quando comparadas à PcAlCl livre quando irradiadas. Todas as formulações apresentaram características que corrobora com o emprego como sistemas de liberação para o aumento da atividade fotodinâmica da PcAlCl podendo serem empregados no tratamento de glioblastoma e de melanoma / The Photodynamic therapy (PDT) has been an alternative for the treatment of skin, and brain tumors, and has shown promising results, both in vitro and in vivo, is a simple and non-evasive technique. The therapy consists into a light-sensitive drug excitation by a light visible source that once absorbed by the molecule lead to produce reactive oxygen species (ROS) in the molecular oxygen presence by a sequence of photochemical reactions. This work proposes the preparation and characterization of a cholesterol-rich nanoemulsion and ultradeformable liposomes as new delivery systems for the drug photosensitizer chloro aluminum phthalocyanine (PcAlCl) compared to a classical system as the conventional liposome and their photodynamic activity in glioblastoma cells line (U87MG) and melanoma cells line (B16F10). The formulations showed suitable characteristics such as reproducibility, particle size, short and long-term stability and deformity for their use as drug delivery for PcAlCl. For the photophysical studies: absorption, fluorescence, fluorescence quantum yield (?F), fluorescence lifetime (?) and quantum yield of singlet oxygen (??) of PcAlCl in ethanol and incorporated in the formulations demonstrated that the incorporation was able to improve its photophysical characteristics. In in vitro studies, the drug delivery systems showed no cytotoxicity in the absence of light, but demonstrated increased in PcAlCl photodynamic activity up to 80% over the PcAlCl free when irradiated. All formulations showed characteristics, which cooperates with the use of these drug delivery systems for, increased the PcAlCl photodynamic activity for glioblastoma and melanoma treatment

Neste trabalho, duas estratégias para obtenção de um complexo de rutênio com os tetraazamacrociclos insaturados 2,3,9,10-tetrametil-1,4,8,11-tetraazaciclotetradeca-1,3,8,10-tetraeno (TIM) ou 5,7,712,14,14-hexamethil-1,4,8,11-tetraazaciclotetradeca-4,11-dieno (1,7-CT) foram estudados. [RuCl2(TIM)] e [RuCl2(1,7-CT)] seriam precursores para obtenção de nitrosilo complexos capazes de liberar óxido nítrico fotoquimicamente pela irradiação com luz em comprimentos de onda na região do visível, como na Terapia Fotodinâmica. Essas duas estratégias são a reação utilizando o rutênio como template e a metalação do ligante previamente sintetizado. A estratégia de metalação foi empregada com o ligante 1,7-CT e utilizando o complexo cis-[RuCl2(dmso)] como precursor para obter o cis-[Ru(1,7-CT)Cl2]Cl. Este método foi aplicado com sucesso para sintetizar complexos de rutênio ligantes tetraazamacrocíclicos como cyclam, cyclen, imcyclen. O ligante 1,7-CT foi sintetizado com sucesso. O espectro de infravermelho mostrou bandas em 3130 cm-1, 2910 cm-1, 1663 cm-1, e 1547 cm-1, em acordo com o relatado na literatura, e o espectro de RMN-1H mostrou singletes em 1.45 ppm, 2.04 ppm, 2.77 ppm, e tripletes em 2.92 ppm e 3.39 ppm, como esperado. Tentativas de síntese do complexo de rutênio correspondente não foram bem sucedidas, conforme se depreende pelos espectros de RMN-1H e de infravermelho. A estratégia que aplica o efeito template para a obtenção do complexo foi a que deu os melhores resultados, embora o complexo não tenha sido isolado do meio reacional. Os resultados das análises espectroscópicas obtidos do extrato seco da reação mostram que o complexo [RuCl2(TIM)] foi obtido. Os espectros de absorção no UV-visível foram feitos durante a reação e mostraram que os precursores estavam reagindo, pois novas bandas apareciam em detrimento do desaparecimento das originais, ao longo da reação. Há alguns indícios de que possa ter havido decomposição, pois o espectro de RMN-1H mostrou um pequeno singleto em 2.25 ppm que pode indicar a presença de 2,3-butanodiona como resultado da decomposição. O espectro de RMN-1H também mostrou um quintupleto em 2.09 ppm e um tripleto em 3.13 ppm, conforme esperado para o macrociclo. Os espectros de infravermelho mostraram a presença de bandas em 1690 cm-1, 1429 a 1374 cm-1, 1200 cm-1 e 942 cm-1, consistentes com a presença do TIM no complexo, além da banda em 448 cm-1, consistente com a presença de ligações Ru-N. A comparação entre os espectros de infravermelho do complexo de rutênio com os complexos análogos de níquel e ferro apoia essas atribuições. / ABSTRACT In this work, two strategies to obtain a complex of ruthenium with the unsaturated tetraazamacrocycles 2,3,9,10-tetramethyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradeca-1,3,8,10-tetraene (TIM) or 5,7,712,14,14-hexamethyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradeca-4,11-diene (1,7-CT) were studied. [RuCl2(TIM)] and [RuCl2(1,7-CT)] would be precursors to obtain nitrosyl complexes able to deliver nitric oxide photochemically by irradiation with visible light as in photodynamic therapy. These two strategies are the reaction using ruthenium as template and the metallation of the ligand previously synthesized. The metallation strategy was used with the ligand 1,7-CT and the precursos cis-[RuCl2(dmso)4] to obtain cis-[Ru(1,7-CT)Cl2]Cl. This method is successfuly applied to synthesize ruthenium complexes with tetraazamacrocyclic ligands as cyclam, cyclen, imcyclen. The 1,7-CT was successfully synthesized. The infrared spectrum of 1,7-CT showed bands about 3130 cm-1, 2910 cm-1, 1663 cm-1, and 1547 cm-1, in agreement with the data found in the literature, and the 1H-NMR spectrum showed singlets at 1.45 ppm, 2.04 ppm, 2.77 ppm, and triplets at 2.92 ppm and 3.39 ppm, as expected. Attempts to synthesize the corresponding ruthenium complex were unsuccessful as long as 1H NMR and infrared spectroscopy are concerned. The strategy applying the template effect to obtain the complex was the one that gave the more positive results, although the complex was not isolated from the reaction media. Spectral analysis from the dry extract of the reaction drove us to believe that the complex [RuCl2(TIM)] was obtained. The UV-visible absorption spectra taken during the reaction showed that the precursors were properly reacting because new bands were taking place of the originals bands of the precursors during the reaction course. There are some indications that some decomposition may have taken place, as the 1H NMR spectrum showed a small singlet at 2.25 ppm that could indicate the presence of 2,3-butanedione as a result of this decomposition. The 1H NMR spectrum also showed a quintuplet at 2.09 ppm and a triplet at 3.13 ppm, as expected for the macrocycle. The infrared spectrum showed the presence of bands about 1690 cm-1, 1429 to 1374 cm-1, 1200 cm-1 and 942 cm-1, consistent with the presence of TIM in the complex, and the presence of bands about 448 cm-1, consistent with the presence of Ru-N bonds. Comparison of the ruthenium complex infrared spectrum to those of the nickel and iron analogous complexes supports this assumption.

O glioblastoma multiforme (GBM) pode desenvolver-se rapidamente sem evidências clínicas, radiológicas ou morfológicas de um tumor precursor menos maligno. Entretanto, um novo tumor pode desenvolver-se a partir de células gliais normais ou de suas precursoras, sendo chamado de GBM primário. Já meduloblastoma é um tumor embrionário maligno do cerebelo, cuja incidência ocorre preferencialmente em crianças de até 7 anos. Os tumores de cérebro se diferem entre si em nível molecular. A amplificação do gene EGFR (Receptor do Fator de Crescimento Epidermal) com consequente elevação da expressão do receptor de EGF (Fator de Crescimento Epidermal) é mais proeminente em GBM primário quando comparado com GBM secundário e está presente também em meduloblastoma. O presente trabalho consiste em investigar o perfil de expressão gênica da via EGF e o perfil proteico de genes supressores de tumor e oncogenes de linhagens de células tumorais de glioblastoma e meduloblastoma após o tratamento com terapia fotodinâmica (TFD). O conhecimento da ação da TFD em tumores cerebrais em nível molecular permitiu a detecção de genes que participam da regulação da expressão gênica de outras vias de sinalização como RTK/Ras/PI3-K e AKT/MAPK que são responsáveis pela proliferação celular aumentada, sobrevivência ou resistência a apoptos e perda de aderência e migração, podendo revelar alto grau de invasividade. Portanto, o tratamento com terapia fotodinâmica em células tumorais do cérebro acrescenta informações relevantes sobre o processo de proliferação celular e da biologia do câncer. / Glioblastoma multiforme (GBM) can develop quickly without clinical, radiological or morphological of a less malignant precursor tumor. However, a new tumor can grow from normal glial cells or their precursors, is called the primary GBM. Medulloblastoma is also a malignant embryonic tumor of the cerebellum, whose incidence occurs preferentially in children under 7 years. Brain tumors differ from between them at the molecular level. The amplification of the EGFR gene (Growth Factor Receptor Epidermal) with an increase in the expression of EGF receptor (Epidermal Growth Factor) is the main cause in primary GBM compared to secondary GBM and is also present in medulloblastoma. This work to investigate the gene expression profile of the EGF pathway and the protein profile of tumor suppressor genes and oncogenes tumor cell lines of glioblastoma and medulloblastoma after treatment with photodynamic therapy (PDT). PDT\'s share knowledge in brain tumors at the molecular level allowed to discovery of genes that participate in the regulation of gene expression of other RTK/Ras/PI3-K and AKT/MAPK signaling pathways such as that are responsible for the increased cell proliferation, survival or resistance to apoptosis and loss of adhesion and migration, and may reveal a high degree of invasiveness. For this reason, treatment with photodynamic therapy in brain tumor cells adds relevant information about the process of cellular proliferation and cancer biology.

O princípio de terapia fotodinâmica (TFD) foi introduzido por volta de 1900 mas posteriormente investgado como candidato para tratamento de cancer na década de 1970. Desde então, existem diversos trabalhos a respeito do assunto in vitro, in vivo e em estudos clínicos e grandes avanços foram alcançados. Entretanto, alguns desafios ainda não foram superados, como a variabilidade dos resultados. Este trabalho consiste na investigação de suas causas, em que o principal objetivo é avançar o estado da arte em TFD. Para isso foi usado um modelo de distribuição de limiar de dose para avaliar resistência em TFD in vitro. As distribuições de limiar de dose são obtidas pela derivação a curva de dose resposta experimental. Elas são caracterizadas pela sua largura e pela dose que corresponde ao pico, que se relaciona a homogeneidade e resistência intrínseca da população, respectivamente. Na seção 1, é apresentada a avaliação e comparação de dados obtidos de resultados publicados na literatura e, na seção 2, de experimentos realizados pela autora em diferentes linhagens celulares. Da análise da primeira etapa, foi observado que a largura da distribuição é proporcional a dose do pico e foi possível investigar a dependência do resultado da TFD com a linhagem celular, dado um fotossensibilizador (FS). Foi interessante, também, notar que as distribuições de limiar de dose correspondem a curvas de atividade de marcadores celulares de apoptose, como função da dose de luz, para a maior parte das condições analisadas. Dos experimentos realizados pela autora, foi visto que as células normais são as mais resistentes ao dano, seguida das células de câncer resistentes e sua linhagem parental, e que sua resposta foi a mais homogênea. Essas observações foram corroboradas pelas imagens obtidas de microscopia de fluorescência para avaliação da captação de FS, que mostraram que as células tumorais acumulam mais FS que as outras. Portanto, foi mostrado o potencial de se aplicar distribuições de limiar de dose na análise de resultados de TFD in vitro, ela é uma poderosa ferramenta que fornece mais informações que as curvas de dose resposta padrão. / The principle of photodynamic therapy (PDT) was introduced around 1900 but further investigated as a candidate to cancer treatment in the 1970´s. Since then, there are several papers regarding the subject in vitro, in vivo and clinical trials and great advances were achieved. However, some challenges were not yet overcome, such as results variability. This work consists in the investigation of its causes, where the main goal is to advance the state of art of PDT. For that it is being used a threshold dose distribution model to evaluate cell resistance to PDT in vitro. The threshold distributions are obtained by differentiating the experimental dose response curve. They are characterized by its width and the dose that corresponds to the peak which relates to the homogeneity and intrinsic resistance of the population, respectively. In section 1, it is presented the evaluation and comparison of data obtained from published results in literature and, in section 2, of experiments performed by the author in different cell lines. From the analysis in the first part, it was observed that the width of the distribution is proportional to its dose of the peak and it was possible to investigate the dependence of the PDT result with the cell line, given a fixed photosensitizer (PS). It was also interesting to note that the threshold distribution corresponded to the activity curves for apoptotic cell markers as a function of light dose, for most of the conditions analyzed. From the experiments performed by the author, it was seen that the normal cell line was the most resistant one, followed by the resistant cancer cells and its parental cell line, and that its response was more homogeneous. Those finding were supported by the fluorescence microscopy images obtained to evaluate PS uptake, which shown that the tumor cells accumulated more PS than the other ones. Therefore, it was shown the potential of applying the threshold distribution to analyze PDT results in vitro, it is a powerful tool that provides more information than the standard dose response curves.

A periodontite é causada por bactérias patogênicas, podendo ser tratada com sucesso por meio de procedimentos que incluem instruções de higiene oral, eliminação de fatores retentivos de biofilme, raspagem e alisamento radicular (RAR), combinados ou não com cirurgias periodontais. A literatura tem relatado que os pacientes fumantes apresentam uma resposta inferior ao tratamento periodontal convencional, cirúrgico ou não, quando comparados aos pacientes não-fumantes. Assim, justifica-se a avaliação de terapias complementares aos procedimentos convencionais de raspagem e alisamento radicular (RAR) nesses pacientes. Estudos in vitro e in vivo têm demonstrado o potencial da terapia fotodinâmica antimicrobiana (TFDa) contra as bactérias periodontopatogênicas. Desta forma, o presente estudo visou analisar a ação complementar da TFDa à RAR em pacientes fumantes portadores de periodontite crônica. Foram selecionados 20 pacientes fumantes com periodontite crônica, apresentando um par de dentes contralaterais com sangramento à sondagem e profundidade de sondagem maior ou igual a 5 mm. Cada par de dentes foi aleatoriamente dividido em grupo controle (GC), no qual foi realizada a RAR e em grupo teste (GT), no qual além da RAR foi realizada a TFDa, em aplicação única. Parâmetros clínicos de índice de placa (IP), sangramento à sondagem (SS), profundidade de sondagem (PS), nível clínico de inserção relativo (NCI), recessão gengival (RG) foram registrados no exame inicial, 4 e 12 semanas após o tratamento periodontal. Além disso, no exame inicial e 1, 4 e 12 semanas após o tratamento periodontal foram coletadas amostras de biofilme subgengival para a identificação e quantificação das espécies bacterianas através da técnica de Checkerboard DNA-DNA Hybridization e também de fluido crevicular gengival (FCG) para a quantificação da Interleucina-1 beta (IL-1&beta;) e Metaloproteinase 8 (MMP-8) por meio do teste ELISA. Houve uma redução estatisticamente significante na PS (GT: 1,81±0,52 mm / GC: 1,58±1,28 mm; p<0,001) e um ganho estatisticamente significante no NCI (GT: 1,60±0,92 mm/GC: 1,41±1,58 mm; p<0,001) para ambos os grupos. Diferenças estatisticamente significantes não foram observadas nas comparações entre os grupos. A concentração de IL-1&beta; no FCG foi maior no GC no exame realizado 1 semana após o tratamento periodontal (GT: 24,65±18,85 pg/&mu;L / GC-34,07±24,81 pg/&mu;L; p=0,048) e a concentração de MMP-8 foi maior também no GC 12 semanas após o tratamento periodontal (GT: 303,31±331,62 pg/&mu;L / CG: 534,23±647,37 pg/&mu;L; p=0,024). Não houve diferenças estatisticamente significantes na análise intragrupos. As 40 espécies bacterianas avaliadas foram detectadas em diferentes níveis no exame inicial, sem diferenças estatisticamente significantes entre os grupos. Após o tratamento periodontal, o nível de algumas bactérias diminuiu enquanto outras espécies apresentaram um aumento. Apesar dessa variação, a análise estatística não foi capaz de identificar diferenças estatisticamente significantes nas comparações intra e intergrupos. Assim, este estudo não foi capaz de demonstrar que o efeito adjunto da TFDa (em aplicação única) associada à RAR melhora os parâmetros clínicos em pacientes fumantes. Contudo, a TFDa foi capaz de reduzir significativamente a concentração de IL-1&beta; (no exame de uma semana) e MMP-8 (no exame de 12 semanas), sugerindo uma possível vantagem na cicatrização periodontal. Isso não foi confirmado, no entanto, pela analise microbiológica, que mostrou que nenhum dos tratamentos reduziu significamente os níveis bacterianos. / Periodontitis is caused by pathogenic bacteria and it can be successfully treated by procedures that include oral hygiene instructions, elimination of plaque retentive factors and scaling and root planing (SRP) alone or in combination with periodontal surgery. The literature has reported that smokers present a poorer response to conventional periodontal treatment when compared with nonsmoking patients. Thus, it is appropriate to evaluate adjunctive therapies to conventional treatment of scaling and root planing (SRP) in these patients. In vitro and in vivo studies have demonstrated the potential of antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) against periodontopathic bacteria. Thus, this study aimed to analyze the adjunctive action of aPDT to SRP in smokers with chronic periodontitis. We selected 20 smokers with chronic periodontitis, presenting a pair of contralateral teeth with bleeding on probing and probing depth greater than or equal to 5 mm. Each pair of teeth was randomly alocated on control group (CG), in which SRP was performed, and on test group (TG), in which PDT was performed in addition to SRP. Clinical parameters of plaque index (PI), bleeding on probing (BOP), probing depth (PD), relative clinical attachment level (CAL), gingival recession (GR) were recorded at the baseline and 4 and 12 weeks after periodontal treatment. Moreover, at baseline and 1, 4 and 12 weeks after periodontal treatment, subgingival plaque samples were collected for identification and quantification of periodontopathic bacteria using Checkerboard DNA-DNA hybridization technique, as well as gingival crevicular fluid (GCF) samples for quantification of Interleukin-1 beta (IL-1&beta;) and metalloproteinase 8 (MMP-8) using ELISA. There was a statistically significant reduction in PD (GT-1.81 ± 0.52 mm / GC-1.58 ± 1.28 mm, p <0.001) and a statistically significant gain in CAL (GT-1.60 ± 0, 92 mm / GC-1.41 ± 1.58 mm, p <0.001) for both groups. Statistically significant differences were not observed in comparisons between groups. The concentration of IL-1&beta; in GCF was higher in GC in the examinations performed 1 week after periodontal treatment (GT-24, 65 ± 18.85 pg / &mu;L / GC-34, 07 ± 24.81 pg / &mu;L, p = 0.048) and MMP-8 was also higher in GC 12 weeks after periodontal treatment (GT-303, 31 ± 331.62 pg / &mu;L / CG-534, 23 ± 647.37 pg / &mu;L, p = 0.024). There was no statistically significant differences in the intra-groups analyses. The 40 bacterial species tested were detected at different levels at baseline, with no statistically significant differences between groups. After periodontal treatment, the level of some bacterial species had decreased while others presented an increasing. Despite this variation, statistical analysis was not able to identify statistically significant differences in comparisons within and between groups. Thus, the present study failed to demonstrate that the adjunctive effect of a single episode of aPDT to SRP improves clinical parameters in smokers. However, it resulted in a significantly suppression of IL-1&beta; and of MMP-8, suggesting an advantage on periodontal healing. This has not been confirmed, on the other hand, by the microbiological analysis, which showed that none of the treatments was able to significantly reduce the bacteria levels

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica que vem atuar no tratamento de diversos tipos de câncer, com interesse crescente nas últimas décadas. Atuando de forma pouco invasiva e complementar as terapias tradicionais, a TFD consiste basicamente na administração sistêmica ou tópica de um fármaco fotossensibilizador (FS) seguido pela exposição da lesão à luz visível resultando na regressão tumoral caracterizada por processos de morte celular, sendo que, o fármaco fotossensibilizador e a radiação luminosa separadamente não induzem nenhum tipo de dano aos tecidos. A radiação monocromática utilizada na maioria dos casos é do tipo LASER sendo direcionada sobre a lesão por um conjunto de fibras ópticas. A maioria dos estudos até o presente momento sugerem um mecanismo comum de ação para a TFD. Após a excitação do fotossensibilizador para os estados excitados singlete e triplete, e por transferência de energia para o oxigênio molecular (O2) leva a morte tumoral ocasionada por espécies reativas de oxigênio definidas como EROS (1O2, O2_ ,OH, H2O2) além de outras formas radicalares (CH3, NO2, R-CO2, etc.) que atacam centros específicos dentro dos sistemas celulares, desencadeando a morte de tais tecidos por processos de necrose e/ou apoptose celular. Neste trabalho de pesquisa avaliamos a interação do fármaco fotossensibilizador Foscan® com Nanoemulsões biodegradáveis como sistemas de liberação em TFD-tópica. Na primeira etapa do trabalho foram realizados estudos físico-químicos para avaliação da estabilidade termodinâmica e determinação de alguns parâmetros morfológicos. Consecutivamente, determinamos a caracterização fotofísica do fotossensibilizador em ambiente coloidal empregando-se técnicas de espectroscopia no estado estacionário e resolvida no tempo. Foi possível determinar importantes parâmetros que elucidaram o potencial fotodinâmico do sistema fármaco/veículo, confirmando sua viabilidade para aplicação em Terapia Fotodinâmica. A última parte do trabalho de dissertação consiste na determinação do perfil de interação cutânea do sistema a partir de estudos in vitro em modelo animal. Empregando-se protocolos de permeação e retenção cutânea, foram determinados os fluxos difusionais para, a taxa de retenção tecidual e o tempo de latência. Portanto, com estes estudos concluímos que o sistema Foscan®/NE apresenta caracterísiticas favoráveis que lhe conferem grande potencial para aplicação em TFD, dando margem para estudos in vivo e em fase clínica. / Photodynamic Therapy (PDT) is the therapeutics that comes to act in the treatment of several cancer types, with growing interest in the last decades. Acting in way a complemental the traditional therapies, PDT consists basically of the administration systemic or topical of a photosensitizer drug (FS) following for the exhibition of the lesion to the visible light resulting in the regression tumoral characterized by processes of cellular death, and, the photosensitizer drug and the luminous radiation separately don\'t induce any damage type to the lesion. The monochrome radiation used in most of the cases is of the type LASER being addressed on the lesion by a group of fiber optic. Most of the studies to the present moment they suggest a mechanism common of action for PDT. After the excitement of the PS for the states excited singlet and triplet, and for transfer of energy for the molecular oxygen (O2) it takes the death tumoral caused by species reactivate of oxygen defined like ROS (1O2, O2_ ,OH, H2O2) besides other forms radicalares (CH3, NO2, R-CO2, etc.) that attack specific centers inside of the cellular systems, unchaining the death of such woven by necrosis processes and/or cellular apoptosis. In this research work we evaluated the interaction of the photosensitizer drug Foscan® with biodegradable nanoemulsion (NE) as drug delivery system (DDS) in PDT-topical. In the first step of the work physiochemical studies were accomplished for evaluation of the thermodynamic stability and determination of some morphologic parameters. Consecutively, we determined the photophysical characterization of the drug in colloidal medium being used spectroscope techniques in the stationary state and in the time function. It was possible to determine important parameters that elucidated the photodynamic potential of the system (DDS), confirming its viability for application in PDT. The last step of the dissertation work consists of the determination of the profile of cutaneous interaction of the system starting from studies in vitro in animal model. Being used permeation protocols and cutaneous retention, they were certain the diffusion flux, the index of retention, skin up-take and the time-lag. Therefore, with these studies we ended that the system Foscan®/NE showed characteristics favorable and great potential for application in PDT-topical giving sequence to futures studies in vivo and in clinical phase.

A proposta deste trabalho foi de aplicar a Terapia Fotodinâmica (TFD) para avaliar a inativação da bactéria Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans), um patógeno que está associado à endocardite bacteriana, abscessos cerebrais e subcutâneos e principalmente à doença periodontal, que é caracterizada pela inflamação dos tecidos de suporte dos dentes, e consequentemente a perda de dentes. O surgimento de resistência bacteriana a diversas classes de antibióticos vem sendo um problema sério que surge como efeito do uso indiscriminado destes fármacos e até mesmo por fatores adaptativos dos microrganismos. Devido a este fator, várias investigações vêm surgindo com referências satisfatórias no que diz respeito ao emprego da TFD como medida terapêutica. O efeito da TFD foi verificado sobre a cultura da bactéria A. actinomycetemcomitans em meio planctônico e em biofilme. Foi utilizado como agentes fotossensibilizadores Rose bengal, Azul de metileno e Eritrosina, que em baixas concentrações não causam toxicidade para células de fibroblastos e células humanas. Como fonte de luz foi utilizado o fotopolimerizador de resina odontológica, que é de fácil acesso, baixo custo e apresenta uma faixa de emissão de luz de 300 a 800 nm. Rose Bengal até 1 µM não afetou as células de fibroblastos, mas essa mesma concentração sem usar a TFD reduziu a viabilidade de A. actinomycetemcomitans em 41,2%, porém as células de A. actinomycetemcomitans quando cultivadas em biofilme não foram afetadas quando se usou apenas o corante (0,5 e 1,0 µM) ou apenas a luz. Quando se aplicou a TFD Rose Bengal foi o segundo corante (entre os três estudados), que causou uma maior redução da viabilidade celular de A. actinomycetemcomitans cultivadas em meio planctônico 54,4% e o terceiro em reduzir a viabilidade quando cultivadas em biofilme com 45% de redução. Azul de Metileno nas concentrações de 0,5 e 1,0 µM reduziu a viabilidade de A. actinomycetemcomitans em meio planctônico 16 e 24% respectivamente, já sobre o biofilme essa concentração de corante não promoveu redução da viabilidade bacteriana. Com a TFD observou-se uma redução de 50% da viabilidade das células de A. actinomycetemcomitans em meio planctônico e 53,3% em biofilme. Dos três corantes utilizados Eritrosina foi o corante que per se apresentou menor redução da viabilidade 5 e 14%, indicando ter baixa toxicidade, no escuro, e não afetou as células do biofilme de A. actinomycetemcomitan. Porém com a TFD, esse corante promoveu uma maior redução da viabilidade das células bacterianas de A. actinomycetemcomitans cultivadas em meio planctônico e em biofilme 75% e 67,2% respectivamente. Desta forma, a Eritrosina foi o corante mais eficiente em diminuir a viabilidade de A. actinomycetemcomitans nas condições estudadas. Esses resultados indicam que a TFD reduz as células viáveis de A. actinomycetemcomitans cultivadas em meio planctônico e em biofilme, indicando que essa terapia poderá ser uma opção efetiva para o tratamento clinico da doença periodontal, com a vantagem de não apresentar efeitos colaterais como a terapia medicamentosa, nem desenvolver a resistência bacteriana que vem sendo um grande problema do tratamento com antibióticos. / The objective of this work was to apply the photodynamic therapy (TFD) to evaluate the inactivation of the Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans) bacteria, a pathogen that is associated to bacterial endocarditis, subcutaneous and cerebral abscesses and mainly to periodontal disease, which is characterized by inflammation of teeth support tissue and as a consequence, teeth loss. The occurrence of bacterial resistance to many classes of antibiotics has been a serious problem that results from the indiscriminate use of these drugs and also by the adaptation factors of these microorganisms. Due to this, many investigations are being done with satisfactory references regarding the use of TFD as therapeutic step. The TFD effect on A. actinomycetemcomitans bacteria culture in planktonic medium and biofilm was verified. Rose Bengal, methylene Blue and Erythrosyn were used as photosensitizing agents which, in low concentrations are not toxic to fibroblast cells and human cells. The odontological resin photopolymerizer was used as a light source since it is easy accessible, low cost and has a light emission range between 300 and 800nm. Rose Bengal up to 1 µM did not affect the fibroblast cells, but this same concentration without the use of TFD has reduced viability of A. actinomycetemcomitans in 41.2%, but the cells when cultivated in biofilm were not affected when only dye (0.5 and 1.0 µM) or only light were used. When TFD was applied, Rose Bengal was the second dye (among the three studied) to cause the highest reduction of cell viability of A. actinomycetemcomitans cultivated in 54.4% planktonic medium and the third in reducing the viability when cultivated in biofilm, with 45% reduction. Methylene Blue in 0.5 and 1.0 µM concentrations has reduced the viability of A. actinomycetemcomitans in planktonic medium in 16% and 24%, respectively. In biofilm, this dye concentration has not fostered bacterial reduction. With TFD, a 50% reduction of A. actinomycetemcomitans cells in planktonic medium and a 53.3% in biofilm was observed. Among the three dyes used, Erythrosyn was the one that , per se, has shown the lowest viability reduction of all, 5% and 14%, indicating its low toxicity in the dark, and it did not affect the biofilm cells. Nevertheless, with TFD, this dye has fostered a higher viability reduction of A. actinomycetemcomitans bacterial cells cultured in planktonic medium and in biofilm of 75% and 67.2%, respectively. Therefore , Erythrosyn was the dye that, per se, has been the most efficient in reducing A. actinomycetemcomitans viability in the conditions studied. These results indicate that TFD reduces A. actinomycetemcomitans viable cells cultivated in planktonic medium and biofilm, indicating that this therapy could be an effective option for the treatment of periodontal disease, with the advantage that it does not show collateral effects like the drug therapy and without developing bacterial resistance, as this has been a major issue with antibiotics treatment.

O câncer de mama apresenta-se como um dos maiores problemas de saúde pública no mundo por ser, entre as mulheres, o primeiro em incidência e o segundo em número de óbitos. Este tipo de câncer apresenta alto grau de recorrência devido a falha no tratamento do tumor primário e o aparecimento de metástases da doença é a principal causa de mortalidade. As estratégias de tratamento nesse estágio não são específicas e comprometem a qualidade de vida das pacientes. A terapia fotodinâmica (PDT) aparece como uma alternativa terapêutica promissora. No entanto, a eficácia da PDT para o tratamento de tumores da mama, bem como os mecanismos que conduzem à morte celular permanecem obscuros. Para este propósito, neste estudo, nos propusemos a investigar mais profundamente os mecanismos moleculares envolvidos na morte celular induzida MB-PDT. Observou-se que a MB-PDT induz massiva morte celular em células tumorais preferencialmente. As células não-tumorigênicas foram significativamente mais resistentes à terapia em comparação com as células malignas. Análises morfológicas e bioquímicas das células em processo de morte apontou para mecanismos alternativos à apoptose clássica. A autofagia induzida por MB-PDT resultou em citoproteção ou citotoxicidade, dependendo do modelo de célula utilizado. No entanto, o comprometimento de uma destas vias não impediu o destino fatal das células tratadas com MB-PDT. Ao analisar os mecanismos de necrose regulada, observamos que a necroptose desempenhou um papel importante na morte celular induzida por MB-PDT. Adicionalmente, nossos resultados mostraram uma localização preferencial do MB nos lisossomos, o que nos levou a analisar o comprometimento destas organelas. Nós demonstramos por meio da atividade de catepsinas no citosol das células tratadas com MB-PDT, evidências de que a permeabilização da membrana lisossomal é outro mecanismo de necrose regulada responsável pelos efeitos citotóxicos da MB-PDT. Além de resistência à morte celular, as células tumorais também desenvolvem mecanismos de evasão do sistema imune. Neste estudo, também demonstramos que a MB-PDT tem o potencial de aumentar o número de células de linfócitos T CD4+. Por fim, também mostramos a eficácia da terapia em induzir morte celular seletiva às células tumorais em um modelo que recapitula a morfologia do epitélio glandular. Em resumo, demonstramos que vários mecanismos de morte celular são ativados por MB-PDT, uma vez que o comprometimento de uma via de morte celular não impediu o destino fatal das células tratadas com MB-PDT. No geral, os resultados obtidos nesta tese apontam a MB-PDT como uma terapia alternativa e eficaz para o tratamento do câncer de mama, exibindo uma ação de amplo espectro em células com diferentes mecanismos de resistência a vias de morte celular clássica, uma propriedade fundamental para uma terapia contra o câncer. Finalmente, as nossas observações destacam o potencial de MB-PDT como uma estratégia altamente eficaz para tratar o câncer de mama com segurança e possivelmente outros tipos de tumores. / Breast cancer is the main cause of mortality among women presenting high recurrence due to primary treatment failure. Photodynamic therapy (PDT) appears as a promising therapeutic alternative. However, the efficacy of PDT to treat breast tumors as well as the mechanisms that lead to tumorigenic cell death remain unclear. For this purpose, in this study, we set out to deeper investigate the molecular mechanisms involved in MB-PDT induced cell death. We observed that MB-PDT differentially induces massive cell death of tumor cells. Non-malignant cells were significantly more resistant to the therapy compared to malignant cells. Morphological and biochemical analysis of dying cells pointed to alternative mechanisms rather than classical apoptosis. MB-PDT-induced autophagy resulted in either cytoprotection or cytotoxicity depending on the cell model used. However, impairment of one of these pathways did not prevent the fatal destination of MB-PDT treated cells. When analyzing regulated necrosis mechanisms, we observed that necroptosis played an important role in MB-PDT-induced cell death. Additionaly, our results have shown preferential lysosomal MB localization. Furthermore, we have also presented evidences that the lysosome membrane permeabilization is another regulated necrosis mechanism responsible for MB-PDT cytotoxic effects. It is known that in addition to resistance to tumor cell killing therapies, malignant cells develop molecular mechanisms in order to evade the immune system. In this study, we have also been able to show that the MB-PDT has the potential to increase the number of T lymphocytes CD4+. Additionally, when using a physiological 3D culture model that recapitulates relevant features of normal and tumor breast tissue morphology, we found that MB-PDT differential action in killing tumor cell was even higher than what was detected in 2D cultures. In summary, we demonstrated that different cell death mechanisms are being activated upon MB-PDT induction, since impairment of only one cell death pathway did not prevent the fatal destination of MB-PDT treated cells. Overall, our observations point MB-PDT as an alternative and effective therapy for breast cancer treatment, displaying a broad-spectrum action on tumors with different resistance mechanisms to classic cell death pathways, a desired property for improving an anticancer therapy. Finally, our observations underscore the potential of MB-PDT as a highly efficient strategy to safely treat breast cancer and possibly other types of tumors.