A incidência de câncer tem aumentado nas últimas décadas, o que coloca essa doença como um problema de saúde pública mundial. Para melhorar o prognóstico do paciente, é necessário o desenvolvimento e/ou aprimoramento de técnicas que aumentem a efetividade e diminuam os efeitos adversos do tratamento. Entre as técnicas para tratamento local de lesões neoplásicas, destacam-se a terapia fotodinâmica (TFD) e a radioterapia (RT). A TFD consiste na interação entre fotossensibilizador, luz e oxigênio molecular; que combinados causam morte celular. A RT, por sua vez, é uma técnica já consagrada clinicamente que utiliza radiação ionizante para o tratamento de tumores malignos. O efeito da combinação entre as técnicas não está claramente estabelecido, e poderia aumentar o dano causado ao tecido enquanto diminui os efeitos colaterais provenientes da RT. Neste contexto, o objetivo deste estudo é analisar os efeitos da TFD associada à RT quando comparados aos efeitos individuais de cada terapia, avaliando se existe um método preferencial de combinação das técnicas. A primeira etapa do estudo foi realizada na Universidade de São Paulo e tratou a pele sadia de ratos Wistar com diferentes protocolos que combinavam as técnicas em diversos protocolos. Análises clínicas, imunohistoquímica e histológica, além da coleta de espectros de fluorescência, foram realizadas com o intuito de observar a possível sinergia dos efeitos das terapias combinadas. Os resultados mostraram uma maior necrose tecidual para a combinação TFD+24h+RT. A combinação RT+24h+TFD não apresentou um dano tão expressivo quanto o grupo TFD+24h+RT, devido a ineficiência de produção de PpIX em tecido previamente irradiado, comprovado pelo espectro de fluorescência. Na segunda etapa, realizada no Dartmouth College, os grupos que apresentaram maior dano foram escolhidos para avaliação do dano vascular por análises de refletância, da qual foram extraídas informações sobre a saturação de oxigênio, concentrações de meta-hemoglobina e bilirrubina, fração de volume sanguíneo e raio do vaso, tanto em tecido sadio de ratos Wistar quanto em tumores cutâneos em camundongos Nude. O recrescimento dos tumores também foi avaliado. A análise óptica se mostrou um método efetivo para monitorar o dano causado pela TFD na pele normal, mas ineficiente para monitorar o dano na combinação dos grupos, uma vez que a RT não apresenta dano vascular importante. Para os tumores, as análises ópticas não foram eficazes para monitorar o dano das terapias A curva de crescimento do tumor mostrou que o grupo TFD+24h+RT foi a melhor combinação para TFD e RT. Estudar a combinação do uso de raios-X com o efeito fotodinâmico é muito importante para o entendimento de fatores associados ao tratamento de tumores malignos. Os resultados obtidos devem contribuir na escolha da melhor combinação entre os tratamentos, potencializando o resultado do tratamento de lesões, diminuindo o tempo de tratamento e os efeitos colaterais. / The cancer incidence has shown a great increase recently, making this disease a worldwide public health problem. Improving a patient\'s prognosis requires development and/or improvement of techniques that increase efficacy and reduce side effects of the treatment. Among the techniques for non-systemic treatment of cancer, photodynamic therapy (PDT) and radiotherapy stand out. PDT consists in an interaction between photosensitizer, light and molecular oxygen to induce cell death, whereas radiotherapy is a well-established technique which uses ionizing radiation for tumor treatment. The effect of the technique combination is not clear and is expected to increase the damage in the tissue while decreasing the side effects from RT. In this context, the aim of this study is to analyze the effects of PDT associated with RT compared to individual effects of each therapy, assessing whether there is a preferred method of combination of both. The first stage of the study was conducted at the University of Sao Paulo and treated healthy skin of Wistar rats with different protocols that combined the techniques in various protocols. Clinical, immunohistochemistry and histological evaluations, as well as collecting fluorescence spectra were conducted in order to observe the possible synergistic effects of combined therapies. The results showed greater tissue necrosis for combining PDT+24h+RT. The combination RT+24h+PDT did not show as significant damage as the PDT+24h+RT group, due to PpIX production inefficiency in previously irradiated tissue, evidenced by fluorescence spectrum. In a second stage, performed at Dartmouth College, vascular damage was evaluated for the groups that showed enhanced damage through reflectance analysis, which provided information about oxygen saturation, met-hemoglobin and bilirubin concentrations, blood volume fraction and vessel radius, both in healthy tissue of Wistar rats and skin tumors in Nude mice. The regrowth of tumors was also evaluated. The optical analysis proved to be an effective method to monitor the damage caused by PDT in normal skin. This is not, however, an efficient method for monitoring the damage on the combination of groups, since the RT does not present any significant vascular damage. For tumors, the optical analysis did not show an effective method to monitor the damage of therapies. Tumor regrowth curves showed that the PDT+24h+RT group was the best combination for PDT and RT. The study of combination using X-rays and the photodynamic effect is very important to understand factors associated with the treatment of malignant tumors. The results should help in choosing the best combination of treatments and may be used to enhance the result of a lesion treatment, reducing treatment time and side effects.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A periodontite agressiva é um processo inflamatório de origem bacteriana mediado pelo sistema imunológico do hospedeiro e é provavelmente a forma mais grave de doença periodontal, apresentando destruição das estruturas tanto de proteção quanto de suporte dentário, num período relativamente rápido, normalmente levando a perda prematura dos elementos dentários e, em alguns casos, terapia antimicrobiana adjunta é necessária em adição à terapia mecânica. O objetivo do presente ensaio clínico randomizado controlado foi avaliar o efeito clínico da terapia fotodinâmica como adjunto ao tratamento periodontal não cirúrgico no tratamento da periodontite agressiva Os seguintes parâmetros clínicos foram avaliados: índice de placa visível, sangramento à sondagem, profundidade de bolsa à sondagem, nível de inserção clínica relativo, envolvimento de furca e mobilidade. Foram selecionados dez pacientes com periodontite agressiva, os quais foram examinados no dia zero e após três meses.O desenho do estudo consistiu em um modelo de boca dividida, onde um hemiarco foi tratado com raspagem e alisamento radicular e terapia fotodinâmica (laser diodo) e o outro apenas com raspagem e alisamento radicular. Três meses após o término do tratamento, os grupos terapêuticos apresentaram resultados semelhantes para todos os parâmetros clínicos avaliados: ambas as terapias tiveram sucesso, como redução de profundidade de bolsa, ganho de nível de inserção clínica relativo, redução de índice de placa visível, redução de sangramento à sondagem, diminuição de envolvimento de furca e diminuição de mobilidade, porém sem diferenças estatisticamente significantes entre elas. Dentro das limitações do presente estudo, os resultados sugerem que a terapia fotodinâmica adjuntamente ao tratamento periodontal não cirúrgico mecânico foi tão eficaz quanto o tratamento periodontal não cirúrgico mecânico sozinho. / Aggressive periodontitis is an inflammatory process of bacterial origin mediated by host immune response and is probably the most serious form of periodontal disease, with destruction of the structures of protection and support, with fast course, often leading to premature loss of the teeth and, in some cases, adjunct antimicrobial therapy is need in addition to mechanical therapy. The aim of this randomized controlled trial was to investigate the clinical effect of photodynamic therapy as an adjunct to nonsurgical periodontal treatment in patients with aggressive periodontitis. The following clinical parameters were evaluated: visible plaque index, bleeding on probing, probing pocket depth, relative attachment level, furcation involvement and mobility. We selected ten patients with aggressive periodontitis, which were examined in the baseline to three months. The study design consisted of a split mouth model, where a quadrant was treated with scaling and root planing and photodynamic therapy (diode laser) and the other only with scaling and root planing. Three months after the end of the treatment, the treatment groups showed similar results for all clinical parameters evaluated: both therapies have been successful and showed reduction of pocket depth, gain of relative attachment level, reduction of visible plaque index, reduction of bleeding on probing, decreased furcation involvement and decreased mobility, but without statistically significant differences between them. Within the limitations of the present study the results suggest that photodynamic therapy adjunct to non-surgical periodontal mechanic treatment was as effective as the non-surgical periodontal mechanic treatment alone.

Orientador: Juliana Campos Junqueira / Banca: Antonio Olavo Cardoso Jorge / Banca: Martha Simões Ribeiro / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da terapia fotodinâmica sobre a patogenicidade de C. albicans e C. dubliniensis na candidose bucal em ratos. Foram utilizados 96 ratos (Rattus norvegicus, Albinus, Wistar), sendo que 80 animais foram submetidos à indução de candidose experimental no dorso da língua por C. albicans ou C. dubliniensis e 16 ratos não foram infectados por Candida. Após 5 dias da indução da candidose, foram realizados diferentes tratamentos: laser e azul de metileno como fotossensibilizador (Grupo L+F+), apenas laser (Grupo L+F-), apenas fotossensibilizador (Grupo L-F+) e grupo sem laser e fotossensibilizador (Grupo L-F-). Após 1 dia, amostras do dorso da língua foram coletadas e semeadas em ágar Sabouraud para contagem de UFC/mL recuperadas da cavidade bucal. Os animais foram submetidos à eutanásia para análise microscópica do dorso da língua. Foi avaliada também a capacidade de produção de fosfolipase e proteinase por C. albicans e C. dubliniensis. Os resultados demonstraram que a quantidade de C. albicans recuperadas da cavidade bucal dos ratos foram semelhantes entre os quatro grupos estudados. C. dubliniensis não foi recuperarada da cavidade bucal dos ratos estudados. Na análise microscópica do dorso da língua, observou-se a presença de várias lesões teciduais induzidas por C. albicans, sendo que no grupo L+F+ essas lesões foram menores em relação aos demais grupos estudados. C. dubliniensis exibiu lesões teciduais discretas sem diferença estatística entre os grupos. Em relação aos fatores de patogenicidade de C. albicans, o grupo L+F+ produziu menor quantidade de fosfolipase e proteinase em relação aos demais grupos. C. dubliniensis produziu menor quantidade de fosfolipase em relação à C. albicans, sem diferença entre os 4 grupos estudados. Entretanto, C. dubliniensis não foi capaz de produzir proteinase... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective was to evaluate the effects of photodynamic therapy on the pathogenicity of C. albicans and C. dubliniensis in oral rats candidosis. Were evaluated 96 rats, while 80 were subjected to candidosis experimental induction on the tongue dorsum by C. albicans or C. dubliniensis and 16 rats were not infected. After 5 days of induction candidosis, different treatments were performed: laser and methylene blue as photosensitizers (Group L+F+), laser only (Group L+F-), only photosensitizers (Group L-F+) and without laser neither photosensitizers group (Group L-F). After 1 day, samples of the tongue dorsum were collected and sown on Sabouraud agar for counts of UFC/mL recovered from the oral cavity. The animals were submitted to euthanasia for microscopic analysis. It also evaluated the production capacity of a proteinase and phospholipase C. albicans and C. dubliniensis. The results showed that the amount of C. albicans recovered from rats oral cavity were similar among the four groups. To recover C. dubliniensis of the oral cavity from studied rats was not possible. In microscopic examination of tongue dorsum, was seen the presence of multiple tissue lesions induced by C. albicans, whereas in group L+ F+ these lesions were smaller than in other groups. C. dubliniensis showed slight tissue lesions with no statistic difference between groups. Regarding the factors of pathogenicity of C. albicans, the group L+F+ produced smaller amounts of phospholipase and proteinase compared to other groups. C. dubliniensis produced fewer quantitiy of phospholipase related to C. albicans, without difference between the 4 (four) groups studied. However, C. dubliniensis was not able to produce proteinase. It was concluded that the development of experimental candidosis by C. dubliniensis was less than that induced by C. albicans. Photodynamic therapy was effective on treatment... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Le pronostic des cancers ovariens reste sombre, en particulier en raison du retard diagnostic. Les traitements actuels associent une chirurgie de cytoréduction complète à l'administration de chimiothérapie à base de sels de platine. Les métastases viscérales sont rares dans cette pathologie, et la maladie est longtemps localisée à la cavité péritonéale. Pour cette raison, une attention particulière est portée au traitement des métastases péritonéales. Il est admis en effet que le facteur principal de réduction des récidives est l'absence de résidu tumoral en fin d'intervention. Malgré les progrès et la standardisation des techniques chirurgicales, la chirurgie de cytoréduction macroscopiquement complète, associée à une chimiothérapie efficace, ne prévient pas la survenue des récidives qui concerneront 60% des femmes en rémission à l’issu de ce traitement.Parmi les hypothèses expliquant ce taux élevé de récidive, l’existence d’une maladie microscopique résiduelle à l’issu de la chirurgie est évoquée. Le traitement de cette maladie microscopique représente un nouveau défi à relever pour les oncologues médicaux et les chirurgiens, et de nouvelles stratégies sont à développer dans ce domaine.Notre objectif est de réaliser la destruction ciblée par thérapie photodynamique (PDT) des métastases péritonéales microscopiques qui sont ignorées lors de la chirurgie. Nous espérons ainsi diminuer l’incidence des récidives locales qui concernent la majorité des patientes. Pour apporter la preuve de l’efficacité de cette stratégie innovante, un ciblage thérapeutique est indispensable car le développement de la PDT dans cette indication est limité par la mauvaise tolérance des tissus sains.Nous présentons ici les résultats précliniques obtenus in vitro et in vivo pour l’évaluation de photosensibilisateurs couplés à l’acide folique (PS1 et PS2) et ainsi dirigés vers le récepteur au folate, récepteur membranaire spécifique des cancers épithéliaux de l’ovaire (CEO).Nous avons travaillé sur des lignées cellulaires murine (NuTu-19) et humaines (SKOV-3, OVCAR-3) de CEO et sur un modèle animal de carcinose péritonéale. Après validation du modèle animal pour l'évaluation de molécule couplée à l'acide folique, nous avons montré la bonne spécificité du PS1 pour sa cible tumorale, meilleure que celle rapportée pour les autres photosensibilisateurs utilisés dans cette indication. Les lignées cellulaires émettent une fluorescence détectable après mise en culture dans un milieu enrichi en PS ce qui indique leur capacité à incorporer la molécule d’intérêt. Cette fluorescence a été détectée par spectrofluorimétrie (PS1 et PS2) et en photodiagnostic (PS2) in vivo au niveau des métastases péritonéales. La PDT permet d'obtenir la mort cellulaire des cellules humaines in vitro avec une excellente efficacité. Les premières données précliniques obtenues in vitro sur lignées humaines indiquent que la PDT utilisant un photosensibilisateur couplé à l'acide folique pourrait avoir des applications en immunothérapie.Un photosensibilisateur spécifique pourrait autoriser le développement d'une technique de PDT sure et efficace et jouer ainsi un rôle dans le traitement et la prévention des récidives péritonéales des cancers épithéliaux de l'ovaire. / Ovarian cancer’s prognosis remains dire after primary therapy. The standard of care remains debulking surgery in combination with platinum-based chemotherapy. This consists of either primary debulking surgery and adjuvant chemotherapy or neoadjuvant chemotherapy followed by interval debulking surgery, depending on FIGO stage and predictive factors concerning residual macroscopic disease after surgery. Recurrence rate is disappointingly high as 60-80% of women with epithelial ovarian cancer (EOC) considered in remission will develop recurrent disease within five years. Special attention to undetected peritoneal metastases and residual tumorous cells during surgery is necessary as they are the main predictive factors of recurrences.An option to improve the completion of cytoreductive surgery is using photodynamic therapy (PDT) to induce necrosis of micrometastases. A limit of this technique is the toxicity induced by the low photosensitizer (PS) specificity for tumor tissue if the light cannot be specifically applied. This would be the case in advanced ovarian cancer. To solve this problem, a solution is the design of selective PS, that is to say PS coupled to a unit that target over-expressed receptors on tumor cells. Approximately, 72-100% of ovarian carcinoma overexpress Folate Receptor α (FRα) in particular the serous carcinoma. FRα is absent in most of the healthy tissues; thus, representing a promising target for EOC targeted therapy.We present preclinical results of in vitro and in vivo studies concerning properties of folic-acid targeted photosensitizers (PS1 and PS2). Those studies have been performed on murine and human cell lines of EOC and on a preclinical model of peritoneal carcinomatosis (Fisher F344 rat / NuTu-19 cell line). Results suggest that specificity for ovarian cancer metastases is better than previously reported with other photosensitizer. Fluorescence emission was higher in peritoneal metastases than in liver and healthy peritoneum. Tissue quantification of the PS showed specific incorporation of the folate-targeted PS within tumor tissue. Folic acid targeted PDT induced cellular death on EOC human cell lines.Specific PS may allow the development of efficient and safe intraperitoneal PDT procedure which could play a role in the prevention of EOC peritoneal recurrences.

O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto da terapia fotodinâmica (PDT) no tratamento de bolsas residuais de pacientes portadores de periodontite crônica em manutenção periodontal, através da avaliação de parâmetros imunológicos, durante 12 meses de acompanhamento. Foi conduzido um estudo prospectivo intervencional com 28 pacientes com periodontite crônica, que foram submetidos ao tratamento periodontal não-cirúrgico e apresentaram ao menos quatro sítios com bolsas residuais para serem submetidos à PDT. Os pacientes foram pareados em gênero, idade e média de profundidade clínica de sondagem (PCS) dos sítios experimentais, e assim sorteados em grupo teste (PDT) ou grupo controle. A intervenção foi feita no início do estudo, aos três, seis e nove meses e a coleta do fluido gengival foi realizada antes da intervenção, uma semana após, três e 12 meses depois. A avaliação imunólogica, realizada por meio do Luminex, quantificou os níveis de dez citocinas: interleucina (IL) IL-1(alfa), IL-1ß, IL-8, IL-1ra, fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), interferon- ? (IFN- Y), fator de necrose tumoral- (alfa) (TNF-(alfa)), IL-4 e IL-10. Em relação a essa análise, verificou-se que para o FGF, IL-4 e TNF-(alfa) não houve diferença estatística entre os grupos (p>0,05) em qualquer momento do estudo. Os mediadores IL-1(alfa), IL-1ß, IL-8 e VEGF apresentaram diferença significativa (p<0,05) entre os grupos, ao passo que os mediadores IL-1ra e IFN-Y demonstraram diferença estatística (p<0,01) ao longo do tempo em ambos os grupos e a IL-10 apresentou diferença estatística (p<0,01) aos 03 meses para o grupo PDT. Dentro dos parâmetros apresentados, a PDT se mostrou superior na modulação da inflamação. / The objective of this study was to evaluate the impact of photodynamic therapy (PDT) in the treatment of residual pockets of patients with chronic periodontitis in periodontal maintenance, by evaluating immunological parameters during 12 months of follow up. . An interventional prospective study in 28 patients with chronic periodontitis, who underwent non-surgical periodontal treatment and had at least four sites with residual pockets to undergo PDT was conducted. Patients were matched for gender, age and average probing pocket depth (PPD) of the experimental sites, and so drawn in group test (PDT) or control group. The intervention was done at baseline, at three, six, nine and gingival fluid collection was performed before intervention, a week after three and 12 months later. Immunological evaluation performed by the Luminex quantified levels ten cytokines: interleukin (IL) IL-1(alfa), IL-ß, IL-8, IL-1ra, fibroblast growth factor (FGF), vascular growth factor endothelial (VEGF), interferon-Y (IFN-Y), Tumor necrosis factor (alfa) (TNF-(alfa)), IL-4 and IL-10. In relation to this analysis, it was found that FGF, IL-4 and TNF-(alfa) was not different between groups (p> 0.05) at any time of the study. The mediators IL-(alfa), IL-1ß, IL-8 and VEGF showed a significant difference (p <0.05) between the groups, whereas IL-1ra mediators and IFN-Y showed a statistical difference (p <0.01) over time in both groups and IL-10 showed statistically significant difference (p <0.01) at 03 months for PDT group. Within the given parameters, the PDT was superior in the modulation of inflammation

O princípio de terapia fotodinâmica (TFD) foi introduzido por volta de 1900 mas posteriormente investgado como candidato para tratamento de cancer na década de 1970. Desde então, existem diversos trabalhos a respeito do assunto in vitro, in vivo e em estudos clínicos e grandes avanços foram alcançados. Entretanto, alguns desafios ainda não foram superados, como a variabilidade dos resultados. Este trabalho consiste na investigação de suas causas, em que o principal objetivo é avançar o estado da arte em TFD. Para isso foi usado um modelo de distribuição de limiar de dose para avaliar resistência em TFD in vitro. As distribuições de limiar de dose são obtidas pela derivação a curva de dose resposta experimental. Elas são caracterizadas pela sua largura e pela dose que corresponde ao pico, que se relaciona a homogeneidade e resistência intrínseca da população, respectivamente. Na seção 1, é apresentada a avaliação e comparação de dados obtidos de resultados publicados na literatura e, na seção 2, de experimentos realizados pela autora em diferentes linhagens celulares. Da análise da primeira etapa, foi observado que a largura da distribuição é proporcional a dose do pico e foi possível investigar a dependência do resultado da TFD com a linhagem celular, dado um fotossensibilizador (FS). Foi interessante, também, notar que as distribuições de limiar de dose correspondem a curvas de atividade de marcadores celulares de apoptose, como função da dose de luz, para a maior parte das condições analisadas. Dos experimentos realizados pela autora, foi visto que as células normais são as mais resistentes ao dano, seguida das células de câncer resistentes e sua linhagem parental, e que sua resposta foi a mais homogênea. Essas observações foram corroboradas pelas imagens obtidas de microscopia de fluorescência para avaliação da captação de FS, que mostraram que as células tumorais acumulam mais FS que as outras. Portanto, foi mostrado o potencial de se aplicar distribuições de limiar de dose na análise de resultados de TFD in vitro, ela é uma poderosa ferramenta que fornece mais informações que as curvas de dose resposta padrão. / The principle of photodynamic therapy (PDT) was introduced around 1900 but further investigated as a candidate to cancer treatment in the 1970´s. Since then, there are several papers regarding the subject in vitro, in vivo and clinical trials and great advances were achieved. However, some challenges were not yet overcome, such as results variability. This work consists in the investigation of its causes, where the main goal is to advance the state of art of PDT. For that it is being used a threshold dose distribution model to evaluate cell resistance to PDT in vitro. The threshold distributions are obtained by differentiating the experimental dose response curve. They are characterized by its width and the dose that corresponds to the peak which relates to the homogeneity and intrinsic resistance of the population, respectively. In section 1, it is presented the evaluation and comparison of data obtained from published results in literature and, in section 2, of experiments performed by the author in different cell lines. From the analysis in the first part, it was observed that the width of the distribution is proportional to its dose of the peak and it was possible to investigate the dependence of the PDT result with the cell line, given a fixed photosensitizer (PS). It was also interesting to note that the threshold distribution corresponded to the activity curves for apoptotic cell markers as a function of light dose, for most of the conditions analyzed. From the experiments performed by the author, it was seen that the normal cell line was the most resistant one, followed by the resistant cancer cells and its parental cell line, and that its response was more homogeneous. Those finding were supported by the fluorescence microscopy images obtained to evaluate PS uptake, which shown that the tumor cells accumulated more PS than the other ones. Therefore, it was shown the potential of applying the threshold distribution to analyze PDT results in vitro, it is a powerful tool that provides more information than the standard dose response curves.

Síntese, aspectos estruturais, propriedades fotoquímicas, fotofísicas e fotoindução para avaliação citotóxica in vitro de derivados de [Ru (Pc)] (PC = ftalocianina) são descritos neste trabalho. O desenvolvimento ftalocianinas utilizando anéis macrocíclicos, substituídos e não substituídos simetricamente, coordenados com o centro metálico de rutênio permitiu a obtenção de diferentes compostos. Coordenação de ligantes derivados de óxido nítrico (NO) na posição axial do rutênio (II) permitiu obter [Ru(NO)(Pc)(NO2)], um complexo liberador de NO quando submetido ao processo de redução. Os complexos foram caracterizados por FTIR, UV-Vis, 1H RMN e espectrometria de massas. As propriedades fotoquímicas de complexos como ftalocianinas de rutênio (II) têm sido investigadas por fotólise a laser em diferentes comprimentos de onda. Na irradiação de luz em 660 nm em solução aquosa aerada, observamos o fotoprocesso com a produção de oxigênio singleto. Pode-se observar a relação do rendimento quântico de oxigênio singleto e dos fotossensibilizadores utilizados para sua produção. O oxigênio singleto para [Ru (Pc-R)] segue a ordem [Ru(Pc)]> [Ru (Pc-DCBz)]> [Ru(Pc-DMX)] com DCBz = ácido 4-(3,4-dicianofenoxi) benzóico e DMX = 4,5-bis (2,5-dimetilfenoxi) ftalonitrilo. Estudos fotobiológicos são destacados com particular enfoque na irradiação de luz em 660 nm com interesse para aplicações de terapia fotodinâmica (TFD). Neste contexto, temos também a avaliação citotóxica em linhagens de células B16F10 do efeito sinérgico entre NO e oxigênio singleto quando comparado ao complexo [Ru(Pc)], um composto que é apenas produtor de oxigênio singleto. O NO parece potencializar a ação de oxigênio singleto uma vez que em ensaios de viabilidade celular, o complexo [Ru(NO)(Pc)(NO2)] é pelo menos 40% mais ativo que [Ru(Pc)], considerando 8,93 J / cm2 como uma potência. Considerando apenas a produção de oxigênio singleto encontramos a espécie [Ru(Pc-DCBz)] mais citotóxica nas linhagens B16F10 e MCF-7, sob irradiação em 660nm. Com base em todos os estudos, concluímos que citotoxicidade é dependente tanto da localização subcelular quanto do rendimento quântico de oxigênio singleto. A citotoxicidade pode ser reforçada pela produção de NO, seguido por irradiação de luz na janela terapêutica. / Synthesis, structural aspects, photochemistry, photophysical and in vitro photoinduced cytotoxic properties of [Ru(Pc)] (pc = phthalocyanine) derivatives are described in this work. Use of an unsubstituted or symmetrically substituted phthalocyanine ring coordinated to the central ruthenium allowed to obtain different compounds. Coordination of nitric oxide (NO) derivative ligands on axial position of ruthenium(II) ion permitted to obtain [Ru(NO)(Pc)(NO2)] a NO deliver agent under reduction process. The complexes were characterized by FTIR, UV-Vis, 1H NMR and mass spectrometry. The photochemical properties of (phthalocyanine)ruthenium(II) like complexes have been investigated by laser photolysis at different wavelengths. At 660 nm light irradiation in aerated aqueous solution we observed photoprocesses with singlet oxygen production. We have addressed the relationship of the singlet oxygen quantum yield and the photosensitizers used in its generation. The singlet oxygen for [Ru(Pc-R)] follows the order [Ru(Pc)] > [Ru(Pc-DCBz)] > [Ru(Pc-DMX)] with DCBz = 4-(3,4-dicianofenoxy)benzoic acid and DMX = 4,5-bis (2,5-dimethylfenoxy)ftalonitrile. Photobiological studies are highlighted with particular focus on light irradiation on 660 nm with interest for photodynamic therapy (PDT) applications. In this way we also have compared the synergism effect of NO and singlet oxygen production with [Ru(Pc)] as a compound producer of singlet oxygen only by means of cytotoxicity in B16F10 cell line. The NO seems to leverage the singlet oxygen action once [Ru(NO)(NO2)(Pc)] cell viability is at least 40 % more active than [Ru(Pc)] considering 8.93 J/cm2 as a potency. Considering only singlet oxygen production we found [Ru(Pc-DCBz)] more cytotoxic specie in B16F10 and MCF7 cell lines, under irradiation in 660 nm. Based on all studies, we have concluded that citotoxycity is dependent on subcellular localization as well singlet oxygen quantum yield. The cytotoxicity could be enhanced by NO production followed by light irradiation on the therapeutic window.

O câncer de mama apresenta-se como um dos maiores problemas de saúde pública no mundo por ser, entre as mulheres, o primeiro em incidência e o segundo em número de óbitos. Este tipo de câncer apresenta alto grau de recorrência devido a falha no tratamento do tumor primário e o aparecimento de metástases da doença é a principal causa de mortalidade. As estratégias de tratamento nesse estágio não são específicas e comprometem a qualidade de vida das pacientes. A terapia fotodinâmica (PDT) aparece como uma alternativa terapêutica promissora. No entanto, a eficácia da PDT para o tratamento de tumores da mama, bem como os mecanismos que conduzem à morte celular permanecem obscuros. Para este propósito, neste estudo, nos propusemos a investigar mais profundamente os mecanismos moleculares envolvidos na morte celular induzida MB-PDT. Observou-se que a MB-PDT induz massiva morte celular em células tumorais preferencialmente. As células não-tumorigênicas foram significativamente mais resistentes à terapia em comparação com as células malignas. Análises morfológicas e bioquímicas das células em processo de morte apontou para mecanismos alternativos à apoptose clássica. A autofagia induzida por MB-PDT resultou em citoproteção ou citotoxicidade, dependendo do modelo de célula utilizado. No entanto, o comprometimento de uma destas vias não impediu o destino fatal das células tratadas com MB-PDT. Ao analisar os mecanismos de necrose regulada, observamos que a necroptose desempenhou um papel importante na morte celular induzida por MB-PDT. Adicionalmente, nossos resultados mostraram uma localização preferencial do MB nos lisossomos, o que nos levou a analisar o comprometimento destas organelas. Nós demonstramos por meio da atividade de catepsinas no citosol das células tratadas com MB-PDT, evidências de que a permeabilização da membrana lisossomal é outro mecanismo de necrose regulada responsável pelos efeitos citotóxicos da MB-PDT. Além de resistência à morte celular, as células tumorais também desenvolvem mecanismos de evasão do sistema imune. Neste estudo, também demonstramos que a MB-PDT tem o potencial de aumentar o número de células de linfócitos T CD4+. Por fim, também mostramos a eficácia da terapia em induzir morte celular seletiva às células tumorais em um modelo que recapitula a morfologia do epitélio glandular. Em resumo, demonstramos que vários mecanismos de morte celular são ativados por MB-PDT, uma vez que o comprometimento de uma via de morte celular não impediu o destino fatal das células tratadas com MB-PDT. No geral, os resultados obtidos nesta tese apontam a MB-PDT como uma terapia alternativa e eficaz para o tratamento do câncer de mama, exibindo uma ação de amplo espectro em células com diferentes mecanismos de resistência a vias de morte celular clássica, uma propriedade fundamental para uma terapia contra o câncer. Finalmente, as nossas observações destacam o potencial de MB-PDT como uma estratégia altamente eficaz para tratar o câncer de mama com segurança e possivelmente outros tipos de tumores. / Breast cancer is the main cause of mortality among women presenting high recurrence due to primary treatment failure. Photodynamic therapy (PDT) appears as a promising therapeutic alternative. However, the efficacy of PDT to treat breast tumors as well as the mechanisms that lead to tumorigenic cell death remain unclear. For this purpose, in this study, we set out to deeper investigate the molecular mechanisms involved in MB-PDT induced cell death. We observed that MB-PDT differentially induces massive cell death of tumor cells. Non-malignant cells were significantly more resistant to the therapy compared to malignant cells. Morphological and biochemical analysis of dying cells pointed to alternative mechanisms rather than classical apoptosis. MB-PDT-induced autophagy resulted in either cytoprotection or cytotoxicity depending on the cell model used. However, impairment of one of these pathways did not prevent the fatal destination of MB-PDT treated cells. When analyzing regulated necrosis mechanisms, we observed that necroptosis played an important role in MB-PDT-induced cell death. Additionaly, our results have shown preferential lysosomal MB localization. Furthermore, we have also presented evidences that the lysosome membrane permeabilization is another regulated necrosis mechanism responsible for MB-PDT cytotoxic effects. It is known that in addition to resistance to tumor cell killing therapies, malignant cells develop molecular mechanisms in order to evade the immune system. In this study, we have also been able to show that the MB-PDT has the potential to increase the number of T lymphocytes CD4+. Additionally, when using a physiological 3D culture model that recapitulates relevant features of normal and tumor breast tissue morphology, we found that MB-PDT differential action in killing tumor cell was even higher than what was detected in 2D cultures. In summary, we demonstrated that different cell death mechanisms are being activated upon MB-PDT induction, since impairment of only one cell death pathway did not prevent the fatal destination of MB-PDT treated cells. Overall, our observations point MB-PDT as an alternative and effective therapy for breast cancer treatment, displaying a broad-spectrum action on tumors with different resistance mechanisms to classic cell death pathways, a desired property for improving an anticancer therapy. Finally, our observations underscore the potential of MB-PDT as a highly efficient strategy to safely treat breast cancer and possibly other types of tumors.

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da terapia fotodinâmica antimicrobiana (TFDa), utilizando laser de baixa potência, em duas densidades de energia, associado ao azul de toluidina em biofilme de S. mutans. Biofilmes de S. mutans UA159 foram crescidos por 5 dias em discos de resina acrílica (3 mm de diâmetro x 2 mm de altura) a 37&ordm;C 5 % de CO2;. Os espécimes foram divididos aleatoriamente em 4 grupos de tratamento (n=3): Digluconato de clorexidina 0,12% (CHX, controle positivo); Solução salina a 0,89% (NaCl, controle negativo); Terapia fotodinâmica antimicrobiana com azul de toluidina e laser de baixa potência (densidade de energia 320 J/cm&sup2;) (TFDa 320); Terapia fotodinâmica antimicrobiana com azul de toluidina e laser de baixa potência (densidade de energia 640 J/cm&sup2;) (TFDa 640). Os tratamentos foram realizados 2x/dia durante 3 dias. Ao final dos 5 dias, os biofilmes foram coletados e número de bactérias viáveis e a concentração de polissacarídeos extracelulares insolúveis (PECI) e intracelulares (PIC) foram determinadas e analisadas estatisticamente (ANOVA e teste de Tukey, p < 0,05). O tratamento com a TFDa (320 e 640 J/cm&sup2;) reduziu o número de bactérias viáveis em biofilmes de S. mutans, de uma maneira dose-dependente (p < 0,05). Além disso, a TFDa 640 J/cm&sup2;, reduziu a viabilidade bacteriana de forma tão eficaz quanto a CHX (p > 0,05). Em relação a PECI e PIC, os grupos TFDa (320 e 640 J/cm&sup2;) não foram significativamente diferentes de CHX (p > 0,05). Os resultados mostraram que a terapia fotodinâmica antimicrobiana, mediada pelo azul de toluidina e laser de diodo (640 J/cm&sup2;), pode ser uma abordagem utilizada no controle do biofilme dental cariogênico. / The aim of this study was to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), using low-power laser, with two energy densities, associated with toluidine blue in S. mutans biofilm. S. mutans UA159 biofilms were grown for 5 days on acrylic resin discs (3 mm diameter x 2 mm height) a 37&ordm;C, 5 % de CO2. The specimens were randomly divided into 4 treatment groups (n = 3): 0.12% chlorhexidine digluconate (CHX, positive control); 0,89% Saline (NaCl, negative control); Antimicrobial photodynamic therapy with toluidine blue and low power laser (energy density of 320 J/cm&sup2;) (aPDT 320); Antimicrobial photodynamic therapy with toluidine blue and low power laser (energy density of 640 J/cm&sup2;) (aPDT 640). Treatments were performed 2x/day for 3 days. At the end of 5 days, the biofilms were collected and the number of viable bacteria and the concentration of insoluble extracellular (IEPS) and intracellular polysaccharides (IPS) were determined and analyzed statistically (ANOVA and Tukey\'s test, p<0.05). Treatment with aPDT (320 and 640 J/cm&sup2;) reduced the number of viable bacteria of S. mutans biofilms in a dose-dependent manner (p<0.05). Furthermore, the aPDT 640 group reduced the bacterial viability as effectively as CHX group (p>0.05). For IEPS and IPS, the aPDT groups (320 and 640 J/cm&sup2;) were not significantly different CHX (p>0.05). The results showed that the antimicrobial photodynamic therapy mediated by toluidine blue and diode laser (640 J/cm&sup2;) may be an approach used to control the cariogenic dental biofilm.

A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade de tratamento para o câncer baseado na interação da luz com um agente fotossensibilizador (FS) e o oxigênio molecular presente na célula alvo. A TFD apresenta vantagens sobre os métodos tradicionais de tratamentos como o dano seletivo às células neoplásicas, ausência de intervenção cirúrgica, possibilidade de repetição do procedimento e efeitos colaterais controlados. Uma das limitações da técnica é a profundidade de pouca penetração da luz no tecido biológico e consequentemente o volume tecidual tratado. Uma alternativa para superar esta limitação é o emprego de fonte de luz pulsada que comparativamente a irradiação com luz contínua (CW), apresenta maior potência de pico levando a uma maior profundidade de penetração e maior formação de espécies reativas de oxigênio. O objetivo deste trabalho é a avaliação da TFD utilizando fonte de luz pulsada no regime de femtossegundos através de ensaios in vitro da fotodegradação de dois tipos de FSs e da necrose induzida em fígado sadio de ratos (estudos in vivo). Nos estudos in vitro foram avaliadas a fotodegradação do Photogem (PG - 8&mu;g/mL) e do Photodithazine (PDZ - 6&mu;g/mL), para as irradiâncias de 280, 340 e 400 mW/cm2 com PG, e 15, 56 e 112 mW/cm2 para o PDZ. Nos estudos in vivo foram avaliados o perfil de necrose induzida com as fontes de luz CW e pulsado em modelo animal, que receberam PG e PDZ nas concentrações de 1,5 mg/kg e 1,0 mg/kg, respectivamente. Foram irradiados com 74 mW/cm2 (PG) e 102 mW/cm2(PDZ) e dose total de energia de 150 J/cm2. Posteriormente foi avaliada a dependência de profundidade de necrose com a irradiância (60, 80, 107, 127, 138, 188 e 229 mW/cm2) utilizando PG e com dose total entregue de 150 J/cm2. As fontes de luz empregadas foram um laser de diodo 630 nm (PG), um laser de diodo emitindo em 660 nm (PDZ) e um laser de Ti:Safira, taxa de repetição de 1 kHz, comprimento de onda 800 nm e largura de pulso de 75 fs em associação com amplificador paramétrico óptico (APO) para conversão de comprimentos de onda na região de 400 - 1150 nm. Os experimentos in vitro mostraram que taxa de fotodegradação para o PG foi maior utilizando o laser pulsado do que para o laser CW. Quando utilizado o PDZ, o laser CW promoveu uma taxa de fotodegradação maior do que o pulsado. Nos estudos in vivo, foi observada a necrose induzida com laser pulsado cerca de duas vezes mais profunda do que a induzida pelo laser CW, enquanto necrose induzida pelo laser pulsado com PDZ foi maior do que a do laser CW. No estudo da dependência da profundidade de necrose em função da irradiância, o laser pulsado induziu profundidade de necrose maior do que o laser CW para irradiâncias abaixo de 80 mW/cm2, acima desta irradiância, o laser CW e o pulsado não mostraram diferença significativa. Estes resultados mostram que a combinação da fonte de luz pulsada e PG podem ser consideradas como alternativa para aumentar o volume tecidual tratado, porém, devem-se observar os parâmetros empregados para se obter o maior volume tecidual tratado. O mesmo resultado não foi observado para o PDZ como fotossensibilizador, o que indica uma forte dependência dos mecanismos da TFD com o FS e o regime de iluminação empregado. / Photodynamic therapy (PDT) is a therapeutic modality for cancer based on light, a photosensitizer agent (PS) and molecular oxygen into the target cells. PDT has advantages over traditional treatments, such as, selective damage to tumor cells, absence of surgical intervention, possibility of repeated procedures and controlled side effects. One of the limitations of PDT is the low light penetration in biological tissues and hence the treated tissue volume. An alternative to overcome this limitation is the use of pulsed light sources that compared to continuous (CW) irradiation, present higher peak power leading to a greater penetration depth and enhancing the reactive oxygen species production. The aim of this study is to evaluate PDT using pulsed light source at femtosecond regime through in vitro photodegradation of two PSs types and in vivo induced necrosis in healthy rat liver. In the in vitro study we evaluated the photodegradation of Photogem (PG - 8&mu;g/mL) and Photodithazine (PDZ - 6&mu;g/mL), at different irradiances (280, 340, and 400 mW/cm2 for PG and 15, 56 and 112 mW/cm2 for PDZ). In the in vivo studies the induced necrosis profile with CW laser and Pulsed Laser were evaluated in animal model which received PG (1,5 mg/kg) and PDZ (1,0 mg/kg) and were irradiated with 74 mW/cm2 and 102 mW/cm2, respectively, and the fluence was 150 J/cm2. After that, the dependence of depth of necrosis with irradiance (60, 80, 107, 127, 138, 188 and 229 mW/cm2) with PG and 150 J/cm2 of fluence was evaluated. The light source used in those studies were a 630 and 660 nm diode laser (PG and PDZ excitation light, respectively) and a Ti:Sapphire Regenerative Amplifier laser, 1 kHz repetition rate, 800 nm wavelength and 75 fs pulse width in association with an optical parametric amplifier (OPA) to convert 400-1150 wavelengths. The in vitro results showed that the PG photodegratation rates were greater to pulsed laser when compared with CW laser. When PDZ was used, the photodegradarion rates with pulsed laser were lower than CW laser. In the in vivo studies, the induced necrosis with pulsed laser was twice the induced by CW laser with PG as photosensitizer. When PDZ was used, the induced necrosis was greater for CW laser than for pulsed laser. For different irradiances, the depth of necrosis induced by CW laser was greater than for pulsed laser below 80 mW/cm2, above this, the pulsed and CW laser did not show difference. These results demonstrated that pulsed light and PG can be considered an alternative to enhance the treated tissue volume. The same was not observed to PDZ, which indicate the strong dependence of PDT mechanisms with PS and the light regime applied.