O efeito do fotossensibilizador na estrutura biológica não é apenas influenciado por suas propriedades fotofísicas, mas também por sua interação específica com biosistemas.Além disso, a localização do fotossensibilizador no tecido tumoral é um importante fator que resulta em diferentes mecanismos de destruição do tumor. Muitos fotossensibilizadores, após administração sistêmica, se ligam às proteínas plasmáticas e com isso são distribuídos em diferentes sítios no organismo. Os fotossensibilizadores hidrofílicos são largamente transportados por albuminas e globilinas e se acumulam preferencialmente no estroma vascular dos tumores. Entretanto, fotossensibilizadores mais hidrofóbicos se ligam às lipoproteínas, principalmente LDL, que promove a entrada do FS na célula através de endocitose mediado por receptor. Sendo assim, a localização do FS depende de sua ligação com as deferentes proteínas plasmáticas, sua farmacocinética e também é influenciada pela diferença entre o tecido normal e tumoral. O tecido tumoral tem pH mais baixo e maior expressão de receptores de LDL do que os tecidos normais, aumentando a seletividade dos FSs as células tumorais. A incorporação de FS hidrofóbicos em lipossomas para a administração sistêmica pode realçar ao transporte deste pelas lipoproteínas. No presente trabalho estudou-se a influência do pH na interação de fotossensibilizadores com lipossomas de DMPC e LDL. Os fotossensibilizadores utilizados nesse estudo foram Photofrin®, Photogem® e Photosan® que são derivados de hematoporfirinas. A metodologia empregada constitui de variação das concentrações de DMPC e LDL para os seguintes valores de pHs 5,0; 7,4 e 9,0, esse último pH utilizou-se somente para DMPC. O complexo FS - DMPC foi obtido por incubação dos FSs na concentração de 10 micro g.mL-1 com diferentes concentrações de DMPC (0 a 400 micro M) por trinta minutos no escuro. Isolou-se o LDL do plasma humano por ultracentrifugação por gradiente de densidade. Após a separação, o complexo FS - LDL foi obtido por incubação (12 horas no escuro) do FS na concentração 10 micro g.mL-1 com diferentes concentrações de LDL (0 a 0,04 micro M). O comportamento desses complexos foi analisado por espectroscopia de absorção ótica e por espectroscopia de fluorescência. / The effect of a photosensitizing compound on biological structures is governed not only by its photophysical properties but also by the specificity of its interaction with biosystems. Moreover, localization of the photosensitizer in the tumor tissue is an important factor affecting the outcome as well as mechanism leading to tumor destruction. Following administration, most photosensitizers are bound to blood components and delivered to different sites in the organism. It is generally accepted that hydrophilic photosensitizers are largely transported by albumins and globulins and mainly accumulate in the vascular stroma of tumors. More hydrophobic sensitizers are bound to lipoproteins, which promote drug internalization by cells through endocytosis of the lipoprotein carrier. In this way, uptake and localization depend on the initial plasma binding and the plasma pharmacokinetics of the drug. However, the selective localization of some photosensitizers are influence for the difference between malignant and normal tissues. Notably, the lower pH of the microenvironment usually found in the tumor tissue and the expression of greater number of LDL receptors on the surface of the tumor cells might influence cellular uptake. Delivery to lipoproteins or target tissues may be facilitated and enhanced by the incorporation of lipophilic photosensitizers into liposomes for systemic administration. In the present work we have studied the pH-dependence of the interaction of photosensitizers with DMPC liposomes and low density lipoprotein (LDL). The photosensitizers used in this study are Photofrin®, Photogem® and Photosan®, which are hematoporphyrin derivates. The methodology used to this work, constitute of various concentrations of DMPC liposomes and LDL at different pH values. It were used the 5,0; 7,4 and 9,0 pH values. The DMPC-drug complexes were obtained by incubation of the photosensitizers 10 _g.mL-1 with differents DMPC concentrations for 30 min in the dark. The LDL was isolated from human plasma by sequential density gradient ultracentrifugation. The LDL-drug complexes were obtained by incubation of the photosensitizers 10 _g.mL-1 with differents LDL concentrations. The incubation was performed in a water bath at 20_C for 12 hours in the dark. The comportment of the complexes was analyzed by fluorescence spectroscopy and UV-visible spectroscopy.

A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade de tratamento para o câncer baseado na interação da luz com um agente fotossensibilizador (FS) e o oxigênio molecular presente na célula alvo. A TFD apresenta vantagens sobre os métodos tradicionais de tratamentos como o dano seletivo às células neoplásicas, ausência de intervenção cirúrgica, possibilidade de repetição do procedimento e efeitos colaterais controlados. Uma das limitações da técnica é a profundidade de pouca penetração da luz no tecido biológico e consequentemente o volume tecidual tratado. Uma alternativa para superar esta limitação é o emprego de fonte de luz pulsada que comparativamente a irradiação com luz contínua (CW), apresenta maior potência de pico levando a uma maior profundidade de penetração e maior formação de espécies reativas de oxigênio. O objetivo deste trabalho é a avaliação da TFD utilizando fonte de luz pulsada no regime de femtossegundos através de ensaios in vitro da fotodegradação de dois tipos de FSs e da necrose induzida em fígado sadio de ratos (estudos in vivo). Nos estudos in vitro foram avaliadas a fotodegradação do Photogem (PG - 8μg/mL) e do Photodithazine (PDZ - 6μg/mL), para as irradiâncias de 280, 340 e 400 mW/cm2 com PG, e 15, 56 e 112 mW/cm2 para o PDZ. Nos estudos in vivo foram avaliados o perfil de necrose induzida com as fontes de luz CW e pulsado em modelo animal, que receberam PG e PDZ nas concentrações de 1,5 mg/kg e 1,0 mg/kg, respectivamente. Foram irradiados com 74 mW/cm2 (PG) e 102 mW/cm2(PDZ) e dose total de energia de 150 J/cm2. Posteriormente foi avaliada a dependência de profundidade de necrose com a irradiância (60, 80, 107, 127, 138, 188 e 229 mW/cm2) utilizando PG e com dose total entregue de 150 J/cm2. As fontes de luz empregadas foram um laser de diodo 630 nm (PG), um laser de diodo emitindo em 660 nm (PDZ) e um laser de Ti:Safira, taxa de repetição de 1 kHz, comprimento de onda 800 nm e largura de pulso de 75 fs em associação com amplificador paramétrico óptico (APO) para conversão de comprimentos de onda na região de 400 - 1150 nm. Os experimentos in vitro mostraram que taxa de fotodegradação para o PG foi maior utilizando o laser pulsado do que para o laser CW. Quando utilizado o PDZ, o laser CW promoveu uma taxa de fotodegradação maior do que o pulsado. Nos estudos in vivo, foi observada a necrose induzida com laser pulsado cerca de duas vezes mais profunda do que a induzida pelo laser CW, enquanto necrose induzida pelo laser pulsado com PDZ foi maior do que a do laser CW. No estudo da dependência da profundidade de necrose em função da irradiância, o laser pulsado induziu profundidade de necrose maior do que o laser CW para irradiâncias abaixo de 80 mW/cm2, acima desta irradiância, o laser CW e o pulsado não mostraram diferença significativa. Estes resultados mostram que a combinação da fonte de luz pulsada e PG podem ser consideradas como alternativa para aumentar o volume tecidual tratado, porém, devem-se observar os parâmetros empregados para se obter o maior volume tecidual tratado. O mesmo resultado não foi observado para o PDZ como fotossensibilizador, o que indica uma forte dependência dos mecanismos da TFD com o FS e o regime de iluminação empregado. / Photodynamic therapy (PDT) is a therapeutic modality for cancer based on light, a photosensitizer agent (PS) and molecular oxygen into the target cells. PDT has advantages over traditional treatments, such as, selective damage to tumor cells, absence of surgical intervention, possibility of repeated procedures and controlled side effects. One of the limitations of PDT is the low light penetration in biological tissues and hence the treated tissue volume. An alternative to overcome this limitation is the use of pulsed light sources that compared to continuous (CW) irradiation, present higher peak power leading to a greater penetration depth and enhancing the reactive oxygen species production. The aim of this study is to evaluate PDT using pulsed light source at femtosecond regime through in vitro photodegradation of two PSs types and in vivo induced necrosis in healthy rat liver. In the in vitro study we evaluated the photodegradation of Photogem (PG - 8μg/mL) and Photodithazine (PDZ - 6μg/mL), at different irradiances (280, 340, and 400 mW/cm2 for PG and 15, 56 and 112 mW/cm2 for PDZ). In the in vivo studies the induced necrosis profile with CW laser and Pulsed Laser were evaluated in animal model which received PG (1,5 mg/kg) and PDZ (1,0 mg/kg) and were irradiated with 74 mW/cm2 and 102 mW/cm2, respectively, and the fluence was 150 J/cm2. After that, the dependence of depth of necrosis with irradiance (60, 80, 107, 127, 138, 188 and 229 mW/cm2) with PG and 150 J/cm2 of fluence was evaluated. The light source used in those studies were a 630 and 660 nm diode laser (PG and PDZ excitation light, respectively) and a Ti:Sapphire Regenerative Amplifier laser, 1 kHz repetition rate, 800 nm wavelength and 75 fs pulse width in association with an optical parametric amplifier (OPA) to convert 400-1150 wavelengths. The in vitro results showed that the PG photodegratation rates were greater to pulsed laser when compared with CW laser. When PDZ was used, the photodegradarion rates with pulsed laser were lower than CW laser. In the in vivo studies, the induced necrosis with pulsed laser was twice the induced by CW laser with PG as photosensitizer. When PDZ was used, the induced necrosis was greater for CW laser than for pulsed laser. For different irradiances, the depth of necrosis induced by CW laser was greater than for pulsed laser below 80 mW/cm2, above this, the pulsed and CW laser did not show difference. These results demonstrated that pulsed light and PG can be considered an alternative to enhance the treated tissue volume. The same was not observed to PDZ, which indicate the strong dependence of PDT mechanisms with PS and the light regime applied.

Devido à grande preocupação com a geração de novas tecnologias mais ágeis, eficientes e de baixo custo, as reações fotodinâmicas (RF) têm ganhado destaque. Estas envolvem a ativação de um fármaco fotossensível (fotossensibilizador (FS)), pela iluminação em uma faixa específica de comprimentos de onda, gerando assim espécies reativas altamente citotóxicas levando as células à morte. As RF são divididas em duas categorias: terapia fotodinâmica (TFD) e inativação fotodinâmica (IFD). A primeira é utilizada para tratamentos oncológicos, dermatológicos, entre outros. A segunda é utilizada para descontaminação de micro-organismos em infecções localizadas. Atualmente a IFD tem sido alvo de muitos estudos pois tem diversas vantagens quando comparadas com as técnicas de descontaminação atuais. Duas das mais importantes são: a seletividade e a não geração de micro-organismos resistentes aos FSs. Apesar desta técnica ser utilizada com sucesso em diversos campos, ela ainda apresenta baixa eficiência quando comparada às técnicas tradicionais. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi criar um novo protocolo de aplicação da IFD visando o aumento de eficiência, bem como um estudo profundo das interações dos FSs com as células, e o monitoramento da dinâmica do FS nestas. O presente estudo utiliza-se de células da levedura Candida albicans e demonstra a interação destas células com dois FSs: Photogem® e Curcumina. Foi proposto um novo protocolo que promove o aumento da internalização de FS pelas células baseado na pré-iluminação de baixa dose durante o tempo de incubação. Foi possível demonstrar através da medida dos espectros de absorção do sobrenadante de uma solução com células e Photogem®, que as amostras que tiveram pré-iluminação internalizaram mais FS do meio do que as células mantidas no escuro. Além disso, a partir de ensaios de viabilidade com a levedura e o Photogem® foi demonstrado que as amostras que tiveram pré-iluminação apresentaram diminuição de até seis ordens de grandeza nas unidades formadoras de colônia quando comparadas com as amostras tratadas pelo protocolo tradicional de IFD. Através das técnicas de microscopia confocal de fluorescência e de imagem de tempo de vida de fluorescência foi possível compreender a interação entre os FSs e as células, bem como estudar a ligação deste FS em diferentes regiões da célula. Além disso, foi estudada ainda a mobilidade destas moléculas dentro das células sob condições com e sem iluminação de baixa dose. Através deste estudo pôde-se inferir que as moléculas de curcumina tem tempos característicos de entrada nas células mais lentos que os tempos característicos do Photogem®. Ainda foi possível tomar vantagem da fluorescência do Photogem® para monitorar a entrada deste nas células de levedura, bem como monitorar a formação do seu fotoproduto, determinando assim que 7,5 minutos é o tempo médio de iluminação durante a incubação com FS necessário para que pelo menos 80% das células tivessem o FS internalizado, sem significante formação de fotoprodutos. Conclui-se ainda que este novo protocolo de incubação com iluminação leva a maior eficiência e seletividade da IFD, abrindo caminho para uma nova linha de pesquisa nas RF em geral, possivelmente podendo este protocolo ser aplicado em diversos tipos de células. / In the last years, due to the increasing need of generation of novel faster and cheaper technologies, the photodynamic reactions (PR) have been highlighted. These reactions involves the activation of a photosensitive drug, named photosensitizer (PS), by light in proper spectral window and generation of highly cytotoxic reactive species, leading cells to death. The photodynamic reactions may be divided in two categories: photodynamic therapy (PDT) and photodynamic inactivation (PDI). The first one is performed in order to treat oncologic, dermatologic and other diseases, whereas the second one is employed in the decontamination of microorganisms in localized infections. When compared with existing decontamination techniques, PDI has several advantages, among which two of the most important are its selectivity of the PS that acts only at the delivered site, as well as not inducing antibiotic resistance, for such reasons are subjected of many current studies. Althought this technique has been performed with great success in many fields, it still has a lack of efficiency. In this context, the purpose of this study was create a new application protocol of this technique in order to increase the efficiency, as well as understand the interactions of the PS with the cells and monitoring the drug dynamic in cells. In this study, Candida albicans cells were utilized and the interaction of two PSs (Photogem® and Curcumin) were demonstrated. A new protocol which promotes an increase of the PS cells uptake was proposed, this protocol is based on the low dose illumination during the incubation time. By measuring absorption spectra of the supernatant of two solutions with cells and Photogem®, in which in one of them were applied a low dose light, was demonstrated that the illuminated cells had an uptake increased when compared with the sample kept in the dark. Moreover, viability assays with the Photogem® and the cells proved that the cells that receive low dose light in the incubation stage had more damage in the PDI, showing a decrease of six orders of magnitude when compared with the traditional PDI. Through confocal and lifetime fluorescence microscopy techniques it was possible not only to comprehend the interaction between the PS and cells, as well as to study the binding of this molecules in different regions of the cells. Furthermore, the mobility of the PS molecules inside the cells was studied in conditions of illumination and dark, it could be inferred that the curcumin molecules has higher characteristic time than Photogem® molecules. Monitoring the cell Photogem® uptake, and the photoproduct formation was possible by take advantage of the PS fluorescence. Thus it was possible to determine the average illumination time (7.5 minutes) during the incubation time so at least 80% of the cells had the PS internalized, without much generation of photoproducts. It follows also that this new incubation protocol with low dose illumination leads to greater efficiency of PDI, so this study leads a new field of research in overall photodynamic reaction.

Um conceito central na dosimetria da terapia fotodinâmica (TFD) é o limiar de dose (Dth do inglês threshold dose). O Dth é definido como a quantidade mínima de luz que deve ser absorvida pelas moléculas de fotossensibilizador (FS) dentro das células malignas a serem tratadas para que ocorra a morte celular por necrose ou apoptose. Os resultados do estudo da captação de FS por células Hep G2 demonstraram que uma população celular de linhagem, cultivada em monocamada, apresenta captação de Photogem (PG) heterogênea, ou seja, algumas células têm maior capacidade de captar moléculas de PG, outras células captam o PG em menor quantidade. A captação heterogênea de PG pode ser a causa para fenômenos de seleção de células mais resistentes à TFD. É razoável supor que as subpopulações celulares de uma mesma massa de células malignas possam apresentar diferentes valores de Dth. Definiu-se uma função de distribuição das doses limiares (g()) como uma função de distribuição gaussiana, e para a sua parametrização desenvolveu-se um método para o cultivo in vitro de culturas tridimensionais (culturas 3D), mais fidedignas ao tecido neoplásico maligno que as culturas tradicionais. Utilizando-se o método de levitação magnética (MLM) e o método de impressão magnética (MIM) para a dosimetria da TFD, foi possível parametrizar a g(Dth), investigar a resistência celular à TFD. O MLM demonstrou ser facilmente manuseável na rotina experimental, e consistente para o teste in vitro de novos FS. Comparando-se as culturas MDA-MB-231e Hep G2, obtidas por MLM por mais de 185 horas de levitação, pode-se concluir que as células Hep G2 formaram uma estrutura celular mais densa e que ofereceu mais resistência ao dano causado pela TFD. É notável como as células Hep G2 retomaram o crescimento, e restabeleceram-se em cultura de modo semelhante ao grupo controle, por meio da reconstrução da matriz extracelular (MEC). Enquanto isso, no caso das células MDA-MB-231, a integridade da cultura não foi restabelecida após a aplicação da TFD, formando uma cultura fragmentada. O dano mais evidente, para ambas as culturas, foi observado nas margens dos tumores, evidenciando que os componentes importantes da reação fotodinâmica, como o fotossensibilizador, a luz e o oxigênio, estavam presentes em maiores quantidades na superfície da cultura, em comparação às outras regiões tumorais. Os resultados obtidos demonstram que para o Photogem (PG) é necessária uma fluência de luz da ordem de 40 J.cm-2, para que o efeito fotodinâmico promova morte celular nas culturas 3D obtidas pelo MLM. O resultado da combinação de dois tipos celulares, o maligno (MDA-MB-231) e o sadio (HPF), demonstrou que o efeito fotodinâmico é efetivo quando se tem controle adequado da entrega dos agentes da terapia, independentemente do tipo celular. Algumas células sobreviveram ao tratamento, e existe um forte indicativo de que a presença de fibroblastos HPF esteja relacionada a esta pequena parcela de células que receberam dose de luz inferior ao seu Dth. Os resultados demonstraram que quanto maior a fluência de luz, menor é o IC50 do PG. Para a fluência de luz de 60 J.cm-1 obteve-se um IC50 de 3,1 μg.mL-1, e para a fluência de luz de 30 J.cm-1 obteve-se um IC50 de 18,0 μg.mL-1. / Photodynamic therapy (PDT) dosimetry includes a central concept: the threshold dose (Dth), which is the minimum amount of light to be absorbed by the photosensitizer (PS) molecules to induce irreversible oxidative damage, and hence to cause cell death by necrosis or apoptosis. It is reasonable to assume that cells subpopulation in one individual tumor cell mass may present different Dth values, which implies the existence of a distribution of Dth values defined by a Gauss distribution function (g(Dth)). Developing methods for more realistic tissue emulation with in vitro cultures, such as three-dimensional (3D) cultures, have been encouraged aiming to avoid the above-mentioned dissimilarities. A 3D cell culture is preferable compared to monolayer cell cultures, because it provides cell-cell and cell-substrate interaction, and makes evaluating a culture and its volumetric dimension (which resembles the tumor morphology) possible. This study also includes the development of a 3D model, using the magnetic levitation method (MLM) and the magnetic printing method (MIM, from Portuguese método de impressão magnetic) for PDT dosimetry. The aim is to define parameters for g(Dth), to investigate cell resistance to PDT, and to achieve a fast and consistent method for new PS in vitro tests. By comparing cultures from the different cell types studied, the ones obtained by MLM for more than 185 hours were found to present a denser cellular structure, which provided improved resistance to PDT-induced damage. Hep G2 cells showed a remarkable behavior by being able to recover culture integrity; meanwhile MDA-MB-231 cells were not able to do so. The most evident damage, for both cell culture types, was observed on tumor margins, showing that the main elements to play a role in PDT reaction (PS, light and oxygen) were present in larger quantities, at culture surface, when compared with internal regions of the cell culture. Results obtained for PG show that a light fluence of about 40 J.cm-2 is required to induce cell death by photodynamic effect on 3D cells obtained by MLM. A combination of two different cell types - a tumor cell line and a healthy cell line - shows clearly that there is no difference for the photodynamic outcome if one holds enough control on the therapeutic parameters. The results presented in this thesis show that even a strain cell population, grown in a monolayer cell culture, results in a non-homogeneous PG uptake, which means that part of the cells seems to be able to collect PG molecules more efficiently than other cells. This difference in collection among cells may be the cause of a selection of cells that are more \"resistant\" to PDT. There were cells that survived treatment, and the presence of HPF fibroblasts might be the cause of these surviving cells, since their Dth might have not been achieved. The results showed that as higher is the light fluence, as lower is the IC50 of PG. The fluence of 60 and 30 J.cm-1 resulted in IC50 of 3.1 and 18.0 μg.mL-1, respectively.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5642.pdf: 1776062 bytes, checksum: da09965abd9a6b2902c7875682004bd4 (MD5) Previous issue date: 2012-11-08 / Universidade Federal de Sao Carlos / Photodynamic Therapy (PDT) is known to be limited to applications in large volume tumours due to its limited penetration. Therefore, the PDT with the Luzitin® photossensitizer as well as a combination of PDT and laser surgery may constitute a potential to destroy bulk tumors. Thus, with the aim of proposing a minimally invasive treatment protocol involving the application of PDT for large tumors, the present study analyzed histomorphometrically necrosis resulting from both a combination of a laser ablation with PDT as PDT with the photosensitizer Luzitin® (a bacteriochloryn synthetic with greater potential for penetration into biological tissue) in livers of healthy rats. In the first study, 87 animals were divided into 2 groups: CO2 laser and diode laser. Each of these groups were subdivided into six subgroups: 1) only laser ablation, 2) administered the PS and ablated with laser, 3) only PDT (drug and ligth), 4) drug and light (PDT) followed by laser ablation, 5) ) laser ablation followed by a PDT and 6) drug, followed by laser ablation and ligth. For each subgroup, three types of photosensitization were used: topical 5- aminilevunic acid (ALA), intravenous ALA and intravenous Photogem®. Thirty hours after the different treatments, the animals were sacrificed and the livers removed for the histological and morphometric study of necrosis. The results showed that the effects of treatment were considerably improved when PDT was used in combination with laser ablation. For the group CO2 laser, the average depth of necrosis obtained showed a minimum difference between the studied conditions for the group photosensitized Photogem® and with an increased depth of necrosis after the combined procedures in comparison with the isolated techniques for the subgroups fotossensibilizados with ALA, especially treatment with PDT was performed before ablation by CO2 laser. In the diode laser group, subgroups with better performance were those in which the ablation was performed before PDT using intravenous photosensitizers and ALA topic. From these results, it is suggested that PDT and laser ablation can synergistically in the treatment of large tumors. In the second study, sixteen normal male rats were randomly divided into 4 groups with 4 animals each. Initially, all groups were intravenously photosensitizated with 2 mg/kg or 2.6 mg/kg of the drug and after 12 hours, a 1cm2 of area, in the right abdominal region, corresponding to the liver, was irradiated during 22 minutes and 13 seconds or16 minutes and 40 seconds. Groups are described following: 1) control group: photosensitized with 2mg/kg, but untreated, 2) treated group 1: irradiated with light dose of 100J/cm2 after photosensitization with 2mg/kg of 12hs and 3) treated group 2: irradiated with light dose of 70J/cm2 and photosensitized with 2mg/kg of Luzitin®, 4) treated group 3: photosensitized with 2.6 mg/kg of the drug and irradiated with light dose of 70J/cm2 Animals were sacrificed 30 hours after irradiation, except the control group, which were sacrificed 42hs after drug administration. Livers were removed and prepared for histological analysis. Moreover, macroscopic aspects of liver were observed. Results showed significantly more extensive necrosis and greater severity in treated group 1. Data suggested that, among the conditions studied, light dose suitable for PDT treatment of photosensitized tissue by Luzitin® is 100J/cm2 and that 30% of reduction in this value produces decay in PDT response, even with proportional increase of drug concentration in the organism. / A terapia fotodinâmica (TFD) é uma técnica conhecida por sua limitada aplicação em tumores volumosos, devido a sua restrita penetração. Portanto, a TFD com o fotossensibilizador (FS) Luzitin®, bem como a combinação da TFD com a cirurgia a laser possuem potencial destrutivo para tumores volumosos. Assim, com o intuito de propor um protocolo de tratamento minimamente invasivo envolvendo a TFD para aplicação em tumores volumosos, o presente estudo analisou histomorfometricamente a necrose resultante tanto da combinação de lasers ablativos com a TFD, quanto da TFD com o fotossensibilizador Luzitin® (uma bacterioclorina sintética com maior potencial para penetração nos tecidos biológicos) em fígados de ratos saudáveis. No primeiro estudo, 87 animais foram divididos em 2 grupos: grupo laser de CO2 e grupo laser de Diodo. Cada um desses grupos foram subdivididos em 6 subgrupos: 1) subgrupo ablação a laser, 2) subgrupo fotossensibilização seguida de ablação a laser, 3) subgrupo TFD, 4) subgrupo fotossensibilização e luz seguido pela ablação a laser, 5) subgrupo laser seguido de fotossensibilização e luz, e 6) subgrupo fotossensibilização seguida da ablação a laser e luz. Para cada subgrupo, três condições de fotossensibilização foram utilizadas: ácido 5-aminolevulínico (ALA) tópico, ALA endovenoso e Photogem® endovenoso. Trinta horas após o tratamento, os animais foram eutanasiados e os fígados removidos para estudo histológico e morfométrico da necrose. Os resultados mostram que os efeitos do tratamento com TFD foram consideravelmente melhorados quando combinada com a ablação a laser. Para o grupo laser de CO2, a profundidade de necrose média obtida mostrou uma mínima diferença entre as condições estudadas para o grupo fotossensibilizado com o Photogem® e um aumento da profundidade de necrose após os procedimentos combinados em comparação com as técnicas isoladas para os subgrupos fotossensibilizados com o ALA, especialmente qunado o tratamento com a TFD foi realizado antes da ablação pelo laser de CO2. No grupo laser de Diodo, os subgrupos com melhor desempenho foram aqueles em que a ablação foi realizada antes da TFD para os fotossensibilizadores intravenosos e o subgrupo fotossensibilizado com ALA tópico, ablacionado e iluminado. A partir desses resultados, sugere-se que a TFD e a ablação a laser podem atuar de forma sinérgica no tratamento de tumores volumosos. No segundo estudo, dezesseis ratos machos normais foram randomicamente divididos em 4 grupos, com 4 animais cada. Inicialmente foi realizada a fotossensibilização por meio da administração intravenosa de 2mg/kg ou 2,6mg/kg da droga e após 12 horas, uma área de 1cm2 na região abdominal direita correspondente ao fígado foi irradiada durante 22 minutos e 13 segundo ou 16 minutos e 40 segundos. Os grupos estão descritos a seguir: 1) grupos controle: fotossensibilizado com 2mg/kg, porém não tratado; 2) grupo tratado 1: irradiado com intensidade de 100J/cm2 após 12hs da fotossensibilização com 2mg/kg; 3) grupo tratado 2: irradiado com intensidade de 70J/cm2 e fotossensibilizados com 2mg/kg de Luzitin®, 4) grupo tratado 3: fotossensibilizado com 2,6mg/kg da droga e irradiado com intensidade de 70J/cm2 Os animais foram eutanasiados após 30 horas da irradiação, exceto o grupo controle, que foram aguardadas 42hs após a administração do composto. Os fígados dos animais foram removidos e preparados para a análise histológica. Além disso, foram observados aspectos macroscópicos do fígado. A análise dos resultados mostrou uma necrose significativamente mais extensa e com maior grau de severidade para o grupo tratado 1. Com base nos dados observados, sugere-se que, dentre as condições estudadas, a dose mais adequada para o tratamento com TFD do tecido fotossensibilizado com Luzitin® seja de 100J/cm2 e que uma redução de 30% desse valor provoca um decaimento na resposta da TFD, mesmo com aumento proporcional da concentração da droga no organismo.

Um conceito central na dosimetria da terapia fotodinâmica (TFD) é o limiar de dose (Dth do inglês threshold dose). O Dth é definido como a quantidade mínima de luz que deve ser absorvida pelas moléculas de fotossensibilizador (FS) dentro das células malignas a serem tratadas para que ocorra a morte celular por necrose ou apoptose. Os resultados do estudo da captação de FS por células Hep G2 demonstraram que uma população celular de linhagem, cultivada em monocamada, apresenta captação de Photogem (PG) heterogênea, ou seja, algumas células têm maior capacidade de captar moléculas de PG, outras células captam o PG em menor quantidade. A captação heterogênea de PG pode ser a causa para fenômenos de seleção de células mais resistentes à TFD. É razoável supor que as subpopulações celulares de uma mesma massa de células malignas possam apresentar diferentes valores de Dth. Definiu-se uma função de distribuição das doses limiares (g()) como uma função de distribuição gaussiana, e para a sua parametrização desenvolveu-se um método para o cultivo in vitro de culturas tridimensionais (culturas 3D), mais fidedignas ao tecido neoplásico maligno que as culturas tradicionais. Utilizando-se o método de levitação magnética (MLM) e o método de impressão magnética (MIM) para a dosimetria da TFD, foi possível parametrizar a g(Dth), investigar a resistência celular à TFD. O MLM demonstrou ser facilmente manuseável na rotina experimental, e consistente para o teste in vitro de novos FS. Comparando-se as culturas MDA-MB-231e Hep G2, obtidas por MLM por mais de 185 horas de levitação, pode-se concluir que as células Hep G2 formaram uma estrutura celular mais densa e que ofereceu mais resistência ao dano causado pela TFD. É notável como as células Hep G2 retomaram o crescimento, e restabeleceram-se em cultura de modo semelhante ao grupo controle, por meio da reconstrução da matriz extracelular (MEC). Enquanto isso, no caso das células MDA-MB-231, a integridade da cultura não foi restabelecida após a aplicação da TFD, formando uma cultura fragmentada. O dano mais evidente, para ambas as culturas, foi observado nas margens dos tumores, evidenciando que os componentes importantes da reação fotodinâmica, como o fotossensibilizador, a luz e o oxigênio, estavam presentes em maiores quantidades na superfície da cultura, em comparação às outras regiões tumorais. Os resultados obtidos demonstram que para o Photogem (PG) é necessária uma fluência de luz da ordem de 40 J.cm-2, para que o efeito fotodinâmico promova morte celular nas culturas 3D obtidas pelo MLM. O resultado da combinação de dois tipos celulares, o maligno (MDA-MB-231) e o sadio (HPF), demonstrou que o efeito fotodinâmico é efetivo quando se tem controle adequado da entrega dos agentes da terapia, independentemente do tipo celular. Algumas células sobreviveram ao tratamento, e existe um forte indicativo de que a presença de fibroblastos HPF esteja relacionada a esta pequena parcela de células que receberam dose de luz inferior ao seu Dth. Os resultados demonstraram que quanto maior a fluência de luz, menor é o IC50 do PG. Para a fluência de luz de 60 J.cm-1 obteve-se um IC50 de 3,1 μg.mL-1, e para a fluência de luz de 30 J.cm-1 obteve-se um IC50 de 18,0 μg.mL-1. / Photodynamic therapy (PDT) dosimetry includes a central concept: the threshold dose (Dth), which is the minimum amount of light to be absorbed by the photosensitizer (PS) molecules to induce irreversible oxidative damage, and hence to cause cell death by necrosis or apoptosis. It is reasonable to assume that cells subpopulation in one individual tumor cell mass may present different Dth values, which implies the existence of a distribution of Dth values defined by a Gauss distribution function (g(Dth)). Developing methods for more realistic tissue emulation with in vitro cultures, such as three-dimensional (3D) cultures, have been encouraged aiming to avoid the above-mentioned dissimilarities. A 3D cell culture is preferable compared to monolayer cell cultures, because it provides cell-cell and cell-substrate interaction, and makes evaluating a culture and its volumetric dimension (which resembles the tumor morphology) possible. This study also includes the development of a 3D model, using the magnetic levitation method (MLM) and the magnetic printing method (MIM, from Portuguese método de impressão magnetic) for PDT dosimetry. The aim is to define parameters for g(Dth), to investigate cell resistance to PDT, and to achieve a fast and consistent method for new PS in vitro tests. By comparing cultures from the different cell types studied, the ones obtained by MLM for more than 185 hours were found to present a denser cellular structure, which provided improved resistance to PDT-induced damage. Hep G2 cells showed a remarkable behavior by being able to recover culture integrity; meanwhile MDA-MB-231 cells were not able to do so. The most evident damage, for both cell culture types, was observed on tumor margins, showing that the main elements to play a role in PDT reaction (PS, light and oxygen) were present in larger quantities, at culture surface, when compared with internal regions of the cell culture. Results obtained for PG show that a light fluence of about 40 J.cm-2 is required to induce cell death by photodynamic effect on 3D cells obtained by MLM. A combination of two different cell types - a tumor cell line and a healthy cell line - shows clearly that there is no difference for the photodynamic outcome if one holds enough control on the therapeutic parameters. The results presented in this thesis show that even a strain cell population, grown in a monolayer cell culture, results in a non-homogeneous PG uptake, which means that part of the cells seems to be able to collect PG molecules more efficiently than other cells. This difference in collection among cells may be the cause of a selection of cells that are more \"resistant\" to PDT. There were cells that survived treatment, and the presence of HPF fibroblasts might be the cause of these surviving cells, since their Dth might have not been achieved. The results showed that as higher is the light fluence, as lower is the IC50 of PG. The fluence of 60 and 30 J.cm-1 resulted in IC50 of 3.1 and 18.0 μg.mL-1, respectively.

Devido à grande preocupação com a geração de novas tecnologias mais ágeis, eficientes e de baixo custo, as reações fotodinâmicas (RF) têm ganhado destaque. Estas envolvem a ativação de um fármaco fotossensível (fotossensibilizador (FS)), pela iluminação em uma faixa específica de comprimentos de onda, gerando assim espécies reativas altamente citotóxicas levando as células à morte. As RF são divididas em duas categorias: terapia fotodinâmica (TFD) e inativação fotodinâmica (IFD). A primeira é utilizada para tratamentos oncológicos, dermatológicos, entre outros. A segunda é utilizada para descontaminação de micro-organismos em infecções localizadas. Atualmente a IFD tem sido alvo de muitos estudos pois tem diversas vantagens quando comparadas com as técnicas de descontaminação atuais. Duas das mais importantes são: a seletividade e a não geração de micro-organismos resistentes aos FSs. Apesar desta técnica ser utilizada com sucesso em diversos campos, ela ainda apresenta baixa eficiência quando comparada às técnicas tradicionais. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi criar um novo protocolo de aplicação da IFD visando o aumento de eficiência, bem como um estudo profundo das interações dos FSs com as células, e o monitoramento da dinâmica do FS nestas. O presente estudo utiliza-se de células da levedura Candida albicans e demonstra a interação destas células com dois FSs: Photogem® e Curcumina. Foi proposto um novo protocolo que promove o aumento da internalização de FS pelas células baseado na pré-iluminação de baixa dose durante o tempo de incubação. Foi possível demonstrar através da medida dos espectros de absorção do sobrenadante de uma solução com células e Photogem®, que as amostras que tiveram pré-iluminação internalizaram mais FS do meio do que as células mantidas no escuro. Além disso, a partir de ensaios de viabilidade com a levedura e o Photogem® foi demonstrado que as amostras que tiveram pré-iluminação apresentaram diminuição de até seis ordens de grandeza nas unidades formadoras de colônia quando comparadas com as amostras tratadas pelo protocolo tradicional de IFD. Através das técnicas de microscopia confocal de fluorescência e de imagem de tempo de vida de fluorescência foi possível compreender a interação entre os FSs e as células, bem como estudar a ligação deste FS em diferentes regiões da célula. Além disso, foi estudada ainda a mobilidade destas moléculas dentro das células sob condições com e sem iluminação de baixa dose. Através deste estudo pôde-se inferir que as moléculas de curcumina tem tempos característicos de entrada nas células mais lentos que os tempos característicos do Photogem®. Ainda foi possível tomar vantagem da fluorescência do Photogem® para monitorar a entrada deste nas células de levedura, bem como monitorar a formação do seu fotoproduto, determinando assim que 7,5 minutos é o tempo médio de iluminação durante a incubação com FS necessário para que pelo menos 80% das células tivessem o FS internalizado, sem significante formação de fotoprodutos. Conclui-se ainda que este novo protocolo de incubação com iluminação leva a maior eficiência e seletividade da IFD, abrindo caminho para uma nova linha de pesquisa nas RF em geral, possivelmente podendo este protocolo ser aplicado em diversos tipos de células. / In the last years, due to the increasing need of generation of novel faster and cheaper technologies, the photodynamic reactions (PR) have been highlighted. These reactions involves the activation of a photosensitive drug, named photosensitizer (PS), by light in proper spectral window and generation of highly cytotoxic reactive species, leading cells to death. The photodynamic reactions may be divided in two categories: photodynamic therapy (PDT) and photodynamic inactivation (PDI). The first one is performed in order to treat oncologic, dermatologic and other diseases, whereas the second one is employed in the decontamination of microorganisms in localized infections. When compared with existing decontamination techniques, PDI has several advantages, among which two of the most important are its selectivity of the PS that acts only at the delivered site, as well as not inducing antibiotic resistance, for such reasons are subjected of many current studies. Althought this technique has been performed with great success in many fields, it still has a lack of efficiency. In this context, the purpose of this study was create a new application protocol of this technique in order to increase the efficiency, as well as understand the interactions of the PS with the cells and monitoring the drug dynamic in cells. In this study, Candida albicans cells were utilized and the interaction of two PSs (Photogem® and Curcumin) were demonstrated. A new protocol which promotes an increase of the PS cells uptake was proposed, this protocol is based on the low dose illumination during the incubation time. By measuring absorption spectra of the supernatant of two solutions with cells and Photogem®, in which in one of them were applied a low dose light, was demonstrated that the illuminated cells had an uptake increased when compared with the sample kept in the dark. Moreover, viability assays with the Photogem® and the cells proved that the cells that receive low dose light in the incubation stage had more damage in the PDI, showing a decrease of six orders of magnitude when compared with the traditional PDI. Through confocal and lifetime fluorescence microscopy techniques it was possible not only to comprehend the interaction between the PS and cells, as well as to study the binding of this molecules in different regions of the cells. Furthermore, the mobility of the PS molecules inside the cells was studied in conditions of illumination and dark, it could be inferred that the curcumin molecules has higher characteristic time than Photogem® molecules. Monitoring the cell Photogem® uptake, and the photoproduct formation was possible by take advantage of the PS fluorescence. Thus it was possible to determine the average illumination time (7.5 minutes) during the incubation time so at least 80% of the cells had the PS internalized, without much generation of photoproducts. It follows also that this new incubation protocol with low dose illumination leads to greater efficiency of PDI, so this study leads a new field of research in overall photodynamic reaction.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5345.pdf: 1839849 bytes, checksum: 117cb76c1a10deab4b3e8c9df4d797f3 (MD5) Previous issue date: 2012-03-30 / In Brazil there was an increase of post-surgical infections by rapidly growing mycobacteria, mainly Mycobacterium massiliense, leading the Agency for Sanitary Surveillance (ANVISA) to establish standards for the mandatory notification of cases occurring nationwide. In order to deal with a major public health problem, this study aimed to determine the efficiency of using antimicrobial photodynamic inactivation (PDIa) in Mycobacterium massiliense for future use in the treatment of agent infections. The objective was to test in vitro technique the PDI to control Mycobacterium massiliense to determine the best light dose and concentration of each photosensitizer (FS). To accomplish this search were used two FS: Photogem® and salt Curcumin (N-Methyl-D-Glucominato of Curcumin, 31.8%). As a light source for radiating a BioTable ® operated at 630nm (red light) for Photogem ® and 460nm (blue light) to the salt of curcumin. After the standardized inoculum was added to the sample analyzed in triplicate to a 24 well plate which contained 500μl aliquots of the inoculum +500 μ l of the FS for the study groups tested, and the control group containing 1 ml of inoculum, and five minutes as time incubation (protected from light). After expiration of the irradiation time in accordance with the previously analyzed fluences of the tested groups and subsequent dilution of the sample to the value of 10-5, 100mL sample were plated in triplicate on 7H10 agar + OADC 10% and maintained at 37 for about 5 days with subsequent counting of colony forming units. Based on the results, they showed that FS Photogem ® until the concentration of 1000 μg/Ml was not effective in reducing the number of CFU of M. massiliense. In contrast, the FS Salt Curcumin was effective at concentrations of 1300 μg/Ml with a light dose 50 J/cm2 compared to controls. Thus, these data suggest that the salt FS Curcumin in photodynamic action is a viable alternative for reducing M massiliense when tested in vitro. / No Brasil houve um crescimento de infecções pós-cirúrgicas por micobactérias de crescimento rápido, principalmente por Mycobacterium massiliense, levando a Agência de Vigilância Sanitária (ANVISA) estabelecer normas de notificação obrigatória dos casos ocorridos em todo território nacional. Tendo em vista de se tratar de um grande problema de saúde pública, o presente trabalho visou determinar a eficiência da atividade antimicrobiana utilizando Inativação Fotodinâmica (IFD) em Mycobacterium massiliense para futura utilização no tratamento de infecções por esse agente. O objetivo foi testar in vitro, a técnica da IFD no controle de Mycobacterium massiliense, para determinar a melhor dose de luz e concentração de cada fotossensibilizador (FS). Para realizar esta pesquisa foram utilizados dois FS: Photogem® e Sal de Curcumina (N-Metil-D-Glucominato de Curcumina, a 31,8%). Como fonte de luz para irradiação, uma BioTable® operou em 630nm (luz vermelha) para o Photogem® e em 460nm (luz azul) para o Sal de Curcumina. Após padronizado o inóculo, a amostra analisada foi adicionada em triplicata a uma placa de 24 poços a qual continha alíquotas de 500μl do inoculo +500μl do FS para os grupos de estudos testados, e o grupo controle contendo 1ml do inoculo, tendo 5 minutos como tempo de incubação (protegido da luz). Após decorrido o tempo de irradiação de acordo com as fluências previamente analisadas dos grupos testados e com posterior diluição da amostra até o valor de 10-5, 100μl da amostra foram semeadas em triplicada em placas contendo Agar 7H10 + OADC 10% e mantidas a 37o por aproximadamente 5 dias com posterior contagem das unidades formadoras de colônias. Com base nos resultados obtidos, estes mostraram que o FS Photogem® até a concentração de 1000μg/ml não foi efetivo na redução do número de UFC de M. massiliense. Em contraponto, o FS Sal de Curcumina foi efetivo a partir da concentração de 1300 μg/ml com dose de luz a 50 J/cm2 comparado ao grupo controle. Assim, estes dados sugerem que o FS Sal de Curcumina sob ação fotodinâmica é uma alternativa viável para a redução de M. massiliense quando testadas in vitro.

Submitted by Izabel Franco (izabel-franco@ufscar.br) on 2016-09-14T17:46:21Z No. of bitstreams: 1 DissLMS.pdf: 2276370 bytes, checksum: ee5f91507ba780836a4577a021cc883c (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-16T19:21:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissLMS.pdf: 2276370 bytes, checksum: ee5f91507ba780836a4577a021cc883c (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-16T19:21:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissLMS.pdf: 2276370 bytes, checksum: ee5f91507ba780836a4577a021cc883c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-16T19:21:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissLMS.pdf: 2276370 bytes, checksum: ee5f91507ba780836a4577a021cc883c (MD5) Previous issue date: 2015-08-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / The Aedes aegypti mosquito is the main responsible for the transmission of dengue. Among numerous alternatives to combat vector, we can cite the use of photosensitizers (PSs) as inactivating of Aedes aegypti larvae. These compounds are able to interact with the light in a specific wavelength, so the cause highly reactive cytotoxic oxygen, resulting in the oxidation of biological targets. The present study had as main objective to analyze the phototoxic effects of PSs: Photogem® and turmeric, in three molecular variations (curcumin, curcuminoids pigment mixture (curcumin, desmethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin) and curcumin in sucrose), against Aedes aegypti larvae under different conditions of delivery of the PSs and lighting. The experiments of this study were divided into two stages: i) Photogem® and the three compositions of turmeric were applied in trials of photodynamic inactivation (PDI) in solution. The groups that received the Photogem®, were also fed with two different types of food, in order to verify the influence of these foods on larval mortality. ii) in a second step the three compositions of turmeric were incorporated in pet food, where it obtained a lyophilized powder, which was subsequently offered to the larvae for scanning. After the receipt of the PSs in solution as in the form of freeze-dried powder, the larvae were irradiated with two sources of light: artificial and natural. In addition to the trials of mortality, other studies were performed, such as checking the time of degradation of PSs when exposed to light, the anatomical location of accumulation of FSs in the larvae, and characterization studies of the product obtained in the form of lyophilized powder. On PDI with the Photogem® comparing the foods, exposed to artificial lighting, one of the foods introduced a higher mortality, indicating the importance of this on effectiveness of PDI. Already on PDI with variations of turmeric, mortality rates varied according to the molecular forms of this compound, showing high mortality for curcumin and curcumin in sucrose. In conditions involving sunlight, high mortality rates were obtained for all FSs delivered solution, featuring in various conditions 100% mortality in 8 hours from exposure to light. For IFD using the freeze-dried powder of three variations of turmeric and sunlight, mortalities in the order of 80% were achieved in lighting 16 hours. The analysis of the fluorescence image obtained by confocal microscope showed that both the three variations of turmeric, such as Photogem®, after an incubation period of 12 hours, accumulated throughout the alimentary canal of the larvae. The Photogem®, as well as turmeric showed potent photodynamic activity being more effective in conditions with higher light intensities. Regarding the delivery conditions of the PS, we observe that the highest values of mortality were obtained through the application of PSs in solution, when compared with the mortality studies using the freeze-dried powder. These results indicate that PDI can be a promising technique in the control of vectors as the Aedes aegypti. / O mosquito Aedes aegypti é o principal vetor responsável pela transmissão da dengue. Dentre as inúmeras alternativas de combate ao vetor, podemos citar o uso de fotossensibilizadores (FSs) como inativadores de larvas do Ae. aegypti. Esses compostos são capazes de interagir com a luz, num comprimento de onda específico, de modo a originar espécies altamente reativas de oxigênio citotóxico, resultando na oxidação de alvos biológicos. O presente estudo teve como principal objetivo analisar os efeitos fototóxicos dos FSs: Photogem® e cúrcuma, em três variações moleculares (curcumina, mistura de pigmentos curcuminóides (curcumina, demetoxicurcumina e bis-demetoxicurcumina) e curcumina em sacarose), contra larvas do Ae. aegypti sob diferentes condições de entrega dos FSs e de iluminação. Os experimentos deste estudo foram divididos em duas etapas: i) tanto o Photogem® quanto as três composições de cúrcuma foram aplicados nos ensaios de inativação fotodinâmica (IFD) em solução. Os grupos que receberam o Photogem® foram também alimentados com dois diferentes tipos de ração, com a finalidade de verificar a influência desses alimentos na mortalidade larval. ii) em uma segunda etapa as três composições de cúrcuma foram incorporadas nas rações, onde obteve-se um pó liofilizado, que foi posteriormente ofertado às larvas para a verificação da mortalidade. Após o recebimento dos FSs, tanto em solução como na forma de pó liofilizado, as larvas foram irradiadas com duas fontes de luz: artificial e natural. Além dos ensaios de mortalidade, outros estudos foram realizados, como a verificação do tempo de degradação dos FSs quando expostos à luz, o local anatômico de acumulação dos FSs nas larvas, e estudos de caracterização do produto obtido na forma de pó liofilizado. Na IFD com o Photogem® comparando as rações, expostas à iluminação artificial, uma delas apresentou uma mortalidade superior, indicando a importância desta na efetividade da IFD. Já na IFD com as variações de cúrcuma, as porcentagens de mortalidade variaram de acordo com as formas moleculares deste composto. Nas condições envolvendo luz solar, foram obtidas altos valores de mortalidade para todos os FSs entregues em solução, apresentando em diversas condições 100% de mortalidade em 8 horas de exposição à luz. Nos ensaios de IFD utilizando o pó liofilizado das três variações de cúrcuma e luz solar, mortalidades da ordem de 80% foram atingidas em 16 horas de iluminação. As análises das imagens de fluorescência obtidas por microscópio confocal mostraram que tanto as três variações de cúrcuma, como o Photogem®, após um período de incubação de 12 horas, acumularam-se em todo o canal alimentar das larvas. O Photogem®, assim como a cúrcuma apresentaram atividade fotodinâmica potente, sendo mais efetivos em condições com maiores intensidades de luz. Com relação às condições de entrega do FS, observamos que as maiores mortalidades foram obtidas através da aplicação dos FSs em solução, quando comparadas com os estudos de mortalidade utilizando o pó liofilizado. Esses resultados indicam que IFD pode ser uma técnica promissora no controle de vetores como o Ae. aegypti.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5518.pdf: 1765927 bytes, checksum: 354bfee295ad1873956c15264ad51854 (MD5) Previous issue date: 2013-08-29 / Financiadora de Estudos e Projetos / The photodynamic inactivation (PDI), used for biological control of microorganisms, involves the action of a photosensitizer (PS), activated by visible light, in order to oxidize organic substrates, resulting in cytotoxic effect. The control of free-living amoebae is important both for its pathogenicity and its microorganisms harboring. Additionally, some species may develop serious infections in humans. The present study evaluated the in vitro effectiveness of PDI in Acanthamoeba polyphaga. Salt of curcuminoids, curcumin, methylene blue and Photogem® were used as FS. Besides, this study intended to observe morphological changes caused by the salt of curcuminoids in the microorganism. The samples were grown at 37 ºC in PYG medium for a period of 48 to 72 hours. Curcumin was solubilized in 1 mL DMSO and further diluted in distilled water to obtain final concentrations. The other PS s were directly solubilized in distilled water. The irradiation light-emitting diodes were used at wavelengths 460 and 630 nm at doses of 30 and 50 J/cm2. After treatments, resazurin was added to evaluate the respiratory activity of A. polyphaga and the samples were incubated at 37 °C for 4 hours. The fluorescence intensity was measured in a fluorescence spectrophotometer. In PDI with salt of curcuminoids at concentrations 500, 1000 and 1500 µg/mL, there was a reduction of 27.7%, 61.4% and 82.5% at 30 J/cm2 and 75.2%, 85.0% and 95.9% at 50 J/cm2, respectively. In PDI with curcumin at concentrations 35, 70 and 140 µg/mL, there was a reduction of 16.2%, 24.0% and 25.7% at 30 J/cm2, and 25.4%, 28.3 % and 30.5% at 50 J/cm2, respectively. In PDI with methylene blue at concentrations 24 and 32 µg/mL, there was a reduction of 14.1% and 28.3% at 30 J/cm2, with no reduction in the concentration of 16 µg/mL and 18.7%, 36.9% and 23.9% at 50 J/cm2, respectively. Finally, in PDI with Photogem® at concentrations 50, 100 and 200 µg/mL, there was a reduction of 20.1%, 37.6% and 53.5% at 30 J/cm2, and 17.1%, 38.9% and 57.3% at 50 J/cm2, respectively. The removal of the PS before irradiation showed that the salt of curcuminoids probably didn t stay inside of amoebas, because the reduction obtained previously was not observed in this condition. The PS was toxic to the amoebae in the absence of light, at the concentrations tested, and the isolated use of light showed no phototoxic effect, except the dose of 50 J/cm2 at 460 nm wavelength. The phototoxicity by doses of light together the PS contributed to the death of the amoebae, being more efficient with salt of curcuminoids. The analysis of confocal microscopy images showed that the salt of curcuminoids caused damage in amoebae, confirming its toxicity in the dark. Therefore, it is concluded that contact with only the PS is already able to induce morphological changes in A. polyphaga, leading some of them to death. / A inativação fotodinâmica (IFD), utilizada no controle biológico de microrganismos, envolve a ação de um fotossensibilizador (FS), ativado por luz visível, no intuito de oxidar substratos biológicos, resultando em efeito citotóxico. O controle de amebas de vida livre é importante, tanto pela sua patogenicidade quanto pelo fato de abrigarem microrganismos. Além disso, algumas espécies podem desenvolver sérias infecções em humanos. O presente estudo propôs analisar a efetividade in vitro da IFD em Acanthamoeba polyphaga utilizando sal de curcuminóides, curcumina, azul de metileno e Photogem® como FS, além de observar alterações morfológicas causadas pelo sal de curcuminóides neste microrganismo. As amostras foram cultivadas em meio PYG, incubadas a 37°C por 48 a 72 horas. A curcumina foi solubilizada em 1 mL de DMSO e posteriormente diluída em água destilada para obtenção das concentrações finais. Os demais FS foram solubilizados diretamente em água destilada. Para a irradiação, diodos emissores de luz foram utilizados nos comprimentos de onda 460 e 630 nm, nas doses de 30 e 50 J/cm2. Após os tratamentos, resazurina foi adicionada para avaliar a viabilidade de A. polyphaga, sendo as amostras incubadas a 37°C por 4 horas. A intensidade de fluorescência foi medida em espectrofotômetro de fluorescência. Na IFD com sal de curcuminóides nas concentrações 500, 1000 e 1500 µg/mL, houve redução de 27,7%, 61,4% e 82,5% com 30 J/cm2, e de 75,2%, 85,0% e 95,9% com 50 J/cm2, respectivamente. Já na IFD com curcumina nas concentrações 35, 70 e 140 µg/mL, houve redução de 16,2%, 24,0% e 25,7% com 30 J/cm2, e de 25,4%, 28,3% e 30,5% com 50 J/cm2, respectivamente. Na IFD com azul de metileno nas concentrações 24 e 32µg/mL, houve redução de 14,1% e 28,3% com 30 J/cm2, não havendo redução na concentração de 16 µg/mL e de 18,7%, 36,9% e 23,9% com 50 J/cm2, respectivamente. Por fim, na IFD com Photogem® nas concentrações 50, 100 e 200 µg/mL, houve redução de 20,1%, 37,6% e 53,5% com 30 J/cm2, e de 17,1%, 38,9% e 57,3% com 50 J/cm2, respectivamente. A retirada do FS antes da irradiação mostrou que o sal de curcuminóides provavelmente não permaneceu no interior das amebas, pois a redução obtida anteriormente não foi observada nesta condição. Os FS apresentaram toxicidade para as amebas, na ausência de luz, nas concentrações testadas e o uso isolado da luz não apresentou efeito fototóxico, exceto a dose 50 J/cm2 no comprimento de onda 460 nm. A fototoxicidade proporcionada pelas doses de luz junto aos FS utilizados contribuiu para o efeito de morte das amebas, sendo a IFD eficiente com o sal de curcuminóides. A análise das imagens obtidas pela microscopia confocal mostrou que o sal de curcuminóides causou danos em amebas, confirmando a toxicidade apresentada no escuro. Portanto, conclui-se que apenas o contato com o FS já é capaz de induzir mudanças morfológicas em A. polyphaga, levando algumas células à morte.