A égua é classificada como poliéstrica estacional, o que implica suspensão da atividade reprodutiva cíclica usualmente a partir da metade do outono, na maioria destes animais. Esta resposta é devida à diminuição gradual no fotoperíodo natural, considerado como fator primário na sazonalidade reprodutiva. A ausência de ciclos ovulatórios durante os meses de inverno e a inconsistência da fase de ressurgência atingem não só os criadores de raças que procuram o nascimento de potros mais cedo na temporada reprodutiva oficial, mas principalmente aqueles que empregam a técnica da transferência de embriões. A obtenção de ovulações ao longo do ano possibilitaria a utilização reprodutiva ótima de éguas doadoras e receptoras. A fim de verificar a ciclicidade reprodutiva durante outono e inverno, dezessete éguas em uma propriedade do sul do Brasil foram distribuídas ao acaso em dois grupos. De quinze de Janeiro a doze de Setembro de 2009, os animais do grupo Tratamento foram submetidos a fotoperíodo diário fixo de 15 horas. Duas vezes por semana, o trato reprodutivo de todos os animais foi avaliado por ultrassonografia transretal, para verificação da presença de folículos dominantes e corpo lúteo. Dosagem de progesterona foi utilizada para confirmação de anestro. Oitenta e cinco por cento dos animais submetidos ao tratamento mantiveram ciclicidade reprodutiva, enquanto oitenta por cento dos animais controle entraram em anestro de inverno. Houve aumento na duração dos ciclos, devido a fatores endógenos, nutricionais e ambientais. Os resultados demonstram que o tratamento foi efetivo para obtenção de ciclos ovulatórios durante os meses de inverno. / The mare is classified as a seasonal poliestric, which means the suspension of reproductive activity usually from the first half of autumn, most of the mares. This is a response to the gradual decline in the natural photoperiod, considered as a primary factor of reproductive seasonality. The absence of ovulatory cycles during winter months and the inconsistency of the resurging phase strike both breeders who aim foals’ birth early in the official breeding season and those who employ the embryo transfer technique. Achieving ovulation throughout the year would enable the optimal reproductive use of donors and recipient mares. In order to check autumn and winter cyclicity, seventeen mares on a farm in southern Brazil were randomly assigned into two groups. From January 15th to September 12th 2009, animals in Treatment group were subjected to a fixed 15 hours daily photoperiod. Twice a week, the reproductive tract of all animals was examined by transrectal ultrasonography, searching for dominant follicles and presence of corpora lutea. Progesterone levels were used to confirm winter anestrus. 85% mares undergoing treatment maintained reproductive activity, while 80% of Control mares showed winter anestrus. There were changes in lenght of cycles, due to endogenous, nutritional and environmental factors. Results demonstrate that the treatment was effective to attain ovulatory cycles during winter months.

O presente experimento verificou se o fotoperíodo artificial iniciado no verão retarda o início da transição outonal e nos casos de ocorrência do anestro determinar sua forma de início. Foram utilizadas no experimento 13 éguas com idades variando entre 4 e 10 anos. Todas as éguas no início do experimento encontravam-se ciclando, com presença de corpo lúteo funcional ou folículo dominante. Antes do início do experimento os animais foram divididos em dois grupos, Grupo Luz (GL) com 08 animais e Grupo Controle (GC) com 05 animais, buscando equilibrar a idade e a condição corporal das éguas nos diferentes grupos. A partir do dia 23 de fevereiro de 2006 as éguas do GL foram submetidas a um fotoperíodo artificial de 15 horas de luz e de 9 horas de escuridão, e as éguas do GC foram mantidas sob fotoperíodo natural. Em relação ao início do anestro e à condição corporal não foram observadas diferenças entre o GL e o GC. Dentre os 13 animais utilizados no experimento todos entraram em anestro. Não se observaram diferenças entre os dois grupos de tratamento em relação ao número de dias entre o início do tratamento e a última ovulação e os inícios do tratamento e do anestro, bem como entre o número de dias de duração do último corpo lúteo. Entretanto observou-se diferença no grupo luz onde 75% das éguas apresentaram diestro prolongado enquanto que no grupo controle isto ocorreu em somente 40% das éguas. O anestro inicia por persistência lútea seguida de inatividade folicular ou por inatividade folicular após um diestro regular. O fotoperíodo artificial iniciado a partir da segunda metade do verão não impediu o início do anestro. Entretanto, a maioria das éguas submetidas ao fotoperíodo artificial iniciou o anestro após uma persitência lútea. / The present study aimed to verify if the artificial photoperiod started during summer retards the beginning of autumn transition and if anestrus occurs, to determine the way it begins. There were used 13 mares with ages varying between 4 and 10 years. All the mares were cycling in the beginning of the study, having either a functional corpus luteum or a dominant follicle. Before starting the experiment, the animals were divided in two groups: Light Group (LG) with 08 animals and Control Group (CG) with 05 animals, trying to equilibrate age and body condition of the different group mares. After February 23rd, 2006, the mares of LG were submitted to artificial photoperiod of 15 hours light and 9 hours dark, and the mares of CG were kept under natural photoperiod. Concerning the beginning of anestrus and body condition, no differences were observed between LG and CG. Among the 13 animals used in the study, all entered anestrus period. No differences were observed between the treatment groups about the number of days between the beginning of the treatment and the last ovulation, and the beginning of treatments and anestrus, as well as the number of days of duration of the last corpus luteum. However, differences were found in the light group, where 75% of the mares presented a prolonged diestrus while in the control group it only happened in 40% of the mares. The anestrus begins by luteal persistency followed by follicular inactivity or by follicular inactivity after a regular diestrus. The artificial photoperiod initiated after the second half of the summer did not affect the beginning of the anestrus. However, most of the mares submitted to artificial photoperiod initiated anestrus after a luteal persistency.

O presente experimento verificou se o fotoperíodo artificial iniciado no verão retarda o início da transição outonal e nos casos de ocorrência do anestro determinar sua forma de início. Foram utilizadas no experimento 13 éguas com idades variando entre 4 e 10 anos. Todas as éguas no início do experimento encontravam-se ciclando, com presença de corpo lúteo funcional ou folículo dominante. Antes do início do experimento os animais foram divididos em dois grupos, Grupo Luz (GL) com 08 animais e Grupo Controle (GC) com 05 animais, buscando equilibrar a idade e a condição corporal das éguas nos diferentes grupos. A partir do dia 23 de fevereiro de 2006 as éguas do GL foram submetidas a um fotoperíodo artificial de 15 horas de luz e de 9 horas de escuridão, e as éguas do GC foram mantidas sob fotoperíodo natural. Em relação ao início do anestro e à condição corporal não foram observadas diferenças entre o GL e o GC. Dentre os 13 animais utilizados no experimento todos entraram em anestro. Não se observaram diferenças entre os dois grupos de tratamento em relação ao número de dias entre o início do tratamento e a última ovulação e os inícios do tratamento e do anestro, bem como entre o número de dias de duração do último corpo lúteo. Entretanto observou-se diferença no grupo luz onde 75% das éguas apresentaram diestro prolongado enquanto que no grupo controle isto ocorreu em somente 40% das éguas. O anestro inicia por persistência lútea seguida de inatividade folicular ou por inatividade folicular após um diestro regular. O fotoperíodo artificial iniciado a partir da segunda metade do verão não impediu o início do anestro. Entretanto, a maioria das éguas submetidas ao fotoperíodo artificial iniciou o anestro após uma persitência lútea. / The present study aimed to verify if the artificial photoperiod started during summer retards the beginning of autumn transition and if anestrus occurs, to determine the way it begins. There were used 13 mares with ages varying between 4 and 10 years. All the mares were cycling in the beginning of the study, having either a functional corpus luteum or a dominant follicle. Before starting the experiment, the animals were divided in two groups: Light Group (LG) with 08 animals and Control Group (CG) with 05 animals, trying to equilibrate age and body condition of the different group mares. After February 23rd, 2006, the mares of LG were submitted to artificial photoperiod of 15 hours light and 9 hours dark, and the mares of CG were kept under natural photoperiod. Concerning the beginning of anestrus and body condition, no differences were observed between LG and CG. Among the 13 animals used in the study, all entered anestrus period. No differences were observed between the treatment groups about the number of days between the beginning of the treatment and the last ovulation, and the beginning of treatments and anestrus, as well as the number of days of duration of the last corpus luteum. However, differences were found in the light group, where 75% of the mares presented a prolonged diestrus while in the control group it only happened in 40% of the mares. The anestrus begins by luteal persistency followed by follicular inactivity or by follicular inactivity after a regular diestrus. The artificial photoperiod initiated after the second half of the summer did not affect the beginning of the anestrus. However, most of the mares submitted to artificial photoperiod initiated anestrus after a luteal persistency.

A égua é classificada como poliéstrica estacional, o que implica suspensão da atividade reprodutiva cíclica usualmente a partir da metade do outono, na maioria destes animais. Esta resposta é devida à diminuição gradual no fotoperíodo natural, considerado como fator primário na sazonalidade reprodutiva. A ausência de ciclos ovulatórios durante os meses de inverno e a inconsistência da fase de ressurgência atingem não só os criadores de raças que procuram o nascimento de potros mais cedo na temporada reprodutiva oficial, mas principalmente aqueles que empregam a técnica da transferência de embriões. A obtenção de ovulações ao longo do ano possibilitaria a utilização reprodutiva ótima de éguas doadoras e receptoras. A fim de verificar a ciclicidade reprodutiva durante outono e inverno, dezessete éguas em uma propriedade do sul do Brasil foram distribuídas ao acaso em dois grupos. De quinze de Janeiro a doze de Setembro de 2009, os animais do grupo Tratamento foram submetidos a fotoperíodo diário fixo de 15 horas. Duas vezes por semana, o trato reprodutivo de todos os animais foi avaliado por ultrassonografia transretal, para verificação da presença de folículos dominantes e corpo lúteo. Dosagem de progesterona foi utilizada para confirmação de anestro. Oitenta e cinco por cento dos animais submetidos ao tratamento mantiveram ciclicidade reprodutiva, enquanto oitenta por cento dos animais controle entraram em anestro de inverno. Houve aumento na duração dos ciclos, devido a fatores endógenos, nutricionais e ambientais. Os resultados demonstram que o tratamento foi efetivo para obtenção de ciclos ovulatórios durante os meses de inverno. / The mare is classified as a seasonal poliestric, which means the suspension of reproductive activity usually from the first half of autumn, most of the mares. This is a response to the gradual decline in the natural photoperiod, considered as a primary factor of reproductive seasonality. The absence of ovulatory cycles during winter months and the inconsistency of the resurging phase strike both breeders who aim foals’ birth early in the official breeding season and those who employ the embryo transfer technique. Achieving ovulation throughout the year would enable the optimal reproductive use of donors and recipient mares. In order to check autumn and winter cyclicity, seventeen mares on a farm in southern Brazil were randomly assigned into two groups. From January 15th to September 12th 2009, animals in Treatment group were subjected to a fixed 15 hours daily photoperiod. Twice a week, the reproductive tract of all animals was examined by transrectal ultrasonography, searching for dominant follicles and presence of corpora lutea. Progesterone levels were used to confirm winter anestrus. 85% mares undergoing treatment maintained reproductive activity, while 80% of Control mares showed winter anestrus. There were changes in lenght of cycles, due to endogenous, nutritional and environmental factors. Results demonstrate that the treatment was effective to attain ovulatory cycles during winter months.

A égua é classificada como poliéstrica estacional, o que implica suspensão da atividade reprodutiva cíclica usualmente a partir da metade do outono, na maioria destes animais. Esta resposta é devida à diminuição gradual no fotoperíodo natural, considerado como fator primário na sazonalidade reprodutiva. A ausência de ciclos ovulatórios durante os meses de inverno e a inconsistência da fase de ressurgência atingem não só os criadores de raças que procuram o nascimento de potros mais cedo na temporada reprodutiva oficial, mas principalmente aqueles que empregam a técnica da transferência de embriões. A obtenção de ovulações ao longo do ano possibilitaria a utilização reprodutiva ótima de éguas doadoras e receptoras. A fim de verificar a ciclicidade reprodutiva durante outono e inverno, dezessete éguas em uma propriedade do sul do Brasil foram distribuídas ao acaso em dois grupos. De quinze de Janeiro a doze de Setembro de 2009, os animais do grupo Tratamento foram submetidos a fotoperíodo diário fixo de 15 horas. Duas vezes por semana, o trato reprodutivo de todos os animais foi avaliado por ultrassonografia transretal, para verificação da presença de folículos dominantes e corpo lúteo. Dosagem de progesterona foi utilizada para confirmação de anestro. Oitenta e cinco por cento dos animais submetidos ao tratamento mantiveram ciclicidade reprodutiva, enquanto oitenta por cento dos animais controle entraram em anestro de inverno. Houve aumento na duração dos ciclos, devido a fatores endógenos, nutricionais e ambientais. Os resultados demonstram que o tratamento foi efetivo para obtenção de ciclos ovulatórios durante os meses de inverno. / The mare is classified as a seasonal poliestric, which means the suspension of reproductive activity usually from the first half of autumn, most of the mares. This is a response to the gradual decline in the natural photoperiod, considered as a primary factor of reproductive seasonality. The absence of ovulatory cycles during winter months and the inconsistency of the resurging phase strike both breeders who aim foals’ birth early in the official breeding season and those who employ the embryo transfer technique. Achieving ovulation throughout the year would enable the optimal reproductive use of donors and recipient mares. In order to check autumn and winter cyclicity, seventeen mares on a farm in southern Brazil were randomly assigned into two groups. From January 15th to September 12th 2009, animals in Treatment group were subjected to a fixed 15 hours daily photoperiod. Twice a week, the reproductive tract of all animals was examined by transrectal ultrasonography, searching for dominant follicles and presence of corpora lutea. Progesterone levels were used to confirm winter anestrus. 85% mares undergoing treatment maintained reproductive activity, while 80% of Control mares showed winter anestrus. There were changes in lenght of cycles, due to endogenous, nutritional and environmental factors. Results demonstrate that the treatment was effective to attain ovulatory cycles during winter months.

O presente experimento verificou se o fotoperíodo artificial iniciado no verão retarda o início da transição outonal e nos casos de ocorrência do anestro determinar sua forma de início. Foram utilizadas no experimento 13 éguas com idades variando entre 4 e 10 anos. Todas as éguas no início do experimento encontravam-se ciclando, com presença de corpo lúteo funcional ou folículo dominante. Antes do início do experimento os animais foram divididos em dois grupos, Grupo Luz (GL) com 08 animais e Grupo Controle (GC) com 05 animais, buscando equilibrar a idade e a condição corporal das éguas nos diferentes grupos. A partir do dia 23 de fevereiro de 2006 as éguas do GL foram submetidas a um fotoperíodo artificial de 15 horas de luz e de 9 horas de escuridão, e as éguas do GC foram mantidas sob fotoperíodo natural. Em relação ao início do anestro e à condição corporal não foram observadas diferenças entre o GL e o GC. Dentre os 13 animais utilizados no experimento todos entraram em anestro. Não se observaram diferenças entre os dois grupos de tratamento em relação ao número de dias entre o início do tratamento e a última ovulação e os inícios do tratamento e do anestro, bem como entre o número de dias de duração do último corpo lúteo. Entretanto observou-se diferença no grupo luz onde 75% das éguas apresentaram diestro prolongado enquanto que no grupo controle isto ocorreu em somente 40% das éguas. O anestro inicia por persistência lútea seguida de inatividade folicular ou por inatividade folicular após um diestro regular. O fotoperíodo artificial iniciado a partir da segunda metade do verão não impediu o início do anestro. Entretanto, a maioria das éguas submetidas ao fotoperíodo artificial iniciou o anestro após uma persitência lútea. / The present study aimed to verify if the artificial photoperiod started during summer retards the beginning of autumn transition and if anestrus occurs, to determine the way it begins. There were used 13 mares with ages varying between 4 and 10 years. All the mares were cycling in the beginning of the study, having either a functional corpus luteum or a dominant follicle. Before starting the experiment, the animals were divided in two groups: Light Group (LG) with 08 animals and Control Group (CG) with 05 animals, trying to equilibrate age and body condition of the different group mares. After February 23rd, 2006, the mares of LG were submitted to artificial photoperiod of 15 hours light and 9 hours dark, and the mares of CG were kept under natural photoperiod. Concerning the beginning of anestrus and body condition, no differences were observed between LG and CG. Among the 13 animals used in the study, all entered anestrus period. No differences were observed between the treatment groups about the number of days between the beginning of the treatment and the last ovulation, and the beginning of treatments and anestrus, as well as the number of days of duration of the last corpus luteum. However, differences were found in the light group, where 75% of the mares presented a prolonged diestrus while in the control group it only happened in 40% of the mares. The anestrus begins by luteal persistency followed by follicular inactivity or by follicular inactivity after a regular diestrus. The artificial photoperiod initiated after the second half of the summer did not affect the beginning of the anestrus. However, most of the mares submitted to artificial photoperiod initiated anestrus after a luteal persistency.

O sistema circadiano das aves é composto pela retina, a região homóloga aos núcleos supraquiasmáticos de mamíferos (NSQ) e a glândula pineal. A retina apresenta muitos eventos fisiológicos rítmicos, como por exemplo os movimentos das células fotorreceptoras em vertebrados não mamíferos, a expressão de opsinas, regeneração do cromóforo visual e produção e liberação de melatonina e dopamina. Todos estes eventos rítmicos são coordenados para prever alterações nas condições luminosas que ocorrem durante o dia, otimizando a função retiniana. Neste trabalho foi investigada a expressão de componentes chave de um sistema circadiano, incluindo os dois genes de melanopsina, Opn4x e Opn4m, os genes de relógio Clock e Per2, e os genes das enzimas chave da síntese de melatonina, N-Acetiltransferase, e de dopamina, Tirosina Hidroxilase, em células da retina de embriões de galinha. Culturas primárias de retina de embriões de galinha com 8 dias foram preparadas no ZT0 (quando as luz é acesa) e semeadas na densidade de 107 células por frasco de 25 cm2 . As células foram mantidas em ambiente úmido, com 5% CO2, a 40o C, em escuro constante, fotoperíodo 12C:12E, fotoperíodo 12C:12E seguido de escuro constante, ou em escuro constante na presença e na ausência de glutamato 100 μM por 12 h. A extração de RNA total foi feita ao longo de 24 horas com intervalo de três horas tendo início no ZT0 do sexto dia. As amostras foram submetidas a RT-PCR seguido de PCR quantitativo para a quantificação de RNAm. Para confirmar a expressão da proteína OPN4x foi realizado ensaio imunohistoquímico com anticorpos anti-melanopsina de galinha desenvolvidos em coelho. Também foi feita a quantificação da concentração das proteínas OPN4x, CLOCK e TIROSINA HIDROXILASE através da técnica de Western Blot. A quantificação do RNAm em escuro constante não apresentou ritmos de transcrição para nenhum gene. Já as células mantidas em fotoperíodo 12C:12E apresentaram padrões rítmicos de transcrição para Clock, Per2, Opn4m, N-Acetiltransferase e Tirosina Hidroxilase. Glutamato 100 μM foi eficaz em induzir ritmo em Clock, e inibiu drasticamente a expressão de Tirosina Hidroxilase e, apenas mais pontualmente, de Opn4x e Opn4m. Ensaios de viabilidade celular e fragmentação de DNA por citometria de fluxo demonstraram que essa inibição não foi resultante de ação tóxica ou apoptótica do glutamato. O neurotransmissor não teve qualquer efeito sobre a transcrição de Per2 e de N-Acetiltransferase. A quantificação protéica não indicou a presença de ritmo para CLOCK, OPN4x ou TIROSINA HIDROXILASE. A grande variabilidade inter-ensaios nos resultados de quantificação protéica sugere uma menor sensibilidade e precisão para esse método, quando comparado a PCR quantitativo. Nossos resultados indicam que as células de retina de embrião de 8 dias de galinha em cultura já contêm um relógio funcional, porém, este necessita do ciclo claro-escuro ou glutamato para sua sincronização. / The avian circadian system is composed by the retina, the mammalian homolog region of the supra-chiasmatic nucleus (SNC) and the pineal gland. The retina itself shows many rhythmic physiological events, such as movements of photoreceptor cells, opsin expression, retinaldehyde re-isomerization, melatonin and dopamine production and release. Altogether these rhythmic events are coordinated to predict environmental changes in light conditions during the day, optimizing retina function. In this work we investigated the expression of key components of a circadian system, including the two melanopsin genes, Opn4x, Opn4m, as well as the Clock, Per2, N-Acetyltransferase and Tyrosine Hidroxylase genes in chick embryo retinal cells. Primary cultures of chicken retina from 8-day-old embryos were prepared at ZT0 (lights on) and seeded at the density of 107 cells per 25 cm2 culture flask. The cells were kept in a humidified incubator in a 5% CO2 atmosphere at 40o C in constant dark, in 12L:12D, in 12L:12D followed by constant dark, or in constant dark in the absence or presence of 100 μM glutamate for 12 h starting at ZT0 of the fifth day in vitro. Total RNA extraction was performed along 24 hours every three hours starting at ZT0 of the sixth day. The samples were submitted to RT-PCR followed by quantitative PCR for mRNA quantification. To analyze the Opn4x expression in these cells we performed an immunocytochemistry analysis with antibodies anti-chicken melanopsin developed in rabbit. We also quantified the protein levels of OPN4x, CLOCK AND TYROSINE HYDROXYLASE by Western Blot. The mRNA quantification showed no rhythm of transcription for any gene in cells kept in constant dark. However under a light-dark cycle, Clock, Per2, Opn4m, N-Acetyltransferase and Tyrosine Hydroxylase presented rhythm patterns of transcription. 100 μM glutamate was able to induce rhythmic expression of Clock, and strongly inhibited the expression of Tyrosine Hydroxylase and, just punctually, of Opn4x and Opn4m. Assays of cell viability and DNA fragmentation using flow cytometry demonstrated that the inhibition did not result of glutamate toxic or apoptotic actions. The neurotransmitter had no effect on Per2 and N-Acetyltransferase transcription. Protein quantification by Western Blot showed no rhythmic oscillation of CLOCK, OPN4x or TYROSINE HYDROXYLASE. The great variability inter-assays seen in the results of protein quantification suggests that this method is less precise and sensitive than quantitative PCR. The present data show evidences that chicken embryonic retinal cells contain a functional circadian Clock. However light-dark cycle or glutamate stimuli are needed to its synchronization.

Muitos vertebrados ectotérmicos ajustam suas cores corporais para serem confundidos com o ambiente, através da migração de pigmentos no interior de cromatóforos, regulada por sistemas neurais e/ou hormonais. Essas mudanças de coloração auxiliam no mimetismo, termorregulação, comunicação social e expressão de comportamentos como excitação sexual, agressividade e medo. Entretanto, cromatóforos de inúmeras espécies respondem diretamente à luz. Estudos sobre a resposta à luz nos melanóforos de Xenopus laevis levaram à descoberta do fotopigmento melanopsina, uma opsina que está presente na retina de todos os grupos de vertebrados, inclusive no homem. Vários hormônios podem regular o processo de mudança de cor nos vertebrados, dentre eles a melatonina, hormônio secretado pela glândula pineal. Este é o principal órgão responsável pela integração do sistema neuroendócrino dos vertebrados ao meio ambiente, traduzindo direta ou indiretamente a informação do fotoperíodo em sinal hormonal, coordenando assim os ritmos fisiológicos circadianos com o meio ambiente. Os objetivos deste trabalho foram: investigar se a expressão gênica das melanopsinas e do receptor de melatonina em melanóforos de Xenopus laevis apresenta variação temporal sob diferentes condições luminosas; verificar se a expressão gênica das melanopsinas e do receptor de melatonina em melanóforos de Xenopus laevis pode ser modulada por melatonina. Dados do trabalho demonstram que as melanopsinas em melanóforos de Xenopus laevis são sincronizadas aos ciclos de claro-escuro, expressando um robusto ritmo ultradiano com período de 16h para Opn4m e um ritmo circadiano com período de 25h para Opn4x. Curiosamente, essa ritmicidade só foi observada quando os melanóforos foram mantidos em ciclos 12C:12E e foram submetidos à troca de meio durante a fase clara do fotoperíodo. A constância na expressão gênica do receptor de melatonina Mel1, quer sob diferentes regimes de luz, quer sob tratamento por melatonina, sugere que esse gene é extremamente estável, não sofrendo alterações ao ser submetido a estímulos exógenos, podendo ser considerado um gene constitutivo. O tratamento com melatonina por 6h na fase clara do fotoperíodo, além de inibir drasticamente a expressão de Opn4x e Opn4m, aboliu a ritimicidade de ambas as melanopsinas. Nossos resultados indicam que os melanóforos de Xenopus laevis possuem um relógio funcional e podem ser caracterizados como relógios periféricos, porém necessitam do ciclo claro-escuro associado à troca de meio para exibirem sua sincronização. / Many ectothermic vertebrates adjust their body color to mimic the environment, through the pigment migration within chromatophores, regulated by neural and / or hormonal systems. These changes in color help in camouflage, thermoregulation, social communication and behaviors such as sexual arousal, agressiveness and fear. However, chromatophores of several species respond directly to light. Studies about light response in melanophores of Xenopus laevis have led to the discovery of the photopigment melanopsin, an opsin that is present in the retina of all vertebrate groups, including man. Various hormones may regulate the process of color change in vertebrates, among them melatonin, hormone secreted by the pineal gland. This is the main organ responsible for the integration of the neuroendocrine system of vertebrates to the environment, translating directly or indirectly the photoperiod information into hormonal signal, thus coordinating physiological circadian rhythms with the environment. The objectives of this work were: to investigate whether the gene expression of melanopsins and melatonin receptor in melanophores of Xenopus laevis exhibited temporal variation under different light conditions; to verify whether gene expression of melanopsins and melatonin receptor in melanophores of Xenopus laevis could be modulated by melatonin. Our data show that melanopsins in melanophores of Xenopus laevis are synchronized to light-dark cycles, expressing a robust ultradian rhythm with a period of 16h for Opn4m and circadian rhythm with a period of 25h for Opn4x. Interestingly, the rhythm was only observed when the melanophores were maintained in 12L: 12D regime and medium change was performed during the fotophase of photoperiod. The constancy in the expression of melatonin receptor Mel1c, either under different light regimes, or under treatment by melatonin, suggesting that this gene is extremely stable, not being altered by exogenous stimulus, and may be considered a constitutive gene. Treatment with melatonin for 6h during the fotophase of the photoperiod, drastically inhibit the expression of Opn4x and Opn4m, and abolished the rhythm of both melanopsins. Our results indicate that melanophores of Xenopus laevis possess a functional clock and can be characterized as peripheral clocks, but they need the light-dark cycle associated with change of medium to exhibit their synchronization.

Os relógios biológicos são fundamentais para a sincronização do comportamento dos organismos a mudanças no fotoperíodo. Todas as alterações rítmicas são determinantes para a sobrevivência da espécie uma vez que elas prevêem que os ajustes internos coincidam com a fase mais propícia do ciclo ambiental, permitindo aos organismos a capacidade de sincronizar esses eventos internos com os ciclos ambientais. Muitos desses ritmos biológicos são claramente associados ao ciclo claro-escuro, sendo este ciclo de grande importância para as espécies que possuem algum tipo de pigmento fotossensível. Os melanóforos de Xenopus laevis são fotossensíveis, respondendo à luz com dispersão dos grânulos de melanina, devido à presença de duas melanopsinas, Opn4x e Opn4m. As células pigmentares dos vertebrados heterotérmicos respondem com migração pigmentar a uma variedade de agentes, incluindo as endotelinas. Em peixes teleósteos, ETs induzem a agregação pigmentar em melanóforos, enquanto que em anfíbios, ET-3 induz a dispersão de grânulos de pigmentos em melanóforos de Xenopus laevis e de Rana catesbeiana, através da ativação de receptores ETc. Propusemos determinar o padrão temporal de expressão dos genes das melanopsinas e do receptor ETc em melanóforos dérmicos de X. laevis em cultura, bem como os efeitos temporais e dose- dependentes da endotelina sobre essa expressão. Demonstramos, através de ensaios de PCR quantitativo, que o tratamento de 12C:12E , somado a uma troca de meio, assim como o de endotelina-3 10-9 e 10-8M em escuro constante, foi capaz de sincronizar a expressão de Opn4x e Opn4m. Entretanto, o receptor ETc parece não ser sincronizado pelo ciclo claro-escuro, ou pelo tratamento hormonal. Dependendo da dose utilizada e do ZT analisado, ET-3 pode promover um aumento ou inibição da expressão gênica de Opn4x, Opn4m e ETc, indicando uma modulação de forma dose-dependente. Além disso, pode atuar como um agente sincronizador da expressão dos transcritos das melanopsinas. / The biological clocks are critical for synchronizing the behavior of organisms to changes in photoperiod. All rhythmic changes are crucial to the survival of the species since they provide for internal adjustments to coincide with the phase of the cycle most favorable. Many of these biological rhythms are clearly associated with the light-dark cycle, of major importance for species that have some type of photosensitive pigment. Melanophores of Xenopus laevis are photosensitive, responding to light with dispersion of melanin granules, due to the presence of two melanopsins, Opn4x and Opn4m. The pigment cells of ectothermic vertebrates respond with pigment migration to a variety of agents including the endothelins. In teleost fish, ETs induce pigment aggregation in melanophores, whereas in amphibians, ET-3 induces the dispersion of pigment granules in melanophores of Xenopus laevis and Rana catesbeiana, by activation of ETc. We proposed to determine the temporal pattern of gene expression of the ETc receptor and melanopsins in dermal melanophores of X. laevis in culture as well as the effects of endothelin-3 on the temporal expression of the 3 genes. Using quantitative PCR, we demonstrated that 12L: 12D regimen, combined with medium changes, as well as the treatment with 10-9 and 10-8M endothelin-3, was able to synchronize the expression of Opn4x and Opn4m. However, ETc receptor seems not to be synchronized by light-dark cycle, or hormone treatment. Depending on the dose and the ZT, ET-3 may promote an increase or inhibition of gene expression of Opn4x, Opn4m and ETc, indicating a dose-dependent modulatory effect. In addition, endothelin-3 may also act as a synchronizing agent of the melanopsins transcripts.

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