Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / Facteur de transcription Ikaros / La rétine constitue un modèle très intéressant pour l'étude du développement du système nerveux. Elle origine de cellules neuroépithéliales qui se diviseront et se différencieront pour donner naissance à 6 différents types de neurones et un type de cellule gliale. Au cours du développement, la majorité des cellules progénitrices de la rétine (CPRs) sont multipotentes et quelques unes ont même le potentiel de générer tous les différents types cellulaires de la rétine. Cependant, à des stades plus tardifs, les CPRs perdent alors la compétence qui leur permet de générer les cellules dites précoces et acquièrent la capacité de générer les cellules dites tardives. Il est clair que l'ensemble des types cellulaires est produit dans un ordre bien précis et concomitant, mais les mécanismes moléculaires par lesquels les CPRs changent leur compétence au cours du temps pour générer chaque type de cellule au bon moment restent toutefois inconnus. Le facteur de transcription Ikaros avait été largement étudié dans le système hématopoïétique, cependant son rôle potentiel au niveau du système nerveux n'avait que très peu été exploré. Dans cette étude nous avons investigué l'hypothèse qu'Ikaros puisse contrôler la compétence temporelle des CPRs. Nous avons premièrement observé qu'Ikaros est exprimé dans les CPRs au début du développement tandis qu'à des stades plus avancés son expression devient alors restreinte à une sous-population pour finalement être absente dans l'ensemble des CPRs aux derniers stades du développement de la rétine. De plus, chez la rétine adulte, Ikaros est exprimé dans les neurones différenciés de type précoce. En effectuant une analyse clonale à l'aide de rétrovirus, nous avons montré qu'en induisant l'expression d'Ikaros dans les CPRs à des stades tardifs, où il n'est normalement pas exprimé, il est possible d'induire la production de cellules de type précoce au dépend des cellules produites tardivement. De plus, l'analyse de souris dont le gène Ikaros à été inactivé nous a révélé que plusieurs cellules nées précocement au cours du développement sont manquantes. L'ensemble de ces résultats suggère donc un modèle dans lequel l'expression d'Ikaros est à la fois nécessaire et suffisante pour conférer une compétente temporelle précoce au CPRs. Une fois la diversité cellulaire générée, des vagues d'apoptoses successives ont lieu de manière à éliminer les cellules extranuméraires ou corriger les erreurs de connections. La mort cellulaire programmée ou apoptose est donc un procédé essentiel au développement du système nerveux. Cependant, les régulateurs extracellulaires de cette mort cellulaire developpementale restent toutefois très méconnus. Dans cette thèse, nous avons étudié le rôle de la voie de signalisation du CNTF/LIF durant le développement rétinien in vivo. Nous démontrons que l'exposition au CNTF durant le développement postnatal de la rétine in vivo retarde l'expression de la rhodopsine et résulte en un important déficit spécifique en photorécepteurs. Plus spécifiquement, nous montrons que l'exposition au CNTF induit une augmentation importante de la mort cellulaire des précurseurs postmitotiques des photorécepteurs bâtonnets. De plus, nous montrons que le blocage de la voie du CNTF/LIF durant le développement de la rétine de souris in vivo résulte en une diminution significative de la mort cellulaire developpementale des photorécepteurs. Nous démontrons aussi que la voie CNTF/LIF est responsable de l'apoptose spécifique des photorécepteurs issuent de clones contenant seulement des photorécepteurs sans toutefois affecter les photorécepteurs issuent de clones mixtes. Nous avons observé que la stimulation ou le blocage de la voie du CNTF/LIF contrôle l'expression génique des isoformes neuronale et endotheliale de la synthase d'oxide nitrique (NOS) et la production subséquente d'oxide nitrique (NO) à partir de ces enzymes est responsable de l'apoptose induite par CNTF . Ces résultats suggèrent donc que la voie de signalisation du CNTF/LIF est active au cours du dévelopement rétinien et agit via la régulation de la production d'oxide nitrique afin de moduler la mort cellulaire programmée des précurseurs postmitotiques des photorécepteurs bâtonnets.

La Dégénérescence Maculaire Liée à l’Age (DMLA) est la première cause de cécité légale dans les pays industrialisés chez les personnes âgées. L’atrophie géographique – l’une des formes tardives de la DMLA - est caractérisée par la perte de l’épithélium pigmentaire et la dégénérescence des photorécepteurs. Nous groupe a montré précédemment que dans l’atrophie géographique, les phagocytes mononucléés (PMs) s’accumulent dans l’espace sous-rétinien, et induisent la dégénérescence rétinienne via la production d’IL-1β. Dans un premier temps, nous montrons que la présence de PMs sous-rétiniens est associée à la perte des bâtonnets et la dégénérescence des segments de cônes dans la zone de transition de patients atrophiques. Nous montrons ensuite dans différents modèles in vivo et ex vivo que les macrophages récapitulent ces effets, et qu’IL-1β est nécessaire à la perte des segments externes des cônes induite par les PMs. Dans un deuxième temps, nos résultats montrent qu’IL-1β induit indirectement la mort des bâtonnets, en perturbant l’homéostasie rétinienne du glutamate. L’inhibition des récepteurs glutamatergiques pour prévenir l’excitotoxicité du glutamate, ou la supplémentation en cystine favorisant la restauration de la machinerie neuronale antioxydante, permettent de protéger les bâtonnets de la toxicité induite par IL-1β. L’ensemble de nos résultats démontre le rôle joué par IL-1β dans la dégénérescence des segments de cônes et la perte des bâtonnets dans l’inflammation sous-rétinienne. Cette étude permettra la mise au point de thérapies innovantes, afin de lutter contre la forme atrophique de la DMLA, pour laquelle il n’existe actuellement aucun traitement. / In geographic atrophy (GA), one of the late forms of Age-related Macular Degeneration (AMD), an extending atrophic zone forms, characterized by the loss of retinal pigment epithelium and photoreceptor degeneration. Subretinal mononuclear phagocytes (MPs) accumulate in GA, and are associated with IL-1β-dependent retinal degeneration. First, we confirmed that subretinal accumulation of MPs is associated with rod degeneration and cone segment loss in the transitional zone in GA human samples. Using ex vivo and in vivo models, we then demonstrated that MPs-derived IL-1β leads to severe cone segment degeneration. Therefore, inhibiting subretinal MP accumulation or IL-1β might protect the cone segment, and help preserve high acuity daytime vision in conditions characterized by subretinal inflammation. Second, we showed that IL-1β effect on rod degeneration is indirect, and mediated by glutamate. Our results indicate that IL-1β impairs Müller glial cells glutamate recycling, and subsequently leads to the extracellular increase in glutamate content. Inhibiting glutamate receptors to prevent excitotoxicity, or exogenous cystine supplementation to supply antioxidant metabolism, are sufficient to protect rods from IL-1β-induced neurotoxicity. Our results provide new perspectives to treat pathologies associated with subretinal inflammation such as late AMD. Our results collectively demonstrated that MP-derived IL-1β induces cone segment loss, and glutamate homeostasis disruption associated with rod degeneration. This study will help with the development of new therapeutic strategies in dealing with inflammatory retinal pathologies as geographic atrophy.

La rétine est constituée de plusieurs types de neurones incluant les cellules amacrines, ganglionnaires, bipolaires et les photorécepteurs. Les photorécepteurs, qui englobent les cônes et les bâtonnets, sont des neurones sensoriels hautement spécialisés qui permettent la conversion de la lumière en signaux électriques par le mécanisme de phototransduction. Les mécanismes moléculaires par lesquels les progéniteurs rétiniens (RPCs) se différencient en différents neurones spécialisés comme les photorécepteurs sont encore peu connus. Le gène Polycomb Bmi1 appartient à la famille des gènes Polycomb qui forment des complexes multimériques impliqués dans la répression de l’expression génique via le remodelage de la chromatine. Au niveau biologique, le gène Bmi1 régule, entre autre, le contrôle de la prolifération cellulaire, le métabolisme des radicaux libres, et la réparation de l’ADN. Récemment, il a été démontré que Bmi1 joue un rôle critique dans la prolifération et l’auto-renouvellement d’un groupe de RPCs immatures. De plus, Bmi1 est essentiel au développement post-natal de la rétine. L'objectif de cette étude est d'analyser le rôle de Bmi1 dans le développement et la survie des photorécepteurs chez la souris. Nos résultats révèlent un phénotype de dégénérescence des photorécepteurs de types cônes chez notre modèle de souris déficiente pour Bmi1. Les bâtonnets sont insensibles à la mutation. De plus, Bmi1 est exprimé de façon prédominante dans les cônes. Nos expériences de culture de cellules rétiniennes suggèrent que le phénotype est cellule-autonome. Par ailleurs, la co-délétion du gène Chk2, membre de la réponse aux dommages à l'ADN, permet de ralentir la progression du phénotype. Les rétines Bmi1-/- et Bmi1-/-Chk2-/- présentent une augmentation importante des dommages oxydatifs à l'ADN. Ces résultats suggèrent que le stress oxydatif pourrait jouer un rôle important dans la survie des cônes. L'étude du rôle du gène Polycomb Bmi1 dans les photorécepteurs est importante pour une meilleure compréhension des mécanismes contribuant à la survie des cônes et pourrait mener à la découverte de nouveaux traitements des maladies dégénératives des cônes. / The retina is composed of several types of neurons such as amacrin, ganglion, bipolar and photoreceptor cells. Photoreceptors, which include cones and rods, are highly specialized neurons that convert light into electrical signals by phototransduction. The molecular mechanisms involved in differentiation of retinal progenitors (RPCs) into specialized neurons such as photoreceptors are poorly understood. The polycomb gene Bmi1 is a member of the Polycomb gene family that forms multimeric complexes involved in chromatin remodeling leading to gene repression. Biological functions of Bmi1 include regulation of cell proliferation, free radical metabolism, and DNA repair. Recently, it was shown that Bmi1 plays a critical role in the proliferation and self-renewal of a specific immature RPC group. Moreover Bmi1 is essential for post-natal retinal development. The objective of the current study is to analyze Bmi1 function in photoreceptor development and survival. Our results show that Bmi1 deficiency in mice causes degeneration of cone photoreceptors, but not of rods. Furthermore, Bmi1 is predominantly expressed in cones. Experiments using primary retinal cell cultures suggest a cell-autonomous phenotype. In addition, codeletion of Bmi1 and the critical DNA damage response protein Chk2 resulted in partial rescue and slow-down of cone degeneration. Bmi1-/- and Bmi1-/-Chk2-/- retinas also exhibit an important increase in oxidative DNA damage, suggesting that cellular redox state could play an important role in cone survival. Our studies on the role of Bmi1 in photoreceptors elucidate the mechanisms contributing to cone survival, and could lead to the development of new treatments for cone degenerative diseases.

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La leucine zipper de la rétine neurale (Nrl) joue un rôle central dans le développement et l'homéostasie des bâtonnets en activant I'expression de gènes tels que le photopigment Rhodopsine. Nrl est aussi associé à la Rétinite Pigmentaire, faisant ainsi de ce gène un modèle intéressant pour la compréhension des programmes contrôlant le développement et I'homéostasie des photorécepteurs.Ce travail de thèse vise à caractériser les mécanismes régulateurs de I'expression de Nr/ au cours du développement rétinien. L'électroporation in vivo de vecteurs rapporteurs dans des rétines de souris en développement, a révélé des séquences minimales de promoteur Nr/ nécessaires à une expression spécifique dans les photorécepteurs. Nous avons identifié RORI3 comme facteur requis pour cette expression, et montré que les facteurs OTX2, CRX et CREB s'accrochent aussi directement à des régions régulatrices particulières du promoteur. Nous avons construit un virus adéno-associé (AAV) contenant un promoteur minimal Nrl de 0.3 kb, et montré qu'il est adapté à la délivrance de gène spécifiquement dans les photorécepteurs.Nous avons montré que NRL, CRX et NR2E3, les régulateurs principaux de la Rhodopsine, ont une expression rythmique au cours de 24 h, et que l'expression cyclique de Nr/ peut être due à l'activation par RORp, un composant l'horloge circadienne. Enfin, nous avons identifié un nouveau facteur de transcription, NonO, au niveau de la région du promoteur proximal de la Rhodopsine, qui en combinaison avec NRL et CRX, active le promoteur de la Rhodopsine. L'invalidation de NonO au cours du développement rétinien a prouvé son implication pour le développement et I'homéostasie des bâtonnets. / The Neural Retina Leucine zipper transcription factor (Nrl) plays a central role in rod photoreceptor development and homeostasis, by activating the expression of rod-specific genes such as the visual photopigment, Rhodopsin. Nrlhave been also associated with Retinitis Pigmentosa, making this gene an interesting model for understanding genetic programs controlling photoreceptors development and homeostasis.This thesis work aimed at characterizing regulatory mechanisms of Nr/ expression during retinal development. Using in vivo electroporation of reporter vectors carrying distinct portions of Nrlpromoter into neonatal mouse retina, we identified minimal sequences required for expression photoreceptors-specific expression. We identified RORI3 as being required for this expression and showed that OTX2, CRX and CREB transcription factors also directly bind to the defined regulatory regions.We designed a novel adeno-associated virus (AAV) vector containing a minimal Nrl promoter fragment of 0.3 kb, and showed that it is well-suited for gene delivery specifically into photoreceptors.We also showed that NRL, CRX, and NR2E3, the main transcriptional regulators of Rhodopsin, display rhythmic expression over 24 h. and that Nrl might undergo cyclic activation by RORB which is part of the photoreceptor circadian clock. Finally, we investigated the role of a novel Rhodopsin transcriptional regulator, NonO, identified in theRhodopsin proximal promoter region. We demonstrated that NonO co-activates Rhodopsin promoter along with NRL and CRX. By knocking down this gene during retinal development we provided evidence for its role in rod development and homeostasis.

La rétinopathie diabétique est une cause majeure de cécité et de malvoyance qui affecte jusqu'à 90% des patients atteints de diabète. Le Maroc n’échappe pas à cette pathologie, qui est connue pour altérer le fonctionnement du système visuel et pourrait conduire également à des désordres chronobiologiques, aussi bien chez l’Homme que chez des modèles animaux. Ces altérations pourraient être liées aux dégénérescences neuronales des systèmes de photoréception classique (cône et bâtonnet) et des cellules ganglionnaires à mélanopsine, impliqués dans la régulation et l’entraînement par la lumière du système circadien. Cependant, à l’heure actuelle, peu d’études ont analysé précisément l’impact de la rétinopathie diabétique sur le système circadien. L’objectif de notre travail est d’analyser au cours de la rétinopathie diabétique (1) l’atteinte des cônes, des bâtonnets et des cellules ganglionnaires à mélanopsine, (2) le fonctionnement endogène moléculaire et la réponse à la lumière des horloges centrale et rétinienne et (3) la réponse comportementale du système circadien à la lumière. Notre stratégie est basée sur l’utilisation d’un modèle murin, chez lequel le diabète est induit expérimentalement par l’administration d’un agent chimique la streptozotocine (STZ), toxique pour les cellules β pancréatiques. Des approches morphométriques, moléculaires et comportementales ont été utilisées. Nos résultats montrent que le diabète induit des changements morphologiques des cellules ganglionnaires à mélanopsine tels que des gonflements des somas et des varicosités au niveau des dendrites avec une préservation du nombre total de ces cellules. Ceci est associé à une diminution de l’induction par la lumière du gène c-fos et des gènes de l’horloge Per1 et Per2 au niveau du SCN et à l’absence de cette induction au niveau rétinien au stade 12 semaines après l’induction du diabète. La machinerie moléculaire des horloges rétinienne et centrale évaluée par l’analyse de l’expression circadienne des gènes de l’horloge et des gènes contrôlés par les gènes de l’horloge montre que certains gènes de l’horloge clés pour chaque tissu sont altérés. A l’échelle comportementale, les souris STZ (souris diabétiques) montrent une réduction de l’amplitude du rythme de leur activité locomotrice totale et une diminution de la sensibilité à la lumière aux faibles intensités. Après une avance de phase du cycle 12L/12D, ces animaux présentent également une diminution de la vitesse de resynchronisation au nouveau cycle lumineux imposé par rapport aux animaux témoins. Ces nouvelles données montrent que le diabète de type 1 altère les réponses du système circadien à la lumière d’un point de vue moléculaire et comportemental et suggèrent que les patients diabétiques peuvent présenter des troubles circadiens particulièrement lorsqu’ils sont soumis aux challenges chronobiologiques / Diabetic retinopathy is a major cause of blindness and is commonly viewed as a vascular complication of type 1 diabetes. However, this kind of diabetes causes visual dysfunction before the onset of clinically visible microvascular changes, associated with diabetic retinopathy. Several histopathological studies in diabetic patients and in chemically-induced or genetic rodent models of diabetes indicate that photoreceptors and retinal ganglion cells (RGCs) are affected by diabetes with apoptotic degeneration. There is increasing evidence that melanopsin-expressing ganglion cells that are crucial for the regulation of a range of non-visual functions including the photic synchronization of circadian rhythms are altered in retinal pathologies. The link between diabetes and circadian rhythms has only been addressed in a relatively limited number of studies. Using a streptozotocin-induced (STZ) model of diabetes, we investigated the impact of diabetic retinopathy on non-visual functions by analyzing the morphology of melanopsin ganglion cells and light-induced c-fos and Period 1-2 clock genes in the central (SCN) and the retina clocks. The effect of this pathology on the endogenous circadian function of clock and controlled clock genes was assessed in the SCN and the retina at 12 weeks post-diabetes. Behaviorally, the ability of STZdiabetic mice to entrain to light was challenged by the exposure of animals to 1) successive light/dark (LD) cycle of decreasing or increasing light intensities during the light phase and 2) 6-hr advance of the LD cycle. Our results show that diabetes induces morphological changes of melanopsin-expressing ganglion cells including soma swelling and dendritic varicosities with no reduction in their total number, associated with decreased c-fos and clock genes induction by light in the SCN and also in the retina at 12 weeks post-onset of diabetes. In addition, the circadian expression of major clock genes was altered in the central and retinal clocks, suggesting that RD affects the endogenous molecular machinery and the light response of these two clocks. Moreover, STZ-diabetic mice exhibited a reduction of overall locomotor activity, a decrease of circadian sensitivity to light at low intensities, and a delay in the time to re-entrain after a phase advance of the LD cycle. These novel findings demonstrate that diabetes alters clock genes and behavioral responses of the circadian timing system to light and suggest that diabetic patients may show an increased propensity for circadian disturbances, in particular when they are exposed to chronobiological challenges

La vision est considérée comme un des sens les plus importants, prenant en charge environ 80% des perceptions que nous recevons dans notre vie quotidienne. Les photorécepteurs de type cônes sont responsables de la vision centrale de haute résolution et en couleurs, et leur dégénérescence est souvent la cause de la perte de vision dans les maladies dégénératives rétiniennes (RDs). Les RDs sont un groupe hétérogène de maladies affectant des millions de personnes dans le monde, qui pour le moment sont pour la plupart sans aucune option thérapeutique. Les modèles animaux sont extrêmement utiles pour étudier le développement ou la dégénérescence de la rétine, ainsi que pour comprendre les mécanismes moléculaires des maladies génétiques héréditaires affectant les photorécepteurs. La modélisation des maladies dégénératives et du développement peut être particulièrement difficile, spécialement dans le cas de maladies humaines rares et complexes pour lesquelles aucun modèle animal exhaustif n'est disponible. De nos jours, la génération et le maintien de modèles de maladies humaines permettant une analyse approfondie du mécanisme moléculaire représente un grand défis . La technologie des cellules souches possède un grand potentiel dans la modélisation des maladies et représente un outil puissant pour générer des modèles évolutifs, sans l’utilisation d’animaux qui peuvent illustrer plus précisément les phénotypes cliniques de maladies humaines complexes. Nous avons développé un protocole pour différencier les cellules souches pluripotentes (PSCs) en feuillets rétiniens (RSs), qui sont des tissus polarisés et multicouches contenant des photorécepteurs cône et exprimant les marqueurs spécifiques du segment externe (OS), du cilium connecteur (CC) et du noyau. En utilisant à la fois des modèles de souris et des modèles humanisés à base de cellules souches, nous avons étudié le rôle de BMI1 dans les photorécepteurs matures. La protéine du groupe Polycomb Bmi1 est connue pour ses fonctions neuroprotectrices en contrôlant la sénescence et l'apoptose, et est exprimée à la fois dans le progéniteur rétinien et les neurones, mais on en sait peu sur son rôle spécifique dans la rétine adulte. Elle a été récemment associée à des troubles neurodégénératifs d'apparition tardive, et elle pourrait avoir un rôle dans la pathologie des RDs d'apparition tardive, comme la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA). Nous avons montré que les photorécepteurs cône et les neurones bipolaires sont générés normalement mais subissent ensuite une dégénérescence rapide chez les souris Bmi1-/- par nécroptose associée à Rip3. La dégénérescence était associée à des anomalies de compactage de la chromatine, à l'activation des répétitions en tandem et au stress oxydatif. De plus, nous montrons que BMI1 est préférentiellement exprimé dans les cônes au niveau des foyers hétérochromatiques dans la rétine humaine. Son inactivation dans les cellules souches embryonnaires humaines (hESCs) a altéré la différenciation terminale du cône et a entraîné des anomalies de compactage de la chromatine, l'activation des répétitions en tandem et l'induction de P53. Ces résultats fournissent un mécanisme expliquant comment une carence en Bmi1 conduit à la dégénérescence des cônes et révèlent des fonctions biologiques conservées et des différences pour Bmi1 dans la biologie des photorécepteurs entre la souris et l'homme. En utilisant un modèle humain basé sur les cellules souches pluripotentes induites (iPSCs), nous avons ensuite étudié le processus dégénératif chez les patients atteints de ciliopathies, un groupe de maladies génétiques hétérogènes affectant les protéines impliquées dans la structure et la fonction du cil primaire, qui sont fréquemment accompagnée d'une dégénérescence rétinienne. Nous générons des feuillets rétiniens dérivés d'iPSCs à partir de patients atteints de deux ciliopathies, les syndromes de Meckel-Gruber (MKS) et de Bardet-Biedl (BBS). Les photorécepteurs ciliopathiques présentaient des altérations communes significatives dans l'expression de centaines de gènes de développement. De plus, ils ont montré plusieurs anomalies dans la formation et le maintien du cilium interne, le positionnement du centriole mère, l'activation d'une réponse au stress aux protéines mal repliées, instabilités génomiques et l'accumulation de dommages à l'ADN. Cette étude révèle comment la combinaison des technologies de reprogrammation cellulaire et d'organogenèse avec le séquençage de nouvelle génération permet d'élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans les troubles dégénératifs et développementaux de la rétine humaine. La même approche, combinant la différenciation en RSs avec des techniques de séquençage du génome à large spectre, pourrait être appliquée pour modéliser de nombreuses maladies génétiques, développementales et dégénératives affectant les photorécepteurs. Il peut également aider à élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents à ces maladies, au criblage de médicaments de composés ayant des effets thérapeutiques potentiels et à prédire les effets secondaires des médicaments. / Vision is considered the most important sense, taking on about 80% of the perceptions we receive in our everyday life. Cone-photoreceptors are responsible for high-resolution central vision and color discrimination, and their degeneration is frequently the cause of vision loss in retinal degenerative diseases (RDs). RDs are a heterogeneous group of diseases affecting millions of people worldwide, which at the moment are mostly without any therapeutic option. Animal models are extremely useful in studying the retina's development or degeneration and understanding the molecular mechanisms in inherited genetic disease affecting photoreceptors. Modeling human developmental and degenerative diseases can be particularly challenging, especially in the case of rare and complex diseases where no exhaustive animal models are available. Generation of sustainable human disease models that allow in-depth analysis of the molecular mechanism is one of the big challenges nowadays. Stem cell technology holds great potential in disease modeling and represents a new powerful tool for generating scalable and animal-free models that can more accurately illustrate clinical phenotypes of complex human diseases. We developed a protocol to differentiate pluripotent stem cells (PSCs) into retinal sheets (RSs), which are polarized, multi-layered tissues containing cone photoreceptors and expressing outer segment (OS), connecting cilium (CC), and nuclear specific markers. Using both mouse and stem cells-based humanized models, we first investigate the role of BMI1 in mature photoreceptors. The Polycomb group protein Bmi1 is known for its neuroprotective functions by controlling senescence and apoptosis and is expressed in both retinal progenitor and neurons, but little is known about its specific role in the adult retina. It has been recently linked to late-onset neurodegenerative disorders, and it could have a role in the pathology of late-onset RDs, such as Age-related Macular Degeneration (AMD). We showed that cone photoreceptors and bipolar neurons are generated normally but then undergo rapid degeneration in Bmi1-/- mice through Rip3-associated necroptosis. Degeneration was associated with chromatin compaction anomalies, activation of tandem-repeats, and oxidative stress. Furthermore, we show that BMI1 is preferentially expressed in cones at heterochromatic foci in the human retina. Its inactivation in human embryonic stem cells (hESCs) impaired cone terminal differentiation and resulted in chromatin compaction anomalies, activation of tandem-repeats, and P53 induction. These findings provide a mechanism explaining how Bmi1 deficiency leads to cone degeneration and reveal conserved biological functions and differences for Bmi1 in photoreceptor biology between mouse and man. Using an induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) based human model, we then investigate the degenerative process in patients with ciliopathies, a group of heterogeneous genetic diseases affecting proteins involved in primary cilium structure and function frequently accompanied by retinal degeneration. We generate iPSC-derived retinal sheets from patients affected by two ciliopathies, Meckel-Gruber (MKS) and Bardet-Biedl syndromes (BBS). Ciliopathic photoreceptors displayed significant common alterations in the expression of hundreds of developmental genes. Moreover, they showed several anomalies in the formation and maintenance of cilia, the mother centriole's positioning, the activation of a stress response to misfolded proteins, genomic instabilities, and DNA damage accumulation. This study reveals how combining cell reprogramming and organogenesis technologies with next-generation sequencing enables the elucidation of molecular and cellular mechanisms involved in human retinal degenerative and developmental disorders. The same approach, combining photoreceptor sheet differentiation and wide-genome expression profile, could be applied to model many genetic, developmental, and degenerative diseases affecting photoreceptors. It may help elucidate the molecular mechanisms underlining these diseases, drug screening of compounds with potential therapeutic effects, and predict drug side effects.

Au cours de l’évolution, les plantes ont développé des mécanismes pour percevoir et s'adapter aux conditions de stress. Les formes actives de l'oxygène (FAO) sont des facteurs importants de l'état redox cellulaire et sont impliquées dans ces réponses. Le peroxyde d'hydrogène (H2O2), une FAO majeure des voies de signalisation oxydative, peut être produit rapidement dans la photorespiration. Chez Arabidopsis, le H2O2 produit dans la photorespiration est métabolisé notamment par la CATALASE2 (CAT2). Dans le contexte du mutant cat2 déficient pour cette catalase, les réponses au stress oxydatif induit par la production conditionnelle du H2O2 sont fortement dépendante de la photopériode. En particulier, la formation de lésions, accompagnée de réponses similaires à celles d' attaques pathogènes, sont spécifiques des conditions de culture en jours longs (JL). Ces effets ne sont pas observés en jours courts (JC) malgré un stress oxydant qui semble être aussi prononcé qu’en JL. Une approche transcriptomique globale a été utilisée pour explorer les patterns d’expression génique associées à ces effets. Elle a permis de mettre en évidence des interactions entre photopériode et H2O2 ou entre photopériode et CO2. En particulier, la majorité des gènes répondant à l' H2O2 dans le mutant cat2 sont induits lorsque les plantes sont cultivées en JC alors que un plus petit nombre sont induits par l’ H2O2 spécifiquement en JL. De façon générale, ces analyses ont mis en évidence des relations étroites entre les ressources carbonées, la lumière et l'état redox cellulaire dans les réponses aux changements environnementaux. Un gène induit par le H2O2 spécifiquement en JL, l’AZELAIC ACID INDUCED 1 (AZI1), a été sélectionné pour des analyses fonctionnelles à l’aide d’approches génétique, biochimique et transcriptomique. L’analyse de mutants cat2 azi1 a révélé que AZI1 ne semble pas jouer un rôle majeur dans les réponses des plantes à un stress oxydatif durable. Cependant, ce gène semble jouer un rôle important lorsque le stress oxydatif est déclenchée de façon abrupte par le transfert des plantes de conditions de culture en fort CO2 vers l'air ambiant. De plus, cette étude montre que la communication de feuille à feuille est impliquée dans la régulation de l'expansion de la mort cellulaire en réponse a l'H2O2 issue de la photorespiration. Dans la régulation de l'expansion des lésions, nous proposons que AZI1 agirait d'une part localement pour induire la mort cellulaire et d'autre en inhibant la mort cellulaire d'une façon systémique. Dans des fonds génétiques sauvage Col-0 ou mutant cat2, l’analyse comparative de mutants d'insertion ADN-T pour les principaux photochromes (phyA , phyB) et cryptochromes (cry1, cry2) a permis d'étudier les interactions entre les stress et les fonctions des photorécepteurs. Il est apparu que, la mutation des gènes PHY comme CRY conduit a une stimulation de l’accumulation de glutathion H2O2 dépendante. En revanche, dans le fond génétique cat2 contrairement à la perte des fonctions PHY, la mutation des gènes cry conduit a une modulation du profil transcritomique induit par l’ H2O2. De plus, un criblage de conditions de stress sur les simples mutants cry a révélé une plus forte sensibilité de ces génotypes au stress osmotique, a l’ H2O2 et au paraquat. Globalement, ces données indiquent que l’ensemble des photorécepteurs et plus particulièrement les cryptochromes peuvent jouer un rôle dans la réponse à l’ H2O2 intracellulaire suggérant ainsi l’existence d’un réseau complexe permettant l’intégration de conditions environnementales et la détermination de réponses appropriées au stress. / During evolution, plants have developed mechanisms to perceive and respond to stress conditions. Reactive oxygen species (ROS) are important components of cell redox state that have been implicated in these responses. H2O2, an important ROS molecule in oxidative signalling, can be produced rapidly in photorespiration. In Arabidopsis, photorespiratory H2O2 is notably metabolized by CATALASE2 (CAT2). Responses to oxidative stress induced conditionally by photorespiratory H2O2 in the catalase-deficient mutant, cat2, are highly determined by growth daylength. In particular, lesion formation, accompanied by induction of a range of pathogenesis responses, is specific to the long day (LD) photoperiod: these responses are not observed in short days (SD), even though oxidative stress seems to be as marked as in LD. A whole-genome transcriptomics approach was used to explore gene expression patterns underlying these effects, and identified interactions between daylength and H2O2 and between daylength and CO2. In particular, the majority of H2O2-responsive genes in cat2 were up-regulated more strongly in SD air, though a subset of H2O2-induced genes showed a LD-specific response. Overall, this analysis indicates close networking between carbon status, light, and redox state in environmental responses. The most strongly H2O2-induced gene in LD was azelaic acid induced 1 (AZI1) and this gene was chosen for functional analysis using a genetic, biochemical and transcript profiling approach. Analysis of cat2 azi1 mutants revealed that AZI1 does not seem to play an important role in the plant response to sustained, continuous oxidative stress, but is influential when oxidative stress is abruptly induced, in this case, by transferring plants from high CO2 to air. Moreover, this study provided evidence that leaf-to-leaf communication is involved in regulating cell death spread in response to photorespiratory H2O2. In the regulation of this lesion spread, it is proposed that AZI1 acts both locally to promote cell death as well as systemically to inhibit it. Using a comparative analysis of T-DNA insertion mutants for the major phytochromes (phyA, phyB) and cryptochromes (cry1, cry2) introduced into the Col-0 or cat2 background, interactions between stress and photoreceptor function were analyzed. A stimulatory effect of both phy and cry mutations on H2O2-triggered glutathione accumulation was apparent. In contrast to loss of PHY function, both cry mutations modulated daylength-dependent H2O2-triggered transcriptome profiles in cat2. In addition, stress screening of single cry mutants revealed effects on osmotic, H2O2 and paraquat sensitivity. Overall, these data show that both kinds of photoreceptor, but particularly cryptochromes, can play a role in the response to intracellular H2O2, suggesting that there is an intricate network allowing integration of environmental information to determine appropriate responses to stress.

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La leucine zipper de la rétine neurale (Nrl) joue un rôle central dans le développement et l'homéostasie des bâtonnets en activant I'expression de gènes tels que le photopigment Rhodopsine. Nrl est aussi associé à la Rétinite Pigmentaire, faisant ainsi de ce gène un modèle intéressant pour la compréhension des programmes contrôlant le développement et I'homéostasie des photorécepteurs.Ce travail de thèse vise à caractériser les mécanismes régulateurs de I'expression de Nr/ au cours du développement rétinien. L'électroporation in vivo de vecteurs rapporteurs dans des rétines de souris en développement, a révélé des séquences minimales de promoteur Nr/ nécessaires à une expression spécifique dans les photorécepteurs. Nous avons identifié RORI3 comme facteur requis pour cette expression, et montré que les facteurs OTX2, CRX et CREB s'accrochent aussi directement à des régions régulatrices particulières du promoteur. Nous avons construit un virus adéno-associé (AAV) contenant un promoteur minimal Nrl de 0.3 kb, et montré qu'il est adapté à la délivrance de gène spécifiquement dans les photorécepteurs.Nous avons montré que NRL, CRX et NR2E3, les régulateurs principaux de la Rhodopsine, ont une expression rythmique au cours de 24 h, et que l'expression cyclique de Nr/ peut être due à l'activation par RORp, un composant l'horloge circadienne. Enfin, nous avons identifié un nouveau facteur de transcription, NonO, au niveau de la région du promoteur proximal de la Rhodopsine, qui en combinaison avec NRL et CRX, active le promoteur de la Rhodopsine. L'invalidation de NonO au cours du développement rétinien a prouvé son implication pour le développement et I'homéostasie des bâtonnets.