A cutia Dasyprocta leporina é um roedor pertencente à sub-ordem histricomorfa, e é encontrada em todo território nacional. Os roedores da sub-ordem histricomorfa apresentam uma placenta dotada de uma estrutura peculiar, a subplacenta. Nesta pesquisa estudou-se em 9 (nove) placentas de cutias, nas três fases de gestação (inicial, média e final). Este estudo consistiu da análise morfológica placentária, pelas microscopias de luz e eletrônica, em conjunto com as técnicas de citoquímica, imunohistoquímica, e microvascularização. A subplacenta da cutia encontra-se localizada no ápice da placenta corioalantoidiana, separada desta por um tecido mesenquimal. Insere-se na parede uterina em íntimo contato com o tecido materno. Histologicamente a subplacenta consistiu de estruturas lamelares, cujos eixos são formados por tecido mesenquimal fetal. Sobre estes apoiam-se arranjos epiteliais de cito e sinciciotrofoblasto. Na região de interface da subplacenta e da decídua, foram encontradas populações de células trofoblásticas gigantes multinucleadas, citoqueratina positivas. A vimentina apresentou intensa reação positiva junto ao revestimento endotelial dos vasos do tipo arterial, e no interior do tecido mesenquimal do eixo central das lamelas da subplacenta. A reação de PCNA apresentou reatividade positiva no citotrofoblasto das lamelas da subplacenta, e em algumas células do sincício, principalmente no terço médio de gestação. A análise ultra-estrutural da subplacenta mostrou duas populações de células trofoblásticas distintas na parede das lamelas: o cito e o sinciciotrofoblasto. A vascularização da subplacenta analisada pela perfusão de látex colorido, e por Mercox, ao microscópio eletrônico de varredura, demonstrou a ausência de vasos de origem materna, e irrigação oriunda da artéria fetal. Esta após capilarização dirigia-se para os lóbulos da placenta principal, cuja disposição lembrava uma circulação do tipo portal. / The agouti Dasyprocta leporina is a rodent belongs to the suborder hystricomorph, and may be found in all national territory. The hystricomorph has one specific structure on the placenta, the subplacenta. In this research 9 (nine) placentae of agouti were studied, in three different gestation age (early, middle and late). The study consisted of placental morphologic analysis by light and electron microscopy, associated with cytochemical, immunohystochemistry and microvascularization techniques. The subplacenta of agouti is localized on the apical part of the chorioallantoic placenta, separated by a mesenchyme and inserted on the uterus wall. Histologically the subplacenta consisted of lamear structures where the axis was formed by mesenchyme. On this structure the epithelial formation of the cytotrophoblast and syncytiotrophoblast was found. In the region between suplacenta and decidua the multinucleate giant trophoblast cells were observed, cytokeratin immunostaining. The endothelial cells on the arterial vessels showed intense positive reaction to vimentin and also the mesenchyme from axis of the lamelae. The cytotrophoblast on the lamelae and some cells of the syncytiotrophoblast showed PCNA positive reaction, principally in middle part of gestation. The ultra-structure analysis of the subplacenta showed two cells populations on the lamelae: the cytotrophoblast and syncytiotrophoblast. The vascularization analyzed by scanning electron microscopy of the Mercox and by colored latex perfusion demonstrated only fetal vessels on the subplacenta originated from fetal artery. The fetal artery, after branched in a net of capillaries, run to lobules of the principal placental, and this behavior suggest a type of portal circulation.

Os roedores da sub-ordem histricomorfa, na qual a paca está classificada, apresentam placentação hemocorial e desenvolvem uma estrutura peculiar junto a sua placenta denominada de subplacenta. Apesar dos relatos de sua presença em diversas espécies, as possíveis funções dessa estrutura permanecem no âmbito especulativo, devido às variações na forma, dimensão e localização, bem como à falta de estudos experimentais focalizando essa estrutura placentária. Foram utilizadas oito placentas de pacas obtidas nos períodos médio e final de gestação, para avaliações das organizações e constituições teciduais, relações anatômicas do órgão por meio da microscopia de luz e eletrônica, aliadas às técnicas de citoquímica, imunocitoquímica e perfusões de traçadores para a rede vascular. Os resultados demonstraram que a subplacenta da paca estava localizada no ápice da placenta corioalantoidiana, separada desta por um tecido mesenquimal e inserida na parede uterina em íntimo contato com o tecido materno. A subplacenta consistia de estruturas lamelares com um eixo de tecido mesenquimal fetal sobre o qual apoiavam-se arranjos epiteliais de citotrofoblastos e sinciciotrofoblastos. Nas áreas de interfaces dos perímetros da subplacenta em contato com o tecido materno foram encontradas ainda populações de células trofoblásticas gigantes multinucleadas. Essas células trofoblásticas gigantes e sinciciotrofoblastos citoqueratina positivas foram também encontradas distantes do perímetro da subplacenta, invadindo profundamente o endométrio, que se apresenta totalmente desestruturado, contendo vasos sangüíneos com as paredes infiltradas pelas células trofoblásticas e destituídas de revestimento endotelial, confirmada pela reação vimentina negativa pela imunocitoquímica. Essas localizações de células trofoblásticas apontam para a capacidade invasiva das células trofoblásticas tanto através do leito vascular materno quanto pelos interstícios do estroma endometrial. Verificou-se uma área limítrofe de tecido endometrial decidualizado junto ao miométrio que se mantinha íntegra e que aparentemente conteve a invasividade das células trofoblásticas. Nos espaços interlamelares do interior da subplacenta, em meio ao sinciciotrofoblato, foram encontrados materiais amorfos resultantes da degradação do tecido endometrial retidos durante a progressão e crescimento da placenta para o interior da parede uterina. Nesses espaços, não foram encontrados vasos sangüíneos, porém, no eixo mesenquimal da subplacenta, foram constatados vasos sangüíneos de pequeno calibre, todos vimentina positivos, sugerindo a ausência de vascularização através de sangue materno na subplacenta. Pela localização estratégica, acima da placenta principal e pelos aspectos ultra-estruturais das células citotroblasticas presentes nas lamelas, juntamente com sua intensa marcação pelo PCNA, presume-se que as células da subplacenta possam originar as demais células trofoblásticas, particularmente as sinciciais e as gigantes, ao longo do terço médio da gestação. A vascularização da subplacenta avaliada pela perfusão de látex colorido e pela técnica de corrosão e análise em microscopia eletrônica de varredura comprovou a ausência de vasos de origem materna na subplacenta e demonstrou uma irrigação oriunda da artéria fetal que, após capilarização na subplacenta, dirigia-se para os lóbulos da placenta principal. Esta disposição lembra uma circulação do tipo portal, com uma possível recapilarização dos vasos oriundos da subplacenta junto à placenta principal, onde o sangue fetal efetuaria as trocas metabólicas para retornar como sangue oxigenado antes de confluir para a veia fetal no cordão umbilical. / The rodents of suborder hystricomorph, in which is classified the Agouti paca, present hemochorial type placentation and develops an unique structure known as subplacenta. In spite of many report of its presence in several species, the possible functions of this structure related to placenta and pregnancy remains speculative, mainly due to the diversity of form, size, localization and lack of experimental studies focusing such a placental structure. In the present study were used eight placentas collected from paca at midle and end stage of gestation in the aim to evaluate their tissue components and organization, anatomical relation of the organ at light and electron microscopy level, associated with cytochemical and immunocytochemical techniques and perfusion of vascular bed. The results showed the subplacenta was localized at apical portion of chorioallantoic placenta of paca, separated from this by mesechimal tissue and inserted in the uterine wall in intimate contact with maternal tissue. The subplacenta consisted of lamellar structures with mesenchimal axis of fetal origin on which, cytotrophoblast and syncytiotrophoblasts layers were organized as epithelial sheets. The interfaces at peripheral portion of subplacenta in contact with maternal tissue were also found populations of multinucleated giant trophoblast cells. These giant cells and syncytiotrophoblast were cytokeratin positives and were found far from the limits of subplacenta, deeply invading the completely damaged endometrium, as did the maternal vessels showing presence of trophoblast cells in their walls devoid of endothelial cells attested by vimentin and cytokeratin immunostaining. These findings suggest the invasive capability of trophoblast cells either through the maternal vascular bed and interstitium of endometrial stroma. However, it was seen a well defined border line of helthy decidualized endometrium near the miometrium that seems to retain the invasive progression of trophoblast cells. In the interlamellar space of subplacenta formed by syncytiotrophoblast, it was found amorphous materials originated from degradation of endometrial tissue retained during the progression and growth of placenta into the uterine wall. In these interlamellar spaces were not found blood vessels, but in the mesenchimal axes were found vimentin positive small vessels, which suggest absence of maternal vascularization inside the subplacenta. The strategical localization of subplacenta upside of chorioallantoic placenta of paca and the ultra structure of cytotrophoblast cells and their strong reaction to PCNA (proliferating cell nuclear antigen) supports these subplacental cells could be the source of trophoblast cells, namely the giant and syncytiotrophoblast. The vascularization of subplacenta evaluated by stained latex perfusion and by microvascular casting seen at scaning electron microscopy clearly showed the absence of maternal vascularization in the subplacenta. The blood supply of subplacenta seems to be exclusively from fetal artery whieems after capilarization in the subplacenta flows to the lobules of main placenta. Such a blood flow remind the portal type circulation, being the second capilarization of venous type vessels coming from the subplacenta inside the lobulules of the main placenta, where the fetal blood could make the metabolic changes to return with enough oxygenation level before join to the fetal vein in the umbilical cord.

A barreira placentária é constituída por duas camadas de células sinciciais, uma camada de células trofoblásticas gigantes e o endotélio fetal. Apesar da importância das camadas sinciciais no transporte molecular entre mãe e feto, o exato mecanismo de formação dessa barreira não está completamente elucidado em camundongos. Em humanos, estudos sugerem que a formação do sinciciotrofoblasto ocorre por um processo de fusão celular dependente de Caspase- 8, uma proteína iniciadora da cascata de apoptose. Desta forma, este estudo teve como proposta analisar o processo de formação das camadas sinciciais do labirinto em placentas de camundongos e o possível envolvimento da caspase-8 neste processo. Sítios de implantação foram coletados de camundongos fêmeas nos dias 8,5 a 11,5 de gestação e caracterizados morfologicamente através de marcadores de células precursoras sinciciais (EpCAM) e de células sinciciais maduras (Slc16A3) por meio de reações imunohitoquímicas. A expressão gênica dos marcadores diferenciais de células sinciciais também foi analisada por RT-PCR na região labiríntica dissecada nos diferentes dias de gestação. A expressão de Caspase-8 total e clivada também foi avaliada por Western blot e a relação entre a presença de Caspase-8 clivada e a indução de apoptose, avaliada por TUNEL e pela imunolocalização da Citoqueratina 18 clivada. Tambem foram realizadas análises com células labirínticas cultivadas, isoladas nos dias 8,5 a 10,5 de gestação. As células cultivadas foram caracterizadas morfologicamente e avaliadas quanto a expressão gênica de marcadores sinciciais e proteica de Caspase-8. Nossos resultados mostraram que os primeiros sinais morfológicos de formação da barreira placentária ocorream no dia 9,5 de gestação. O marcador EpCAM foi encontrado na base da placenta nos dias 8,5 e 9,5. No dia 11,5 de gestação, o labirinto já se encontra estruturado e funcional, o que foi indicado pela expressão de Slc16A3, nos dias 10,5 e 11,5 de gestação. A expressão gênica dos fatores de transcrição associados ao desenvolvimento das camadas sinciciais mostraram expressões crescentes ao longo do período estudado. Caspase-8 total e clivada mostrou intensa expressão no dia 9,5 de gestação, e aparentemente não estava associada à morte celular por apoptose, uma vez que não se detectou reatividade pela reação de TUNEL ou imunomarcação de Citoqueratina 18 clivada nas células labirínticas em formação em nenhum dos dias estudados. Células labirínticas obtidas aos 9,5 dias de gestação e cultivadas formaram ninhos celulares ao longo das 48 horas de cultura, com indícios morfológicos de sincicialização. A imunolocalização do marcador de células progenitoras do labirinto, EpCAM foi mais intensa nas culturas de 6 horas e se limitou a áreas ao redor dos ninhos celulares após 48 horas. Inversamente, a imunolocalização do transportador sincicial Slc16A3 não foi observada após 6 horas de cultura, mas foi bastante intensa no centro dos ninhos celulares após 48 horas. As culturas de labirinto de 9,5 das de gestação, também mostraram aumento de expressão das Sincitinas A e B ao longo do tempo de cultivo. A análise da expressão proteica de Caspase-8 mostrou expressão mais alta após 6 horas de cultivo do que a observada nos demais tempos experimentais. Por outro lado, a forma ativa (clivada) da caspase aumentou gradativamente após 24 e 48 horas de cultivo. Culturas submetidas ao tratamento com o inibidor farmacológico de Caspase-8 z-IEDT-fmk, mostraram perfis morfológicos alterados com redução da formação dos ninhos celulares e diminuição da reatividade ao Slc16A3. A expressão dos marcadores de diferenciação Sincitina A e B também foi significativamente diminuída (p<0.05) nestes experimentos em que a inibição da Caspase-8 clivada foi comprovada por Western blot. Estes achados mostraram a expressão de Caspase- 8, principalmente no dia 9,5 de gestação, nas células trofoblásticas labirínticas da placenta de camundongos e sugerem sua participação na formação das camadas sinciciais do labirinto. / Two layers of syncytial cells, a layer of trophoblastic giant cells and the fetal endothelium form the placental barrier. Despite the importance of the syncytial layers in molecular transport between mother and fetus, its exact developmental mechanism is still not completely elucidated in rodents. In humans, studies suggest that the formation of the syncytiotrophoblast occurs through a cell fusion process dependent on Caspase-8, an apoptosis cascade-initiating protein. In this way, this study had the proposal to analyze the process of formation of the syncytial layers of the labyrinth in placentas of mice and the possible involvement of Caspase-8 in this process. Implantation sites were collected from female mice on days 8.5 to 11.5 of gestation and morphologically characterized by the labyrinthine precursor cell marker EpCAM, and the mature syncytial cell marker - Slc16A3, through immunohistochemical reactions. The gene expression of the differential markers of syncytial cells was analyzed by RT-PCR in the labyrinthine region dissected on the different days of gestation. Total and cleaved Caspase-8 expression was also evaluated by Western blot and the relationship between the presence of cleaved Caspase-8 and the induction of apoptosis as assessed by TUNEL and the immunolocalization of the cleaved Cytokeratin 18. Analyzes were also performed with cultured labyrinth cells, isolated on days 8.5 to 10.5 of gestation. The cultured cells were characterized morphologically and evaluated for the gene expression of syncytial markers and Caspase-8 protein. Our results showed that the first morphological signs of placental barrier formation occurred on day 9.5 of gestation. The EpCAM marker was found at the base of the placenta on days 8.5 and 9.5. At day 11.5 of gestation, the labyrinth is already structured and functional, which was indicated by the expression of Slc16A3, on days 10.5 and 11.5 of gestation. The gene expression of the transcription factors associated with the development of the syncytial layers showed increased throughout the studied period. Total and cleaved Caspase-8 showed intense expression at day 9.5 of gestation, and apparently was not associated with cell death by apoptosis, since no reactivity was detected by the TUNEL reaction or cleaved Cytokeratin 18 immunolabeling in the labyrinthine zone. Labyrinthine cells obtained at 9.5 days of gestation formed nests during the 48 hours of culture, with morphological signs of syncytialization. Immunolocalization of the progenitor cell marker EpCAM was more intense in the 6-hour cultures and was limited to areas around the cell nests after 48 hours. Conversely, immunolocalization of the syncytial transporter Slc16A3 was not observed after 6 hours of culture but was quite intense at the center of the cell nests after 48 hours. Labyrinthine cell cultures of 9.5 gestation days also showed increased expression of A and B syncytins throughout the culture time. Analysis of the protein expression of Caspase- 8 showed higher expression after 6 hours of culture than that observed in the other experimental times. On the other hand, the active (cleaved) form of Caspase gradually increased after 24 and 48 hours of culture. Cultures submitted to the pharmacological inhibitor of Caspase-8 - z-IEDT-fmk showed altered morphological 18 profiles with reduction of cell nests formation and a decrease of reactivity to Slc16A3. The expression of the differentiation markers A and B Syncytins was also significantly decreased (p <0.05) in the experiments, in which the inhibition of the cleaved Caspase-8 was confirmed by Western blot. These findings show the expression of Caspase-8, mainly on day 9.5 of gestation, in the labyrinthine cells of the mice placenta and suggest its participation in the formation of the labyrinthine syncytial layers.

Atualmente, grande parte do onhecimento adquirido sobre reprodução de serpentes, advém de estudos levados a efeito na América do Norte e Europa, com animais de regiões temperadas; e, na Austrália, com Elapídeos tropicais. No presente estudo foram utilizadas dez serpentes fêmeas prenhes de Crotalus durissus (Viperidae) de região neotropical, com o objetivo de descrever e correlacionar a morfologia do corpo lúteo, placenta e estágio fetal. Com isso pode-se inferir também, o tempo de prenhez. As técnicas realizadas para essa descrição e correlação foram: biometria macroscópica das fêmeas e suas estruturas; microscopia de luz com coloração de hematoxilina-eosina e microscopia eletrônica de varredura. Foram coletados no total 124 corpos lúteos e 116 placentas, onde observou-se que a cascavel possui o corpo lúteo de caráter ovulatório e a placenta do tipo corioalantóica evolvida por uma delgada membrana da casca do ovo. Concluiu-se que o tamanho padrão da superfície dos corpos lúteos para uma prenhez normal é de 18 a 34 mm2 e que há um corpo lúteo para cada ovo, independente se está fertilizado ou atrésico, porém os ovos atrésicos não possuem placenta. Pela primeira vez foi possível visualizar a disposição estrutural dos filamentos calcários em forma de trama na membrana da casca do ovo. Foi inferida uma classificação da placenta em três estágios I, II e III de acordo com a morfologia e aumento das vilosidades apresentadas entre placenta e útero; e a partir da identificação do estágio de desenvolvimento embrionário e fetal pode-se inferir o tempo de prenhez em C. durissus, classificadas em três terços, inicial, médio e final, evidenciando que existe uma correlação entre a evolução dos estágios placentários com desenvolvimento fetal, conforme a evolução gradual da prenhêz / At de present time, great part of snake reproduction knowledge results from researches realized in North America and Europe, with temperate region animals; in Australia with tropical Elapides. At this present research, ten pregnant females of the snake Crotalus durissus (Viperidae), from Neotropical Region, were utilized. The main goal is to correlate the morphology, corpus luteum, placenta and fetal development. Then, it is also easy to deduce the pregnancy time. The techniques performed for this description and correlation were females macroscopic biometry and their structures; light microscopy with hematoxiline-eosine color and electronic scanning microscopy. 124 corpora lutea and 116 placentas were collected. In those samples could be observed that rattlesnakes have an ovulatory corpus luteum and a corioalantoic placenta wrapped by a slender membrane of the eggshell. Clearly the conclusion is that the normal standard size surface corpus luteum for a normal pregnancy is from 18 to 34mm² and that there is a corpus luteum for each egg, independently if it is fertilized or atresic; but, these atresic eggs have not placenta. For the first time it was possible to visualize the structural arrangement of the calcareous filaments in shaped frame in the eggshell membrane. It was inferred a placenta classification in three stages: I, II and III according to the morphology and increased vilosiddes presented among placenta and uterus; and, from the identification of embryonic and fetal development stage we can infer the time pregnancy in C. durissus, classified in three thirds, initial, middle and final, indicating that there is a correlation between the evolution of placental stage with fetal development, as the gradual evolution of pregnancy

A clonagem de animais é uma técnica em desenvolvimento e ainda requer refinamento, uma vez que as perdas embrionárias são significativas. Mesmo com animais chegando à termo, algumas deficiências verificadas ao nascimento provocam a morte destes antes do primeiro mês de vida. As alterações placentárias durante a embriogênese estão relacionadas, à formação deficiente da placenta, principalmente nas regiões de troca materno-fetal. Considerando a necessidade de estudos mais detalhados sobre a morfologia da placenta e a ausência de estudos quantitativos das estruturas placentárias em grandes mamíferos, investigamos comparativamente os vilos coriônicos da placenta de bovinos não clonados e clonados usando delineamento estereológico. Foram utilizadas placentas de quatro fêmeas de bovinos clonados e quatro de não clonados. A amostragem foi realizada de modo uniforme, sistemático e aleatório, sendo obtidas estimativas de densidade de volume, volume referência, tamanho e comprimento e número de unidades volume star. Todos os parâmetros estereológicos apresentaram valores superiores (embora não significativos) para não clonados, com exceção do número de unidades volume star. No entanto, a placenta de não clonados foi mais eficiente (p= 0.014). Apesar de não significativos, os resultados sugerem a existência de diferenças biológicas, ou seja, a placenta de bovinos não clonados apresenta vilos maiores (porém em menor número), mas distribuídos em um número maior de placentomas. Já em animais clonados, estes vilos são menores, mais numerosos e distribuídos em um número menor de placentomas. / Animal cloning is still in development it requires further improvements since embryonic losses are remarkable animals die before the first month after birth. The placental changes during embryogenesis cause a deficiency in the placenta, mostly in the maternal-fetal exchange areas. Due to the need for more detailed studies on the placenta?s morphology, especially the quantitative analysis of the placenta structures in large animals, chorionic villi were comparatively investigated in both cloned and non-cloned bovines by means of stereology designed methods. Placentas from four cloned and four non-cloned bovines were used. Specimens were collected in a random uniformand systematic procedure, and stereological designed methods were pursued to estimate volume density of villi; the volume reference of placenta (Cavilieri Principle), surface density, surface area, star volume and number of star volume units. All parameters presented larger values for non-cloned, with exception of number of star volume units, thought these results were statistically non-significant larger in non-cloned animals (p= 0.014). In conclusion, it is possible to say that there are biological differences, in the placenta of non-cloned bovines which presents larger chorionic villi, small villi number, but distributed in a larger number of placentomas. In cloned bovines, however, villi are smaller, numerous more, and they are distributed in fewer number of placentomes.

Wong Chi Ho. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2000. / Includes bibliographical references (leaves 74-94). / Abstracts in English and Chinese. / Tittle / Table of contents / Acknowledgment / Abstract / Chapter Chapter 1. --- Introduction --- p.1 / Chapter Chapter 2. --- Literature Reviews --- p.2 / Chapter 2.1 --- Sonographic history --- p.2 / Chapter 2.1.1 --- Definition of ultrasound --- p.2 / Chapter 2.1.2 --- History of general ultrasonography --- p.2 / Chapter 2.1.3 --- Early history of fetal diagnostic ultrasonography --- p.4 / Chapter 2.2 --- Placental sonography --- p.10 / Chapter 2.2.1 --- Development of the placenta --- p.10 / Chapter 2.2.2 --- Sonographic placental development --- p.12 / Chapter 2.2.3 --- Placental grading --- p.14 / Chapter 2.2.3.1 --- Early studies of the placenta --- p.14 / Chapter 2.2.3.2 --- Placental grading --- p.16 / Chapter 2.2.3.3 --- Placental grading and gestational age --- p.18 / Chapter 2.2.3.4 --- Placental grade and neonatal outcome --- p.20 / Chapter 2.2.4 --- Placental thickness --- p.22 / Chapter 2.3 --- Amniotic fluid --- p.24 / Chapter 2.3.1 --- Amniotic fluid dynamics --- p.24 / Chapter 2.3.2 --- Methods of sonographic assessment of amniotic fluid --- p.28 / Chapter 2.3.3 --- Correlation of AFI with clinical oligohydramnios --- p.30 / Chapter 2.3.4 --- Clinical outcome associated with oligohydramnios --- p.32 / Chapter Chapter 3. --- Methodology --- p.34 / Chapter 3.1 --- Introduction --- p.34 / Chapter 3.2 --- Criteria for patients selection --- p.35 / Chapter 3.3 --- Calculation of the gestational age --- p.35 / Chapter 3.3.1 --- Measurement of bipatietal diameter (BPD) --- p.36 / Chapter 3.4 --- Ultrasonic measurements of the placenta and amniotic fluid --- p.37 / Chapter 3.4.1 --- Placental grading --- p.37 / Chapter 3.4.2 --- Placental thickness --- p.38 / Chapter 3.4.3 --- Amniotic fluid index --- p.39 / Chapter 3.5 --- Statistical analysis --- p.39 / Chapter 3.5.1 --- Amniotic fluid index --- p.39 / Chapter 3.5.2 --- Placental thickness --- p.40 / Chapter 3.5.3 --- Clinical outcome --- p.41 / Chapter Chapter 4. --- Results --- p.42 / Chapter 4.1 --- Overall obstetric demographic characteristics of study population --- p.44 / Chapter 4.2 --- "Gestation-related changes in placental grade, placental thickness and amniotic fluid index" --- p.48 / Chapter 4.2.1 --- "Amniotic fluid index, gestational age and maternal characteristics" --- p.48 / Chapter 4.2.2 --- Placental thickness --- p.53 / Chapter 4.2.3 --- Placental grades and gestational age --- p.57 / Chapter 4.3 --- The clinical outcomes and ultrasound parameters --- p.61 / Chapter Chapter 5. --- Discussion --- p.63 / Chapter 5.1 --- Gestation related change of AFI and maternal characteristics --- p.63 / Chapter 5.2 --- Placental grade and gestational age --- p.67 / Chapter 5.3 --- Placental thickness --- p.72 / Chapter Chapter 6. --- Reference --- p.74 / Graphics --- p.95 / Figure 1 Grannum's placental grading system / Figure 2 Amniotic fluid index against gestational age / Figure 3 Placental thickness versus gestational age / Figure 4 Graph of placental grades versus progressing gestational age / Figure 5 Median amniotic fluid index in four populations

Le placenta humain est un organe indispensable au maintien de la grossesse et au développement fœtal. Son unité structurale et fonctionnelle est la villosité choriale, constituée principalement de cytotrophoblastes qui se différencient selon la voie villeuse endocrine ou extravilleuse invasive. Le développement intense du placenta et ses fonctions multiples requièrent des besoins en énergie importants. La régulation du métabolisme énergétique placentaire passe, en partie, par le contrôle de l’activité mitochondriale.La mitochondrie est l’organelle clé du métabolisme énergétique. Cependant, elle intervient dans de nombreuses autres fonctions cellulaires telles que l’apoptose et la biosynthèse des hormones stéroïdes. Des études récentes suggèrent que les mitochondries sont impliquées dans la différenciation cellulaire.Le récepteur apparenté aux récepteurs des oestrogènes-γ, (ERRγ), est un facteur de transcription qui joue un rôle crucial dans le contrôle du métabolisme énergétique. Des travaux préliminaires ont montré qu’ERR est fortement exprimé dans le placenta humain.Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à l’implication d’ERRγ dans le développement placentaire.Dans une première partie, nous avons caractérisé l’expression d’ERRγ dans les trophoblastes de placentas humains de 1er et de 3ème trimestre. Nous avons montré que l’expression d’ERRγ i) augmente au cours de la grossesse et ii) est plus importante dans les cytotrophoblastes villeux en comparaison aux cytotrophoblastes extra-villeux.Dans une seconde partie, nous avons montré que la différenciation des cytotrophoblastes villeux est associée à des modifications du métabolisme énergétique et du contenu mitochondrial. De plus, nous avons clairement démontré qu’ERRγ contrôle positivement la différenciation des trophoblastes villeux en modulant les fonctions mitochondriales.Enfin, nous avons montré qu’ERRγ est moins exprimé dans les placentas issus de retards de croissance intra-utérins en comparaison à des placentas normaux. De plus, la diminution d’ERRγ est associée à une baisse du contenu mitochondrial placentaire.L’ensemble de ce travail a permis de mettre en évidence le rôle clé d’ERRγ et des mitochondries dans le développement du placenta humain. / Human placenta is a vital organ for pregnancy support and fetal development. The chorionic villi is the structural and functional unit of the placenta and is mainly constituted by trophoblastic cells. The trophoblast differentiate in villous endocrine and extra-villous invasive trophoblast. Placental development and its numerous functions require the availability of high energy. Placental energetic metabolism control is partially mediated by the regulation of mitochondrial activity.Mitochondria are key organelles of the energetic metabolism. However, mitochondria are involved in numerous other cellular functions such as apoptosis and steroid hormone biosynthesis. Moreover, recent studies suggest that mitochondria are involved in cell differentiation.Estrogen related receptor-γ (ERRγ) is a transcriptional factor implicated in the control of energetic metabolism. Preliminary studies showed that ERRγ is highly expressed in human placenta.In this work, we decided to study ERRγ implication in human placental development.In a first part, we characterized ERRγ expression in trophoblast from first and third trimester human placentas. We showed that ERRγ expression i) increased during pregnancy and ii) was higher in villous than extra-villous trophoblasts.In a second part, we showed that villous trophoblast differentiation was associated with modifications of energetic metabolism and mitochondrial content. Moreover, we clearly demonstrated that ERRγ positively controled villous differentiation by the modulation of mitochondrial functions.In a last part, we showed that ERRγ was less expressed in placentas from intra-uterine growth restriction as compared to non-pathological placentas. Moreover, this down-regulation was associated with a decrease of mitochondrial content.This work thus showed, for the first time, that ERRγ and mitochondria played a key role in placental development.

O VEGF é um fator mitogênico específico de células endoteliais que promove diferenciação celular materno-fetal placentária quando ligado a seus receptores (Flt-1 e KDR). Sua expressão é controlada por mecanismos autócrinos e parácrinos e está associada ao desenvolvimento da placenta. A placenta bovina foi utilizada como modelo de estudo por apresentar a facilidade de se avaliar os componentes do sistema VEGF em diferentes fases gestacionais. Como objetivo este estudo buscou analisar o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e seus receptores através da técnica de PCR em tempo real no início, meio e fim de gestação. Para tanto, amostras de placentomas, região interplacentomal e corpo lúteo foram coletadas em diferentes fases gestacionais. Foram utilizados placentomas de animais clonados obtidos apenas aos 270 dias de gestação e estas amostras foram comparadas aos animais não clonados na mesma fase. A expressão do VEGF no placentoma apresentou um decréscimo (p &lt; 0.05) no final da gestação (270 dias) em relação à expressão do VEGF aos 90 dias. A expressão do Flt-1 e do KDR na região interplacentomal foi semelhante desde os 45 até 90 dias de gestação e apresentou um aumento significativo (p &lt; 0.05) aos 150 dias. No corpo lúteo gestacional, a expressão do VEGF aos 210 dias foi maior (p &le; 0.05) em relação a 90 e 150 dias; observou-se também baixa expressão do KDR aos 90 dias de gestação (p &lt; 0.05) em relação aos 210 dias. Pode-se concluir que a regulação da expressão do VEGF variou em relação aos seus receptores nos três tecidos avaliados. Placentomas de bovinos clonados não apresentaram diferenças significativas em relação à expressão do sistema VEGF se comparados aos placentomas de animais não clonados sugerindo ser esta expressão equivalente em placentas de animais clonados que vieram a termo. / The VEGF is a specific endothelial mitogenic factor that promotes feto-maternal cell differentiation in placenta through binding to its receptors (Flt-1 and KDR). Their expression is controlled by autocrine and paracrine mechanisms that are associated to placenta development. The bovine placenta was used in this study as a model due to easiness of evaluation of VEGF system components in different phases of pregnancy. The objective of this study was to analyze the vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors expression using the real time PCR technique in the beginning, half and end of pregnancy. Furthermore, placentome samples, interplacentomal areas and corpus luteum were collected in different gestational phases for comparative studies. Placentome of cloned animals were analyzed at 270 days of pregnancy and compared to non-cloned animals in the same phase. The expression of VEGF in the placentome presented a decrease of expression (p &lt; 0.05) in the end of the gestation (270 days) in relation to 90 days. The expression of Flt-1 and of KDR in interplacentomal area was similar from 45 to 90 days of pregnancy with a significant increase (p &lt;0.05) observed at 150 days. In the gestational corpus luteum, the expression of VEGF at 210 days was higher (p &le; 0.05) in comparison to 90 and 150 days. In the same tissue KDR expression at 90 days was lower (p &lt; 0.05) in relation to 210 days. In conclusion the regulation VEGF varied in relation to its receptors expression in all three studied tissues. Cloned placentomes showed no significant differences in VEGF system expression compared to the placentome of non-cloned animals, suggesting there is an equivalent expression in placentas from cloned animals that came to term.

O estabelecimento e perfeito funcionamento da placenta são fatores dependentes da intensa vascularização ocorrida no órgão. Os processos de vasculogênese e angiogênese placentária são modulados por diversos fatores, incluindo o VEGF (fator de crescimento vascular endotelial) e bFGF (fator de crescimento fibroblástico básico). Apesar da importância do VEGF e bFGF durante a vascularização estar estabelecida, vários estudos indicam a participação desses fatores de crescimento como moduladores locais em outras funções fisiológicas, como por exemplo o controle da produção hormonal em tecidos esteroidogênicos. Animais clonados podem apresentar alterações na expressão de determinados genes durante seu desenvolvimento, o que pode alterar a função placentária. Os objetivos deste estudo são determinar a localização tecidual do VEGF, bFGF e seus receptores na placenta bovina e avaliar a influência destes fatores de crescimento sobre a produção de progesterona placentária em bovinos não clonados e clonados. Placentomas de 90, 150 e 210 dias de gestação foram obtidos em abatedouro e placentônios de gestações aos 270 dias provenientes de bovinos clonados e não clonados foram coletados após cesarianas. As amostras foram fixadas em formol tamponado 4%, desidratadas e incluídas em parafina. Cortes foram submetidos a imuno-histoquímica para posterior localização das proteínas do VEGF, bFGF e seus receptores. Sob condições assépticas, as células foram mecanicamente dispersas e cultivadas em placas de 96 cavidades. Os fatores foram adicionados em concentrações de 10 e 50 &#951;g/ml de bFGF e VEGF, respectivamente. Amostras de meio de cultura e as células dos grupos controle, bFGF, VEGF e VEGF mais bFGF foram coletadas 24, 48 e 96 horas após a adição dos fatores. A progesterona foi dosada por radioimunoensaio e o conteúdo protéico pelo método de Lowry. Os dados foram analisados utilizando-se o programa estatístico SAS (Statistical Analysis System), as diferenças estatísticas encontradas foram comparadas pelo teste de variação múltipla de Duncan. O VEGF, bFGF e seus receptores foram localizados em células do epitélio e estroma maternos e fetais e células endoteliais vasculares em bovinos não clonados e clonados. As células placentárias apresentaram diferentes capacidades de síntese de progesterona ao longo da gestação. Aos 90 e 210 dias de gestação o VEGF estimulou a produção de progesterona, enquanto aos 270 dias de gestação o fator inibiu a produção deste hormônio. O bFGF estimulou a produção de progesterona pelas células placentárias aos 90 dias de gestação. A adição dos dois fatores de crescimento conjuntamente determinou um estímulo na produção de progesterona aos 210 dias de gestação. A produção de progesterona pelas células de bovinos clonados foi semelhante àquela observada em células de bovinos não clonados na mesma idade gestacional e os fatores de crescimento não influenciaram essa produção. Conclui-se que o VEGF e bFGF, atuando localmente no tecido placentário, funcionam como moduladores do processo de esteroidogênese, influenciando de maneira tempo-dependente a produção de progesterona deste órgão. / Placental establishment and function are dependent on intense vascularization. Placental vasculogenesis and angiogenesis are modulated by several factors, including VEGF (vascular endothelial growth factor) and bFGF (basic fibroblast growth factor). Although the role of VEGF and bFGF during vascularization is already well established, some studies have indicated the participation of these growth factors as local modulators in other physiological functions, such as control of hormonal production in steroidogenic tissues. Cloned animals may exhibit alterations in gene expression during development modifying placental function. The aims of this study are to determine the tissue localization of VEGF, bFGF and their receptors in the bovine placenta and to evaluate the influence of bFGF and VEGF on placental progesterone production in non-cloned and cloned bovines. Placentomes from days 90, 150 and 210 of pregnancy were obtained at local slaughterhouse and placentomes from cloned and non-cloned gestations at 270 days were obtained after cesarean sections. Samples were fixed in 4% buffered formol solution, dehydrated and included in paraffin. Sections were subimitted to immunohistochemistry for subsequent localization of VEGF, bFGF and their receptors proteins. Under aseptic conditions, cells were mechanically dispersed and then cultivated in a 96-well plate. Growth factors were added at concentrations of 10 and 50 &#951;g/ml for bFGF and VEGF, respectively. Samples of culture medium and cells from control, bFGF, VEGF and bFGF plus VEGF groups were collected 24, 48 and 96 hours after growth factor addition. Progesterone concentrations were assessed by radioimmunoassay and protein content was measured by Lowry?s method. Data were analyzed by SAS (Statistical Analysis System) program, significant differences were compared by Duncan?s range multiple test. VEGF, bFGF and their receptors were localized in maternal and fetal epithelial and stromal cells and vascular endothelial cells during pregnancy in non-cloned animals and in cloned bovine placenta at 270 days of pregnancy. Bovine placental cells were able to produce different amounts of progesterone during pregnancy. Growth factors were able to influence progesterone production in placental cells only after 24 hours in culture. At 90 and 210 days of pregnancy VEGF stimulated progesterone production, while at 270 days of pregnancy the growth factor inhibited production of this hormone. bFGF stimulated progesterone production in placental cells from 90 days of pregnancy. Both growth factors together determined an increase in progesterone production in placental cells from 210 days of pregnancy. Progesterone production in placental cells from cloned cattle is similar when compared with non-cloned placental cells at the same gestational age and growth factors did not influence progesterone production in these cells. VEGF and bFGF, acting locally in the placental tissue, are modulators of the steroidogenic process, influencing in a time-dependent manner the progesterone production in this organ.

A indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) desempenha um papel importante na tolerância materno-fetal devido á sua ação de catabolizar o triptofano e, consequentemente, impedir a proliferação de linfócitos T, que necessitam desse aminoácido para se manter. Hormônios da reprodução também participam do processo de sobrevivência do feto alogênico, como a progesterona que bloqueia o estímulo mitogênico da proliferação de células T, modula a produção de anticorpos, favorece a produção de IL-10, etc. e o estradiol, que pode modular o perfil imune Th1 ou Th2 na gestação, dependendo de sua concentração. Contudo, a existência ou não de correlação da ação da IDO com esses hormônios ou vice-versa ainda encontra-se pouco evidenciada. Desta forma este trabalho verificou a influência da expressão da IDO e às ações de hormônios da reprodução e citocinas no ciclo celular de células oriundas de fetos e placenta de gestação a termo de fêmeas de ratas e camundongos em cultivo. Este estudo foi realizado em complementação a um trabalho anterior, no qual foi realizada uma avaliação da expressão da IDO por citometria de fluxo em células uterinas, de placentas e de embriões de ratas e camundongos fêmeas prenhes e não prenhes que foram mantidas em cultivo e suplementadas com estradiol, progesterona, interferon &gamma;, triptofano e 1-metil-DL- triptofano. A avaliação das fases do ciclo celular foi realizada pela citometria de fluxo. De acordo com os resultados, em relação ao efeito dos tratamentos no comportamento das células no ciclo celular, podemos observar que, em ratas prenhes e não prenhes, ao adicionar estradiol, houve maior predominância das células em fase G1 nos períodos de 4 e 24 horas, bem como no grupo de camundongos fêmeas prenhes. Algumas células uterinas de ratas não prenhes tratadas com estradiol, assim como as tratadas com progesterona e interferon &gamma; progrediram no ciclo para fase de síntese nos tempos de 24 e 48 horas. Com a adição de triptofano podemos notar nos grupos de ratas não prenhes, camundongos fêmeas prenhes e não prenhes, um aumento da quantidade de células na fase G1 nos três períodos analisados. No grupo de ratas prenhes foi observado uma predominância celular em fase G1 nos tempos de 4 e 24 horas, sendo que em 48 horas, as células sofreram fragmentação de DNA. As células que foram suplementadas com 1- metil DL - triptofano + triptofano mantiveram o mesmo comportamento no ciclo celular , se mantendo em fase G1 nos tempos de 4, 24 e 48 horas grupos prenhes e não prenhes de ratas e nos tempos de 4 e 24 horas nos grupos de camundongos fêmeas prenhes e não prenhes, estando com seu DNA fragmentado e em fase de síntese, respectivamente, no tempo de 48 horas. A suplementação dos diversos fatores aos cultivos celulares permitiu observar alterações na dinâmica do ciclo celular, representada principalmente por um aumento de células em fase G1 nos grupos de células placentárias e embrionárias que receberam progesterona, estradiol, interferon &gamma; e triptofano e apresentaram um significativo aumento da expressão de IDO, e que permite inferir que provavelmente a síntese de RNAm esteja correlacionada à produção da IDO. / The indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) plays an important role in maternal-fetal tolerance due to its capacity to catabolize tryptophan and thereby preventing the proliferation of T lymphocytes, necessary for their maintenance. Reproductive hormones are also involved in the process of survival of semi-allogeneic fetus, as progesterone that blocks mitogenic stimulation of T cell proliferation, modulates antibodies production, promotes production of IL-10, etc. and estradiol, that can modulate the Th1 or Th2 immune profile during pregnancy, depending on its concentration. However, there is very few evidences regarding a possible correlation between IDO expression and these hormones; thus this study examined the influence of the expression of IDO and the actions of reproductive hormones and cytokines in the cell cycle of cells derived from fetuses and placenta at term gestation of female rats and mice in culture. This study was conducted as a complement to an earlier work, in which an evaluation was made of the IDO expression by flow cytometry in uterine cells, placentas and embryos of pregnant rats and mice and non-pregnant females that were maintained in culture and supplemented with estradiol, progesterone, interferon &gamma;, tryptophan and 1-methyl-DLtryptophan. The cell cycle evaluation was conducted by flow cytometry. According to the results, regarding the effect of treatments on the behavior of the cells in the cell cycle, it was observed that in pregnant and non-pregnant rats after the addition of estradiol, there is a greater predominance of cells in G1 phase at periods of 4 and 24 hours, that also was noted in the group of pregnant female mice. Uterine cells from non-pregnant female rats treated with estradiol and progesterone as well as treated with interferon &gamma; progressed to the phase of synthesis on the cycle, at 24 and 48 hours. With the addition of tryptophanin the groups of non-pregnant rats, pregnant and non-pregnant mice , an increased amount of cells in the G1 phase were observed in the three periods analyzed. In the group of pregnant rats a predominance of cells in the G1 phase was observed in periods of 4 and 24 hours, and 48 hours, where the cells undergone DNA fragmentation. In pregnant and non-pregnant rats the cells supplemented with 1 - methyl - DL - tryptophan + tryptophan remained at G1 phase in periods of 4, 24 and 48 hours and 4 and 24 hours for cells from pregnant and non-pregnant mice , that show ragmented DNA followed by synthesis at 48 hours period. Supplementation of the various factors to cell cultures allowed to observe dynamic changes in the cell cycle, represented primarily by an increase of cells in G1 phase in groups of embryonic and placental cells that received progesterone, estradiol, interferon &gamma; and tryptophan and showed a significant increase in the expression of IDO, that allows us to infer that the mRNA synthesis is probably correlated to the production of IDO.