Depuis deux décennies, le bois-énergie se développe fortement en Franche-Comté, notamment dans le secteur collectif/tertiaire. Face à l'épuisement prochain des connexes de scierie, la plaquette forestière (bois déchiqueté) est amenée à se développer. La question de l'approvisionnement devient alors centrale pour l'ensemble des acteurs de la filière, soulevant un grand nombre d'enjeux en matière d'aménagement territorial et forestier, de développement local, d'environnement... Parallèlement, des interrogations émergent : quelle quantité d'énergie peut-on mobiliser durablement ? La configuration spatiale et structurelle des espaces boisés a-t-elle une influence sur les processus d'approvisionnement ? Cherche-t-on à minimiser les distances de transport ? Existe-t-il des phénomènes de concurrence spatiale entre les chaufferies ? Afin de comprendre l'organisation actuelle des approvisionnements, nous avons analysé deux jeux de données de traçabilité de plaquettes forestières. Puis, nous avons développé une démarche visant à modéliser des bassins d'approvisionnement locaux, tenant compte des contraintes de renouvelabilité de la ressource, et des conflits d'usage, en couplant diverses sources d'information : indices de végétation issus de l'imagerie satellitaire, données dendrométriques, cartographie forestière, et tables de production. L'objectif de cette démarche était double : d'une part savoir si les deux terrains d'études choisis étaient en mesure d'assurer eux-mêmes l'approvisionnement de leurs propres chaufferies, d'autre part mettre en évidence les phénomènes de concurrence spatiale des différents bassins d'approvisionnement, et la contribution des différents types de peuplement. Cela a notamment permis de montrer l'importance du gisement énergétique des arbres isolés, à notre connaissance encore jamais évalué à une échelle infra-régionale. / In a context of strong increase of fuelwood demand in the collective sector, the supply issue becomes central to all stakeholders, raising many issues relating to land and forestry planning, local development, environment ... Meanwhile, questions emerge: how much energy can be mobilized sustainably? Does the spatial and structural configuration of forests influence the supply process? Do we seek to minimize transport distances? Can we observe spatial competition between the boilers ? To understand the current organization of supplies, we analyzed two sets of data traceability of wood chips. Then, we have developed a model of local supply basins, considering constraints of renewability of the resource, and conflicts of use, by combining various information sources: vegetation index derived from satellite imagery, forest mapping and production tables. The objective of this approach was dual : to determine the quantity of forest chips workable on a territory, and to highlight the spatial competition between the different basins supply, and the contribution of different tree species. This has enabled to show the importance of the energy potential of isolated trees, to our knowledge not previously evaluated in a sub-regional scale.

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L’objectif de cette thèse est d’étudier, à l’aide de modèles mathématiques, le mécanisme de régulation qui permet au corps de maintenir une quantité optimale de plaquettes sanguines. Le premier chapitre présente le contexte biologique et mathématique. Dans un second chapitre, un modèle pour la mégacaryopoïèse est introduit qui suppose une régulation ponctuelle par le nombre de plaquettes du taux de différentiation des cellules souches vers la lignée mégacaryocytaire et du nombre de plaquettes produites par mégacaryocyte. Nous montrons que la dynamique de ce modèle est régie par une équation différentielle à retard x'(t) = -?x(t)+f(x(t))g(x(t-t)), et nous obtenons ensuite de nouvelles conditions suffisantes pour la stabilité et l’oscillation des solutions de cette équation. Dans le troisième chapitre, nous analysons un second modèle pour la mégacaryopoïèse qui considère cette fois-ci une régulation opérée en continu uniquement via la vitesse de maturation des mégacaryoblastes. L’analyse de stabilité nécessite d’adapter un cadre pré-existant aux cas où le paramètre de bifurcation n’est pas le retard, et permet de montrer que l’augmentation du taux de mort des mégacaryoblastes conduit à l’apparition de solutions périodiques, en accord avec les observations cliniques de la thrombopénie cyclique amégacaryocytaire. Le dernier chapitre est consacré l’analyse de stabilité d’une équation différentielle à deux retards qui apparait notamment dans le cadre de la mégacaryopoïèse lorsque l’on considère que les plaquettes ont une durée de vie limitée / The object of this thesis is the study, using mathematical models, of the regulation mechanism maintaining an optimal quantity of blood platelets. The first chapter presents the biological and mathematical context of the thesis. In a second chapter, we introduce a model for megakaryopoiesis assuming a regulation by the platelet quantity of both the differentiation rate of stem cells to the platelet cell line and the amount of platelets produced by each megakaryocyte. We show that the dynamic of this model corresponds to a delay differential equation x'(t) = -?x(t) + f(x(t))g(x(t - t)), and we obtain for this equation new sufficient conditions for stability and for the oscillation of solutions. In a third chapter, we analyze a second model for megakaryopoiesis in which the regulation is continuous through the maturation speed of megakaryocyte progenitors. The stability analysis requires to adapt a pre-existing framework to problems where the bifurcation parameter is not the delay, and allows to show that increasing the death rate of megakaryocyte progenitors leads to the onset of periodic solutions, in agreement with clinical observation of amegakaryocytic cyclical thrombocytopenia. The last chapter covers a differential equation with two delays that appears among others in a model of platelet production which considers that platelet death can both age-independent and age-dependent

Lors de la première transformation du bois en scierie, les grumes sont surfacées ou équarries par des têtes de fraisages appelées slabber ou canter. Sous leur action, le copeau de bois est fragmenté en plaquettes dont la valorisation est un enjeu majeur de la filière. Débouché le plus rémunérateur de cette ressource, l’industrie de la pâte à papier impose des critères dimensionnels aux plaquettes approvisionnées notamment concernant leur épaisseur. L’objectif de l’étude est donc d’améliorer la compréhension des mécanismes mis en jeu par la coupe du bois, dans une configuration simplifiée de coupe orthogonale, afin d’optimiser la granulométrie des plaquettes produites. Une campagne expérimentale de coupe sur machine-outil à commande numérique a été réalisée sur du hêtre vert afin de déterminer les mécanismes principaux actionnés. Un modèle mécanique simplifié du comportement dynamique du bois vert est déterminé, ceci afin de développer un modèle numérique du bois vert par la Méthode des Eléments Discrets (DEM) en vue de simuler sa coupe. Une étude préliminaire pour déterminer la capacité de la méthode à modéliser à l’échelle mésoscopique des milieux fortement orthotropes a été réalisée. Sa capacité et ses limites démontrées, la démarche de calibration du modèle numérique a été élaborée et le modèle sollicité en configuration de coupe orthogonale numérique. Les premières simulations présentent des résultats encourageants. / When entering sawmills, logs are faced into cants by the mean of chipper-canters. During this machining, the ribbon produced is split into small chips whose proper valorization is a high economic stake for the industry. The paper maker industry, which is the most worthwhile chips supplier, is strongly concerned by dimensional criterions of the chips for their process optimization, especially toward their thickness. The objective of this work is to improve the comprehension of cutting and fragmentation mechanisms, in a simplified orthogonal cutting configuration, to provide cutting rules to optimize the produced chips geometry. An experimental campaign dedicated to green beech cutting on a computer numerical command machining center is done to study those mechanisms. A simple mechanical model is derived, in order to develop a Discrete Element Method (DEM) model of the material to simulate cutting operations. A preliminary study dedicated to prove the capability of DEM to model a wood-like orthotropic continuous media is presented. The numerical model is then calibrated and cutting simulations are designed to copy the experimental conditions. First results are encouraging.

L’adhésion, l’activation et l’agrégation des plaquettes représentent les étapes initiales dans la formation du thrombus aux sites des lésions vasculaires. Malgré l’utilisation des médicaments antiplaquettaires comme l’Aspirine, le Plavix et les inhibiteurs de la glycoprotéine IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), l’incidence de thrombus dans la maladie coronarienne aigue reste élevée. Le dommage aux artères coronaires induit l’exposition du collagène de la matrice sous-endothéliale et sa liaison au facteur Von-Willebrand (vWF). Ceci contribue au recrutement et à l’adhésion des plaquettes via la liaison du domaine A1 du vWF à la GPIb des plaquettes. Nous avons postulé que l’inhibition de la liaison vWF/GPIb pourra représenter une stratégie efficace pour inhiber l’adhésion initiale des plaquettes et ainsi réduire la propagation du thrombus. L’objectif de notre étude était de déterminer le potentiel anti-thrombotique d’un inhibiteur du vWF. L’aptamère dirigé contre le domaine A1 du vWF (ARC1779) a été développé et fourni par la compagnie Archemix. Son effet et celui du Reopro (abciximab, inhibiteur de la GPIIb/IIIa comme témoin positif) ont été testés en utilisant du sang provenant de 5 volontaires sains et de 27 patients coronariens traités avec l’Aspirine (inhibiteur du cyclo-oxygénase ou COX) et le Plavix (anti-récepteur de l’adénosine diphosphate ou ADP), en accord avec le comité d’éthique de l’ICM. Les plaquettes ont été marquées avec l’Indium-111 afin de pouvoir quantifier leur adhésion dans le sang complet sur des surfaces artérielles porcines dénudées. L’adhésion des plaquettes a été effectuée dans des chambres de perfusion sous des forces de cisaillement de 6974/sec pendant 15 minutes à 37 °C. L’activation plaquettaire, suite à l’étude de l’adhésion, a été évaluée par l’expression de la P-sélectine et du vWF par la cytométrie en flux. L’effet de l’ARC1779 a été également déterminé sur l’agrégation plaquettaire, dans le sang complet par impédance, induite par l’acide arachidonique (AA), l’ADP, la Ristocétine et le peptide agoniste du récepteur de la thrombine-1 (TRAP-1). L’adhésion des plaquettes a été également observée par microscopie électronique à balayage. Dans un premier temps, nous avons trouvé que l’adhésion des plaquettes des volontaires sains à l’artère endommagée était élevée (80 x 106/cm2). Cette adhésion a été réduite significativement de plus que 90% par l’abciximab (100 nM) et d’une façon dose dépendante avec l’ARC1779 (25-250 nM). La perfusion du sang avec ou sans ARC1779 n’entraine pas une activation plaquettaire, telle que déterminée par l’expression de la P-sélectine et du vWF à la surface des plaquettes. Suite à ces résultats, l’étude avec le sang des patients a été poursuivie avec des doses de 25, 83 et 250 nM d’ARC1779. L’agrégation plaquettaire du sang des patients a été complètement inhibée en réponse à l’AA et à l’ADP, ce qui confirme que ces patients étaient bien traités avec l’Aspirine et le Plavix. L’adhésion des plaquettes aux surfaces artérielles endommagées a été réduite, chez les volontaires sains et les patients, d’une manière dépendante de la dose d’ARC1779, lorsqu’il était incubé avant la perfusion. Cependant, l’ARC1779 et aussi l’abciximab étaient sans effets significatifs sur l’adhésion plaquettaire, lorsqu’ils étaient ajoutés 10 minutes après la perfusion. L’inhibition de l’adhésion avec 25 nM d’ARC1779 était comparable à celle obtenue avec l’abciximab. Cependant, l’agrégation plaquettaire en réponse au TRAP-1 n’était pas affectée par l’ARC1779, alors qu’elle était complètement inhibée par l’abciximab. L’ARC1779 est un inhibiteur spécifique de la liaison du vWF au GPIb des plaquettes. Il inhibe l’adhésion plaquettaire aux surfaces artérielles endommagées sans affecter l’agrégation plaquettaire et confère une protection anti-thrombotique similaire à l’abciximab. L’ARC1779 pourra être considéré comme un nouvel antiplaquettaire qui possède des propriétés anti-thrombotiques plus intéressantes que l’abciximab. / Anti-platelet therapy in coronary artery disease (CAD) patients reduces recurrent athero-thrombosis, but at the cost of increased risk of bleeding. Because von Willebrand factor (vWF) functions predominantly in a high-shear environment, the vWF-specific aptamer, ARC1779 that blocks the binding of vWF A1-domain to platelet glycoprotein Ib, may deliver a site-specific anti-thrombotic effect while minimizing bleeding risk. We investigated the efficiency of ARC1779 on platelet activation, adhesion, and aggregation in CAD patients on double anti-platelet therapy. Blood from 27 patients taking aspirin and clopidogrel and 5 normal volunteers was labeled with 111In-autologous platelets and perfused over denuded porcine arteries at high shear rate for 15 minutes. Blood was treated with either 25, 83 and 250 nM ARC1779; 100nM abciximab or placebo, 5 min before (upstream therapy) or 10 min after (downstream therapy) beginning the perfusion. Under upstream, but not downstream therapy, platelet adhesion was significantly reduced by ARC1779 at 83 and 250 nM and by abciximab vs. placebo (4.8, 3.8 and 2.9 vs. 7.3 platelets x 106/cm2, p <0.05). In contrast to abciximab, ARC1779 did not significantly affect platelet aggregation in response to thrombin receptor activating peptide-1, arachidonic acid and adenosine diphosphate. In addition, ARC1779 was without any effect on P-selectin expression and platelet-leukocyte binding. In conclusion, ARC1779 has comparable anti-thrombotic efficacy to abciximab among CAD patients receiving aspirin and clopidogrel, but with lesser systemic effects on platelet activation and aggregation. These important proof-of-concept data form the framework for randomized clinical investigations of this novel anti-platelet therapy among CAD patients. / Drs Dandachli and Arzamendi contributed equally to this work.

Les efforts investis pour diminuer les risques de développer un infarctus du myocarde sont nombreux. Aujourd’hui les médecins prennent connaissance des divers facteurs de risque connus prédisposant aux syndromes coronariens aigus (SCA) dans le but de prendre en charge les patients «à risque» [1]. Bien que le suivi rigoureux et le contrôle de certains facteurs de risque modifiables aient permis une meilleure gestion des cas de SCA, les cas d’infarctus persistent de manière encore trop fréquente dans le monde. Puisque d’importantes études ont démontré que les SCA pouvaient survenir sans même la présence des facteurs de risque conventionnels [2, 3], les chercheurs se sont penchés sur un autre mécanisme potentiellement responsable de l’avènement des SCA : l’inflammation. L’inflammation joue un rôle prépondérant dans l’initiation, la progression et les complications de l’athérosclérose [4, 5] mais aussi dans les situations post-infarctus [6, 7]. Au cours des dernières années, le contrôle du processus inflammatoire est devenu une cible de choix dans la prévention et le traitement des SCA. Cependant, malgré les efforts investis, aucun de ces traitements ne s’est avéré pleinement efficace dans l’atteinte du but ultime visé par une diminution de l’inflammation : la diminution de la mortalité. Le complément est un système complexe reconnu principalement pour son rôle primordial dans l’immunité [2]. Cependant, lorsqu’il est activé de manière inappropriée ou excessive, il peut être à l’origine de nombreux dommages cellulaires caractéristiques de plusieurs pathologies inflammatoires dont font partie les complications de l’athérosclérose et des événements post-infarctus. Le travail effectué dans le cadre de mon doctorat vise à établir les rôles physiopathologiques du complément dans les interactions de l’axe thrombose-inflammation caractéristiques des SCA dans le but ultime d’identifier des cibles thérapeutiques permettant le développement de nouvelles approches pour la prévention et le traitement de ces pathologies. Les principaux résultats obtenus durant mon cursus suggèrent d’abord que la voie alterne du complément peut représenter une cible thérapeutique de choix dans les maladies coronariennes aiguës puisque l’activation terminale du complément semble y être principalement causée par l’activation du cette voie. De faibles niveaux sériques de MBL (mannan-binding lectin) et une activation terminale négligeable du complément caractérisent plutôt la maladie coronarienne stable. En comparant l’activité relative de chacune des voies du complément chez des cohortes de patients traités ou non par un anticorps spécifique à la protéine C5 du complément (pexelizumab), un second volet démontre quant à lui qu’une inhibition de l’activation du C5 n’a pas d’effet bénéfique majeur sur l’inhibition de la formation du complexe sC5b-9 ou sur les événements cliniques subséquents. Par conséquent, nous avons exploré, à l’aide d’un modèle in vitro, les raisons de l’inefficacité du traitement. Les résultats révèlent que le blocage du C5 avec le pexelizumab inhibe la production de l’anaphylatoxine pro-inflammatoire C5a et du complexe terminal du complément sans toutefois avoir d’effet sur l’apoptose des cellules endothéliales produites induite par le sérum des patients atteints de STEMI. Finalement, une autre section stipule que l’atorvastatine diminue l’activation du complément induite par les plaquettes sanguines chez des patients hypercholestérolémiques, mettant en évidence l’importance du rôle de cette statine dans la réduction des effets délétères de l’activation du système du complément médié par les plaquettes. Ensemble, l’étude du rôle spécifique des différentes voies d’activation du complément dans des contextes pathologiques variés, l’analyse des effets d’une inhibition spécifique de la protéine C5 du complément dans la progression des SCA et la mise en évidence des interactions entre l’activation du complément et les plaquettes activées ont contribué au développement d’une meilleure connaissance des rôles physiopathologiques du complément dans la progression de la maladie coronarienne. / Many efforts have been made in lowering the risk of myocardial infarction in the general population. Most clinicians are knowledgeable of the several identified risk factors leading to the development of acute coronary syndromes (ACS), and in turn, insure a better follow-up for “at risk” patients [1]. Despite the fact that intensive efforts in controlling modifiable risk factors have led to a better management of new cases of ACS, myocardial infarction and its deleterious consequences are still a world plague. Because it as been shown that ACS can occur without the presence of traditional risk factors [3, 4], researchers have been interested in modifying new ACS biological pathways such as inflammation. Inflammation plays a key role in the initiation, progression, and complications of atherosclerosis [5, 6], but also in post-infarction situations [7, 8]. In the past years, inflammation markers have become important targets for the prevention and treatment of ACS. Despite intensive efforts, none of the yet tested drug was found to be effective in decreasing mortality. The complement system is mainly known for its fundamental role in innate and adaptive immunity [2]. However, excessive activation of the complement can lead to a significant number of deleterious effects such as inflammation, apoptosis, necrosis and cell lysis. Earlier findings have shown that complement is extensively activated in atherosclerotic lesions, particularly in vulnerable and ruptured plaques. The objective of my doctoral project was to establish the pathophysiological roles of complement in the axis inflammation-thrombosis of ACS with the ultimate goal of identifying new therapeutic targets leading to the development of new drugs for the prevention and treatment of these diseases. The main results obtained first suggest that the complement alternative pathway represents a potential therapeutic target in acute coronary disease since terminal complement activation occurs mainly by this specific pathway. Low MBL levels (mannan-binding lectin) in serum and negligible terminal complement activation rather characterize stable coronary artery disease. By comparing the relative activity of each pathway of the complement in patients treated or not by an antibody specific to the C5 protein of the complement (pexelizumab), other results show that an inhibition of C5 activation does not have a major beneficial effect on the inhibition of the sC5b-9 complex expression or on the subsequent clinical events. Consequently, we explored, using an in vitro model of endothelial cells, the reasons of this inefficiency. This work reveals that C5 inhibition by pexelizumab inhibits the production of the pro-inflammatory anaphylatoxin C5a and of the terminal complement complex without, however, effecting endothelial cell apoptosis induced by the serum of patients with STEMI. Finally, another section stipulates that atorvastatin decreases platelet-induced complement activation in hypercholesterolemic patients, highlighting the importance of statins in the reduction of the deleterious effects of platelets-induced complement activation. All together, the study of the specific role of the various pathways of complement activation in different pathological contexts, the analysis of the effects of a specific inhibition of the C5 complement protein in the progression of ACS and the highlighting of the interactions between complement and platelet activation contribute to the development of a better knowledge of the pathophysiological roles of the complement system in ACS.

Les Cellules Endothéliales Progénitrices ("Endothelial Progenitor Cells", EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui jouent un rôle émergeant en biologie vasculaire. Les EPCs ont été localisées dans le cordon ombilical, la moelle osseuse, le sang périphérique et dans certains tissus régénérateurs. Les interactions des EPCs avec les cellules sanguines et vasculaires peuvent largement influencer leurs propriétés biologiques et dicter leur fonctionnement pendant la réparation endothéliale. Plus spécifiquement, les interactions des EPCs avec les plaquettes circulantes induisent leur migration, leur recrutement et leur différentiation en cellules endothéliales aux sites de lésions vasculaires. Cependant, l’impact d’une telle interaction sur la fonction plaquettaire n’a pas été recherché. Le but de mon projet était de :1) générer des EPCs à partir des cellules mononucléaires du sang humain périphérique ("Peripheral Blood Mononuclear Cells", PBMCs); 2) étudier les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes; 3) déterminer leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus et 4) décrire le mécanisme d’action des EPCs sur les plaquettes et le thrombus. Mises en culture sur une surface de fibronectine dans un milieu conditionné, les PBMCs fraîchement isolées possédaient une morphologie ronde et une petite taille. Après cinq jours, les PBMCs adhérentes donnaient naissance à des colonies, puis formaient une monocouche de cellules aplaties caractéristiques des EPCs après dix jours de culture. Les EPCs différenciées étaient positives pour l’Ulex-lectine et l’Acétyle des lipoprotéines de faible densité ("Acetylated Low Density Lipoprotein", Ac-LDL), exprimaient les marqueurs progéniteurs (CD34, P-sélectine, VEGFR2, vWF et VE-Cadhérine) tandis que les marqueurs leucocytaires (CD14, PSGL-1 et L-sélectine) étaient absents. Ces EPCs interagissaient avec les plaquettes activées par un mécanisme dépendant de la P-sélectine plaquettaire, inhibaient l’activation et l’agrégation plaquettaire et réduisaient significativement l’adhésion plaquettaire, principalement par l’action de prostacycline (PGI2). En fait, ceci était associé avec une augmentation de l’expression de la cyclooxygénase-2 (COX-2) et du monoxyde d’azote (NO) synthéthase inductible (iNOS). Toutefois, les effets inhibiteurs des EPCs sur la fonction plaquettaire ont été renversés par une inhibition de la COX et non pas du NO. Bien que les EPCs fussent en mesure de lier les plaquettes via la P-sélectine, leurs effets prédominants étaient médiés essentiellement par une sécrétion paracrine, impliquant la PGI2. Néanmoins, un rapprochement étroit ou un bref contact entre les EPCs et les plaquettes était requis pour que cette fonction soit complètement réalisée. D’ailleurs, cet aspect a été investigué chez des souris déficientes en P-sélectine (P-sel-/-) et chez leurs congénères de phénotype sauvage (Wild Type, WT). Chez les souris WT, les EPCs inhibaient l’agrégation plaquettaire dans le sang complet de manière concentration-dépendante alors que dans les souris P-sel-/-, l’action des EPCs n’avait pas d’effet significatif. De plus, en utilisant un modèle murin de thrombose artérielle, nous avons démontré que l’infusion systémique des EPCs altéraient la formation du thrombus et réduisaient significativement sa masse chez les souris WT, mais non pas chez les souris P-sel-/-. En outre, le nombre des EPCs incorporées au niveau du thrombus et de la paroi vasculaire était visiblement réduit chez les P-sel-/- par rapport aux souris WT. Dans cette étude, nous sommes parvenus à différentier adéquatement des EPCs à partir des PBMCs, nous avons étudié les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes, et nous avons décrit leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus. De plus, nous avons identifié la PGI2 comme étant le principal facteur soluble sécrété par les EPCs en culture et responsable de leurs effets inhibiteurs sur l’activation, l’adhésion et l’agrégation plaquettaire in vitro. De surcroît, nous avons élucidé le mécanisme d’action des EPCs sur l’agrégation plaquettaire et la formation du thrombus, in vivo, et nous avons souligné le rôle de la P-sélectine plaquettaire dans ce processus. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur la biologie des EPCs et définissent leur rôle potentiel dans la régulation de la fonction plaquettaire et la thrombogenèse. / Endothelial Progenitor Cells (EPCs) are believed to contribute to vascular biology and endothelial repair. EPCs have been isolated from umbilical cord, bone marrow, peripheral blood and in some regenerative tissues. Interactions of EPCs with vascular and blood cells can largely influence their functional properties and predict their destiny in the target tissues. More specifically, interactions of EPCs with circulating platelets provide the critical signal to ensure their migration and homing at the sites of vascular injury and their differentiation into endothelial cells. However, the functional consequences of such interactions on platelets remain unknown. Accordingly, this project was designed to investigate the impact of EPCs on platelet function and the specific objectives of this study were to: 1) generate EPCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs); 2) characterize the adhesive interactions between EPCs and platelets; 3) determine their impact on platelet function and thrombus formation and 4) elucidate the mechanistic action of EPCs on platelets and thrombus. Cultured on fibronectin in conditioned media, PBMCs differentiated, within ten days of culture, into EPCs, which were positive for Ulex-lectin and Ac-LDL (Acetylated Low Density Lipoprotein), and expressed progenitor markers (CD34, VEGFR2, vWF, and VE-Cadherin). These EPCs bind activated platelets through P-selectin-dependent mechanism, inhibited platelet activation, aggregation and adhesion, mainly via prostacyclin (PGI2) secretion. Indeed, this was associated with up-regulation of cyclooxygenase-2 (COX-2) and inducible nitric oxide (NO) synthase (iNOS). However, the effects on platelets were reversed by COX, but not by NO inhibition. Although EPCs bound platelets via platelet P-selectin, their predominant effects occurred via a paracrine secretion, implying PGI2. Nevertheless, a transitory link or brief contact between EPCs and platelets was required for this function to be fully realized. This was further depicted using a murine arterial thrombosis model in P-selectin deficient mice (P sel-/-) and their wild-type counterparts (WT). EPCs significantly impaired, in a concentration dependent-manner, collagen-induced whole blood platelet aggregation in WT mice; whereas in P-sel-/- mice, EPCs had no significant effect. Moreover, in murin model of arterial thrombosis, infusion of EPCs altered thrombus formation and significantly reduced the mass of thrombi generated in WT, but not in P-sel-/- mice. Furthermore, the number of EPCs recruited within the thrombi and along the vascular wall was visually reduced in P-sel-/- mice as compared to WT mice. In this project, we succeeded in adequately differentiating EPCs from PBMCs, we characterized the adhesive interaction between EPCs and platelets, and we addressed the impact of EPCs on platelet function and thrombus formation. Moreover, we identified PGI2 as the principal soluble factor secreted by cultured EPCs and responsible of their inhibitory effects on platelet function in vitro. In addition, using a murine model of arterial carotid injury in WT and P-sel-/- mice, we elucidate the mechanistic action of EPCs on platelet aggregation and thrombus formation, in vivo, and we highlighted the role of platelet P-selectin in this process. These findings add new insights into the biology of EPCs and reveal a potential role for EPCs in regulating platelet function, which in turn may limit thrombogenesis and maintain hemostasis at the sites of vascular injury.

Les énergies non renouvelables (essentiellement gaz, pétrole et uranium) représentent 80 % de l'énergie consommée dans le monde (Agence internationale de l'énergie atomique). Cependant, le spectre de l'amenuisement prochain de ces gisements, ainsi que les problèmes environnementaux et géopolitiques liés à leur usage tendent à remettre en cause cette prévalence. Les politiques et directives énergétiques mettent l'accent sur la sécurisation des approvisionnements et la diversification du bouquet énergétique. Or, la diversification des sources d'énergies primaires implique le développement d'énergies alternatives et renouvelables, disponibles localement. En France, un grand nombre de dispositifs sont mis en place à différents niveaux d'échelle en faveur du développement de la filière bois-énergie : appels d'offres de la Commission de Régulation de l'Énergie, appels d'offres de l'Agence de l'Environnement et de la Maitrise de l'Énergie (ADEME), programme 1000 chaufferies bois pour le milieu rural etc.

Les plaquettes sanguines sont des cellules qui ont un rôle majeur au cours des processus de l'hémostase primaire et jouent un rôle primordial dans l'immunité innée mais aussi adaptative. Ces cellules anucléées ont une capacité sécrétoire très importante de facteurs solubles notamment de cytokines, de chimiokines (CK/CH) et de facteurs immunomodulateurs. L'émergence du rôle inflammatoire des plaquettes sanguines dans la communauté scientifique a soulevé de nombreuses questions auxquelles nous essayons de répondre dans ce manuscrit. La majorité de ces questions repose sur la capacité de ces cellules anucléées à répondre de manière régulée à des stimuli complexes. Nos investigations pour répondre à ces questions ont été réalisées dans un contexte transfusion sanguine. Au cours de nos travaux, nous avons mis en évidence la corrélation des profils de sécrétion plaquettaire avec les récepteurs membranaires et les voies de signalisations intraplaquettaires engagées. Les plaquettes expriment plusieurs récepteurs immunitaires sur leur surface notamment les " Pattern recognition receptors " (PRR) et des récepteurs aux CK/CH. Nous avons démontré et caractérisé la fonction d'un nouveau récepteur plaquettaire, le Siglec-7. Ce récepteur est localisé dans les granules a ; son expression sur la membrane est corrélée avec l'état d'activation plaquettaire. Le Siglec-7 a une avidité élevée avec les molécules composées d'α2,8-disialyl (NeuAcα2,8NeuAcα2,3Gal) et de α2,6-sialyl (Gal-b1,3[NeuAcα2,6]HexNAc) (comme les gangliosides GD2, GD3 et GT1b). L'engagement de ce récepteur peut induire l'apoptose plaquettaire par la voie intrinsèque et extramitochondriale. Ce processus nécessite l'engagement du récepteur GPIIbIIIa et P2Y1 et la signalisation de la voie de PI3k. Nous avons également étudié et mis en évidence une composante inflammatoire multifactorielle dans les effets indésirables des receveurs (EIR) et trouvé dans les concentrés plaquettaires (CP), plusieurs facteurs solubles ayant une valeur prédictive élevée pour la survenue des EIR, notamment le sCD40L et l'IL-13. Nous avons confirmé que la concentration de ces facteurs augmente au cours de temps de stockage des CP, étant, en partie, responsable du taux élevé de l'EIR des CP âgés. Enfin, en plus de la conservation, les processus de préparation des CP peuvent aussi avoir des impacts sur les propriétés inflammatoires des plaquettes. Ces travaux montrent que la réponse inflammatoire plaquettaire est régulée en fonction du stimulus, permettant d'argumenter sur le rôle présumé de sentinelle des plaquettes sanguines humaines. Ainsi, mes travaux s'inscrivent dans la ré-exploration de la fonction inflammatoire des plaquettes sanguines et l'étude du rôle des plaquettes comme cellules de l'immunité à composante inflammatoire

Les cellules endothéliales progénitrices («Endothelial Progenitor Cells», EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui possèdent un potentiel considérable dans la réparation et la régénération vasculaire. Dans le contexte des maladies cardiovasculaires, la compréhension du rôle des EPCs dans la régulation de la thrombogenèse et la réparation endothéliale est pertinente et nécessaire pour comprendre leur potentiel thérapeutique. Nous avons rapporté que les EPCs interagissent avec les plaquettes via la P-sélectine et inhibent l’adhésion, l’activation et l’agrégation des plaquettes ainsi que la formation de thrombus. Plus récemment, nous avons démontré que les EPCs expriment le récepteur inflammatoire CD40 et il est bien connu que les plaquettes constituent la source principale de la forme soluble de son agoniste le CD40L («soluble CD40 Ligand», sCD40L). Ainsi, nous avons émis l’hypothèse principale que l’axe CD40L/CD40 dans les EPCs influence leurs fonctions anti-thrombotique et pro-angiogénique. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons réussi à générer des «early» et «late» EPCs à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique («Peripheral Blood Mononuclear Cells», PBMCs) en culture. Nous avons mis en évidence l’existence de l’axe CD40L/CD40 dans ces EPCs en démontrant l’expression des protéines adaptatrices, nommées les facteurs associés au récepteur du facteur de nécrose tumorale («TNF Receptor Associated Factors», TRAFs). Dans une première étude, nous avons investigué l’effet du sCD40L sur la fonction des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. En effet, nous avons démontré que le sCD40L renverse leur effet inhibiteur sur l’agrégation plaquettaire, et ce sans avoir un effet significatif sur la sécrétion de prostacycline (PGI2) et d’oxyde nitrique («Nitric Oxide», NO) par ces cellules. De plus, aucun effet du sCD40L n’a été noté sur l’apoptose et la viabilité de ces cellules. Par contre, nous avons noté une augmentation importante du stress oxydatif dans les «early» EPCs suite à leur stimulation avec le sCD40L. L’inhibition du stress oxydatif renverse l’effet du sCD40L sur les «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. Ces résultats pourraient expliquer, en partie, la fonction réduite des EPCs chez les individus présentant des niveaux élevés de sCD40L en circulation. Dans une deuxième étude, nous avons étudié l’effet de sCD40L dans la fonction des «early» EPCs en relation avec l’angiogenèse. Nous avons identifié, dans un premier temps,les métalloprotéinases de la matrice («Matrix Metalloproteinases», MMPs) qui sont sécrétées par ces cellules. Nous avons trouvé que les «early» EPCs relâchent principalement la MMP-9 et que cette relâche est augmentée par le sCD40L. Le sCD40L induit aussi la phosphorylation de la p38 MAPK qui contribue à augmenter la sécrétion de MMP-9. Des études fonctionnelles ont démontré que le prétraitement des «early» EPCs au sCD40L potentialise la réparation endothéliale des HUVECs. En conclusion, l’ensemble de nos travaux, dans le cadre de ce projet de doctorat, nous a permis d’élucider les mécanismes responsables de l’action du sCD40L sur les effets inhibiteur et angiogénique des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire et l’angiogenèse, respectivement. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur le rôle des EPCs et pourront constituer la base pour des études futures permettant de corréler les niveaux élevés du sCD40L circulant et l’incidence des maladies cardiovasculaires, particulièrement l’athérothrombose. / Endothelial progenitor cells (EPCs) are endothelial precursors which possess a considerable therapeutic potential in vascular repair and regeneration. In the context of cardiovascular diseases, the understanding of the role of EPCs in the regulation of thrombogenesis and endothelial repair is relevant and necessary to the understanding of their therapeutic potential. We have shown that EPCs interact with platelets via P-selectin and inhibit the adhesion, activation and aggregation of platelets as well as thrombus formation. Recently, we have shown that EPCs express the inflammatory receptor CD40 and it is well known that platelets are the main source of the soluble form of its agonist CD40L («soluble CD40 ligand», sCD40L). Hence, we have hypothesized that the CD40L/CD40 axis in EPCs influences the anti-thrombotic and pro-angiogenic functions of EPCs. To verify this hypothesis, we have successfully generated early and late EPCs from peripheral blood mononuclear cells in culture. We have demonstrated the existence of the CD40L/CD40 axis in EPCs by showing the expression of adaptor proteins, named tumor necrosis factor associated factors (TRAFs). In our first study, we investigated the effect of sCD40L on the function of early EPCs in platelet aggregation. Indeed, we have shown that sCD40L reverses their inhibitory effect on platelet aggregation without having an effect on prostacyclin (PGI2) and nitric oxide (NO) secretion by these cells. Moreover, no effect of sCD40L has been noted on the apoptosis and viability of these cells. However, we have shown a significant increase in oxidative stress in early EPCs following sCD40L stimulation. The inhibition of oxidative stress reverses the effect of sCD40L on early EPCs in platelet aggregation. These results could partially explain the decreased function of EPCs in individuals displaying higher levels of sCD40L in circulation. In our second study, we have studied the effect of sCD40L on the function of early EPCs in relation to angiogenesis. First, we have identified the matrix metalloproteinases (MMPs) which are secreted by these cells. We have found that early EPCs mainly release MMP-9 and that this release is increased by sCD40L. The sCD40L also induces the phosphorylation of p38 MAPK which contributes to increase the secretion of MMP-9. In functional studies, we have shown that pretreatment of early EPCs with sCD40L can potentialize HUVEC endothelial repair. In conclusion, our work in the context of this doctoral research project has allowed us to study the mechanisms involved in the role of sCD40L in the inhibitory and angiogenic function of early EPCs in platelet aggregation and angiogenesis, respectively. These results add new insights to the role of EPCs and could constitute the basis for future studies allowing for the correlation between high levels of sCD40L and the incidence of cardiovascular disease, particularly atherothrombosis.