Les plaquettes sanguines sont les principaux acteurs de l’hémostase primaire et de la thrombose, deux éléments majeurs de la physiopathologie vasculaire. Plusieurs médicaments régulent les fonctions plaquettaires mais peu de tests sont validés pour suivre leur efficacité en fonction de l’évolution clinique des patients. Mon doctorat a eu pour but de développer de nouvelles approches d’évaluation de la fonction plaquettaire. Deux essais cliniques réalisés sur des patients atteints de syndrome coronarien stable ont constitué la première partie de mon doctorat. La première étude met en évidence la nécessité d'une standardisation des tests biologiques pour la détection de patients répondant moins au clopidogrel, un inhibiteur du récepteur plaquettaire de l'ADP P2Y12. L’étude suivante montre le potentiel thérapeutique, chez ces patients, de l’inhibition conjointe de P2Y12 et du second récepteur plaquettaire de l'ADP P2Y1, sur la fonction plaquettaire. De plus, le suivi en temps réel par vidéomiscroscopie a permis de distinguer des effets précoces et tardifs des antiplaquettaires sur la formation du thrombus en chambre de perfusion. La seconde partie de mon doctorat concerne les microdomaines membranaires de type « lipid rafts » qui tiennent une place fondamentale dans les fonctions cellulaires et plaquettaires. Ainsi plusieurs récepteurs dépendent de ces microdomaines, régulant la fonction plaquettaire et les effets des médicaments antiplaquettaires. Cependant, les techniques d’étude de ces microdomaines sont complexes et peu adaptées aux études cliniques. Profitant de nouvelles sondes fluorescentes sensibles au niveau d’ordre liquide membranaire (OLM), nous avons développé une méthode de mesure de l’OLM par cytométrie de flux spectrale. Grâce à cette approche, nous avons montré que l’activation plaquettaire diminue l’OLM alors qu’il est augmenté chez des patients traités par un inhibiteur de la synthèse du cholestérol ou par le clopidogrel. Nous avons également mis en évidence, en condition de forces de cisaillement élevées correspondant à celles retrouvées au niveau de sténoses artérielles, une sous-population plaquettaire présentant un OLM plus bas. Le passage dans le domaine clinique de ces approches fondamentales qui privilégient l’étude dynamique des plaquettes pourrait permettre d’améliorer le diagnostique et le suivi de traitement de pathologies cardiovasculaires. / Blood platelets play a central role in primary hemostasis and thrombosis, two major elements of vascular physiopathology. Although a number of drugs regulate platelet functions, there are no validated tests that monitor their efficacy on the basis of the patients' clinical course. This doctorate, therefore, aims to develop novel approaches to evaluate platelet function. The first part of my work consisted of two clinical trials involving patients with stable coronary syndrome. The first study demonstrated the need for standardized biological tests to screen for patients who respond less well to clopidogrel, an ADP P2Y12 receptor antagonist. The second study showed the therapeutic potential of the joint inhibition of P2Y12 and P2Y1 receptors on platelet adhesion, activation, and aggregation for these patients. Furthermore, a video microscopy model using perfusion chambers made it possible to monitor the course of thrombosis in real time, and enabled us to dissociate the early and late effects of the antiplatelet drugs. Lipid raft membrane microdomains play a pivotal role in many cell functions. At the platelet level, many receptors depend on these microdomains and thus modulate the function as well as the drug sensitivity of platelets. However, current techniques for the study of these microdomains are complex and limit their clinical applications. By taking advantage of new fluorescent probes that are sensitive to the level of the membrane order, we developed a method of measuring the membrane order using spectral flow cytometry. Through this approach we showed that platelet activation reduced the lipid order of the membranes, whereas it was increased in patients treated with a cholesterol synthesis inhibitor or clopidogrel. It was also possible for us to demonstrate the appearance, under shear stress similar to that of stenotic arteries, of a platelet sub-population with a very low membrane order. These approaches which privilege the dynamic study of thrombi and platelets could be applied to the clinical practice and thus widen the fields of clinical studies.

Lors du phénomène d’hémostase primaire ou de thrombose vasculaire, les plaquettes sanguines doivent adhérer aux parois afin de remplir leur fonction réparatrice ou pathologique. Pour ce faire, certains facteurs rhéologiques et hémodynamiques tels que l’hématocrite, le taux de cisaillement local et les contraintes de cisaillement pariétal, entrent en jeu afin d’exclure les plaquettes sanguines de l’écoulement principal et de les transporter vers le site endommagé ou enflammé. Cette exclusion pourrait aussi être influencée par l’agrégation de globules rouges qui est un phénomène naturel présent dans tout le système cardiovasculaire selon les conditions d’écoulement. La dérive de ces agrégats de globules rouges vers le centre des vaisseaux provoque la formation de réseaux d’agrégats dont la taille et la complexité varient en fonction de l’hématocrite et des conditions de cisaillement présentes. Il en résulte un écoulement bi-phasique avec un écoulement central composé d’agrégats de globules rouges avoisinés par une région moins dense en particules où l’on peut trouver des globules rouges singuliers, des petits rouleaux de globules rouges et une importante concentration en plaquettes et globules blancs. De ce fait, il est raisonnable de penser que plus la taille des agrégats qui occupent le centre du vaisseau augmente, plus il y aura de plaquettes expulsées vers les parois vasculaires. L'objectif du projet est de quantifier, in vitro, la migration des plaquettes sanguines en fonction du niveau d’agrégation érythrocytaire présent, en faisant varier l’hématocrite, le taux de cisaillement et en promouvant l’agrégation par l’ajout d’agents tels que le dextran à poids moléculaire élevé. Cependant, le comportement non Newtonien du sang dans un écoulement tubulaire peut être vu comme un facteur confondant à cause de son impact sur l’organisation spatiale des agrégats de globules rouges. De ce fait, les études ont été réalisées dans un appareil permettant de moduler, de façon homogène, la taille et la structure de ces agrégats et de quantifier ainsi leur effet sur la migration axiale des plaquettes. Du sang de porc anti coagulé a été ajusté à différents taux d’hématocrite et insérer dans un appareil à écoulement de Couette, à température ambiante. Les plaquettes sanguines, difficilement isolables in vitro sans en activer certains ligands membranaires, ont été remplacées par des fantômes en polystyrène ayant un revêtement de biotine. La quantification de la migration de ces fantômes de plaquettes a été réalisée grâce à l’utilisation de membranes biologiques fixées sur les parois internes de l’entrefer du rhéomètre de Couette. Ces membranes ont un revêtement de streptavidine assurant une très forte affinité d’adhésion avec les microparticules biotynilées. À 40% d’hématocrite, à un cisaillement de 2 s-1, 566 ± 53 microparticules ont été comptées pour un protocole préétabli avec du sang non agrégeant, comparativement à 1077 ± 229 pour du sang normal et 1568 ± 131 pour du sang hyper agrégeant. Les résultats obtenus suggèrent une nette participation de l’agrégation érythrocytaire sur le transport des fantômes de plaquettes puisque l’adhésion de ces derniers à la paroi du rhéomètre de Couette augmente de façon quasi exponentielle selon le niveau d’agrégation présent. / During the primary hemostatis or thrombosis phenomenon, the human blood platelets must adhere to the vascular wall in order for them to perform their repairing or pathological function. To do so, certain rheological and hemodynamic factors such as the hematocrit, local shear rate and the wall shear stress, must come into play to exclude blood platelets from the main blood stream and transport them to the vicinity of the damaged or inflamed site. This exclusion could also be influenced by red blood cell aggregation which is a natural process present throughout the entire cardiovascular system under certain flow conditions. The displacement of these rouleaux of red blood cells towards the centre of the vessel induces the formation of 3D networks of aggregates whose size and complexity vary as a function of the hematocrit and the shearing conditions present. It results in a two phase flow with an inner core composed of red blood cell aggregates surrounded by single red blood cells or small aggregates and large numbers of white blood cells and platelets. It is therefore reasonable to believe that the larger the inner core becomes, the more platelets will be expulsed towards the vascular wall. The objective of the study was to quantify, in vitro, the lateral migration of blood platelets as a function of the level of red blood cell aggregation present, by changing the hematocrit, the shear rate and by promoting red blood cell aggregation with the use of agents such as high molecular weight dextran. However, the non Newtonian behavior of blood in tube flow can be seen as a confounding factor to the understanding of the spatial organization of the red blood cell aggregates. In this study, whole blood was circulated in a simple shear flow apparatus, which allowed to homogeneously modulate the red blood cell aggregate sizes and structure, and quantify their effect on the axial migration of blood platelets. Anticoagulated porcine bloods were adjusted to different hematocrits and inserted into a Couette flow apparatus, at room temperature. Blood platelets, difficult to isolate in vitro without activating in a non reproducible manner specific membrane ligands, were replaced with biotin coated fluorescent polystyrene beads. The quantification of the migration of these platelet ghosts was conducted with the use of biological membranes fixed on the interior walls of the Couette apparatus. These streptavidin coated membranes ensure a strong adhesive affinity with the biotynilated beads. At 40% hematocrit and at a shear of 2 s-1, 566 ± 53 micro particles were counted for non aggregated erythrocytes, 1077 ± 229 for aggregating red blood cells and 1568 ± 131 for hyper aggregating blood. The results obtained suggest a strong participation of the red blood cell aggregation on the transport of platelet ghosts since the number of ghost cells fixed on the wall of the Couette rheometer increases almost exponentially with the level of aggregation present.

En inhibant la formation de caillots dans le sang, les médicaments antiplaquettaires diminuent de façon importante le risque d’événements ischémiques aigus. Cependant, une sous-population de patients souffrant de maladie coronarienne présente une inhibition inadéquate de la fonction plaquettaire malgré la prise quotidienne d’acide acétylsalicylique (AAS). Le premier volet de cette thèse démontre qu’une régénération plaquettaire accélérée pourrait expliquer en partie la variabilité dans la persistance de l’effet antiplaquettaire de l’AAS chez certains sujets souffrant de maladie coronarienne. Ces données suggèrent qu’une augmentation de la fréquence d’administration d’AAS d’une à deux fois par jour pourrait être bénéfique chez ces sujets. Des méta-analyses ont suggéré qu’une réponse plaquettaire inadéquate à l’AAS pourrait augmenter le risque d’événements ischémiques récurrents. La nature rétrospective de ces analyses ne permet pas d’établir la causalité. Dans le deuxième volet de cette thèse, les résultats d’une étude prospective visant à comparer la pertinence clinique de 6 tests de fonction plaquettaire fréquemment utilisés pour évaluer la réponse plaquettaire à l’AAS est présentée. Les résultats démontrent qu’aucun des tests de fonction plaquettaire couramment employés ne prédit la survenue d’événements ischémiques aigus chez des patients souffrant de maladie coronarienne stable. Toutefois, la cessation de la prise d’AAS est un prédicteur important d’événements thrombotiques. La cessation de médicaments antiplaquettaires a souvent été associée à la survenue d’événements thrombotiques dans les jours suivant l’interruption. À savoir si la survenue de ces événements est attribuable uniquement au retrait d’un médicament protecteur ou plutôt à une sensibilisation plaquettaire, constitue un débat d’actualité. Dans le troisième volet de cette thèse, des données sont présentées démontrant que la cessation de clopidogrel après la période recommandée par les lignes directrices actuelles provoque une sensibilisation des plaquettes nouvellement formées aux stimuli plaquettaires physiologiques. Ces résultats encouragent la recherche sur différentes modalités pour atténuer le risque thrombotique accru chez ces patients souffrant de maladie coronarienne. En conclusion, cet ouvrage présente des études visant à identifier les sous-populations de patients qui sont plus à risque de complications cardiovasculaires récurrentes. Dans ce contexte, la personnalisation de traitement est une avenue thérapeutique prometteuse, où chaque patient pourra recevoir un traitement ciblé en fonction de ses besoins et de ses contre-indications. Ce changement de paradigme d’une thérapie empirique issue d’études de grande envergure sur des données populationnelles à une thérapie ajustée aux besoins individuels représente un vaste champ de recherche, où la majorité des découvertes sont à faire. / By inhibiting the formation of blood clots, antiplatelet drugs significantly reduce the risk of acute ischemic events. However, a subpopulation of patients suffering from coronary artery disease presents with an inadequate inhibition of platelet function despite taking acetylsalicylic acid (ASA) daily. The first part of this thesis demonstrates that accelerated platelet turnover could partly explain the variability in the persistence of the antiplatelet effect of ASA in some coronary artery disease patients. These results suggest that increasing the frequency of administration of ASA from once to twice daily may be beneficial in selected patients. Meta-analyses have suggested that an inadequate platelet response to ASA may increase the risk of recurrent ischemic events. The retrospective nature of these analyses forbids the inference of causality. In the second part of this thesis, the results of a prospective study comparing the clinical relevance of 6 platelet function tests commonly used to assess platelet response to ASA are presented. The results show that none of the commonly used platelet function tests predict the occurrence of acute ischemic events in stable coronary artery disease patients. However, discontinuation of ASA is an important predictor of thrombotic events. Discontinuation of antiplatelet drugs has often been associated with thrombotic events in the days following cessation. If the occurrence of these events is due solely to the withdrawal of a protective drug or rather platelet sensitization is a topic of some debate. In the third part of this thesis, data are presented demonstrating that clopidogrel discontinuation, after the period recommended by current guidelines, leads to sensitization of newly formed platelets to physiological platelet stimuli. These results encourage research on different ways to mitigate the increased risk of thrombosis in coronary artery disease patients scheduled to discontinue clopidogrel therapy. In conclusion, this dissertation presents studies aiming to identify subpopulations of patients who are at increased risk of recurrent cardiovascular events. In this context, the personalization of treatment is a promising therapeutic avenue, where each patient can receive a targeted therapy according to his needs and contraindications. This shift in paradigm from empirical therapy based on population data retrieved from large clinical studies to therapy tailored to individual needs opens a vast field of research, where the majority of discoveries remain to be made.

L'interleukine IL-18 (IL-18), un membre de la famille de l’IL-1, est une cytokine pro-inflammatoire multifonctionnelle. Elle est produite par les monocytes, les macrophages, les cellules dendritiques, les cellules épithéliales, les kératinocytes et le cortex surrénal dans le corps humain. Cette cytokine est d'abord produite comme une protéine précurseure inactive, qui est par la suite clivée en une forme mature par la caspase-1 activée. La caspase, en elle-même, existe comme précurseur inactif dans les cellules humaines et requiert l'assemblage d'inflammasomes pour son activation. L'IL-18 pour joue un rôle clé dans la médiation des conditions inflammatoires. Notre laboratoire et d'autres ont montré que l'infection par le VIH est accompagnée d'une augmentation des taux circulants d'IL-18 avec une diminution des niveaux de son antagoniste, l'interleukine-18 binding protein (IL-18BP). Dans cette thèse, nous démontrons pour que l'IL-18 est également produite et sécrétée par les plaquettes humaines lors de leur activation. Les plaquettes contiennent des composants de l'inflammasome. Ils assemblent et activent la caspase-1, qui ensuite traite le précurseur de l'IL-18 dans sa forme mature au cours du processus d'activation des plaquettes. La cytokine est synthétisée de novo lors de l'activation des plaquettes. Contrairement à l'IL-18, les plaquettes expriment constitutivement l’IL-18BP, et la libèrent de manière constitutive, ainsi que lors de l'activation. L'IL-18 et l'IL-18BP sont colocalisés avec CD63, un marqueur pour les granules α des plaquettes. L'IL-18 libéré des plaquettes constitue la source principale de cette cytokine dans la circulation humaine chez les individus sains. Nous avons identifié des concentrations faibles de cette cytokine dans les lysats de plaquettes chez les individus infectés par le VIH par rapport à ceux en santé. D'autre part, les concentrations ont été augmentées dans le sérum et le plasma pauvre en plaquettes chez les individus infectés. Des résultats similaires ont été obtenus avec l'IL-18BP dans les lysats de plaquettes d'individus sains et infectés par le VIH. Cependant, des quantités plus faibles de cet antagoniste ont été trouvées dans le sérum et le plasma pauvre en plaquettes d'individus infectés par le VIH par rapport à ceux en santé. Nos résultats ont des implications importantes pour les maladies inflammatoires chroniques dans laquelle une activité accrue de l'IL-18 joue un rôle pathogène. Le VIH est également accompagné par une inflammation intestinale et une diminution de l'intégrité intestinale, mesurée par la réparation de la muqueuse, la régénération et la perméabilité. Cependant, on en sait peu sur la relation entre le niveau élevé de l'IL-18 associé à l'infection au VIH et la perméabilité intestinale: ceci n'a jamais été étudié. Dans cette thèse, nous démontrons le rôle du virus et sa protéine Tat à augmenter la production d'IL-18 chez deux lignées de cellules épithéliales intestinales (HT29 et Caco2) ainsi qu'une diminution de l'IL-18BP. L'IL-18 induit une hyperperméabilité de la barrière épithéliale en perturbant à la fois les jonctions serrées et adhérentes, et ce, en modulant l'expression et la distribution de l'occludine, de claudine-2 et de la bêta-caténine. Une désorganisation de l'actine F a également été observée dans les cellules lors de l'incubation avec l'IL-18. Les mêmes observations ont été faites avec la protéine Tat du VIH-1. Après une incubation prolongée, l'IL-18 a causé la mort des cellules intestinales et induit l'apoptose par l'activation de la caspase-1 et la caspase-3. Fait intéressant, les taux plasmatiques de lipopolysaccharides chez trois catégories différentes de patients au VIH (ART-naïf, ART-traitée et contrôleurs élite) sont en corrélation avec les niveaux plasmatiques de l'IL-18. Enfin, nous avons étudié la voie de signalisation à travers laquelle l'IL-18 induit une perméabilité intestinale accrue. En bref, nos études identifient les plaquettes comme une source importante d'IL-18, et leur activation lors d'une infection à VIH contribue à des concentrations accrues de cette cytokine. Le virus entraine également l'augmentation de la production de cytokines par les cellules épithéliales intestinales. L'activité biologique accrue de ces cytokines contribue à la pathogenèse du sida en augmentant la perméabilité intestinale et en causant la mort des cellules intestinales. L'IL-18 pourrait servir de cible moléculaire pour retarder la progression du sida et réduire l'inflammation chronique dans un stade précoce d'une infection à VIH. / Interleukin IL-18 (IL-18), a member of the IL-1 family, is a multifunctional pro-inflammatory cytokine. It is known to be produced by monocytes, macrophages, dendritic cells, keratinocytes and the adrenal cortex in the human body. This cytokine is produced as an inactive precursor protein, which is cleaved into mature form by activated caspase-1. The caspase itself exists as an inactive precursor in human cells and requires inflammasomes assembly for its activation. IL-18 has been shown to play a key role in mediating different inflammatory conditions. Our laboratory and others have shown that HIV infection is accompanied with increased circulating levels of IL-18 along with decreased levels of its antagonist IL-18 Binding Protein (IL-18BP). In this thesis, we show that IL-18 is also produced and secreted by human platelets upon activation. The platelets also contain components of the inflammasome. They assemble and activate caspase-1 and process the precursor IL-18 into its mature form during the platelet activation process. The cytokine is synthesized in platelets de novo upon activation. Contrary to IL-18, the platelets constitutively express pre-formed IL-18BP, and release it constitutively as well as upon activation. Both IL-18 and IL-18BP colocalized with CD63, a marker for the platelet α granules. Platelet-released IL-18 constitutes the main source of this cytokine in the human circulation in healthy individuals. We found decreased amounts of this cytokine in the platelet lysates in HIV-infected individuals as compared to the healthy ones. On the other hand, its concentrations were increased in the serum and platelet-poor plasma in infected individuals. Similar findings were obtained with IL-18BP in platelet lysates from healthy and HIV-infected individuals. However, lower amounts of this IL-18 antagonist were found in the serum and platelet-poor plasma from HIV-infected individuals compared with the healthy ones. Our findings have important implications for chronic inflammatory disease conditions in which increased IL-18 activities play a pathogenic role. HIV is also accompanied by intestinal inflammation and decreased intestinal integrity as measured by mucosal repair, regeneration and permeability. However, little is known concerning the relation between high level of IL-18 associated to HIV infection and intestinal permeability. In this thesis, we demonstrate the role of HIV and its protein Tat in increasing IL-18 production in two intestinal epithelial cell lines (HT29 and Caco2) and decreasing IL-18BP. IL-18 induces epithelial barrier hyperpermeability by disrupting both tight and adherens Junctions by modulating expression and distribution of occludin, claudin-2 and beta-catenin. Disorganization of F-actin was also observed within the cells upon incubation with treated by IL-18. Upon prolonged incubation, IL-18 caused intestinal cells death and induced apoptosis by activating caspase-1 and caspase-3. Interestingly, the plasma levels of lipopolysaccharide in three different categories of HIV-infected patients (ART-naïve, ART-treated and Elite controllers) correlated with their IL-18 plasma levels. Finally we investigated the signaling pathway through which IL-18 induces increased intestinal permeability. Briefly, our studies identified platelets as an important source of IL-18, and their activation in HIV infection contributes to enhanced concentrations of the cytokine. The virus also induces increased production of the cytokine from intestinal epithelial cells. Increased biological activities of the cytokine contribute towards AIDS pathogenesis by increasing intestinal permeability and causing death of intestinal cells. The cytokine may serve as a molecular target for delaying AIDS progression and reducing low-grade chronic inflammation in HIV infection.

Un nombre croissant de preuves suggèrent le rôle bénéfique des anthocyanes alimentaires, composés phyto-chimiques principalement présents dans les baies et les produits dérivés, sur la santé cardiovasculaire. Ces bénéfices peuvent être attribués à leur effet sur les cellules endothéliales ou les plaquettes qui sont les acteurs clés dans le développement des maladies cardiovasculaires (MCV). Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents aux effets cardio-protecteurs de l'anthocyanine ne sont pas entièrement compris. L'objectif de cette thèse était d'évaluer l'effet in vitro des anthocyanines et de leurs métabolites, dans des conditions physiologiques, sur la fonction endothéliale et plaquettaire et d'identifier les mécanismes sous-jacents à leur action. Les résultats de ma thèse ont montré que le prétraitement des cellules endothéliales avec des concentrations physiologiques d'anthocyanes et de leurs métabolites circulants diminue l'adhésion des monocytes aux cellules endothéliales activées ainsi que leur migration transendothéliale qui sont les étapes initiales du développement de l'athérosclérose précédant le MCV. En accord avec ces résultats, l'analyse de l'expression génique a révélé que le traitement des cellules endothéliales avec ces molécules modulait l'expression des gènes impliqués dans la régulation de l'adhésion cellulaire, le réarrangement du cytosquelette d'actine, l'adhésion focale et la transmigration leucocytaire. Les analyses bioinformatiques de ces données ont permis d'identifier les facteurs de transcription potentiellement impliqués dans les effets nutrigénomiques observés ainsi que les protéines de signalisation cellulaire régulant leur activité. Les analyses bioinformatiques ont permit d’identifier des protéines de signalisation cellulaire auxquelles ces bioactifs peuvent se lier et potentiellement affecter leur activité entraînant modification d’activité des protéines de signalisation en aval. L’impact sur des facteurs de transcription a également été cherché et ces effets ont été confirmés par les résultats obtenus des analyses par Western blot. Les anthocyanines et leurs métabolites ont également modulé l'expression de microARN, en particulier ceux impliqués dans la régulation de la perméabilité des cellules endothéliales, contribuant ainsi aux changements observés dans la fonction endothéliale. En plus de leurs effets sur les cellules endothéliales, les résultats de mes travaux ont également montré la capacité des anthocyanes et de leurs métabolites à moduler la fonction plaquettaire en diminuant l'activation plaquettaire et leur agrégation avec les leucocytes, qui contribuent fortement au développement des MCV.En conclusion, les résultats de ma thèse ont révélé les effets positifs des anthocyanes et de leurs métabolites, aux concentrations physiologiques, sur la fonction endothéliale et plaquettaire et ont fourni de nouvelles informations sur les mécanismes sous-jacents de leurs effets cardio-protecteurs. / Increasing number of scientific evidence suggests the beneficial role of dietary anthocyanins, phytochemicals mainly present in berries and derived products, in cardiovascular health. These anthocyanin health benefits may be attributed to their effect on endothelial cells or platelets that represent the key players in the development of cardiovascular diseases (CVD). However, the exact molecular mechanisms underlying anthocyanin cardioprotective effects are not fully understood. The aim of this thesis was to investigate the effect of anthocyanins and their metabolites in vitro on endothelial and platelet function and identify the underlying mechanisms of their action using physiologically relevant conditions.Results from this thesis showed that the pretreatment of endothelial cells with physiologically relevant concentrations of circulating anthocyanins and their metabolites attenuated monocyte adhesion to activated endothelial cells as well as their transendothelial migration, which are the initial steps in the development of atherosclerosis that precede CVD. In agreement with these results, gene expression analysis revealed that the treatment of endothelial cells with these compounds modulated the expression of genes involved in regulation of cell-cell adhesion, actin cytoskeleton reorganisation, focal adhesion and leukocyte transmigration. Bioinformatics analyses of gene expression data allowed the identification of potential transcription factors involved in the observed nutrigenomic effects and cell signalling proteins regulating their activity.Molecular docking analyses further revealed cell signalling proteins to which these bioactives may bind to and potentially affect their activity and the activation of downstream signalling proteins and transcription factors, effects that were in agreement with the results of Western blot analyses. Anthocyanins and their metabolites also modulated the expression of microRNAs, especially those involved in regulation of endothelial cell permeability, contributing to the observed changes in endothelial cell function.In addition to their effects on endothelial cells, anthocyanins and their metabolites displayed the capacity to modulate platelet function by decreasing platelet activation and their aggregation with leukocytes, the processes that are important contributors to CVD development.In conclusion, results from this thesis revealed the positive effects of anthocyanins and their metabolites, at physiologically relevant concentrations, on endothelial and platelet function and provided new insights into the mechanisms underlying their cardioprotective effects.

Les plaquettes sanguines sont les principaux acteurs de l’hémostase primaire et de la thrombose, deux éléments majeurs de la physiopathologie vasculaire. Plusieurs médicaments régulent les fonctions plaquettaires mais peu de tests sont validés pour suivre leur efficacité en fonction de l’évolution clinique des patients. Mon doctorat a eu pour but de développer de nouvelles approches d’évaluation de la fonction plaquettaire. Deux essais cliniques réalisés sur des patients atteints de syndrome coronarien stable ont constitué la première partie de mon doctorat. La première étude met en évidence la nécessité d'une standardisation des tests biologiques pour la détection de patients répondant moins au clopidogrel, un inhibiteur du récepteur plaquettaire de l'ADP P2Y12. L’étude suivante montre le potentiel thérapeutique, chez ces patients, de l’inhibition conjointe de P2Y12 et du second récepteur plaquettaire de l'ADP P2Y1, sur la fonction plaquettaire. De plus, le suivi en temps réel par vidéomiscroscopie a permis de distinguer des effets précoces et tardifs des antiplaquettaires sur la formation du thrombus en chambre de perfusion. La seconde partie de mon doctorat concerne les microdomaines membranaires de type « lipid rafts » qui tiennent une place fondamentale dans les fonctions cellulaires et plaquettaires. Ainsi plusieurs récepteurs dépendent de ces microdomaines, régulant la fonction plaquettaire et les effets des médicaments antiplaquettaires. Cependant, les techniques d’étude de ces microdomaines sont complexes et peu adaptées aux études cliniques. Profitant de nouvelles sondes fluorescentes sensibles au niveau d’ordre liquide membranaire (OLM), nous avons développé une méthode de mesure de l’OLM par cytométrie de flux spectrale. Grâce à cette approche, nous avons montré que l’activation plaquettaire diminue l’OLM alors qu’il est augmenté chez des patients traités par un inhibiteur de la synthèse du cholestérol ou par le clopidogrel. Nous avons également mis en évidence, en condition de forces de cisaillement élevées correspondant à celles retrouvées au niveau de sténoses artérielles, une sous-population plaquettaire présentant un OLM plus bas. Le passage dans le domaine clinique de ces approches fondamentales qui privilégient l’étude dynamique des plaquettes pourrait permettre d’améliorer le diagnostique et le suivi de traitement de pathologies cardiovasculaires. / Blood platelets play a central role in primary hemostasis and thrombosis, two major elements of vascular physiopathology. Although a number of drugs regulate platelet functions, there are no validated tests that monitor their efficacy on the basis of the patients' clinical course. This doctorate, therefore, aims to develop novel approaches to evaluate platelet function. The first part of my work consisted of two clinical trials involving patients with stable coronary syndrome. The first study demonstrated the need for standardized biological tests to screen for patients who respond less well to clopidogrel, an ADP P2Y12 receptor antagonist. The second study showed the therapeutic potential of the joint inhibition of P2Y12 and P2Y1 receptors on platelet adhesion, activation, and aggregation for these patients. Furthermore, a video microscopy model using perfusion chambers made it possible to monitor the course of thrombosis in real time, and enabled us to dissociate the early and late effects of the antiplatelet drugs. Lipid raft membrane microdomains play a pivotal role in many cell functions. At the platelet level, many receptors depend on these microdomains and thus modulate the function as well as the drug sensitivity of platelets. However, current techniques for the study of these microdomains are complex and limit their clinical applications. By taking advantage of new fluorescent probes that are sensitive to the level of the membrane order, we developed a method of measuring the membrane order using spectral flow cytometry. Through this approach we showed that platelet activation reduced the lipid order of the membranes, whereas it was increased in patients treated with a cholesterol synthesis inhibitor or clopidogrel. It was also possible for us to demonstrate the appearance, under shear stress similar to that of stenotic arteries, of a platelet sub-population with a very low membrane order. These approaches which privilege the dynamic study of thrombi and platelets could be applied to the clinical practice and thus widen the fields of clinical studies.

Lors du phénomène d’hémostase primaire ou de thrombose vasculaire, les plaquettes sanguines doivent adhérer aux parois afin de remplir leur fonction réparatrice ou pathologique. Pour ce faire, certains facteurs rhéologiques et hémodynamiques tels que l’hématocrite, le taux de cisaillement local et les contraintes de cisaillement pariétal, entrent en jeu afin d’exclure les plaquettes sanguines de l’écoulement principal et de les transporter vers le site endommagé ou enflammé. Cette exclusion pourrait aussi être influencée par l’agrégation de globules rouges qui est un phénomène naturel présent dans tout le système cardiovasculaire selon les conditions d’écoulement. La dérive de ces agrégats de globules rouges vers le centre des vaisseaux provoque la formation de réseaux d’agrégats dont la taille et la complexité varient en fonction de l’hématocrite et des conditions de cisaillement présentes. Il en résulte un écoulement bi-phasique avec un écoulement central composé d’agrégats de globules rouges avoisinés par une région moins dense en particules où l’on peut trouver des globules rouges singuliers, des petits rouleaux de globules rouges et une importante concentration en plaquettes et globules blancs. De ce fait, il est raisonnable de penser que plus la taille des agrégats qui occupent le centre du vaisseau augmente, plus il y aura de plaquettes expulsées vers les parois vasculaires. L'objectif du projet est de quantifier, in vitro, la migration des plaquettes sanguines en fonction du niveau d’agrégation érythrocytaire présent, en faisant varier l’hématocrite, le taux de cisaillement et en promouvant l’agrégation par l’ajout d’agents tels que le dextran à poids moléculaire élevé. Cependant, le comportement non Newtonien du sang dans un écoulement tubulaire peut être vu comme un facteur confondant à cause de son impact sur l’organisation spatiale des agrégats de globules rouges. De ce fait, les études ont été réalisées dans un appareil permettant de moduler, de façon homogène, la taille et la structure de ces agrégats et de quantifier ainsi leur effet sur la migration axiale des plaquettes. Du sang de porc anti coagulé a été ajusté à différents taux d’hématocrite et insérer dans un appareil à écoulement de Couette, à température ambiante. Les plaquettes sanguines, difficilement isolables in vitro sans en activer certains ligands membranaires, ont été remplacées par des fantômes en polystyrène ayant un revêtement de biotine. La quantification de la migration de ces fantômes de plaquettes a été réalisée grâce à l’utilisation de membranes biologiques fixées sur les parois internes de l’entrefer du rhéomètre de Couette. Ces membranes ont un revêtement de streptavidine assurant une très forte affinité d’adhésion avec les microparticules biotynilées. À 40% d’hématocrite, à un cisaillement de 2 s-1, 566 ± 53 microparticules ont été comptées pour un protocole préétabli avec du sang non agrégeant, comparativement à 1077 ± 229 pour du sang normal et 1568 ± 131 pour du sang hyper agrégeant. Les résultats obtenus suggèrent une nette participation de l’agrégation érythrocytaire sur le transport des fantômes de plaquettes puisque l’adhésion de ces derniers à la paroi du rhéomètre de Couette augmente de façon quasi exponentielle selon le niveau d’agrégation présent. / During the primary hemostatis or thrombosis phenomenon, the human blood platelets must adhere to the vascular wall in order for them to perform their repairing or pathological function. To do so, certain rheological and hemodynamic factors such as the hematocrit, local shear rate and the wall shear stress, must come into play to exclude blood platelets from the main blood stream and transport them to the vicinity of the damaged or inflamed site. This exclusion could also be influenced by red blood cell aggregation which is a natural process present throughout the entire cardiovascular system under certain flow conditions. The displacement of these rouleaux of red blood cells towards the centre of the vessel induces the formation of 3D networks of aggregates whose size and complexity vary as a function of the hematocrit and the shearing conditions present. It results in a two phase flow with an inner core composed of red blood cell aggregates surrounded by single red blood cells or small aggregates and large numbers of white blood cells and platelets. It is therefore reasonable to believe that the larger the inner core becomes, the more platelets will be expulsed towards the vascular wall. The objective of the study was to quantify, in vitro, the lateral migration of blood platelets as a function of the level of red blood cell aggregation present, by changing the hematocrit, the shear rate and by promoting red blood cell aggregation with the use of agents such as high molecular weight dextran. However, the non Newtonian behavior of blood in tube flow can be seen as a confounding factor to the understanding of the spatial organization of the red blood cell aggregates. In this study, whole blood was circulated in a simple shear flow apparatus, which allowed to homogeneously modulate the red blood cell aggregate sizes and structure, and quantify their effect on the axial migration of blood platelets. Anticoagulated porcine bloods were adjusted to different hematocrits and inserted into a Couette flow apparatus, at room temperature. Blood platelets, difficult to isolate in vitro without activating in a non reproducible manner specific membrane ligands, were replaced with biotin coated fluorescent polystyrene beads. The quantification of the migration of these platelet ghosts was conducted with the use of biological membranes fixed on the interior walls of the Couette apparatus. These streptavidin coated membranes ensure a strong adhesive affinity with the biotynilated beads. At 40% hematocrit and at a shear of 2 s-1, 566 ± 53 micro particles were counted for non aggregated erythrocytes, 1077 ± 229 for aggregating red blood cells and 1568 ± 131 for hyper aggregating blood. The results obtained suggest a strong participation of the red blood cell aggregation on the transport of platelet ghosts since the number of ghost cells fixed on the wall of the Couette rheometer increases almost exponentially with the level of aggregation present.

En inhibant la formation de caillots dans le sang, les médicaments antiplaquettaires diminuent de façon importante le risque d’événements ischémiques aigus. Cependant, une sous-population de patients souffrant de maladie coronarienne présente une inhibition inadéquate de la fonction plaquettaire malgré la prise quotidienne d’acide acétylsalicylique (AAS). Le premier volet de cette thèse démontre qu’une régénération plaquettaire accélérée pourrait expliquer en partie la variabilité dans la persistance de l’effet antiplaquettaire de l’AAS chez certains sujets souffrant de maladie coronarienne. Ces données suggèrent qu’une augmentation de la fréquence d’administration d’AAS d’une à deux fois par jour pourrait être bénéfique chez ces sujets. Des méta-analyses ont suggéré qu’une réponse plaquettaire inadéquate à l’AAS pourrait augmenter le risque d’événements ischémiques récurrents. La nature rétrospective de ces analyses ne permet pas d’établir la causalité. Dans le deuxième volet de cette thèse, les résultats d’une étude prospective visant à comparer la pertinence clinique de 6 tests de fonction plaquettaire fréquemment utilisés pour évaluer la réponse plaquettaire à l’AAS est présentée. Les résultats démontrent qu’aucun des tests de fonction plaquettaire couramment employés ne prédit la survenue d’événements ischémiques aigus chez des patients souffrant de maladie coronarienne stable. Toutefois, la cessation de la prise d’AAS est un prédicteur important d’événements thrombotiques. La cessation de médicaments antiplaquettaires a souvent été associée à la survenue d’événements thrombotiques dans les jours suivant l’interruption. À savoir si la survenue de ces événements est attribuable uniquement au retrait d’un médicament protecteur ou plutôt à une sensibilisation plaquettaire, constitue un débat d’actualité. Dans le troisième volet de cette thèse, des données sont présentées démontrant que la cessation de clopidogrel après la période recommandée par les lignes directrices actuelles provoque une sensibilisation des plaquettes nouvellement formées aux stimuli plaquettaires physiologiques. Ces résultats encouragent la recherche sur différentes modalités pour atténuer le risque thrombotique accru chez ces patients souffrant de maladie coronarienne. En conclusion, cet ouvrage présente des études visant à identifier les sous-populations de patients qui sont plus à risque de complications cardiovasculaires récurrentes. Dans ce contexte, la personnalisation de traitement est une avenue thérapeutique prometteuse, où chaque patient pourra recevoir un traitement ciblé en fonction de ses besoins et de ses contre-indications. Ce changement de paradigme d’une thérapie empirique issue d’études de grande envergure sur des données populationnelles à une thérapie ajustée aux besoins individuels représente un vaste champ de recherche, où la majorité des découvertes sont à faire. / By inhibiting the formation of blood clots, antiplatelet drugs significantly reduce the risk of acute ischemic events. However, a subpopulation of patients suffering from coronary artery disease presents with an inadequate inhibition of platelet function despite taking acetylsalicylic acid (ASA) daily. The first part of this thesis demonstrates that accelerated platelet turnover could partly explain the variability in the persistence of the antiplatelet effect of ASA in some coronary artery disease patients. These results suggest that increasing the frequency of administration of ASA from once to twice daily may be beneficial in selected patients. Meta-analyses have suggested that an inadequate platelet response to ASA may increase the risk of recurrent ischemic events. The retrospective nature of these analyses forbids the inference of causality. In the second part of this thesis, the results of a prospective study comparing the clinical relevance of 6 platelet function tests commonly used to assess platelet response to ASA are presented. The results show that none of the commonly used platelet function tests predict the occurrence of acute ischemic events in stable coronary artery disease patients. However, discontinuation of ASA is an important predictor of thrombotic events. Discontinuation of antiplatelet drugs has often been associated with thrombotic events in the days following cessation. If the occurrence of these events is due solely to the withdrawal of a protective drug or rather platelet sensitization is a topic of some debate. In the third part of this thesis, data are presented demonstrating that clopidogrel discontinuation, after the period recommended by current guidelines, leads to sensitization of newly formed platelets to physiological platelet stimuli. These results encourage research on different ways to mitigate the increased risk of thrombosis in coronary artery disease patients scheduled to discontinue clopidogrel therapy. In conclusion, this dissertation presents studies aiming to identify subpopulations of patients who are at increased risk of recurrent cardiovascular events. In this context, the personalization of treatment is a promising therapeutic avenue, where each patient can receive a targeted therapy according to his needs and contraindications. This shift in paradigm from empirical therapy based on population data retrieved from large clinical studies to therapy tailored to individual needs opens a vast field of research, where the majority of discoveries remain to be made.

L'adhérence, l'activation et l'agrégation des plaquettes sanguines sont essentielles à l'hémostase mais peuvent également conduire à la thrombose artérielle sur plaque d'athérosclérose, aujourd'hui première cause de mortalité dans le monde. Les anti-thrombotiques actuels, dirigés contre l'activation et l'agrégation plaquettaires, ont une efficacité reconnue mais ont pour inconvénient d'augmenter le risque de saignement. L'objectif de cette thèse a été d'explorer de nouvelles stratégies réduisant la thrombose tout en préservant l'hémostase. L'utilisation de souris modifiées génétiquement a mis en évidence que l'intégrine alpha6 beta1, impliquée dans l'adhérence des plaquettes aux laminines, joue un rôle critique en thrombose expérimentale mais pas en hémostase. De plus, nous avons montré dans un système de perfusion de sang qu'une protéine préférentiellement exprimée dans les plaques d'athérosclérose, la ténascine-C, permet l'adhérence et l'activation des plaquettes. En revanche, la beta-arrestine-1, une protéine de signalisation, ne contribue que modestement aux fonctions plaquettaires et à la thrombose. En conclusion, ce travail a permis de dégager deux nouvelles pistes anti-thrombotiques potentiellement capables de préserver l'hémostase, basées sur le ciblage de l'intégrine alpha6 beta1 ou de l'interaction plaquette/ténascine-C.

Malgré la mise en oeuvre de la leucoréduction systématique, les transfusions plaquettaires restent génératrices de réactions post-transfusionnelles (encore appelées « Effets Indésirables Receveur, EIR »). Nous savons que les plaquettes sanguines relarguent des molécules proinflammatoires (e.g. CD40 ligand soluble ou sCD40L) durant leur préparation et stockage et leurs taux augmentés sont associées aux EIR. Le travail de cette thèse vise à mieux comprendre les mécanismes de survenue des EIR post transfusion plaquettaire, dans le contexte de l’inflammation. La première partie de nos travaux n’a pas retrouvé de polymorphismes génétiques du gène CD40LG qui pourraient modifier l’affinité du couple Récepteur/Ligand, en cas d’EIR. Dans un second temps, une caractérisation haplotypique de CD40LG n’a pas non plus permis de retrouver d’association avec l’apparition d’EIR. Nous avons ensuite tenté d’identifier des marqueurs génétiques de surexpression de sCD40L (et par conséquence, d’EIR). Pour cela, nous avons étendu l’investigation à douze polymorphismes de CD40LG mais aussi des marqueurs génétiques connus comme indépendamment liés à l’expression de sCD40L : au niveau de son récepteur CD40 et d’ITGA2. Ont été retrouvés associés à une modification significative de sécrétion de sCD40L, d’une part le polymorphisme rs126643 (ITGA2), un haplotype étendu de CD40LG et aussi un haplotype interchromosomique (CD40LG–CD40–ITGA2). Toutefois, ces haplotypes n’ont pas pu être retrouvés associés à l’apparition d’EIR. Nous avons également montré que lors du stockage de concentrés plaquettaires (CP) non leucoréduits, les « modificateurs de réponse biologique » (BRM) leucocytaires diffèrent d’une part, dominent et influencent d’autre part les BRM d’origine plaquettaire. Nous nous sommes ensuite intéressés à un autre BRM individualisé dans les produits transfusés : l’ADN mitochondrial, classé comme un signal de danger endogène (ou DAMP) et nous avons retrouvé une augmentation significative de ceux-ci dans les CP ayant induit un EIR. Nous avons alors entrepris une étude protéomique (LC-MS/MS) et transcriptomique (RNA-seq) sur des CP ayant induit ou non un EIR. L’enrichissement des protéines et gènes différentiellement exprimés présente principalement un rôle dans l’activation plaquettaire, la coagulation, l’apoptose et la dégranulation qui représentent des processus en liaison étroite. Le transcriptome plaquettaire a confirmé l’étiologie apoptique par la mise en évidence de la dérégulation calcique mitochondriale. De plus, l’obtention de l’enrichissement de sa voie intrinsèque permet d’expliquer l’abondance des ADNmt retrouvés précédemment dans les CP associés aux EIR. Par ailleurs, l’état d’activation et la dégranulation des plaquettes expliquent l’abondance des BRM retrouvés en cas d’EIR. Ainsi, nous avons identifié de nouveaux marqueurs inflammatoires hautement exprimés dans le groupe EIR. Après validation de ces résultats par des études complémentaires, ces marqueurs pourraient être proposés comme cibles de prévention d’EIR en modifiant, par exemple la préparation des CP / Despite the implementation of systematic leucoreduction, platelet transfusions are still generating transfusion reactions (also called "Adverse Events or AEs"). We know that platelets release proinflammatory molecules during preparation and storage of platelet components (PCs) notably the soluble CD40 ligand or sCD40L and high levels are associated with AEs. In this thesis, we aimed to understand the mechanisms of occurrence of inflammatory platelet transfusion reactions. In the first part, we investigated the genetic polymorphisms of CD40LG. We failed to identify a significant association with AEs but we identified genetic markers of sCD40L overexpression: a CD40LG haplotype and also an interchromosomal haplotype (CD40LG-CD40-ITGA2). However, these haplotypes have not been found to be associated with AEs. In the second part, we showed that, during storage of non leucoreduced PCs, leukocyte-derived "biological response modifiers" (BRMs) dominate and influence the platelet-derived BRMs. Then, we found increased levels of another individualized BRM in PCs involved in AEs: mitochondrial DNA, classified as an endogenous danger-associated molecular pattern (DAMP). In the last part, we performed an integrated proteomic and transcriptomic study by LC-MS/MS and RNA-seq, respectively, to better understand the pathophysiology of AEs in a case-control approach. The biological enrichment of differentially expressed genes revealed a significant association with platelet activation, apoptosis and inflammatory mechanisms which may be involved in platelet transfusion reactions. This study provides novel insights into the molecular mechanisms underlying the occurrence of AEs and could give paths to prevent them