Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les plaquettes jouent un rôle primordial dans le processus d'hémostase. Elles sont générées à partir des mégacaryocytes (MK) présents dans la moelle osseuse. En plus des compartiments vésiculaires classiques de la voie d'endocytose et de dégradation vers les lysosomes, les plaquettes possèdent deux compartiments sécrétoires additionnels, les granules alpha et denses. Ces granules sont générés au cours de la maturation des MK à partir des corps multivésiculaires (MVB) et contiennent des molécules essentielles aux fonctions plaquettaires. Un défaut dans la production ou le remplissage de ces granules est à l'origine de symdromes hémorragiques. Malgré des études montrant l'implication de certaines protéines du trafic vésiculaire, les mécanismes moléculaires qui contrôlent la biogenèse et la maintenance des granules plaquettaires dans les MK ainsi que les mécanismes de tri des cargos qu'ils contiennent, ne sont pas complètement élucidés. Au cours de ces dernières années les phosphoinositides (PI) sont apparus comme des acteurs majeurs du trafic vésiculaire en régulant de la localisation de certaines protéines. Cependant, peu de choses sont connues à ce jour quant au rôle de ces lipides dans la biogenèse et le trafic des granules plaquettaires dans les MK. Au cours de ma thèse, j'ai étudié le rôle d'un des membres de la famille des PI, le phosphatidylinositol 5-phosphate (PtdIns5P), ainsi que deux enzymes responsables de sa synthèse : la 3-phosphatase MTM1 (mutée dans la myopathie centronucléaire, CNM) et la lipide kinase PIKfyve, dans le contrôle de la dynamique des granules. Mes résultats montrent que MTM1 est présente dans les MK et les plaquettes et est localisée en partie sur les granules denses. Cependant, cette phosphatase n'est pas essentielle pour la production et l'activation plaquettaire. En effet, les souris MTM1 KO ne présentent pas de défaut du nombre plaquettaire, ni d'agrégation et de sécrétion suite à une stimulation par la thrombine ou le collagène. Nous montrons la présence d'autres membres de la famille des myotubularines dans les plaquettes et les MK différenciés, ce qui pourrait expliquer une redondance de fonction. De façon intéressante, nous montrons que la détection de MTM1 à partir de faible quantité de sang (<100 ?l) pourrait déboucher sur la mise au point d'un test diagnostic rapide pour la détection de la CNM. Mes travaux ont été focalisés par la suite sur PIKfyve. En utilisant la lignée leucémique mégacaryoblastique MEG-01 différenciée, je montre pour la première fois que le PtdIns5P est localisé dans les compartiments endosomes tardifs ainsi que dans les granules alpha et denses. Dans ces cellules, PIKfyve contrôle plus de 50% du PtdIns5P. De façon remarquable, l'inhibition pharmacologique de PIKfyve ou son invalidation par siRNA entraine une perte d'identité des granules avec la formation de granules élargis qui présentent à la fois des marqueurs de granules denses et alpha et bloque totalement leur mobilité. Ces données ont été confirmées dans des MK primaires de souris. L'addition de PtdIns5P exogène sur les MEG-01 restaure le phénotype normal des granules démontrant que PIKfyve, par l'intermédiaire du PtdIns5P, contrôle l'intégrité des granules qui est donc un phénomène actif et les mécanismes de fusion/fission des vésicules affectant le tri des cargos. De plus, l'inhibition de PIKfyve dans les plaquettes isolées affecte leur agrégation et leur sécrétion, montrant que PIKfyve et le PtdIns5P peuvent agir d'une part lors de la biogénèse des plaquettes dans les MK et d'autre part sur le fonctionnement des plaquettes. Dans leur ensemble, mes travaux placent PIKfyve et son produit lipidique, le PtdIns5P, comme des acteurs majeurs de la maintenance et l'identité des granules plaquettaires. / Platelets play a major role in homeostasis processes. They are generated from megakaryocytes (MKs) in the bone marrow. In addition to the classic vesicular compartments of the endocytic and degradation pathway toward lysosomes, platelets have two additional specialized secretory compartments, the dense and alpha granules. These granules are made during MK maturation from multivesicular bodies (MVB) and contain molecules that are essential to platelet functions. Defect in the production of these granules or absence of their cargos is the cause of hemorrhagic syndromes. Despite many studies showing the implication of vesicle trafficking proteins, the molecular mechanisms controlling the biogenesis and maintenance of the granules and cargo sorting are not completely understood. In recent years, phosphoinositides (PIs) have emerged as key actors in vesicular trafficking playing a role of important spatial regulators of many proteins. However, little is known about the role of these lipids in the biogenesis and the trafficking of platelet granules in the MK.During my thesis, I have studied the role of one the member of the PI family, the phosphatidylinositol 5-phosphate (PtdIns5P), and of two enzymes responsible of its synthesis : the 3-phosphatase MTM1(mutated in the Centronuclear myopathy, CNM) and the lipid kinase PIKfyve, in the control of granules dynamic. My results show that MTM1 is present in MK and platelet and that platelet MTM1 localizes in part on dense granules. However, the phosphatase is not mandatory for platelet production and activation. Indeed, the knock-out of MTM1 in mice has no effect on platelet count, aggregation and secretion following thrombin or collagen stimulation. We show the presence of other members of the myotubularins family in platelet and differentiated MK, which can explain a redundancy in functions. Interestingly, we show that MTM1 detection from small amount of blood (<100 ?l) could lead to the development of a rapid diagnostic test for the detection of the CNM. My work was next focalized on PIKfyve. Using the differentiated leukemic megakaryoblastic cell line MEG-01 as a cell model, I showed for the first time that PtdIns5P is localized on late endosome and on alpha and dense granules. In these cells, PIKfyve controls more than 50% of cellular PtdIns5P. Remarkably, pharmacological inhibition of PIKfyve or its invalidation by siRNA leads to a loss of granules identity with the formation of enlarged granules containing both alpha and dense granules markers, and totally blocks their mobility. These data were also confirmed on primary mice MK. Addition of exogenous PtdIns5P on MEG-01 cells restores the normal phenotype of granules showing that PIKfyve, via PtdIns5P, controls granules integrity, an active phenomenon, and the fusion/fission mechanisms that affect cargos sorting. Furthermore, PIKfyve inhibition in isolated platelet affects their aggregation and secretion, showing that PIKfyve and the PtdIns5P may act on the biogenesis of platelets in MK and also on the function of mature platelets. In conclusion, my Ph.D. work shows that PIKfyve and its product PtdIns5P are major actors in platelet granules maintenance and integrity.

La transfusion sanguine permet de sauver des vies et réduit la morbidité pour un grand nombre de maladies et d'affections cliniques, mais elle n'est pas exempte de complications. Un incident néfaste lié à une transfusion, également appelé Effet Indésirable Receveur (EIR), est un incident défavorable survenant chez un patient pendant ou après une transfusion sanguine. Parmi eux, le TRALI est considéré comme l’une des réactions inflammatoires les plus critiques. Cette pathologie se développe généralement dans les 6 heures après transfusion. On en reconnaît deux types, les TRALI immunologiques et les TRALI non-immunologiques. En France, les premiers sont presque entièrement prévenus par une politique de sécurité des produits sanguins, tandis que la fréquence des seconds augmente. La physiopathologie du TRALI reste mal connue. Tandis que certains y accordent une place importante aux plaquettes sanguines du patient transfusé, d’autres les considèrent comme pas réellement impliquées. Le but de ce travail de thèse a été, dans un premier temps, d’investiguer le potentiel inflammatoire des plaquettes sanguines conservées dans les concentrés plaquettaires et l’influence de cette inflammation sur l’endothélium vasculaire général. Ensuite, sera évalué le rôle des plaquettes sanguines de l’organisme, notamment par l’intermédiaire de leurs produits de sécrétion, dans la pathogénie de cette complication transfusionnelle. Pour cela, un ALI (mimant un TRALI) a été déclenché, dans un modèle in vivo, par une injection d’anticorps anti-CMH I chez des souris préalablement stimulées avec du LPS. L’ensemble de nos résultats confirme le potentiel inflammatoire des plaquettes sanguines, au sein des concentrés plaquettaires, pouvant probablement assumer l’entière responsabilité du déclenchement d’un TRALI non-immunologique, ainsi qu’un rôle secondaire des plaquettes sanguines de l’organisme, participant activement à l’amplification de la sévérité de la pathologie. Cette thèse s’inscrit dans la continuité logique des études menées, au sein du laboratoire GIMAP-EA3064, investiguant la place des plaquettes sanguines au sein de l’inflammation, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives dans la sécurité transfusionnelle. / Blood transfusion saves lives and reduces morbidity for many diseases and clinical conditions, but it is not without complications. A transfusion-related adverse event, also known as the Adverse Reaction (AR), is an incident occurring in a patient during or after a blood transfusion. Among them, TRALI is considered as one of the most critical inflammatory reactions. This pathology usually occurs within 6 hours after transfusion. Two types are recognized: immune TRALI and non-immune TRALI. In France, the first is almost completely prevented by a blood product safety policy, while the frequency of the second increases. The pathophysiology of TRALI remains poorly understood. While some scientists give an important function of patient blood platelets, others consider them dispensable. The aim of this thesis was, first, to investigate the inflammatory potential of blood platelets stored in platelet concentrates and its impact on the general vascular endothelium. Next, the role of patient blood platelets, including their secretory products, in the pathogenesis of this transfusion complication will be evaluated. For it, an ALI (mimicking a TRALI) was triggered, in an in vivo model, by an injection of anti-MHC I antibody in mice previously stimulated with LPS. Our results confirm the inflammatory potential of blood platelets in platelet concentrates, which can probably assume the entire responsibility for triggering a non-immune TRALI, and a secondary role for patient blood platelets in the amplification of the severity of this pathology. This thesis is the continuity of studies conducted in the laboratory GIMAP-EA3064, investigating the function of blood platelets in inflammation, thus opening up new perspectives in transfusion safety.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique.

Dans le cancer, l'activation de la cascade de coagulation et des plaquettes participent à la formation de thromboses, à la croissance tumorale, et les métastases. Ces thromboses représentent une complication clinique chez les patients atteints du cancer du pancréas. Cet état serait dû à expression par la tumeur et leurs microparticules (MPs) de facteur tissulaire (FT). Dans une première partie, nous avons identifié le FT et le FT pathway inhibitor exprimés par les MPs cancéreuses et la P-sélectine plaquettaire impliqués dans la progression tumorale, les métastases et la thrombose associée au cancer du pancréas .Nous avons montré le rôle des intégrines αvβ3 et αvβ et des "neutrophils extracellular traps" dans l’interaction des MPs cancéreuses avec les plaquettes dans des modèles murins de « deep vein thrombosis » et de blessure au laser. Nous avons alors évalué l’efficacité du clopidogrel qui présente une action anti tumorale et thrombotique. Cette étude a permis d’initier une étude clinique de phase III pour d’évaluer le potentiel thérapeutique du clopidogrel chez des patients atteints de cancer du pancréas. Dans une seconde partie, nous avons montré que des neutrophiles exprimant le FT agissent comme « starter » de la formation de thrombi. A l’inverse, dans un modèle d’inflammation stérile, nos travaux montrent le rôle de la P-sélectine plaquettaire dans le slow rolling, l’adhésion et la transmigration des neutrophiles a des temps précoses. L’ensemble de nos résultats suggère que les coopérations cellulaires entre l’endothélium, les plaquettes, les MPs et les neutrophiles constituent des mécanismes essentiels à la thrombose et l'inflammation. / In cancers, the blood coagulation cascade and platelets can be activated to form thrombosis. This state will mainly due by the tumor and their microparticles (MPs) expression of tissue factor (TF), key protein of the coagulation cascade. In the first part of this study, we demonstrated that TF and the TF pathway inhibitor expressed by cancer MPs and the platelet P-selectin are involved in tumor progression, metastasis and the associated thrombosis in pancreatic cancer in mice. We showed the key role-play by αvβ3 and αvβ1 integrins and neutrophils extracellular traps in the interaction between cancer cells-derived MPs and platelets. We also evaluated the effect of clopidogrel, but not aspirin, treatment exhibits an anti-tumor action and limits thrombosis formation in preclinical models of pancreatic cancer. This study initiates a national investigation of a multicenter clinical phase III study to evaluate the therapeutic potential of clopidogrel in pancreatic cancer patients. In the second part of this study, we identified a “population of neutrophils expressing TF” that acts like a starter of the thrombus formation. At the reverse, in a sterile inflammatory model, our work showed the primordial role of platelet P-selectin in the slow rolling, the adhesion and the transmigration of neutrophils. All together our results suggest that the cooperation between the endothelium, platelets, MPs and neutrophils constitute essential mechanisms acting in the thrombosis and the inflammation.

Pour répondre aux enjeux énergétiques et environnementaux actuels et à venir, le développement du bois est très important, notamment avec des applications aux niveaux industriels et collectifs. Pour répondre à ces besoins et accompagner ce développement, de nombreuses structures d'approvisionnement en plaquettes forestières se mettent en place. La principale difficulté pour ces structures est de garantir une qualité de combustible sûre et constante au cours du temps, notamment en ce qui concerne l'humidité. L'objectif de ce travail de thèse est de rechercher les solutions les plus appropriées pour répondre à cette attente. Ainsi, le travail débute par l'étude bibliographique et la compréhension des systèmes de séchage existants ; le séchage peut se dérouler de manière naturelle (sous bâche, sous abri, …) ou bien artificielle (séchoir tunnel, séchoir rotatif, …). Dans un second temps, des essais ont été mis en place pour comprendre et quantifier précisément l’impact des paramètres influents sur le séchage naturel des plaquettes forestières et les modifications physico-chimiques se produisant lors du stockage des plaquettes forestières. Dans un troisième temps, des modèles mathématiques permettant de traduire le comportement des plaquettes forestières au cours du séchage seront proposés et comparés aux résultats des essais. Enfin, le dernier volet consiste en l’élaboration de scénarios technico-économiques permettant d’étudier les différentes solutions ou combinaisons de solutions de séchage pour aboutir à la qualité de combustible souhaitée. / To answer actual and future energetic and environmental issues, wood development is very important, notably with industrial and collective applications. To answer these needs and follow this development, lots of supplying structures of wood chips are being created. The main difficulty for these companies is guaranty good and stable raw material quality all time, notably concerning moisture content. The objective of this work is to research the most appropriate solutions to answer this problematic. So, the work begins by a bibliographical study that will help to understand the existing systems of drying; drying can be natural (under layer, under shelter …) or artificial (tunnel dryer, rotary dryer …). Then, experiments were put in place to understand and quantify more precisely natural drying parameters impact on wood chips and physico-chemical modifications on wood chips during storage. After, mathematic models are developed to traduce wood chip drying comportment, after models results are compared to experimental results. Finally, economical scenarios were performed to study the different solutions or combinations of solutions to dry wood chips in order to answer technical and economical industrial needs.

Les médiateurs lipidiques de l'inflammation comprennent plusieurs familles de molécules biologiquement actives, incluant le leucotriène B₄ (LTB₄) et le facteur activant les plaquettes (PAF). Ces médiateurs s'avèrent être particulièrement importants dans la pathogenèse de maladies inflammatoires comme l'arthrite. Effectivement, ils participent directement au recrutement et à l'activation des neutrophiles au site inflammatoire. La biosynthèse du LTB₄ et du PAF implique la phospholipase A₂ de groupe IVA (cPLA₂α); en effet, cette enzyme libère les substrats nécessaires à la biosynthèse de ces médiateurs à partir des phospholipides membranaires. Les mécanismes de régulation de la cPLA₂α sont encore aujourd'hui peu compris. Cette présente étude visait à mieux comprendre et à élucider de nouveaux mécanismes de régulation de la cPLA₂α, première enzyme impliquée dans la biosynthèse du LTB₄ et du PAF dans les neutrophiles humains. Les résultats démontrent que, dans les neutrophiles humains, l'activité de la cPLA₂α est inhibée par son produit, l'acide arachidonique (AA) et que l'AA induit la translocation de l'enzyme aux membranes. Nos résultats suggèrent également une interaction directe du produit (AA) avec l'enzyme et que cette interaction se fait probablement au site catalytique. Les résultats de cette étude ont permis de révéler un nouveau mécanisme de régulation de la cPLA₂α jamais identifié, la régulation négative de la cPLA₂α par l'AA. Le site d'interaction de l'AA sur l'enzyme lors de cette régulation reste à être confirmé.

Les plaquettes sont très abondantes dans le sang où elles ont un rôle dans l'hémostase, l’inflammation et l’immunité. Activées, elles vont subir un changement de conformation qui permet la libération de nombreuses molécules effectrices ainsi que la production de vésicules extracellulaires (EV). Les EV sont formées par le bourgeonnement de la plaquette et emportent une partie de son contenu, incluant des acides nucléiques, des protéines de surface et des organelles. Hétérogène, le contenu diversifié des EV de plaquettes suggère qu’elles peuvent exercer de nombreuses fonctions. Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes d’abord intéressés à l’utilisation de l’algorithme SPADE couplé à la cytométrie en flux pour améliorer la détection d’EV et mieux apprécier leur hétérogénéité dans des concentrés plaquettaires (PC) servant à la transfusion. Nous avons aussi évalué l’utilisation de cette approche pour le développement de biomarqueurs dans le cadre de l’analyse d’EV dans le liquide synovial de patients arthritiques. Cette étude a révélé que l’utilisation d’algorithmes couplés à la cytométrie en flux tels que SPADE pourrait faciliter la compréhension des fonctions des EV et le développement de leur étude comme biomarqueurs. Nous nous sommes ensuite intéressés à une première sous-catégorie d’EV de plaquettes, celles qui contiennent des mitochondries (mito⁺EV). Nous avons émis l'hypothèse que ces mito⁺EV représentent un réservoir d'ADN mitochondrial, signal de danger (motifs moléculaires associés aux dommages, DAMP) reconnu et présent dans de nombreuses conditions inflammatoires, et qu’elles pourraient être impliquées dans les réactions transfusionnelles. Nous avons observé que les mito⁺EV étaient plus abondantes dans les PC impliqués dans des réactions transfusionnelles et qu’elles corrèlent significativement avec l’ADN mitochondrial. Comme la majorité de l’ADN mitochondrial est encapsulée dans des EV, cette étude suggère que les EV peuvent être un biomarqueur utile pour la prédiction du risque potentiel de réactions transfusionnelles, bien que des investigations soient iii nécessaires pour déterminer s'il existe un rôle pathogène causal du DAMP mitochondrial encapsulé dans les EV par opposition à l'ADN mitochondrial en solution. Nous nous sommes enfin intéressés à une seconde sous-catégorie d’EV de plaquettes, celles qui contiennent du protéasome. Les plaquettes contiennent un protéasome actif et présentent des antigènes par l'intermédiaire du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH I) ce qui leur confère une fonction dans l’immunité adaptative. Étant donné qu’il n’a jamais été examiné si le protéasome est également transféré dans les EV de plaquettes auparavant, nous avons émis l'hypothèse qu'une machinerie fonctionnelle pour l'apprêtement et la présentation de l'antigène est transférée aux EV de plaquettes. En utilisant une combinaison d'analyses moléculaires et fonctionnelles, nous avons montré la présence d'un protéasome 20S actif dans diverses conditions où les plaquettes sont activées, ainsi que du CMH I et des molécules de coactivation des lymphocytes. L’incubation d’EV de plaquettes avec l’ovalbumine (OVA) a mis en évidence, par l'activation et la prolifération des lymphocytes T CD8⁺ spécifiques de l'antigène OVA, qu’elles peuvent apprêter et présenter efficacement l’antigène. Ces résultats suggèrent que les EV de plaquettes contribuent à l'immunité adaptative. Dans l’ensemble, nous avons montré que les EV de plaquettes ont un rôle dans l’inflammation et l’immunité avec leur contenu en mitochondries et en protéasome. Elles sont hétérogènes et peuvent être utilisées comme biomarqueurs dans différents contextes. / Platelets are very abundant in the blood where they play a role in hemostasis, inflammation and immunity. Activated, platelets will undergo a change of conformation which allows the release of numerous effector molecules as well as the production of extracellular vesicles (EVs). EVs are formed by the budding of the platelet and bring some of its contents, including nucleic acids, surface proteins and organelles. Heterogeneous, the diverse content of platelet EVs suggests that they can perform many functions. As part of this thesis, we first looked at the use of the SPADE algorithm coupled with flow cytometry to improve the detection of EVs and allow a better appreciation of their heterogeneity in platelet concentrates (PC) used for transfusion. We also evaluated the use of this approach for the development of biomarkers in the analysis of EVs in the synovial fluid of arthritis patients. This study revealed that the use of algorithms such as SPADE coupled with flow cytometry could facilitate the understanding of the functions of EVs and the development of their studies as biomarkers. We then looked at a first subcategory of platelet EV, those that contain mitochondria (mito⁺EVs). We hypothesized that these mito⁺EVs represent a reservoir of mitochondrial DNA, a damage-associated molecular pattern (DAMP) recognized and present in many inflammatory conditions, and that they could be involved in transfusion reactions. We observed that mito⁺EVs were more abundant in PCs involved in transfusion reactions and that they correlate significantly with mitochondrial DNA. As the majority of mitochondrial DNA is encapsulated in EVs, this study suggests that EVs may be a useful biomarker for predicting the potential risk of transfusion reactions, although further investigation is needed to determine if there is a pathogenic role of mitochondrial DAMP encapsulated in EVs as opposed to mitochondrial DNA in solution. We finally focused on a second subcategory of platelet EVs, those that contain proteasome. Platelets contain an active proteasome and present antigens through the major histocompatibility complex I (MHC I), which gives them an important function in adaptive immunity. Whether the proteasome is also transferred into the v platelet EVs has never been examined. We hypothesized that a functioning machinery for the processing and presentation of the antigen is transferred to the platelet EVs. Using a combination of molecular and functional assays, we have demonstrated the presence of an active 20 S proteasome under various conditions where platelets are activated, as well as MHC I and lymphocyte coactivation molecules. Demonstrated by activation and proliferation of ovalbumin (OVA) antigen specific CD8⁺ T lymphocytes, EVs from platelets incubated with OVA can efficiently prepare and present antigen. These results suggest that platelet EVs contribute to adaptive immunity. Overall, we have shown that platelet EVs have a role in inflammation and immunity with their mitochondria and proteasome content. They are heterogeneous and can be used as biomarkers in different contexts.

Étudier la mégakaryopoïèse sans utiliser de méthode systématique d'optimisation freine le développement de systèmes efficaces de culture ex vivo des mégakaryocytes (MK) qui produisent les plaquettes sanguines. Grâce à l'utilisation d'une stratégie statistique de planification d'expériences, cette étude de doctorat a permis de quantifier les effets individuels et interactifs de cytokines sur la mégakaryopoïèse in vitro et d'optimiser les rendements en MK matures et en plaquettes. Les cellules de sang de cordon enrichies en CD34+ ont été cultivées pendant 7 jours dans des conditions favorisant la différenciation mégakaryocytaire. Les cellules ainsi obtenues ont ensuite été placées dans différentes combinaisons de cytokines définies par les plans d'expériences. Les plans Plackett Burman utilisés pour analyser 13 cytokines au total, ont été peu efficaces pour identifier les facteurs importants dû à leur faible niveau de résolution. Par contre, l'analyse statistique des plans factoriels à deux niveaux a démontré qu'en présence de la thrombopoïétine (TPO), la cytokine clé de la mégakaryopoïèse, la différenciation et la maturation des MK étaient significativement stimulées par le « stem cell factor » (SCF), l'interleukine (IL)-6 et l'IL-9, alors que le « Flt-3 ligand » (FL) favorisait uniquement les MK immatures. De plus, l'érythropoïétine (EPO), souvent utilisée pour la culture des MK, était un inhibiteur de la maturation des MK. Au niveau de la polyploïdisation, une réduction de la concentration en IL-6, IL-9 et surtout TPO semble favorable. La méthode de surface dose-réponse a permis de déterminer la concentration optimale en cytokines sélectionnées (TPO, SCF, IL-6 et IL-9). Le nouveau mélange de cytokines mis au point (BS1) maximise l'expansion et la maturation des MK, tout en donnant une proportion de MK très élevée (-90%). Un autre optimum, identifié à une concentration plus élevée en SCF, permet d'augmenter davantage la production de MK matures et plaquettes mais réduit la pureté en MK. Ces méthodes statistiques constituent des outils efficaces pour analyser un système complexe de cytokines et pour développer des systèmes prometteurs de production ex vivo des MK et plaquettes à des fins cliniques. / Studying megakaryopoiesis without using a rationale optimization method limits the development of efficient ex vivo culture Systems for megakaryocytes (MK) which produce blood platelets. In this thesis, individual and interactive cytokine effects on in vitro megakaryopoiesis were quantified and yields of mature MK and platelets were optimized by applying a statistical design of experiment strategy. CD34+ -enriched cord blood cells were first cultured for 7 days in conditions favoring commitment into the MK lineage. The obtained cells were then placed in different cytokine combinations defined by experimental designs. Because of their low resolution, the Plackett and Burman designs first used to screen 13 cytokines, were not efficient to identify the important factors. In contrast, the statistical analysis of the two-level factorial designs revealed that in the presence of thrombopoietin (TPO), the key cytokine for megakaryopoiesis, MK maturation was significantly stimulated by stem cell factor (SCF), interleukin (IL)-6 and IL-9, whereas Flt-3 ligand (FL) had a positive effect only on the expansion of immature MK. Moreover, erythropoietin (EPO) was an inhibitor of MK maturation. Importantly, a reduction of the concentration of IL-6, IL-9 and especially TPO seems favorable for polyploidy. A dose-response surface methodology was then used to find the optimal concentrations of the selected cytokines (TPO, SCF, IL-6 and IL-9). The new cytokine cocktail developed (BS1) maximizes MK expansion and maturation, and gives a very high MK purity (-90%). Another optimum was also found at a higher SCF concentration, which further improves mature MK and platelet production, but reduces MK purity. These statistical methods provide an efficient tool to analyze complex Systems of cytokines and to develop promising ex-vivo MK culture Systems for clinical applications.

La récession gingivale est une condition fréquente dans la population qui nécessite souvent d’être traitée en raison de ses conséquences néfastes. Parmi les différentes options de traitements disponibles, la greffe de tissu conjonctif a démontré le meilleur taux d’efficacité. Par contre, ce traitement implique le prélèvement de tissu conjonctif au palais et est associé à des risques chirurgicaux supplémentaires. Récemment, un concentré plaquettaire nommé « Platelet Rich Fibrin » a été utilisé comme matériau substitut afin d’éviter plusieurs inconvénients liés à la greffe de tissu conjonctif. Cependant, est-ce que l’utilisation du Platelet Rich Fibrin comme matériau alternatif au tissu conjonctif est aussi efficace pour le traitement des récessions gingivales ? Cette étude avait pour objectif de comparer l’efficacité de ces deux types de traitements en termes de couverture radiculaire. L’étude a mesuré aussi le niveau de douleur postopératoire ressenti suivant ces deux interventions. Cette étude comprenait une randomisation de la technique choisie et des mesures prises à simple insu. À la clinique de parodontie de l’Université Laval, 22 participants ont été traités avec le Platelet Rich Fibrin et 12 participants avec la greffe de tissu conjonctif. Pendant les 10 premiers jours suivant l’intervention, un questionnaire de douleur devait être rempli par tous les patients. Les mesures finales des couvertures radiculaires obtenues ont été prises 6 mois après l’intervention chirurgicale. Selon les résultats obtenus, la couverture radiculaire était significativement meilleure avec la greffe de tissu conjonctif (de l’ordre de 30%). Par contre, la douleur postopératoire ressentie était significativement plus grande suite à la greffe de tissu conjonctif comparativement à l’intervention utilisant le Platelet Rich Fibrin. Ces résultats démontrent que la greffe de tissu conjonctif demeure la meilleure option de traitement des récessions gingivales. Néanmoins, l’utilisation du Platelet Rich Fibrin demeure une option de traitement valable afin d’éviter une douleur postopératoire plus importante. / Gingival recession is a common condition in the population that often requires treatment because of its adverse consequences. Among the various treatment options available, connective tissue graft has demonstrated the best rate of effectiveness. However, this treatment involves harvesting connective tissue from the palate leading to additional surgical pain and wound healing problems. Recently, a platelet concentrate called “Platelet Rich Fibrin”, has been used as a substitute material to prevent several disadvantages related to connective tissue grafting. However, is the use of Platelet Rich Fibrin effective in treating gingival recessions? The objective of this study was to compare the efficacy of both protocols in terms of root coverage. We also measured the level of patient postoperative pain following each of the grafting procedure. This study includes a randomization of the chosen technique and measures were taken by simple blindness. At the dental clinic of periodontics of Université Laval, a total of 22 grafts were made with the Platelet Rich Fibrin, and 12 grafts with the connective tissue. During the first 10 days after the procedure, a pain questionnaire was completed by all of the patients. The final root coverage measurements were taken 6 months after the procedure. According to our results, the root coverage was significantly better with the connective tissue graft. However, postoperative pain was significantly greater following the connective tissue grafts as compared to Platelet Rich Fibrin grafts. These results confirmed that connective tissue graft remains the best option for treating gingival recessions. Nevertheless, the use of Platelet Rich Fibrin remains a valid treatment option in order to avoid greater postoperative pain.