El Presente Trabajo de Título se enmarca dentro del proyecto de investigación Fondecyt Nº1080143 denominado “Effects of hydrophobic polypeptide tag fusion on protein purification by Hydrophobic Interaction Chromatography”, cuyo objetivo es determinar, cuantitativa y cualitativamente, el efecto de la fusión de polipéptidos hidrofóbicos en diferentes etapas del proceso de producción de proteínas recombinantes. Una de las etapas del proyecto, consiste en la optimización de las condiciones y el modo de operación del cultivo de Escherichia coli, que maximicen la productividad de cutinasas recombinantes. El microorganismo hospedero corresponde a Escherichia coliBL21 (DE3), cepa en la que se ha introducido el vector de expresión pET11a, el cual, bajo inducción, permite la producción de la proteína recombinante cutinasa a la que se han adicionado los aminoácidos triptófano(W), prolina(P) y tirosina(Y). Los polipéptidos hidrofóbicos adicionados son WPWP(Cutinasa-(WP)2) e YYY(Cutinasa-(Y)3). Las condiciones de cultivo en estudio, variables de entrada, corresponden a: temperatura de crecimiento y temperatura de inducción (25/18°C y 37/25°C), densidad celular en el punto de inducción (0,8 y 1,5 U Abs600nm ), concentración de inductor (0,1 y 0,5 mM IPTG); concentración de extracto de levadura (5 y 20 g/L), concentración de triptona (10 y 15 g/L) y concentración de glicerol (0 y 0,3 % v/v), en el medio de cultivo. Para realizar el estudio, se desarrolló un diseño experimental factorial fraccionario (26-2IV) que permite obtener información contundente respecto de los efectos principales de los factores (condiciones de cultivo) y sus interacciones (interacciones entre 2 factores) en cultivos batch en matraces. Se llevó a cabo la totalidad de experimentos establecidos en la malla de tratamientos, para las variantesCutinasa-(WP)2 y Cutinasa-(Y)3. Mediante un análisis estadístico de los resultados obtenidos se determinó la significancia de los factores y sus interacciones sobre la productividad y rendimiento (test ANOVA 95% nivel de significancia), se elaboró un modelo matemático lineal para estas variables en función de los factores e interacciones significativas y se determinaron las condiciones óptimas que maximizan la productividad y rendimiento para cada variante en particular, utilizando el modelo anteriormente nombrado. Los resultados obtenidos permitieron optimizar la producción de Cutinasa-(WP)2, sin inconvenientes, alcanzando una producción total de 28.870 [U Cutinasa-(WP)2/L] lo que equivale a 5,3 veces lo producido bajo las condiciones del caso base. El rendimiento optimizado fue 6,5 veces el rendimiento del caso base. Las condiciones óptimas de cultivo son: temperatura de crecimiento y temperatura de inducción, 37oC/25oC (Alto); densidad celular en el punto de inducción, 1,5 U Abs600nm(Alto); concentración de inductor, 0,1 mM IPTG (Bajo); concentración de extracto de levadura, 20 g/L (Alto); Concentración de triptona, 10 g/L (Bajo) y concentración de glicerol nula. El comportamiento errático de la variante Cutinasa-(Y)3 generó dificultades para modelar, predecir y optimizar la productividad y rendimiento de los cultivos. Se propone que las problemáticas de esta variante provienen de la cepa electrocompetente transfomada productora de Cutinasa-(Y)3. La comparación de los modos de operación en el fermentador Biostat B entregaron como resultado que el modo batch, para la variante Cutinasa-(WP)2, presentó mayor productividad específica total y rendimiento equivalentes a 2,5 y 1,4 veces la producción de fermentador operando en modo fed-batch con alimentación constante de nutrientes. En el caso de la variante Cutinasa-(Y)3, el modo de fermentación batch también fue el más favorable. Se concluye que todos los factores analizados tienen efectos significativos sobre la productividad y/o rendimiento de cutinasa recombinante en cultivos de E. coli BL21(DE3). Los factores e interacciones que poseen un efecto positivo y significativo sobre la productividad y/o rendimiento de ambas variantes corresponden a: densidad celular y sus interacciones con los factores temperatura de crecimiento e inducción y concentración de extracto de levadura. Los factores e interacciones que presentan efectos negativos y significativos sobre la productividad y/o rendimiento de ambas variantes son la concentración de inductor, concentración de triptona y la interacción concentración de glicerol-concentración extracto de levadura.

La mancha bacteriana causada por el patógeno Pseudomonas syringae pv. tomato (P. s. tomato) es una de las enfermedades más devastadoras del cultivo del tomate. En este trabajo se demuestra que la sola inhibición de la expresión del gen Ep5C, que codifica una peroxidasa catiónica extracelular, es suficiente para conferir una marcada resistencia a P.s. tomato. Esta inhibición encontrada en las plantas de tomate produce una resistencia que no requiere la activación de las rutas de defensa descritas hasta ahora, controladas por el ácido salicílico y el ácido jasmónico. Así, la inhibición de este gen constituye una nueva herramienta genética para obtener plantas transgénicas resistentes a esta enfermedad. La temprana inducción del gen Ep5C está mediada por el H2O2, una especie reactiva de oxígeno generada durante el curso de u interacciones planta-patógeno. Los mecanismos que controlan la resistencia de las plantas a patógenos necrotrofos constituye uno de los aspectos menos estudiados en la actualidad. La búsqueda de nuevos componentes genéticos que participan en la cascada de señalización de las plantas frente a patógenos constituye uno de los retos de la biología molecular moderna. En este trabajo llevamos a cabo un escrutinio, utilizando plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana portadoras del gen de la B-glucoronidasa (GUS) como gen marcador bajo el control del promotor del gen Ep5C, en busca de mutantes alterados en la expresión de dicho gen. En el presente trabajo presentamos la identificación y caracterización de uno de los mutantes, en concreto el mutante ocp3 (overexpressor of cationic peroxidase 3), el cual presenta expresión constitutiva del gen GUS. Las plantas ocp3 muestran una elevada acumulación de H2O2, y se caracterizan por presentar expresión constitutiva de GST1 y PDF1.2, dos genes marcadores de la respuesta defensiva, pero sin embargo no muestra expresión de PR-1, un gen marcador dependiente de la ruta del ácido salicílico (SA). La característic / Coego González, A. (2006). Análisis funcional del gen Ep5C y su implicación en los mecanismos de defensa en plantas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1972

[ES] Debido a la naturaleza (poli)iónica de los conjugados polipéptido-fármaco (PDC), su traslado a clínica puede ser una tarea complicada y costosa, que requiere técnicas de polimerización reproducibles y escalables, la implementación de herramientas analíticas sofisticadas, pasos de caracterización exhaustivos y la recopilación de datos detallados de seguridad y eficacia. Algunas técnicas clásicas implementadas en el control de calidad de los PDC no se pueden utilizar para el análisis cualitativo y cuantitativo de productos de degradación y metabolitos. Como alternativa, la espectrometría de masas (MS) y el análisis de fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico (AF4) se han posicionado de forma relevante en dicha caracterización de polipéptidos y PDC. Mediante el uso de métodos de LC-MS, se puede realizar el análisis tanto de fármacos como de productos o metabolitos de degradación. Además, dado que la separación en AF4 no se basa en la interacción del analito con la columna, como ocurre en SEC, sino aplicando el flujo cruzado en un canal vacío; en AF4 es posible una separación de moléculas "a medida" según su tamaño y peso molecular dando lugar a la mejora selectiva de la separación. Teniendo en cuenta lo descrito anteriormente con respecto al diseño de PDC y su caracterización, la investigación incluida en esta tesis se centra en el desarrollo de nuevos procedimientos analíticos que ayuden a la selección de candidatos PDC con las características adecuadas que les permitirán avanzar a su evaluación preclínica. Implementaremos una herramienta de inteligencia artificial, diseño de experimentos, para desarrollar métodos analíticos adecuados y determinar las condiciones óptimas en la síntesis de nanoconjugados polipeptídicos. Además, exploraremos técnicas relativamente nuevas, como AF4 para desarrollar nuevos nanoconjugados polipeptídicos simples y de combinación y además, generaremos imágenes de espectrometría de masas, para entender su comportamiento en modelos preclínicos relevantes, lo que nos permitirá identificar terapias eficaces para una gran variedad de patologías (tumores sólidos avanzados incluyendo cáncer de mama triple negativo, cáncer de próstata y cáncer de páncreas, así como, lesión medular). / [CAT] A causa de la naturalesa (poli)iònica i, de vegades, proteica dels conjugats polipèptid-fàrmac (PDC), el seu trasllat a clínica pot ser una tasca complicada i costosa, que requereix tècniques de polimerització reproduïbles i escalables, la implementació d'eines analítiques sofisticades, passos de caracterització exhaustius i la recopilació de dades detallades de seguretat i eficàcia. Algunes tècniques clàssiques implementades en el control de qualitat dels PDC no es poden utilitzar per l'anàlisi qualitativa i quantitativa de productes de degradació i metabòlits. Com a alternativa, l'espectrometria de masses (MS) i l'anàlisi del fraccionament de flux de camp de flux asimètric (AF4) han trobat el seu camí en la caracterització de PDC. Mitjançant l'ús de mètodes LC-MS, es pot realitzar l'anàlisi tant de fàrmacs com de productes/metabòlits de degradació. A més, atès que la separació en AF4 no es basa en la interacció de l'analit amb la columna com en SEC sinó aplicant el flux creuat en un canal buit, una separació de molècules "a mesura" segons la seua grandària i pes molecular i la millora selectiva de la separació és possible en l'instrument AF4. Tenint en compte tot el descrit anteriorment respecte al disseny de PDC i la seua caracterització, la investigació inclosa en aquest projecte es centra en el desenvolupament de nous procediments analítics que ajuden a la selecció de candidats PDC per als seu estudi preclínic posterior. Implementarem una eina d'intel·ligència artificial, disseny d'experiments, per a desenvolupar mètodes analítics i la síntesi de nanoconjugats basats en polipèptids de manera adequada. A més, explorarem tècniques relativament noves, com AF4, i generarem imatges d'espectrometria de masses, per a desenvolupar nous conjugats a la recerca de teràpies eficaces per a tractar una varietat de malalties (càncer de mama triple negatiu, càncer de pròstata, càncer de pàncrees, així com en la lesió de medul·la espinal). / [EN] Due to the (poly)ionic and proteinic nature of polypeptide-drug conjugates (PDCs), their translation "from bench to bedside" represents a complex and expensive undertaking, requiring reproducible and scalable polymerization techniques, the implementation of sophisticated analytical tools, exhaustive characterization steps, and the collection of detailed safety and efficacy data. Classical techniques, such as liquid chromatography (LC) - UV/Vis and size exclusion chromatography (SEC) implemented in the quality control of PDCs during and after synthesis, cannot always support a qualitative and quantitative analysis of degradation products and metabolites. As an alternative, mass spectrometry (MS) and asymmetric flow field flow fractionation (AF4) have grown in influence on polypeptide and PDC characterization. The analysis of drug and degradation products/metabolites can take advantage of LC when coupled to MS. Meanwhile, AF4-mediated separation does not suffer from problems related to the interaction of the analyte with the column like in SEC; instead, AF4 applies a cross flow in an empty channel, which supports the "tailor-made" separation of molecules according to size and molecular weight. The research included in this Ph.D. thesis focuses on developing new analytical procedures that will aid the selection of PDC candidates for further preclinical studies. We implemented an artificial intelligence tool (design of experiments) to develop analytical methods and optimize the synthesis of genipin-crosslinked PDCs. Moreover, we explored relatively new techniques, such as AF4 and mass spectrometry imaging, in developing novel single and combination PDCs and studying their biological fate in the search for efficient therapies for a range of diseases (advanced solid tumors, including triple negative breast, prostate, and pancreatic cancer, as well as spinal cord injury). / Dordevic, S. (2023). Development of Analytical Procedures for the Characterization of Polypeptide-Based Nanoconjugates [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/194554