Les histones sont des protéines nucléaires hautement conservées chez les cellules des eucaryotes. Elles permettent d’organiser et de compacter l’ADN sous la forme de nucléosomes, ceux-ci representant les sous unités de base de la chromatine. Les histones peuvent être modifiées par de nombreuses modifications post-traductionnelles (PTMs) telles que l’acétylation, la méthylation et la phosphorylation. Ces modifications jouent un rôle essentiel dans la réplication de l’ADN, la transcription et l’assemblage de la chromatine. L’abondance de ces modifications peut varier de facon significative lors du developpement des maladies incluant plusieurs types de cancer. Par exemple, la perte totale de la triméthylation sur H4K20 ainsi que l’acétylation sur H4K16 sont des marqueurs tumoraux spécifiques a certains types de cancer chez l’humain. Par conséquent, l’étude de ces modifications et des événements determinant la dynamique des leurs changements d’abondance sont des atouts importants pour mieux comprendre les fonctions cellulaires et moléculaires lors du développement de la maladie. De manière générale, les modifications des histones sont étudiées par des approches biochimiques telles que les immuno-buvardage de type Western ou les méthodes d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Cependant, ces approches présentent plusieurs inconvénients telles que le manque de spécificité ou la disponibilité des anticorps, leur coût ou encore la difficulté de les produire et de les valider. Au cours des dernières décennies, la spectrométrie de masse (MS) s’est avérée être une méthode performante pour la caractérisation et la quantification des modifications d’histones. La MS offre de nombreux avantages par rapport aux techniques traditionnelles. Entre autre, elle permet d’effectuer des analyses reproductibles, spécifiques et facilite l’etude d’un large spectre de PTMs en une seule analyse. Dans cette thèse, nous présenterons le développement et l’application de nouveaux outils analytiques pour l’identification et à la quantification des PTMs modifiant les histones. Dans un premier temps, une méthode a été développée pour mesurer les changements d’acétylation spécifiques à certains sites des histones. Cette méthode combine l’analyse des histones intactes et les méthodes de séquençage peptidique afin de déterminer les changements d’acétylation suite à la réaction in vitro par l’histone acétyltransférase (HAT) de levure Rtt109 en présence de ses chaperonnes (Asf1 ou Vps75). Dans un second temps, nous avons développé une méthode d’analyse des peptides isomériques des histones. Cette méthode combine la LC-MS/MS à haute résolution et un nouvel outil informatique appelé Iso-PeptidAce qui permet de déconvoluer les spectres mixtes de peptides isomériques. Nous avons évalué Iso-PeptidAce avec un mélange de peptides synthétiques isomériques. Nous avons également validé les performances de cette approche avec des histones isolées de cellules humaines érythroleucémiques (K562) traitées avec des inhibiteurs d’histones désacétylases (HDACi) utilisés en clinique, et des histones de Saccharomyces cerevisiae liées au facteur d’assemblage de la chromatine (CAF-1) purifiées par chromatographie d’affinité. Enfin, en utilisant la méthode présentée précédemment, nous avons fait une analyse approfondie de la spécificité de plusieurs HATs et HDACs chez Schizosaccharomyces pombe. Nous avons donc déterminé les niveaux d’acétylation d’histones purifiées à partir de cellules contrôles ou de souches mutantes auxquelles il manque une HAT ou HDAC. Notre analyse nous a permis de valider plusieurs cibles connues des HATs et HDACs et d’en identifier de nouvelles. Nos données ont également permis de définir le rôle des différentes HATs et HDACs dans le maintien de l’équilibre d’acétylation des histones. Dans l’ensemble, nous anticipons que les méthodes décrites dans cette thèse permettront de résoudre certains défis rencontrés dans l’étude de la chromatine. De plus, ces données apportent de nouvelles connaissances pour l’élaboration d’études génétiques et biochimiques utilisant S. pombe. / Histones are highly conserved, basic proteins found in eukaryotic cell nuclei. They organize and package DNA strands into nucleosome core particles (NCPs), the fundamental repeating units of eukaryotic chromatin. The histones are subject to a wide variety of posttranslational modifications (PTMs) including acetylation, methylation and phosphorylation. These PTMs play an essential role in DNA-replication, transcription, and chromatin assembly. Alterations in histone PTM abundances have been implicated in several types of cancer. For example, the global loss of trimethylation at H4K20 and acetylation at H4K16 is a hallmark of human cancers. Thus, characterization of histone PTMs and their dynamics is extremely useful for elucidating normal cellular functions and molecular pathways that lead to diseases. Traditionally, histone PTMs are analyzed using antibody-based approaches such as western blot and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays. These methods, however, suffer from several limitations including antibody cross-reactivity, epitope occlusion, and the cost and difficulty in producing and validating antibodies. Over the last decade, mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful technique for the characterization and quantification of histone PTMs. MS offers several advantages over the traditional approaches including reproducibility, specificity, and ability to rapidly analyze numerous PTMs in a single experiment. In this thesis, the development and applications of novel analytical tools for the identification and quantification of histone PTMs are presented. First, a method useful for measuring the global and site specific changes in histone acetylation is described. This method combines intact mass analysis and peptide sequencing approaches to study the global and site specific changes in histone acetylation during in vitro assays with yeast Rtt109 and its chaperone (Asf1 or Vps75). Second, a method for analysis of isomeric histone peptides is presented. This method combines a high resolution LC-MS/MS with a novel bioinformatics tool called Iso-PeptidAce to deconvolute mixed spectra of co-eluting isomeric peptides. We benchmarked Iso-PeptidAce using mixtures of synthetic isomeric peptides. We demonstrated its capability in histones isolated from human erythroleukemic (K562) cells treated with clinically relevant histone deacetylase inhibitors (HDACi) and in affinity-purified S. cerevisiae histones bound to chromatin assembly factor-1 (CAF-1). Third, by employing the above methods, an in-depth quantitative analysis of the substrate specificities of several fission yeast HATs and HDACs was assessed. We determined the acetylation site occupancy of multiple lysines in histones isolated from a control or mutant strains lacking specific HAT or HDAC activities. Our analysis identified several known and novel HAT and HDAC target sites. Our data also defined the division of labor between the different HATs and HDACs in maintaining the steady-state level of histone acetylation. Overall, we anticipate that the methods described in this thesis will address some of the existing challenges facing the chromatin field. Moreover, the data presented will provide valuable insights for future genetic and biochemical studies involving the fission yeast.

Les éléments transposables sont des séquences génomiques capables de se répliquer et de se déplacer dans les génomes. Leur capacité à s’insérer près des gènes et à produire des réarrangements chromosomiques par recombinaison entre copies, font des éléments transposables des agents mutagènes. Les éléments transposables sont de plus capables de modifier l’expression des gènes voisins grâce aux régions promotrices qu’ils possèdent. Les éléments transposables ont été trouvés dans la plupart des génomes dans lesquels ils ont été recherchés. Ils forment ainsi 45 % du génome de l’homme et peuvent représenter jusqu’à 90 % du génome de certaines plantes. Dans la première partie de ma thèse, je me suis penché sur les facteurs qui déterminent la distribution de ces éléments. Je me suis intéressé à un facteur particulier, qui est la fonction des gènes dans le voisinage des insertions d’éléments transposables. Dans la deuxième partie, j’ai essayé de déterminer l’impact de l’altération des modifications épigénétiques (modifications d’histones plus précisément) associées aux différents composants géniques, dont les éléments transposables, sur la variation de l’expression des gènes en condition tumorale. / Transposable elements are genomic sequences able to replicate themselves and to move within genomes. Their ability to integrate near genes and to produce chromosomal rearrangements by recombination between copies, make transposable elements mutagens. Moreover, transposable elements are able to alter the expression of neighboring genes through their promoter regions. Transposable elements form 45% of the human genome and may represent up to 90% of certain plant genomes. In the first part of my thesis, I examined the factors that determine the distribution of these elements. I have been interested in a particular factor, which is the function of the genes in the vicinity of transposable element insertions. In the second part, I determined the impact of epigenetic modifications alterations (histone modifications) in different gene components, including transposable elements, on the variation of gene expression in tumoral conditions.

Les invertases de plantes (Invs) hydrolysent de manière irréversible le saccharose en fructose et glucose. En fonction de leur pH optimum et de leur localisation subcellulaire, les Invs sont classées en trois groupes : alcaline et neutre (A/N-Inv), vacuolaire (VI) et de paroi (CWI). Le but de notre étude a été de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les régulations post-traductionnelles d'une VI de Solanum lycopersicum (VINV). L'ADNc codant pour VINV a été cloné et exprimé dans le système hétérologue Pichia pastoris. Après purification, la caractérisation biochimique a été réalisée et a montré des résultats comparables à ceux obtenus précédemment pour d'autres Invs. La structure tridimensionnelle de VINV a été résolue par cristallographie aux rayons X à 2,75 Å et il s'agit de la première structure d'une VI décrite jusqu'ici. Des expériences de mutagénèse dirigée ont permis d'identifier certains acides aminés impliqués dans la catalyse : le nucléophile, le catalyseur acide/base, le stabilisateur d'état de transition et un résidu qui module le pKa du catalyseur acide/base. Par ailleurs, la régulation de l'activité de VINV a été étudiée. La N-glycosylation de VINV recombinante semble être importante pour la stabilité de la structure. De plus, l'activité VINV peut aussi être modulée par un inhibiteur protéique spécifique. Une approche de génomique fonctionnelle a été utilisée, et un inhibiteur d'invertase vacuolaire putatif (SolyVIF) de S. lycopersicum a été identifié dans la banque de données des Solanacées. L'ADNc codant pour SolyVIF a été cloné et exprimé dans le système hétérologue Escherichia coli Rosetta gami (DE3). / Plant invertases (Invs) hydrolyze irreversibly sucrose into fructose and glucose. Based on their pH optima and subcellular localization, Invs are categorized into three groups: alkaline and neutral invertase (A/N-Inv), vacuolar invertase (VI), and cell wall invertase (CWI). The goal of our study was to better understand mechanisms involved in the molecular regulation of a VI from Solanum lycopersicum (VINV) at post-translational levels. The VINV cDNA was cloned and heterologously expressed in Pichia pastoris. After purification, the biochemical characterization was performed and showed comparable results with those obtained previously for other characterized Invs. The three-dimensional structure of VINV was solved by X-ray crystallography to 2.75 Å resolution and it was the first structure of a plant VI described so far. Mutations experiments allowed to identify important amino acids: the nucleophile, the acid/base catalyst, the transition-state stabilizer and a residue that modulate pKa of the acid/base catalyst. Moreover, the regulation of VINV at different post-translational levels was studied. N-glycosylation of recombinant VINV seems to be important for structure stability. VINV activity can also be modulated by specific proteinaceous inhibitor. A functional genomics approach was used, and a putative vacuolar invertase inhibitor (SolyVIF) of S. lycopersicum was identified in the Solanaceae data bank. SolyVIF cDNA was cloned and heterologously expressed in Escherichia coli Rosetta gami (DE3). Recombinant protein was purified and characterized.

L'étude des modifications post-traductionnelles a connu au cours des dernières années un regain d'intérêt notable. Tout d'abord car elle s'effectue aujourd'hui au travers d'approches basées sur la spectrométrie de masse, technique qui pendant cette période a connu de profonds bouleversements, conduisant à des études plus aisées et systématiques.Mais aussi car tant par leur variété que par le rôle qu'elles jouent dans la vie et la régulation cellulaire, ces modifications ne peuvent plus être négligées. Par ailleurs au cours de ces quinze dernières années, nous avons assisté concernant les procaryotes à un changement total de paradigme. En effet à la fin des années 90, l'idée dominante était que ces modifications pouvaient exister chez ceux-ci mais de façon très partielle et/ou très particulière.Dans ce travail, les divers degrés d'iodation de la tyrosine ont été sondés par une approche de type «shotgun » sur un organe entier, la thyroïde de souris. L'efficacité de ce type d'approche démontrée, les modifications post-traductionnelles potentiellement présentes dans des organismes modèles radiorésistants, la bactérie Deinococcus deserti et l'archée Thermococcus gammatolerans ont été analysées. Dans le premier cas, les données de protéomique montrent que de nombreuses acétylations N-terminales portent sur un motif spécifique (essentiellement des thréonines et sérines), cas très atypique pour une bactérie. Chez Thermococcus gammatolerans les acétylations N-terminales sont rares, mais la présence d'acétylations sur les chaînes latérales des lysines est notable. La présence de phosphorylations sur ces mêmes protéines, laisse entrevoir un possible phénomène de « cross talk » entre les lysines acétylées et les sérines et/ou thréonines phosphorylées.Ici, nous démontrons que la complexité du protéome chez les procaryotes par le biais des MPT est bien réelle et que de possibles interdépendances entre MPT mériteraient un regard nouveau. / Recently, the study of post-translational modifications has greatly evolved, mainly because of crucial progresses in mass spectrometry methodology which have allowed high-throughput, high resolution analysis. Their variety and their role in the regulation of key molecular mechanisms are increasingly documented. In this work, the different degrees of iodination of tyrosine were probed with a "shotgun" approach carried out from an entire organ, the mice thyroid. Post-translational modifications present in two radioresistant organism models, the bacterium Deinococcus deserti and the archaeon Thermococcus gammatolerans, were analyzed. The large scale exploration of N-terminal acetylation in D. deserti indicates a specific pattern of this modification on serine and threonine, as well as an atypical, high propension to acetylation with 50% of modified N-termini. In T. gammatolerans, N-terminal acetylation is rare, but the presence of acetylation on lysine side chains is significant. The presence of phosphorylation on these proteins suggests a potential "cross talk" between the acetylated lysine and phosphorylated serine or threonine residues. This work demonstrates that the complexity of the proteome in prokaryotes through post-translational modifications is higher than expected when extremophiles are scrutinized compared to classical prokaryote models. Interdependencies between post-translational modifications definitively deserve a fresher look.

Wnt signalling represents an important mechanism participating in control of cellular and developmental processes, including establishment of cell polarity, cell fate specification, stem cell self-renewal, tissue patterning and organogenesis, homeostasis maintenance and regeneration. Misregulation of the Wnt signalling during embryogenesis leads to developmental defects while aberrant activation later in development is associated with degenerative diseases and a number of cancers. The presented PhD thesis is based on four original publications that deal with the post-translational modifications of Wnt ligands and molecular mechanisms contributing to the regulation of a transcriptional profile of the so-called canonical Wnt pathway. Wnt signalling pathway is used repetitively both in time and different cellular contexts throughout development of multicellular organisms. Inevitably, in each single situation -catenin/TCF complexes, the downstream effectors, induce only subsets of all potential target genes. How this differential tissue- and stage-specific control over various subsets of target genes is achieved with such a limited number of nuclear effectors is not fully understood. Along with the expression of specific LEF/TCF family members or their variants containing different functional domains...

The canonical Wnt signaling pathway is one of the most important pathways involved in cell proliferation and differentiation. It is highly conserved in evolution and participates not only in embryonic development but also in adult tissue homeostasis. In the intestine, Wnt signaling is closely connected to maintenance of intestinal stem cells and renewal of the epithelia. Conversely, aberrant activation of the Wnt signaling pathway underlies different types of human diseases. Its constitutive activation results in neoplasia and specifically in development of colorectal cancer, which is the third most common malignancy in western world. The aim of this thesis was to uncover various aspects of the regulatory mechanisms of the Wnt/β-catenin signaling cascade. Furthermore, I headed to find novel Wnt pathway modulators and confirm their function in vivo. The results are presented in four publications. The first study examines murine Wnt proteins processing and the sequential order of Wnt post-translational modifications which are required for the secretion and signaling activity of the ligands. Next publication focuses on the gene Troy, which we identified as negative regulator of Wnt signaling. TROY was discovered as a Wnt target gene during DNA microarray profiling of human colorectal cancer cells....

Protein-Protein-Wechselwirkungen steuern zelluläre Funktionen auf molekularer Ebene. Posttranslationale Proteinmodifikationen beeinflussen diese Wechselwirkungen und erlauben dynamische Regulierung. Tyrosinphosphorylierung ist eine besonders relevante Modifikation, weil sie eng mit interzellulärer Regulation von Wachstum und Enticklung in Vielzellern verbunden ist. Da falsche Regulierung dieser Prozesse zu Krebs oder Autoimmunerkrankungen führen kann, ist sie auch von großem medizinischen Interesse. In Hefe-Zwei-Hybrid- Untersuchungen mit Volllängen-Proteinen im Genommaßstab wurde ein umfassender Satz von 292 größtenteils neuen phosphotyrosinabhängigen Proteinwechselwirkungen erster Güte ermittelt. Damit wurde eine Wissenslücke im Bereich der phosphotyrosinabhängigen Signalübertragung, der bisher hauptsächlich auf Peptidbindungs- und Affinitätsaufreinigungs-gekoppelten Massenspektronomieexperimenten fußte. Die Güte der Interaktionen wurde experimentell und informatisch, in Coimmunpräzipitations- und Proteinkomplementierungs-, sowie in Überrepräsentationsanalysen und Literaturvergleichen, gezeigt. Bekannte lineare Bindesequenzmotive kommen zwar gehäuft vor, können die Mehrzahl der Interaktionen aber offensichtlich nicht erklären. Die Wechselwirkungen bilden ein dichtes, einheitliches Netzwerk und widerspiegeln phosphotyrosinabhängige KEGG-Signalwege. Es hat ein Herzstück aus acht Genen, von denen sieben fest etablierte Signalverarbeitungshauptknotenpunkte darstellen. Dem achten, SH2D2A, scheint eine deutlich wichtigere Rolle zuzukommen als bisher wahrgenommen. Schliesslich wurde für eine Auswahl von GRB2-Interaktionen unterschiedliche subzelluläre Verortung vorgenommen. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nah, dass die hier veröffentlichten Wechselwirkungen einen wesentlichen Schritt für das Verstehen von Wachstum und Entwicklung markieren und zur Verbesserung der Behandlungsmöglichkeiten in wichtigen Medizinbereichen beitragen werden. / Protein-protein interactions govern cellular functions on the molecular level. Post-translational modifications alter these interactions allowing highly dynamic regulation. Protein tyrosine phosphorylation is an especially relevant post-translational modification, because it is tightly linked to intercellular regulation of growth and development in metazoans. Diseases like cancer or autoimmune disorders arise from misregulation of these processes generating great medical interest in protein tyrosine phosphorylation and processes relating to it. This study provides a comprehensive set of 292 mostly novel, high-quality phosphotyrosine- dependent protein-protein interactions detected in genome-scale yeast two-hybrid screens using full-length proteins filling a gap in phosphotyrosine signaling knowledge, which has so far been based largely on peptide binding and affinity purification-coupled mass spectrometry experiments. The high quality was demonstrated experimentally and computationally, in co-immunoprecipitation and protein complementation assays, as well as over-representation analyses and comparison to prior knowledge. Previously reported linear peptide motifs are reflected in the binding partners, but clearly do not account for most of the interactions, emphasizing the relevance of full-length protein context. The interactions were further shown to form an unusually dense, monolithic network with a central core and reflect and expand phosphotyrosine-related KEGG pathways. Seven of the eight core proteins are well-established signaling hubs. The eighth core gene, SH2D2A, seems to play a more central role than currently appreciated. Finally, selected interactions involving GRB2 were shown to occur in different specific subcellular localizations. Together, these results strongly suggest that the interactions presented here represent an important step toward understanding growth and development and will benefit treatment of pressing medical issues substantially.

La phosphorylation oxydative est un processus majeur du métabolisme énergétique qui est catalysée par les enzymes de la chaîne respiratoire (OXPHOS), localisées dans la membrane interne des mitochondries. Sa dérégulation est souvent associée à des pathologies, par exemple aux maladies mitochondriales et neurodégénératives. La régulation de la phosphorylation oxydative par la phosphorylation reste encore peu comprise et peu étudiée. Pourtant, la phosphorylation est une des modifications post-traductionnelles les plus répandues dans la cellule, régulant de nombreux aspects de la vie cellulaire et dont l’altération est associée à des pathologies au niveau cellulaire (Alzheimer, Parkinson, cancer). Concernant la phosphorylation oxydative, il est à noter que quelques sites de phosphorylation des complexes respiratoires, en particulier du complexe IV, ont été montrés comme ayant un effet sur leur stabilité et/ou leur activité. Toutefois la connaissance du phosphoprotéome mitochondrial n’est pas suffisamment documentée à ce jour pour identifier les différents rôles que pourraient jouer la phosphorylation au niveau de la mitochondrie et en particulier, de la chaîne respiratoire. Dans la première partie de la thèse, nous nous sommes intéressés à l’analyse du phosphoprotéome mitochondrial de Saccharomyces cerevisiae dans trois conditions de culture : respiratoire (YLAC), respiro-fermentaire (YPGalA) et fermentaire (YPGA). Nous avons quantifiés près de 300 sites de phosphorylation dans la mitochondrie, dont 90 ont un niveau de phosphorylation variable selon le substrat. Les données que nous avons obtenues constituent une base pour l’analyse de la phosphorylation mitochondriale et de la compréhension de son mécanisme. Les sites de phosphorylation de la voie métabolique énergie sont ceux présentant le plus de variation de leur niveau de phosphorylation. La localisation des résidus phosphorylés sur la structure des complexes respiratoires nous a permis d’émettre des hypothèses sur le rôle de ces résidus. Afin de normaliser la quantité des résidus phosphorylés dans les trois conditions de culture, nous avons aussi quantifié le protéome mitochondrial dans les trois conditions de culture. Ceci nous a permis d’argumenter en faveur d’un métabolisme respiro-fermentaire en YPGalA, question encore largement discutée à ce jour. Enfin, cette première étude quantitative du protéome et phosphoprotéome mitochondrial constitue une avancée dans l’étude de la régulation de la mitochondrie par la phosphorylation. Elle peut notamment apporter des informations applicables à l’étude du cancer : en effet, les cellules saines ont un métabolisme respiratoire tandis que les cellules tumorales, dérégulées, ont un métabolisme fermentaire. La seconde partie de la thèse concerne l’analyse du rôle de deux sous-unités du complexe IV de la chaîne respiratoire : les sous-unités Cox12p et Cox13p, encore peu étudiées à ce jour. De plus, deux sites de phosphorylation ont été identifiés sur la sous-unité Cox12p. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés au rôle de ces sous-unités, notamment au niveau de l’assemblage et de l’activité du complexe IV, en analysant des mutants Δcox12, Δcox13 et Δcox12Δcox13. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés au rôle des deux sites de phosphorylation de Cox12p : Ser7 et ser82. Nous avons généré les mutants phosphomimétiques de ces deux résidus et étudié leurs effets sur la stabilité et/ou l’activité du complexe IV. Cette seconde étude nous a notamment permis d’identifier un rôle de Cox12p sur la stabilité du complexe et un rôle de Cox13p dans sa dimérisation. La phosphorylation de Cox12p au niveau de la Ser7 semble aussi déstabiliser le complexe IV. De plus, la phosphorylation de la Ser7 et de la Ser82 semblent influencer l’interaction du cytochrome c avec le complexe IV. Cette hypothèse reste à vérifier mais est pertinente du fait de la proximité de Cox12p avec Cox2p, qui porte le lieu de fixation du cytochrome c. / Mitochondria are the powerhouses of cells, providing energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). The synthesis of ATP is achieved by oxidative phosphorylation (OXPHOS), a process catalyzed by the respiratory chain, which is located in the inner membrane of mitochondria. Deregulation of OXPHOS is often associated to diseases. Deregulation is particularly observed in mitochondrial diseases and neurodegenerative diseases, but regulation of respiration by phosphorylation is still poorly understood.However, phosphorylation is one of the most frequent post-translational modifications in the cell, modulating most processes, and defects at a cellular level are observed in some diseases (Alzheimer, Parkinson, cancer). Moreover, some phosphorylation sites have been identified in the respiratory complexes, particularly in the complex IV; some of them have an effect on the stability and/or activity of the complex, but we still lack a comprehensive study about mitochondrial phosphoproteome. Such analysis would be necessary to extend the role of phosphorylation in the regulation of mitochondrial functions in general, and in the regulation of the respiratory chain in particular.In the first part of this thesis, we focused on the analysis of the mitochondrial phosphoproteome of Saccharomyces cerevisiae. We studied the mitochondrial phosphoproteome in three growth conditions: in the respiratory condition (YLAC), in the fermentable condition (YPGA) and in an intermediate one (YPGalA). We quantified around 300 mitochondrial phosphorylation sites in which 90 displayed a different level of phosphorylation according to the substrate. This study is a first step towards understanding mitochondrial phosphorylation and its mechanism. Phosphorylation sites with varying levels of phosphorylation according to their conditions are mostly located on proteins involved in energy metabolism. We localized the phosphosites on the structure of the respiratory complexes when it was possible. This allowed us to make hypotheses on the role of these residues. In order to normalize the quantity of phosphorylation sites in the three growth conditions, we also studied the mitochondrial proteome in the three conditions. These results helped us to understand the energetic metabolism of galactose, which is surely intermediate between respiration and fementation, a question still debated nowadays.Finally this proteomic and phosphoproteomic study is a step forward in the comprehension of regulation of mitochondria by phosphorylation. These results can be used as a model to study cancer cells because they display a deregulation in the energetic metabolism: normal cells display respiratory metabolism whereas cancer cells exhibit fermentable metabolism.The second part of this thesis was the study of two subunits of complex IV of the respiratory chain: Cox12p and Cox13p, which had been poorly studied. Moreover, two phosphorylation sites had been identified in the subunit Cox12p. First we were interested in the role of these two proteins, thus we compared the mitochondria of mutants Δcox12, Δcox13 et Δcox12Δcox13 with wild-type mitochondria. We particularly focused on the assembly and the activity of complex IV. Secondly, we analyzed the role of the two phosphosites of Cox12p: Ser7 and Ser82. We generated phosphomimetic mutants of these two residues and observed their effects on the stability and/or activity of complex IV.All of these results allowed us to identify a role of Cox12p in the stability of complex IV and a role of Cox13p in the dimerization of complex IV. Phosphorylation of Ser7 of Cox12p seemed to destabilize the complex. Moreover phosphorylation of both Ser7 and Ser82 of Cox12p seemed to modify the interaction between cytochrome c and complex IV; this hypothesis remains to be tested but is relevant according to the proximity between Cox12p and the subunit Cox2p, where the cytochrome c interacts.

Trinucleotide repeat (TNR) instability including repeat expansions and repeat deletions is the cause of more than 40 inherited incurable neurodegenerative diseases and cancer. TNR instability is associated with DNA damage and base excision repair (BER). In this dissertation research, we explored the mechanisms of BER-mediated TNR instability via biochemical analysis of the BER protein activities, DNA structures, protein-protein interaction, and protein-DNA interaction by reconstructing BER in vitro using synthesized oligonucleotide TNR substrates and purified human proteins. First, we evaluated a germline DNA polymerase β (pol β) polymorphic variant, pol βR137Q, in leading TNR instability-mediated cancers or neurodegenerative diseases. We find that the pol βR137Q has slightly weaker DNA synthesis activity compared to that of wild-type (WT) pol β. Because of the similar abilities between pol βR137Q and WT pol β in bypassing a template loop structure, both pol βR137Q and WT pol β induces similar amount of repeat deletion. We conclude that the slightly weaker DNA synthesis activity of pol βR137Q does not alter the TNR instability compared to that of WT pol β, suggesting that the pol βR137Q carriers do not have an altered risk in developing TNR instability-mediated human diseases. We then investigated the role of DNA synthesis activities of DNA polymerases in modulating TNR instability. We find that pol βY265C and pol ν with very weak DNA synthesis activities predominantly promote TNR deletions. We identify that the sequences of TNRs may also affect DNA synthesis and alter the outcomes of TNR instability. By inhibiting the DNA synthesis activity of pol β using a pol β inhibitor, we find that the outcome of TNR instability is shifted toward repeat deletions. The results provide the direct evidence that DNA synthesis activity of DNA polymerases can be utilized as a potential therapeutic target for treating TNR expansion diseases. Finally, we explored the role of post-translational modification (PTM) of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) on TNR instability. We find that ubiquitinated PCNA (ub-PCNA) stimulates Fanconi associated nuclease 1 (FAN1) 5’-3’ exonucleolytic activities directly on hairpin structures, coordinating flap endonuclease 1 (FEN1) in removing difficult secondary structures, thereby suppressing TNR expansions. The results suggest a role of mono-ubiquitination of PCNA in maintaining TNR stability by regulating nucleases switching. Our results suggest enzymatic activities of DNA polymerases and nucleases and the regulation of the activities by PTM play important roles in BER-mediated TNR instability. This research provides the molecular basis for future development of new therapeutic strategies for prevention and treatment of TNR-mediated neurodegenerative diseases.

The citrulline-nitric oxide (NO) cycle, comprised of the enzymes argininosuccinate synthase (AS), argininosuccinate lyase (AL) and endothelial nitric oxide synthase (eNOS), is responsible for the regulated production of endothelial NO. Although most studies have focused on eNOS to uncover important regulatory mechanisms, we and others have determined that AS is an essential and regulated step in endothelial NO production. AS is rate limiting for endothelial NO production and is the primary source of arginine, the substrate for eNOS-mediated NO production, despite saturating intracellular levels of arginine and available arginine transport systems. AS is essential for endothelial cell viability and its expression is regulated coordinately with eNOS by TNF and thiazolidenediones with concomitant effects on NO production. Given the importance of AS for endothelial health, we explored three independent regulatory mechanisms. In Chapter One, the functional consequences of altered AS expression due to overexpression, insulin, VEGF and ceramide were studied. We demonstrated that overexpression of AS leads to enhanced NO production and that insulin, VEGF and ceramide coordinately regulate the expression of AS and eNOS. In Chapter Two, the first post-translational modifications of AS in the endothelium were characterized. We determined that AS is an endogenous phosphoprotein in the endothelium, described several levels of biological significance of AS phosphorylation, identified 7 sites of AS phosphorylation and began to uncover the direct impact of phosphorylation on AS function. Finally, in Chapter Three, endothelial AS subcellular localization was defined and important protein interactions were identified including caveolin-1 and HSP90. The work presented in this dissertation demonstrates that multiple mechanisms regulate the function of AS, often coordinately with eNOS, and have a direct impact on nitric oxide production. Our findings suggest that the global understanding of the citrulline-NO cycle as a metabolic unit will unravel new paradigms that will re-define our understanding of the regulation of vascular function by NO.