Pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la genèse et la régulation de l'activité rythmique cardiaque, une bonne connaissance des gènes impliqués dans ces mécanismes et de leur fonction est nécessaire.J'ai mis au point les conditions expérimentales d'un crible génétique et identifié deux gènes régulateur du rythme cardiaque : ork1, code pour un canal potassique à deux pores, pur régulateur du rythme cardiaque ; painless, code pour un canal TRPA, régulateur du rythme cardiaque et acteur essentiel de la réponse cardiaque au stress mécanique. Du fait de l'importance de la régulation de l'activité cardiaque par le stress acide, le rôle de NDAE, échangeur Cl/HCO3, a été recherché. Il est requis pour une meilleure récupération après un stress acide et couplé à l'échangeur Na/Ca.Ces travaux ont permis de valider le modèle Drosophile pour identifier de nouveaux gènes et pour étudier le rôle des gènes encore mal connu dans l'activité cardiaque. / A good knowledge of genes implicated in genesis of cardiac activity and in its regulation is crucial for a better understanding of arrhythmia.In this study, I have developed experimental conditions to perform a genetic screen and identified two gens implicated in cardiac activity : ork1, encoding a two-pore potassium channel is a pure regulator of cardiac rhythm ; painless, encoding a TRPA channel, regulates cardiac frequency and mediates the cardiac response to mechanical stress. We know that cardiac activity is particulary sensitive to acidic stress and the study of NDAE, the unique Drosophila Cl/HCO3 exchanger, has shown that NDAE is required for cardiac activity recovery after acidic stress and displayed the genetic link with the Na/Ca exchanger.This work validates Drosophila as a good system to found new genes implicates in cardiac activity, particularly in genetic screen, and to precise the role of genes still unknown in cardiac activity.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Médecine. Physiologie : Nantes : 2007. / Bibliogr.

La protéine humaine hERG (human ether-à-go-go related gene) s’associe en homo-tétramère pour former le canal potassique voltage-dépendant Kv11.1. C’est un acteur majeur de la repolarisation du potentiel d’action cardiaque par sa capacité à externaliser le potassium du cardiomyocyte. L’altération de sa fonction induit le syndrome du QT long à l’origine d’arythmies cardiaques et pouvant conduire à un arrêt du cœur. Ce syndrome parfois génétique provient le plus souvent d’une inhibition pharmacologique. De nombreux médicaments ont montré leur capacité à inhiber hERG en se fixant dans la lumière du canal. L’étude des interactions moléculaires entre hERG et médicaments intéresse les scientifiques depuis de nombreuses années. Très récemment, la première structure atomique de hERG à l’état ouvert par cryo-microscopie électronique a permis une avancée majeure dans la compréhension de l’agencement du pore du canal. De nombreuses questions restent malgré tout non résolues concernant les mécanismes de liaison des ligands. Plus encore, le développement d’approches biophysiques à partir de canal purifié permettraient de caractériser et d’anticiper des interactions avec les médicaments. Dans cette perspective, nous avons testé plusieurs stratégies pour obtenir le canal hERG purifié dans une forme stable, homogène et fonctionnelle. Notre étude est basée sur une construction simplifiée et chimérique du canal hERG, la version hERG(S1-coil). Chaque étape permettant la production et la purification d’une protéine membranaire a été optimisée en testant différentes techniques proposées par la littérature. Nous avons comparé les rendements d’expression du canal dans différents systèmes recombinants procaryotes ou eucaryotes. La quantité de protéine totale et le pourcentage de protéine fonctionnelle dans les membranes ont été étudiés. Dans un deuxième temps, le canal a été solubilisé puis purifié. Nous avons comparé les rendements de solubilisation et la stabilité protéique en fonction du type de détergent. En parallèle, nous avons mis au point des moyens techniques pour évaluer la fonction du canal au fur et à mesure du processus de production et purification. Le canal hERG(S1-coil) tétramérique et fonctionnel a finalement été identifié dans la fraction purifiée. Cependant, des optimisations sont encore à apporter pour conserver l’agencement tétramérique et empêcher l’agrégation au cours du temps avant de pouvoir envisager des études biophysiques et structurales. A terme, ces travaux pourraient profiter à la production et à la purification d’autres protéines membranaires oligomériques. / The human protein hERG (human ether-à-go-go related gene) assembles as homo-tetramer to form the voltage-gated potassium channel Kv11.1. This channel is involved in repolarization of the cardiac action potential by regulating the potassium release from cardiomyocytes. hERG malfunction was found to cause long QT syndrome, a disorder that predisposes affected patients to arrhythmias and sudden death. This can be due to congenital mutation in the hERG gene and, most frequently, it is caused by pharmacological agents. Several drugs are known to block the channel ion pathway, resulting in off-target inhibition of hERG. Consequently, understanding the molecular basis of drug binding to hERG has become a high priority. The recent determination of a near-atomic resolution structure of the opened channel, using cryo-electron microscopy, provides insights into how this channel work. But several questions are still unanswered to understand the mechanisms of hERG function and drug binding. Moreover, new biophysical protocols with the purified hERG channel would help scientists and industries to anticipate drug side effects. In this context, we investigated strategies to purify a stable, homogenous and functional hERG channel. Our study was based on a shorter and chimeric hERG channel, the hERG(S1-coil) version. We optimized each step from production to purification of membrane proteins by testing experimental protocols found in the literature. In this thesis project, we first compared production rates of the channel in several prokaryote and eukaryotes recombinant systems. Total protein produced and the percent of functional channel were investigated in membranes from each recombinant system. Then, the channel was extracted from membranes before purification. Solubilizing rates and channel stability were compared depending on detergents. In another hand, we also developed protocols to investigate the channel stability and function along production and purification. A tetrameric and functional channel was finally purified and identified by this strategy. More work however is still needed to improve channel homogeneity and stability before to be suitable for biophysical and structural studies. In the future, this work could also help investigations in production and purification of other oligomeric membrane proteins.

La difficulté que connaissent bon nombre de collectivités territoriales en Europe dans la mise en oeuvre du développement durable montre qu'il n'est pas évident d'associer ce dernier au territoire. Pourtant, une analyse approfondie du concept semble faire de la durabilité et de la territorialité un même enjeu.<br />L'étude de la reconversion du Bassin potassique alsacien a permis le rapprochement de ces deux notions. Le passage d'un système mono-activité/ mono-identité propre à l'épopée minière à une diversification des activités et des cultures a permis de s'interroger: comment réussir un tel passage ? Le concept de développement durable peut-il nous y aider ?<br />A l'aide d'études bibliographiques, d'enquêtes publiques et de réseaux d'échanges, une meilleure connaissance du Bassin sur la période 1904-2005 a permis d'envisager autrement son redéploiement et de montrer qu'il était à même d'accueillir un vrai projet de territoire tel un plan de développement durable.<br />S'en sont suivis le décorticage des modalités d'application territoriale de la durabilité, une réflexion sur la pertinence de l'espace de projet, enfin une proposition de diagnostic territorial de développement durable élargi à tout territoire, accompagné d'indicateurs de suivi.<br />L'expérimentation d'un tel diagnostic pour le Bassin a montré l'importance que revêt la territorialité dans la mise en place de l'Agenda 21 local. Tout projet de ce type doit s'insérer dans une entité territoriale cohérente (Bassin potassique) même si les frontières de l'espace décisionnel (Communauté d'Agglomération de Mulhouse Sud-Alsace) en débordent.<br />Même si la réflexion a porté sur le seul Bassin potassique, une application de ses apports méthodologiques serait particulièrement intéressante, dans le cadre d'expérimentations à d'autres plans de développement durable, au sein de territoires cohérents ou non, en France comme à l'étranger.

Des liquides riches en K2O ( K2O > 2 pds. % ; K2O/Na2O > 1) sont observés dans la majeure partie des contextes géodynamiques sur Terre. Ces liquides sont principalement caractérisés par leurs teneurs en K2O variant entre 3 et 13 pds. % et des rapports K2O/Na2O de 1 – 40. Les compositions chimiques des différents groupes de liquides riches en K2O observés sont extrêmement variables, depuis des termes très sous-saturés en silice (kamafugites, kimberlites, lamproïtes madupitiques à olivine) à des termes sur-saturés en silice (shoshonites, lamproïtes à phlogopite). Ces fortes teneurs en K2O et les rapports K2O/ Na2O élevés ne peuvent pas être obtenus par la fusion de péridotites fertiles ou réfractaires. Des expériences de fusion partielle en piston-cylindre ont été réalisées sur des péridotites à phlogopite ± amphibole dans les domaines de stabilité du spinelle et du grenat (1 et 3 GPa) afin de déterminer la capacité du manteau lithosphérique à produire des liquides riches en K2O. La présence de faibles teneurs en fluor dans le matériel de départ stabilise le phlogopite à des températures supérieures aux études antérieures. Les faibles degrés de fusion obtenus à 1 GPa sont sur-saturés en silice et leur teneur en K2O est tamponnée à 4 – 6 pds. % par la présence de phlogopite résiduel pour des péridotites fertile et réfractaire, respectivement. Les expériences réalisées à 3 GPa montrent que les premiers degrés de fusion sont sous-saturés en silice mais plus riches en K2O (6 – 8 pds. % pour la lherzolite et la harzburgite, respectivement) que dans le domaine du spinelle, démontrant l’importance de la pression sur la genèse de liquides riches en K2O. Les modélisations réalisées montrent également que l’augmentation de la proportion de phlogopite dans la source ne modifie pas la teneur en K2O des liquides formés mais diminue leurs rapports K2O/Na2O. Par conséquent, la fusion de péridotite à phlogopite dans la gamme de pression étudiée ne permet pas d’obtenir des liquides aussi riches en K2O que certains lamproïtes et kamafugites. Une série d’expériences réalisée sur du phlogopite pur à 1 et 3 GPa montrent que les liquides dérivés de telles sources sont très riches en K2O (12 – 14 pds. %) et comparables aux lamproïtes. Les différentes lithologies dans le manteau ne permettent cependant pas d’expliquer la grande gamme de composition des liquides riches en K2O et nécessitent des conditions riches en éléments volatils (H2O, CO2, F) et des fugacités d’oxygène réductrices. / K2O-rich melts (K2O > 2 wt. %; K2O/Na2O > 1) have been described in all of the major geodynamic settings on Earth. These melts are mainly characterized by their huge K2O content, ranging between 2 – 13 wt. % and K2O/Na 2 O ratios of 1 – 40. The chemical compositions of the different K2O-rich melt groups span a very high variability, from strongly silica undersaturated melts (kamfugites, kimberlites, madupitic lamproites) to silica-rich terms (shoshonites, phlogopite lamproites). These very high K2O contents together with strong K2O/Na2O ratios cannot be derived from partial melting of fertile or depleted peridotites. Partial melting experiments have been conducted in piston cylinder apparatus on phlogopite ± amphibole-peridotite in the spinel and garnet stability fields (1 – 3 GPa) in order to determine the ability of the lithospheric mantle to produce K2O-rich melts. The presence of small amounts of fluorine in the starting material leads to stabilize phlogopite at higher temperatures than previously determined. The first degrees of melting at 1 GPa are silica-rich and their K2O contents are buffered to 4 – 6 wt. % in the presence of residual phlogopite, depending on the source fertility (lherzolite and harzburgite, respectively). In the garnet stability field at 3 GPa, low-degree melts are silica-undersaturated but are enriched in K2O, compared to the garnet stability field: from 6 to 8 wt. % in lherzolite and harzburgite sources, respectively. These results suggest that pressure is a key parameter in the mantle to produce K2O-rich melts. Partition coefficient modelings show that increasing the phlogopite proportion in the mantle source does not modify the K2O content of derived melts, but decreases their K2O/Na2O ratios. Consequently, partial melting of phlogopite-peridotite in this range of pressure cannot accounts for the highest K2O contents observed in natural lamproites and kamafugites. A series of experiments has been realized on pure phlogopite at 1 and 3 GPa, showing that derived melts are strongly enriched in K2O (12 – 14 wt. %) and share chemical affinities with lamproites. Peridotite or pyroxenite melting in the presence of phlogopite, however, do not permit to reproduce the high chemical variability of natural K2O-rich melts requires volatile-rich conditions (H2O, CO2, F) and reduced oxygen fugacities.

La mécanotransduction correspond à un processus dans lequel la force physique est convertie en signal chimique ou électrique. Ce processus est à la base de nombreuses fonctions physiologiques, y compris le sens du toucher, l’audition, la proprioception et la nociception. Nous ne connaissons pas à ce jour les mécanismes moléculaires à l’origine de la diversité fonctionnelle des mécanorécepteurs. L’objectif de thèse était de fournir 1 caractérisation des canaux mécanosensibles des neurones sensoriels afin d’identifier les mécanismes responsables des propriétés des mécanorécepteurs. 4 types de courants excitateurs ont été identifiés et classés sur la base de leurs cinétiques de relaxation: des courants à relaxation rapide, intermédiaire, lente ou ultra-lente. La relaxation résulte de l’adaptation et de l’inactivation. Nous montrons également que ces courants mécanosensibles possèdent des propriétés spécifiques permettant le codage des différents paramètres du stimulus mécanique. Tous s’activent graduellement en fonction de l’intensité du stimulus mécanique, mais seuls les courants à relaxation lente et ultralente informent sur la persistance du stimulus. A contrario, les courants à relaxation rapide et intermédiaire sont mis en jeu essentiellement par des stimulations rapides, ils traduisent donc la rapidité d’installation du stimulus. Nous avons ensuite identifié un nouveau courant mécanosensible potassique (IKmech) exerçant un effet inhibiteur sur la décharge des mécanorécepteurs. Le profil pharmacologique et les travaux menés sur des souris KO et transgéniques montrent que le courant IKmech est porté par la sous-unité Kv1.1 qui est mécano-susceptible via un mécanisme par lequel la pression altère la sensibilité au potentiel des canaux. En s’opposant aux courants excitateurs, le courant IKmech régule le seuil de décharge des mécano-nocicepteurs et la fréquence de décharge des mécanorécepteurs non nociceptifs. / The somatosensory system mediates fundamental physiological functions, including the senses of touch, pain and proprioception. The aim of my thesis was to understand molecular mechanism of mechanotransduction in mammalian sensory neurons.We identified 4 types of mechanotransducer currents that distribute differentially in cutaneous nociceptors and mechanoreceptors and that differ in desensitization rates. Desensitization of mechanotransducer channels in mechanoreceptors was fast and mediated by channel inactivation and adaptation, which reduces the mechanical force sensed by the transduction channel. Both processes were promoted by negative voltage. These properties of mechanotransducer channels suited them to encode the dynamic parameters of the stimulus. In contrast, inactivation and adaptation of mechanotransducer channels in nociceptors had slow time courses and were suited to encode duration of the stimulus. Thus, desensitization properties of mechanotransducer currents relate to their functions as sensors of phasic and tonic stimuli and enable sensory neurons to achieve efficient stimulus representation.In the second work, we explored the molecular determinants of threshold differences and temporal adaptation among mammalian mechanoreceptors. We identified a novel mechanosensitive K+ current (IKmech) in different classes of mechanosensory neurons from mouse and rat DRGs. IKmech activates slowly in response to mechanical stimulation and is carried by Kv1.1 subunit-containing K+ channels. By antagonizing depolarizing drive induced by excitatory MS currents, IKMech regulates threshold for noxious mechano-perception and temporal adaptation in non-painful mechanosensation. Our work has identified Kv1.1 as an essential molecular element in defining the threshold range of mechanical sensitivity and temporal responses of fibers associated with mechanical perception.

Les canaux ioniques sont des déterminants majeurs de la forme et de la durée du potentiel d'action (PA) cardiaque. Leur expression fonctionnelle à la membrane plasmique résulte d'une balance entre les voies antérograde et rétrograde du trafic intracellulaire, ainsi que de leur prise en charge par des compartiments endosomaux afin d'être recyclés ou dégradés. Le canal KV1.5 porte le courant principal de repolarisation atriale chez l'homme, IKur, et est impliqué dans la physiopathologie de la fibrillation atriale (FA). La FA est caractérisée par un raccourcissement de la durée du PA lié à un courant IKur augmenté et un courant ICaL diminué et est favorisée par l'augmentation des contraintes mécaniques. Ainsi, le canal KV1.5 constitue une cible majeure pour le développement d'anti-arythmiques spécifiques de l'oreillette. Ce projet avait pour but de mieux comprendre comment est régulée l'expression fonctionnelle des canaux KV1.5 dans les myocytes atriaux. Dans un premier temps, nous avons montré que le shear stress entraîne une augmentation du courant IKur impliquant la voie de mécanotransduction intégrine?1/FAK et l'endosome de recyclage lent. Dans les cellules hypertrophiées, cette voie de mécanotransduction est hyperactivée et le courant IKur est ainsi augmenté. Dans un second temps, nous avons montré que la voie d'endocytose des canaux KV1.5 est dépendante de la clathrine et que les microtubules sont principalement impliqués dans l'internalisation et la dynamique du canal à la surface des cellules. Ainsi, ce travail a permis de mieux caractériser les acteurs du trafic impliqués dans la régulation de l'expression fonctionnelle du canal KV1.5 dans les cardiomyocytes atriaux. / Ion channels are major determinants of shape and duration of the cardiac action potential (AP). Their functional expression at the sarcolemma is a dynamic process resulting from a balance between anterograde (exocytosis) and retrograde (endocytosis) pathways, and the involvement of the endosomal compartments which direct ion channels towards recycling or degradation. KV1.5 channel carries IKur current which constitutes the main atrial repolarizing current in human and which is involved in atrial fibrillation (AF). Mechanical forces and shortening of the AP duration are linked to an increased in IKur current and decreased ICaL current. Therefore, KV1.5 channel constitutes a major target for the development of atria-selective antiarrhythmic drugs. The aim on this project was to better understand how functional expression of KV1.5 channels in atrial myocytes is regulated. Firstly, we showed that shear stress triggers an increase in IKur current implying the integrinβ1/FAK mecanotransduction pathway. This process requires an intact microtubule network and involves the Rab11-associated recycling endosome. In hypertrophied cells, the mecanotransduction pathway is overactivated. Consequently, IKur is increased. Secondly, we demonstrated that KV1.5 channel endocytosis is mediated by the clathrin pathway. We showed that microtubules are involved in the internalization and dynamics of KV1.5 channel in the membrane. Therefore, this work provides a better understanding of the different players involved in the trafficking of KV1.5 channel and shed new lights on the functional regulation of this atria-specific channel.

Les cellules épithéliales des voies aériennes respiratoires sécrètent du Cl- via le canal CFTR. La fibrose kystique est une maladie génétique fatale causée par des mutations de ce canal. La mutation la plus fréquente en Amérique du Nord, ∆F508, met en péril la maturation de la protéine et affecte les mécanismes d’activation du canal. Au cours des dernières années, plusieurs molécules ont été identifiées par criblage à haut débit qui peuvent rétablir l’activation de protéines CFTR mutées. Ces molécules sont nommées potentiateurs. Les canaux K+ basolatéraux, dont KCa3.1, jouent un rôle bien documenté dans l’établissement d’une force électromotrice favorable à la sécrétion de Cl- par CFTR dans les cellules épithéliales des voies aériennes respiratoires. Il a par exemple été démontré que l’application de 1-EBIO, un activateur de KCa3.1, sur des monocouches T84 résulte en une augmentation soutenue de la sécrétion de Cl- et que cette augmentation était réversible suite à l’application de CTX, un inhibiteur de KCa3.1(Devor et al., 1996). Dans le cadre d’une recherche de potentiateurs efficaces en conditions physiologiques et dans un contexte global de transport trans-cellulaire, il devient essentiel de considérer les effets des potentiateurs de CFTR sur KCa3.1. Une caractérisation électrophysiologique par la méthode du patch clamp et structurelle via l’utilisation de canaux modifiés par mutagenèse dirigée de différents potentiateurs de CFTR sur KCa3.1 fut donc entreprise afin de déterminer l’action de ces molécules sur l’activité de KCa3.1 et d’en établir les mécanismes. Nous présentons ici des résultats portant sur les effets sur KCa3.1 de quelques potentiateurs de CFTR possédant différentes structures. Un criblage des effets de ces molécules sur KCa3.1 a révélé que la genisteine, le SF-03, la curcumine et le VRT-532 ont des effets inhibiteurs sur KCa3.1. Nos résultats suggèrent que le SF-03 pourrait agir sur une protéine accessoire et avoir un effet indirect sur KCa3.1. La curcumine aurait aussi une action inhibitrice indirecte, probablement via la membrane cellulaire. Nos recherches sur les effets du VRT-532 ont montré que l’accessibilité au site d’action de cette v molécule est indépendante de l’état d’ouverture de KCa3.1. L’absence d’effets inhibiteurs de VRT-532 sur le mutant constitutivement actif V282G indique que cette molécule pourrait agir via l’interaction CaM-KCa3.1 et nécessiter la présence de Ca2+ pour agir. Par ailleurs, un autre potentiateur de CFTR, le CBIQ, a des effets potentiateurs sur KCa3.1. Nos résultats en canal unitaire indiquent qu’il déstabilise un état fermé du canal. Nos travaux montrent aussi que CBIQ augmente la probabilité d’ouverture de KCa3.1 en conditions sursaturantes de Ca2+, ainsi que son affinité apparente pour le Ca2+. Des expériences où CBIQ est appliqué en présence ou en absence de Ca2+ ont indiqué que l’accessibilité à son site d’action est indépendante de l’état d’ouverture de KCa3.1, mais que la présence de Ca2+ est nécessaire à son action. Ces résultats sont compatibles avec une action de CBIQ déstabilisant un état fermé du canal. Finalement, des expériences en Ba2+ nous ont permis d’investiguer la région du filtre de sélectivité de KCa3.1 lors de l’action de CBIQ et nos résultats pointent vers une action de CBIQ dans cette région. Sur la base de nos résultats nous concluons que CBIQ, un potentiateur de CFTR, aurait un effet activateur sur KCa3.1 via la déstabilisation d’un état fermé du canal à travers une action sur sa ‘gate’ au niveau du filtre de sélectivité. De plus, les potentiateurs de CFTR ayant montré des effets inhibiteurs sur KCa3.1 pourraient agir via la membrane ou via une protéine accessoire du canal ou sur l’interaction CaM-KCa3.1. Dans l’optique de traitements potentiels de la fibrose kystique, nos résultats indiquent que le CBIQ pourrait être un potentiateur efficace pusiqu’il est capable de trimuler à la fois KCa3.1 et CFTR. Par contre, dans les cas du VRT-532 et du SF-03, une inhibition de KCa3.1 pourraient en faire des potentiateurs moins efficaces. / Airway epithelial cells are the site of Cl- secretion through CFTR. Cystic fibrosis is a fatal genetic disease caused by mutations in CFTR. The most frequent mutation in North America (∆F508) results in impaired maturation and altered channel gating of the protein. In the last years, several small molecules were identified by high throughput screening that could restore mutated CFTR function. Compounds addressing CFTR gating defects are referred to as potentiators. The basolateral K+ channel KCa3.1 has been documented to play a prominent role in establishing a suitable driving force for CFTR-mediated Clsecretion in airway epithelial cells. It has been shown, for example, that the application of 1-EBIO on T84 monolayers results in a sustained increase of Clsecretion and that this current can be reversed by application of CTX, a KCa3.1 inhibitor (Devor et al., 1996). Thus, in a global approach of transepithelial transport, the research for physiologically relevant CFTR potentiators should also consider their effects on the KCa3.1 channel. Electrophysiological patch clamp measurements and channel structural modification by site directed mutagenesis were used to characterize the action of CFTR potentiators on KCa3.1 and study their molecular mode of action. In this work we present results on the effects on KCa3.1 of several CFTR potentiators of different structures. We observed that the CFTR potentiators genistein, curcumin, SF-03 and VRT-532 could inhibit KCa3.1 activity at concentrations known to activate CFTR. Our results suggest that SF- 03 could act indirectly on KCa3.1 through a mechanism involving an accessory protein. Curcumin would also have an indirect inhibitory effect, probably mediated by the plasma membrane, as documented for other ion channels. A detailed study of VRT-532 revealed that this molecule has access to its binding site in a state independent manner, and is poorly effective on the V282G mutant of KCa3.1, which is constitutively active. These results suggest that VRT-532 could act through the CaM/KCa3.1 complex and require the presence of Ca2+ to inhibit channel activity. In contrast, CBIQ, another CFTR potentiator, succeeded to activate KCa3.1. Our results in single channel show that CBIQ vii destabilizes a non conducting state of the channel. We also showed that this molecule increases the apparent Ca2+ affinity as well as the channel open probability, even in saturating Ca2+ conditions. Experiences in which Ba2+ was used as a probe were also performed to determine if the action mechanism of CBIQ involves an effect on the selectivity filter. Our results showed that Ba2+ could displace CBIQ from its interacting site, suggesting that the increases in channel activity induced by CBIQ could result from a change in the energetics of the channel at the level of the selectivity filter. On the basis of our results, we conclude that CBIQ, a CFTR potentiator, could activate KCa3.1 by destabilizing a non conducting state of the channel, probably through an action near the selectivity filter region. Also, CFTR potentiators having an inhibitory effect on KCa3.1 are likely to act through the plasmic membrane, the CaM/KCa3.1 interaction or an accessory protein of the channel. In a perspective of future treatments for CF, our results indicate that CBIQ could be an efficient potentiator since this product stimulates KCa3.1 as well as CFTR. Conversly, the VRT-532 and SF-03 could be less efficient than on CFTR alone, due to their inhibition of KCa3.1.

Le système rénine-angiotensine est impliqué dans le remodelage structurel et électrique caractérisant la fibrillation auriculaire (FA). L’angiotensine II (ANG II) induit le développement de fibrose et d’hypertrophie au niveau des oreillettes, prédisposant à la FA. Or, les mécanismes électrophysiologiques par lesquels l’ANG II pourrait promouvoir la FA sont peu connus. L’objectif de ce projet de recherche est d’évaluer l’effet de l’ANG II sur les courants potassiques et calciques au niveau auriculaire indépendamment du remodelage structurel. Pour ce faire, nous avons utilisé la technique de patch-clamp avec un modèle de souris surexprimant le récepteur de type 1 à l’angiotensine II (AT1R) spécifiquement au niveau cardiaque. Pour distinguer les effets directs de la surexpression d’AT1R des effets induits par le remodelage cardiaque, nous avons étudié des souris âgées de 180 jours, qui présentent du remodelage structurel, et des souris âgées de 50 jours, qui n’en présentent pas. Des études précédentes sur ce modèle ont montré qu’au niveau des myocytes ventriculaires, l’ANG II réduit le courant potassique global (Ipeak) et rectifiant entrant (IK1) ainsi que le courant calcique de type L (ICaL). Ainsi, notre hypothèse est que l’ANG II modulera aussi ces courants au niveau auriculaire, pouvant ainsi augmenter l’hétérogénéité de repolarisation auriculaire et de ce fait le risque de développer et maintenir la FA. Nous avons observé une diminution significative de la densité d’IK1 dans l’oreillette gauche des souris transgéniques sans changement d’Ipeak. De plus, la densité d’ ICaL n’est pas réduite chez les souris transgéniques âgées de 50 jours. En conclusion, l’effet de l’ANG II sur les courants potassiques et calciques semble dépendre de la chambre cardiaque. En effet, nous savions que l’ANGII réduisait Ipeak, IK1 et ICaL au niveau ventriculaire, mais nos résultats ont montré qu’il ne les affectait pas directement au niveau des oreillettes. Ceci suggère des mécanismes de régulation impliquant des voies de signalisation distinctes selon les chambres cardiaques. Enfin, nos résultats montrant l’absence de l’influence directe de la surexpression d’AT1R sur les canaux K+ et Ca2+ au niveau des myocytes auriculaires renforcent l’importance d’approfondir nos connaissances sur les effets de l’angiotensine II sur le développement de la fibrose, sur le remodelage structurel et sur la conduction électrique cardiaque. / The renin-angiotensin-aldosterone system contributes to the structural and electrical remodelling that characterise atrial fibrillation (AF). Angiotensin II (ANG II) induces fibrosis and hypertrophy in the atrium, creating a substrate for AF development. Whether or not ANG II promotes electrophysiological remodelling in the atrium and by which mechanisms is not known. The objective of this research project is to evaluate the effect of ANG II on potassium and calcium currents in atrial myocytes independently of structural remodelling. We used the patch-clamp technique to measure ionic currents in a mouse model overexpressing the angiotensin II type 1 receptor (AT1R) locally in the heart. To differentiate the direct effects of AT1R overexpression with those related to structural remodelling, we studied mice aged of 180 days that are characterised by structural remodelling and mice aged of 50 days that aren’t. Previous studies have shown that this mouse presented with reduced total potassium current (Ipeak) and inward rectifier potassium current (IK1) as well as with a decrease in L-type calcium currents (ICaL) in ventricular myocytes. Therefore, our hypothesis was that ANG II would also regulate those currents at the atrial level, possibly leading to an increase in heterogeneity in atrial repolarisation and to an increase in AF initiation and maintenance. We show in this project a significant reduction of the IK1 in the left atrium of transgenic mice without any changes of the Ipeak. Furthermore, we show no modulation of ICaL density in 50 days old transgenic mice. We conclude that ANG II effect on potassium and calcium currents depends on the cardiac chamber. Indeed, although we already knew ANG II reduced Ipeak, IK1 and ICaL in ventricular myocytes of transgenic mice, in this project we found ANG II did not affect Ipeak and ICaL at the atrial level. These findings suggest distinctive regulation pathways by which ANG II affects the different cardiac chambers. Furthermore, the absence of direct influence of ANG II on potassium and calcium currents in atrial myocytes reinforces the importance to better understand ANG II’s effect on cardiac fibrosis development, structural remodelling and electric conduction.

Les cellules épithéliales des voies aériennes respiratoires sécrètent du Cl- via le canal CFTR. La fibrose kystique est une maladie génétique fatale causée par des mutations de ce canal. La mutation la plus fréquente en Amérique du Nord, ∆F508, met en péril la maturation de la protéine et affecte les mécanismes d’activation du canal. Au cours des dernières années, plusieurs molécules ont été identifiées par criblage à haut débit qui peuvent rétablir l’activation de protéines CFTR mutées. Ces molécules sont nommées potentiateurs. Les canaux K+ basolatéraux, dont KCa3.1, jouent un rôle bien documenté dans l’établissement d’une force électromotrice favorable à la sécrétion de Cl- par CFTR dans les cellules épithéliales des voies aériennes respiratoires. Il a par exemple été démontré que l’application de 1-EBIO, un activateur de KCa3.1, sur des monocouches T84 résulte en une augmentation soutenue de la sécrétion de Cl- et que cette augmentation était réversible suite à l’application de CTX, un inhibiteur de KCa3.1(Devor et al., 1996). Dans le cadre d’une recherche de potentiateurs efficaces en conditions physiologiques et dans un contexte global de transport trans-cellulaire, il devient essentiel de considérer les effets des potentiateurs de CFTR sur KCa3.1. Une caractérisation électrophysiologique par la méthode du patch clamp et structurelle via l’utilisation de canaux modifiés par mutagenèse dirigée de différents potentiateurs de CFTR sur KCa3.1 fut donc entreprise afin de déterminer l’action de ces molécules sur l’activité de KCa3.1 et d’en établir les mécanismes. Nous présentons ici des résultats portant sur les effets sur KCa3.1 de quelques potentiateurs de CFTR possédant différentes structures. Un criblage des effets de ces molécules sur KCa3.1 a révélé que la genisteine, le SF-03, la curcumine et le VRT-532 ont des effets inhibiteurs sur KCa3.1. Nos résultats suggèrent que le SF-03 pourrait agir sur une protéine accessoire et avoir un effet indirect sur KCa3.1. La curcumine aurait aussi une action inhibitrice indirecte, probablement via la membrane cellulaire. Nos recherches sur les effets du VRT-532 ont montré que l’accessibilité au site d’action de cette v molécule est indépendante de l’état d’ouverture de KCa3.1. L’absence d’effets inhibiteurs de VRT-532 sur le mutant constitutivement actif V282G indique que cette molécule pourrait agir via l’interaction CaM-KCa3.1 et nécessiter la présence de Ca2+ pour agir. Par ailleurs, un autre potentiateur de CFTR, le CBIQ, a des effets potentiateurs sur KCa3.1. Nos résultats en canal unitaire indiquent qu’il déstabilise un état fermé du canal. Nos travaux montrent aussi que CBIQ augmente la probabilité d’ouverture de KCa3.1 en conditions sursaturantes de Ca2+, ainsi que son affinité apparente pour le Ca2+. Des expériences où CBIQ est appliqué en présence ou en absence de Ca2+ ont indiqué que l’accessibilité à son site d’action est indépendante de l’état d’ouverture de KCa3.1, mais que la présence de Ca2+ est nécessaire à son action. Ces résultats sont compatibles avec une action de CBIQ déstabilisant un état fermé du canal. Finalement, des expériences en Ba2+ nous ont permis d’investiguer la région du filtre de sélectivité de KCa3.1 lors de l’action de CBIQ et nos résultats pointent vers une action de CBIQ dans cette région. Sur la base de nos résultats nous concluons que CBIQ, un potentiateur de CFTR, aurait un effet activateur sur KCa3.1 via la déstabilisation d’un état fermé du canal à travers une action sur sa ‘gate’ au niveau du filtre de sélectivité. De plus, les potentiateurs de CFTR ayant montré des effets inhibiteurs sur KCa3.1 pourraient agir via la membrane ou via une protéine accessoire du canal ou sur l’interaction CaM-KCa3.1. Dans l’optique de traitements potentiels de la fibrose kystique, nos résultats indiquent que le CBIQ pourrait être un potentiateur efficace pusiqu’il est capable de trimuler à la fois KCa3.1 et CFTR. Par contre, dans les cas du VRT-532 et du SF-03, une inhibition de KCa3.1 pourraient en faire des potentiateurs moins efficaces. / Airway epithelial cells are the site of Cl- secretion through CFTR. Cystic fibrosis is a fatal genetic disease caused by mutations in CFTR. The most frequent mutation in North America (∆F508) results in impaired maturation and altered channel gating of the protein. In the last years, several small molecules were identified by high throughput screening that could restore mutated CFTR function. Compounds addressing CFTR gating defects are referred to as potentiators. The basolateral K+ channel KCa3.1 has been documented to play a prominent role in establishing a suitable driving force for CFTR-mediated Clsecretion in airway epithelial cells. It has been shown, for example, that the application of 1-EBIO on T84 monolayers results in a sustained increase of Clsecretion and that this current can be reversed by application of CTX, a KCa3.1 inhibitor (Devor et al., 1996). Thus, in a global approach of transepithelial transport, the research for physiologically relevant CFTR potentiators should also consider their effects on the KCa3.1 channel. Electrophysiological patch clamp measurements and channel structural modification by site directed mutagenesis were used to characterize the action of CFTR potentiators on KCa3.1 and study their molecular mode of action. In this work we present results on the effects on KCa3.1 of several CFTR potentiators of different structures. We observed that the CFTR potentiators genistein, curcumin, SF-03 and VRT-532 could inhibit KCa3.1 activity at concentrations known to activate CFTR. Our results suggest that SF- 03 could act indirectly on KCa3.1 through a mechanism involving an accessory protein. Curcumin would also have an indirect inhibitory effect, probably mediated by the plasma membrane, as documented for other ion channels. A detailed study of VRT-532 revealed that this molecule has access to its binding site in a state independent manner, and is poorly effective on the V282G mutant of KCa3.1, which is constitutively active. These results suggest that VRT-532 could act through the CaM/KCa3.1 complex and require the presence of Ca2+ to inhibit channel activity. In contrast, CBIQ, another CFTR potentiator, succeeded to activate KCa3.1. Our results in single channel show that CBIQ vii destabilizes a non conducting state of the channel. We also showed that this molecule increases the apparent Ca2+ affinity as well as the channel open probability, even in saturating Ca2+ conditions. Experiences in which Ba2+ was used as a probe were also performed to determine if the action mechanism of CBIQ involves an effect on the selectivity filter. Our results showed that Ba2+ could displace CBIQ from its interacting site, suggesting that the increases in channel activity induced by CBIQ could result from a change in the energetics of the channel at the level of the selectivity filter. On the basis of our results, we conclude that CBIQ, a CFTR potentiator, could activate KCa3.1 by destabilizing a non conducting state of the channel, probably through an action near the selectivity filter region. Also, CFTR potentiators having an inhibitory effect on KCa3.1 are likely to act through the plasmic membrane, the CaM/KCa3.1 interaction or an accessory protein of the channel. In a perspective of future treatments for CF, our results indicate that CBIQ could be an efficient potentiator since this product stimulates KCa3.1 as well as CFTR. Conversly, the VRT-532 and SF-03 could be less efficient than on CFTR alone, due to their inhibition of KCa3.1.