Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Agronomia, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-05-30T13:08:34Z No. of bitstreams: 1 2012_JuanBenjaminSugasticompleto.pdf: 3717867 bytes, checksum: 50800cad0db0a894d05b442292d9d7f8 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-09-21T11:54:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_JuanBenjaminSugasticompleto.pdf: 3717867 bytes, checksum: 50800cad0db0a894d05b442292d9d7f8 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-21T11:54:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_JuanBenjaminSugasticompleto.pdf: 3717867 bytes, checksum: 50800cad0db0a894d05b442292d9d7f8 (MD5) / O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do consórcio das culturas de alface, quiabo e rabanete na produção. índices econômicos, infestação de plantas espontâneas e artrópodes de parte aérea e solo. O experimento foi realizado na Fazenda Água Limpa - UnB. de setembro de 2010 a Janeiro de 2011. O delineamento foi de blocos ao acaso, em três repetições, com os seguintes tratamentos: monoculturas: alface (Al), rabanete (Rb). quiabo aberto (Ql) e quiabo tradicional (Q2). consórcios duplos: alface e rabanete (Al/Rb). alface e quiabo aberto (Al/Ql). alface e quiabo tradicional (A1/Q2), rabanete e quiabo aberto (Rb/Ql). rabanete a quiabo tradicional (Rb/Q2). e os consórcios triplos: alface, rabanete e quiabo aberto (AL/Ql/Rb) e alface, rabanete e quiabo tradicional (Al/Q2/Rb). A cultura de rabanete em monocultura apresentou maior número de maços (7.8 maços m-2) e maior perda de raiz (21.1%), enquanto em consórcio triplo foram observadas as menores perdas. A maior produtividade da alface foi alcançada em monocultura, seguida dos consórcios triplos. No entanto, a monocultura apresentou plantas com menor massa fresca (0.33 kg), comparada aos consórcios triplos (0.43kg em A1/Q2/RB e 0.45kg Al/Ql/Rb). A maior produtividade de quiabo foi observada em Q2 (1,3 kg.m-2) e o tratamento que proporcionou maior produção por planta foi o consórcio triplo Al/Ql/Rb (0.51 kg.m" ). Os tratamentos que apresentaram maior índice de equivalência de área foram Al/Rb/Q2 (2,71), seguido de Al/Ql/Rb (2.61). Os consórcios triplos apresentaram os maiores custos operacionais totais e as maiores receitas líquidas. Os melhores índices de lucratividade também foram observados nos consórcios triplos (57.%). As menores densidades e massa fresca de plantas espontâneas foram observadas nos consórcios triplos. Alface em consórcio com quiabo reduziu a necessidade de capina comparada às monoculturas de quiabo, nos consórcios duplos e triplos. Houve efeito dos tratamentos na comunidade de artrópodes de solo. A menor incidência de pulgões em plantas de quiabo foi observada no consórcio triplo e também foi observada maior incidência de predadores e menor incidência de sugadores nos consórcios triplos e duplos. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / This research aimed to evaluate intercropping of lettuce, radish and okra and its effect on yield, economical index, weeds infestation, soil and plants arthropods' incidence. The experiment was carried out at Fazenda Água Limpa - UnB. from September 2010 to January 2011. The experimental design was randomized blocks, in three replicates, with the following treatments: single crops: lettuce (Al). radish (Rb). open space okra (Ql) and traditional space okra (Q2): double intercropping: lettuce and radish (Al/Rb). lettuce and open okra (Al/Ql). lettuce and traditional space okra (A1/Q2). radish and open space okra (Ql/Rb). radish and traditional space okra (Rb/Q2). and triple intercropping: lettuce. radish and open space okra (Al/Ql/Rb) and lettuce, radish, and traditional space okra (Al/Q2/Rb). Single radish yielded the highest number of packets per square meter (7.8) and showed the highest root loss (21.1%) when compared to triple intercropping radish- The highest lettuce yield was observed in single cropping followed by that observed in triple intercropping. However, plants of lettuce from single cropping system presented a lower fresh matter (0.33 kg) than those from triple intercropping (0.43kg in A1/Q2/RB and 0,45kg in Al/Ql/Rb). Okra highest yield was observed in Q2 (1.3 kg.m-2), but the treatment that showed the highest production per plant was the triple intercropping Al/Ql/Rb (0.51 kg.m-2 ). The treatments that showed the highest equivalent area index were Al/Rb/Q2 (2.71), followed by Al/Ql/Rb (2.61). Triple intercropping showed the highest total operational costs and the highest net revenues. The highest economic index was observed in both triple intercropping treatments (57%). The lowest weeds' density and fresh matter were observed on triple intercropping treatments. Triple and double intercropping of lettuce and okra reduced the need of cleaning weeds compared to single okra. There was effect of treatments on soil arthropods' community. The lowest aphids' incidence was observed on okra plants of the triple intercropping. More predators and less sucking insects were observed in the triple and double intercropping treatments.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Agronomia, 2013. / Submitted by Luiza Silva Almeida (luizaalmeida@bce.unb.br) on 2013-07-24T18:03:11Z No. of bitstreams: 1 2013_RogerlânidosReisFilha.pdf: 2342802 bytes, checksum: c91109b0b470b2ce3c8367b201988adf (MD5) / Approved for entry into archive by Leandro Silva Borges(leandroborges@bce.unb.br) on 2013-07-25T18:29:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_RogerlânidosReisFilha.pdf: 2342802 bytes, checksum: c91109b0b470b2ce3c8367b201988adf (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-25T18:29:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_RogerlânidosReisFilha.pdf: 2342802 bytes, checksum: c91109b0b470b2ce3c8367b201988adf (MD5) / O presente trabalho teve como objetivo avaliar o impacto da consorciação e aplicação de silício em repolho, milho-doce e feijão-vagem nos seguintes parâmetros: produção, índice de equivalência de área, manejo de artrópodes-praga e plantas espontâneas. O experimento foi realizado na Fazenda Água Limpa – FAL, da Universidade de Brasília – UnB, no período de junho a novembro de 2011. O delineamento foi de blocos ao acaso com 14 tratamentos e 04 repetições, sendo os tratamentos: monoculturas - repolho (RE), repolho/silício (RE/Si), milho-doce (MD), milho-doce/silício (MD/Si), feijão- vagem (FV), feijão-vagem/silício (FV/Si); consórcio duplo: repolho e milho-doce (RE/MD), repolho e milho-doce/silício (RE/MD/Si), repolho e feijão-vagem (RE/FV), repolho e feijão-vagem/silício (RE/FV/Si) e milho-doce e feijão-vagem (MD/FV), milho-doce e feijão-vagem/silício (MD/FV/Si); consórcios triplos: repolho, milho-doce e feijão-vagem (RE/MD/FV) e repolho, milho-doce e feijão-vagem/silício (RE/MD/FV/Si). Na produção do repolho, foram avaliadas a massa fresca da cabeça e circunferência. No milho-doce, foram avaliados a altura da planta, diâmetro do colmo, massa fresca, altura e circunferência das espigas. No feijão-vagem, foram avaliados a massa fresca, comprimento e número de vagens. Os artrópodes-pragas foram avaliados desde o início do ciclo até o momento da colheita. Placas amarelas adesivas foram instaladas a cada quinze dias até o momento da colheita para quantificação e identificação dos insetos. A avaliação das plantas espontâneas foi realizada em duas ocasiões com o quadro de madeira de 25x25 cm em cada parcela. Não foi observado efeito significativo da interação silício e consórcio nos parâmetros avaliados, com exceção do número de vagens no feijão-vagem. A maior massa fresca do repolho foi observada nas parcelas de consórcio RE/FV e RE/FV/MD, enquanto a menor circunferência foi observada na monocultura, diferindo estatisticamente dos demais arranjos de consórcio. Para altura e diâmetro de colmo de milho-doce, os valores mais altos foram observados nas parcelas consorciadas. Não foi observada diferença significativa para massa fresca da espiga entre os sistemas de consórcio. A maior massa fresca de vagens do feijão-vagem foi observada na monocultura, diferindo significativamente dos demais tratamentos. Não houve efeito significativo dos arranjos de consórcio no comprimento de vagens. Houve interação significativa entre silício e consórcio para o número de vagens por planta, apresentando valores superiores na monocultura de feijão-vagem com silício. O índice de equivalência de área indicou vantagem do consórcio, com os maiores valores no consórcio triplo RE/MD/FV. Na avaliação visual da Plutella xylostella foi observado na monocultura do repolho maior número de lagartas nos tratamentos de consórcios duplos e triplos. No milho-doce, as maiores médias de lagartas de Spodoptera frugiperda foram encontradas no consórcio duplo de MD/RE com e sem silício. As maiores médias de adultos de Bemisia tabaci em feijão-vagem foram observadas no consórcio duplo de FV/RE. Quanto à infestação de adultos de Diabrotica speciosa, não foi observada diferença significativa entre os consórcios. Na avaliação das placas amarelas, foi verificado menor número de mastigadores na monocultura do repolho. Quanto aos sugadores, o maior número foi encontrado na monocultura do feijão-vagem. Para parasitóides e predadores, na monocultura do repolho com silício e no consórcio duplo de FV/MD houve maior número de espécimes desses insetos. Para plantas espontâneas, a monocultura de repolho e os consórcios duplo de RE/FV e triplo RE/MD/FV apresentaram as menores médias de massa fresca. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / This study aimed to evaluate the impact of vegetables intercropping and application of silicon in cabbage, sweet corn and snap bean production, area equivalency index management of arthropod pests and weeds. The experiment was carried out Fazenda Água Limpa, University of Brasilia, from June to November 2011. The experiment was a randomized block design with 14 treatments and 04 replicates, with monocultures: cabbage (RE), cabbage and silicon (RE/Si), sweet corn (MD), sweet corn and silicon (MD/Si), snap beans (FV), snap beans and silicon (FV/Si) double: intercropping cabbage and sweet corn (RE/MD), cabbage and sweet corn and silicon (RE/MD/Si), cabbage and snap beans (RE/FV), cabbage and snap beans and silicon (RE/ FV/Si) and sweet corn and snap beans (MD/FV), sweet corn and snap beans and silicon (MD/FV/Si), triple intercropping: cabbage, sweet corn and snap beans (RE/MD/FV) and cabbage, sweet corn and snap beans and silicon (RE/MD/FV/Si). The variables recorded were cabbage fresh weight and circumference, sweet corn plant height and stem diameter, ear fresh weight, circumference and length; snap beans fresh weight, length and number of pods. For arthropod pests, evaluations were performed weekly on each parcel. Yellow sticky cards were placed in the parcels every fifteen days, until the final harvest when the number of arthropod were counted and identified. Weeds were recorded twice using a wooden frame of 25x25 cm in each parcel. There was no interaction of silicon and intercropping for variables, except for snap beans number. The highest cabbage fresh weights were observed at RE/FV and RE/FV/MD, while the lowest plant diameter were recorded at the single crop treatment, statistically different from all intercropping treatments. For sweet corn height and plant diameter, the highest values were observed at the intercropping parcels. There was no difference among intercropping treatments for ear fresh weight. The highest fresh weight for snap beans was observed at single crop cultivation, differing statistically from all treatments. No effect of intercropping was observed for snap beans length. A significant interaction between silicon and intercropping was observed for snap bean number, with the highest values in the single crop cultivation with silicon. The equivalency area index showed an advantage of the intercropping treatments with highest values observed at the triple intercropping RE/MD/FV. The highest number of individuals of Plutella xylostella was observed at the single crop cultivation compared to double and triple intercropping. For sweet corn, the highest number of Spodoptera frugiperda was observed at MD/RE with and without silicon. The highest number of Bemisia tabaci in snap beans was recorded at FV/RE. Concerning Diabrotica speciosa, no effect of intercropping was observed. Through yellow sticky cards, a smaller number of chewers arthropods were observed at cabbage single crop compared to other treatments. Snap beans single crop showed the highest number of suckers arthropods. For parasitoids and predators, the highest numbers of individuals were observed at cabbage single crop with silicon and at double intercropping of FV/MD. For weeds, cabbage single crop, double intercropping of RE/FV and triple intercropping of RE/MD/FV showed the smallest values for fresh weight.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ecologia, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-03-31T18:07:02Z No. of bitstreams: 1 2016_MichelyFerreiraSantosdeAquino.pdf: 3251444 bytes, checksum: 3d66478dbb9c0ac9088d011d4d883c31 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2017-04-03T14:56:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_MichelyFerreiraSantosdeAquino.pdf: 3251444 bytes, checksum: 3d66478dbb9c0ac9088d011d4d883c31 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-03T14:56:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_MichelyFerreiraSantosdeAquino.pdf: 3251444 bytes, checksum: 3d66478dbb9c0ac9088d011d4d883c31 (MD5) / O conhecimento da fauna de parasitoides associada aos percevejos adultos, bem como os mecanismos envolvidos na busca de hospedeiros e o impacto do parasitismo podem contribuir no desenvolvimento de ferramentas para o manejo de percevejos praga da soja. Os objetivos deste trabalho foram conhecer a fauna de parasitoides de percevejos adultos em áreas de produção de soja do Brasil; verificar a influência da composição da paisagem na abundância de percevejos e taxas de parasitismo; estudar o efeito de diferentes métodos de manejo agronômico da soja sobre o parasitismo de percevejos e estudar o impacto do parasitismo por Hexacladia smithii (Hymenoptera: Encyrtidae) na biologia de Euschistus heros (Hemiptera: Pentatomidae). Amostragens sistemáticas (com pano de batida) em áreas de soja revelaram que não houve variação da fauna de percevejos e parasitoides nas principais regiões produtoras do país. A espécie de percevejo dominante foi E. heros. Os índices de parasitismo variaram entre 0,77 a 6,05% por espécies da ordem Diptera e Hymenoptera. O uso de metodologias de sensoriamento remoto revelou que a composição da paisagem influenciou a abundância de percevejos na cultura da soja. Esta variável foi positivamente relacionada à percentagem de cobertura de vegetação nativa, de soja e a interação vegetação nativa x soja x monocultura. O parasitismo não foi influenciado pela composição da paisagem. A distância desde a vegetação nativa influenciou a abundância de percevejos com maiores valores na distância de 200m. Maiores índices de parasitismo (11,2%) foram observados em áreas de soja com aplicação reduzida de inseticida (AI–) que em áreas de soja com frequente aplicação de inseticida [AI+ (4,11%)]. Bioensaios comportamentais em olfatômetro mostraram que fêmeas de H. smithii responderam ao feromônio sexual de E. heros. No estudo de biologia, o parasitismo de H. smithii reduziu a fecundidade de E. heros com consequente redução da taxa de crescimento populacional em 62,22% e 20,27% para Ro e rm, respectivamente, em comparação a fêmeas de E. heros não parasitadas. O efeito negativo do parasitismo também foi observado em simulações da dinâmica populacional de E. heros considerando diferentes condições de parasitismo, migração de percevejos e duração de ciclo da soja. Nessas simulações as populações de E. heros parasitadas tendem a crescer de forma mais lenta quando comparadas a populações não parasitadas. Os resultados obtidos contribuem com novas informações científicas da interação hospedeiro-parasitoide a escalas regional e local e entre indivíduos, considerando os sistemas de cultivo atuais e suas consequências. Estas informações podem subsidiar no futuro o desenvolvimento de programas de manejo integrado que considerem o controle biológico como uma das técnicas principais de controle de percevejos. / Knowledge of parasitoids fauna associated with adult stink bugs as well as the mechanisms involved in the search for hosts and the impact of parasitism can assist in developing tools for stinkbugs pest management. The objectives of this study were to know the parasitoids fauna of adult stink bugs in soybean production areas of Brazil; to check the influence of landscape composition in abundance of stink bugs, and also in the biological control; to study the effect of different management methods on parasitism of stink bug; to study the effect of Hexacladia smithii (Hymenoptera: Encyrtidae) in Euschistus heros biology (Hemiptera: Pentatomidae). Systematic samplings (with beat cloth) in soybean production areas revealed that there was no faunal variation of stink bugs and parasitoids along the main production areas in the country. Euschistus heros was the dominant stink bug. The parasitism ranging from 0.77 to 6.05% for Diptera and Hymenoptera species.The use of remote sensing methods with the aid of ArcGis program revealed that landscape composition influenced the abundance of stink bugs in soybeans. This variable was positively related to percentage of cover of native vegetation, soybean and interaction native vegetation x soybean x monoculture. The parasitism was not influenced by the composition of the landscape. The abundance of stink bugs was influenced by the distance from the native vegetation with higher values at distances of 200m Higher rates of parasitism (11.2%) were observed in soybean areas with reduced application of insecticide (AI–) than in areas of soybean with frequent application of insecticide [AI+ (4,11%)]. Behavioral olfactometer bioassays showed that H. smithii females were attracted to sexual pheromone of E. heros. In biology study, the parasitism of H. smithii reduced the fecundity of E. heros with consequent reduction in population growth rate in 62,22% e 20,27% for Ro e rm, respectively compared to E. heros females not parasitized. The negative effect of parasitism was also observed in simulations of population dynamics of E. heros considering different conditions of parasitism, migration of stink bugs and soybean cycle duration. In these simulations the populations of E. heros parasitized tend to grow more slowly compared with non-parasitized populations. The results contribute to new scientific information from the hostparasitoid interaction at regional and local scales and individual interactions, considering the current cropping systems and their consequences. This information may be important, in the future, for the development of integrated pest management programs that consider the biological control as one of the main technicals control of stink bugs.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2015. / Submitted by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-06-11T15:08:55Z No. of bitstreams: 1 2015_JoaoGilbertoAlvesVillela.pdf: 1346201 bytes, checksum: 67224c4a62d1c57b75781b5b2d771431 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-06-11T15:11:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_JoaoGilbertoAlvesVillela.pdf: 1346201 bytes, checksum: 67224c4a62d1c57b75781b5b2d771431 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-11T15:11:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_JoaoGilbertoAlvesVillela.pdf: 1346201 bytes, checksum: 67224c4a62d1c57b75781b5b2d771431 (MD5) / A Murcha de Curtobacterium, causada pela bactéria Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff), é um importante problema para o cultivo do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) no Brasil. A principal forma de disseminação da bactéria é por sementes contaminadas. No presente trabalho avaliou-se a eficiência de diferentes tratamentos de sementes no controle da Murcha de Curtobacterium em feijoeiro. Inicialmente se avaliou “in vitro” a sensibilidade de Cff a fungicidas e bactericidas cúpricos, casugamicina, cloretos de benzalcônio e ácido peracético. Os tratamentos de sementes realizados foram: imersão em solução de cobre, casugamicina, cloretos de benzalcônio e ácido peracético, exposição a vapor de etanol e metanol, e ozonização. Na avaliação da eficiência dos tratamentos na erradicação de Cff, sementes inoculadas foram tratadas e submetidas ao processo de extração, verificando posteriormente a incidência de sementes contaminadas e número de células bacterianas. Foram realizados experimentos em condições de campo e casa de vegetação. No ensaio em campo foi avaliado o efeito dos tratamentos sobre a qualidade fisiológica das sementes, e em casa de vegetação avaliou-se o efeito dos tratamentos na qualidade fisiológica das sementes, no desenvolvimento vegetativo da planta, na incidência e severidade da Murcha de Curtobacterium, produção de grãos, além da transmissão de Cff via planta – semente. Hidróxido de cobre (30 µg/mL), oxicloreto de cobre (50 µg/mL), óxido cuproso (20 µg/mL), sulfato de cobre (20 µg/mL), casugamicina (100 µg/mL), cloretos de benzalcônio (20 µg/mL) e ácido paracético (200 µg/mL) inibiram o crescimento da Cff “in vitro”. Os tratamentos com cloretos de benzalcônio e vapor de metanol foram os mais eficientes na redução da incidência de sementes contaminadas e do número de células bacterianas em sementes de feijão. Em campo os tratamentos com ácido peracético e ozônio reduziram significativamente a emergência e velocidade de emergência das plântulas. Os resultados obtidos em casa de vegetação mostraram que os tratamentos não interfiram na qualidade fisiológica das sementes, e plantas oriundas de sementes inoculadas tratadas ou não, apresentaram menor desenvolvimento vegetativo e produção de grãos. Nenhum tratamento de sementes foi eficiente na redução da incidência e severidade da Murcha de Curtobacterium. A taxa de transmissão de Cff das plantas para as sementes foi de aproximadamente 24%. / Bacterial Wilt, caused by Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, is an important disease for bean (Phaseolus vulgaris L.) production in Brazil. Seeds are the major way of spread this bacterium. The objective of this study was to evaluate the efficiency of different seed treatments to control bacterial wilt in bean. First an “in vitro” test was conductive to evaluate the sensitivity of Cff to copper formulations, kasugamycin, benzalkonium chlorides and peracetic acid. The seed treatments performed were: immersion in solution of copper, kasugamycin, benzalkonium chlorides and peracetic acid, exposure to vapor ethanol and methanol, and ozonation. In the evaluation of treatments efficiency in eradicating of Cff, inoculated seeds were treated and subjected to extraction process, then checking the incidence of contaminated seeds and number of bacterial cells. Experiments were carried in field conditions and greenhouse conditions. In field experiment was evaluated the effects of treatments on seed physiological quality, and greenhouse was measured the effect of treatments on seed physiological quality, in vegetative plant development, in incidence and severity of bacterial wilt, in production, beyond the transmission of Cff via plant - seed. The products copper hydroxide (30 µg/mL), copper oxychloride (50 µg/mL), cuprous oxide (20 µg/mL), copper sulfate (20 µg/mL), kasugamycin (100 µg/mL), chlorides benzalkonium (20 µg/mL) and peracetic acid (200 µg/mL) inhibited the growth of Cff “in vitro”. Treatments with benzalkonium chloride and vapor methanol were the most effective in reducing the incidence of contaminated seeds and the number of bacterial cells in bean seeds. Under field conditions the treatments with peracetic acid and ozone significantly reduced emergence and seedling emergence speed. The results obtained in the greenhouse showed that the treatments do not interfere in seed physiological quality, and plants grown from seeds inoculated, treated or not, showed lower vegetation development and grain production. The Cff transmission rate of the plants for seeds was approximately 24%.

Toxinas Cry provenientes de Bacillus thuringiensis, também denominadas de δ- endotoxinas, possuem ampla atividade inseticida e são específicas para insetos de diferentes ordens, não sendo nocivas a mamíferos, aves, anfíbios ou répteis. Devido a esta característica, seus genes vêm sendo utilizados no desenvolvimento de plantas transgênicas, visando o controle de insetos-praga de culturas de importância econômica. Dentre estas, destaca-se o algodoeiro que tem como principais pragas o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) e a lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda), ambas causadoras de grandes prejuízos econômicos. Assim, este trabalho objetivou: caracterizar uma estirpe de Bt (S811) tóxica contra S. frugiperda e A. grandis, identificar e clonar os genes codificadores de toxinas Cry potenciais para o controle dessas pragas, expressar os genes em sistema heterólogo Escherichia coli e testar a toxicidade das toxinas contra as pragas em questão. Os resultados obtidos nas análises da estirpe por microscopia eletrônica revelaram a presença de cristais esféricos e bipiramidais, enquanto que a análise de SDS-PAGE detectou proteínas de massa molecular com cerca de 140 kDa e 80 kDa. Posteriormente, uma caracterização gênica, utilizando oligonucleotídeos específicos para genes cry, identificou três genes, cry1Ab, cry1Ia e cry8, sendo estes dois últimos de maior interesse. O gene cry8, que foi isolado pela técnica TAIL-PCR, codifica uma proteína com 58% de identidade de aminoácidos com outras toxinas Cry8, enquanto que o gene cry1Ia12 (isolado com oligonucleotídeos específicos) codifica uma proteína que possui 99% de identidade com as outras proteínas do tipo Cry1Ia descritas na literatura. As porções tóxicas dos genes foram clonadas e expressadas em E. coli produzindo as proteínas recombinantes Cry8 e Cry1Ia12 de aproximadamente 70 kDa (cada uma). As proteínas recombinantes causaram mortalidade de 50% para larvas de A. grandis com 230 μg/ml e 160 μg/ml de Cry1Ia12 e Cry8, respectivamente, enquanto que para larvas de S. frugiperda, apenas Cry1Ia12 foi tóxica causando mortalidade de 50% com 5 μg/ml. Todos estes estudos contribuirão para o desenvolvimento de plantas transgênicas de algodão, bem como para a geração de novas moléculas com maior toxicidade e especificidade utilizando a evolução molecular in vitro (DNA shuffling) destes genes. / Cry toxins or δ-endotoxins, produced by Bacillus thuringiensis, show broad activity against several orders of insects. In addition, they are harmless to mammals, birds, amphibian, and reptiles. Because of these characteristics, several genes have been used in the development of transgenic plants to control pests in important crops. Among them, the cotton crop is very important in Brazil and it has the cotton boll weevil, Anthonomus grandis, and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, as the major pests in this crop, which cause several economic damages. The objective of this work was: to characterize a Bt strain (S811), which is toxic towards S. frugiperda and A. grandis, to identify and clone the coding genes of the Cry toxins with potential to control these pests, to express the genes in Escherichia coli heterologous system, and to test the toxicity of the recombinant proteins towards the reported pests. Electronic microscopic analysis revealed the presence of bipyramidal and spherical crystals and SDS-PAGE analysis showed proteins with 140 kDa and 80 kDa of molecular weight mass. Further gene characterization, using specific primer sets to detect cry genes, identified three genes, cry1Ab, cry1Ia e cry8, although the cry1Ia e cry8 were the genes of major interest. The cry8 gene was isolated through TAIL-PCR techniques and encodes a protein 58% identical to other Cry8 toxins, while the protein deduced from cry1Ia12 gene showed 99% identity with other Cry1Ia toxins previously described. The cry1A12 and cry8 gene toxic fragments were cloned and expressed in E. coli, and the 70 kDa recombinant proteins of were tested against A. grandis and S. frugiperda. Cry1Ia12 toxin caused 50% mortality at 230 μg/ml and 5 μg/ml towards both A. grandis and S. frugiperda, respectively. Cry8 toxin caused 50% mortality only against A. grandis at 160 μg/ml. In addition to the transgenic cotton development program, these results will permit the generation of new molecules with higher toxicity and specificity for these pests through in vitro molecular evolution (DNA shuffling) of these genes.

Bacillus thuringiensis é uma bactéria gram-positiva que produz cristais protéicos durante a fase de esporulação. Os cristais, são formados por proteínas Cry e apresentam atividade tóxica específica a determinadas classes de insetospraga, sendo o seu uso bastante difundido na agricultura. O presente trabalho teve como objetivo gerar uma biblioteca de variantes, do gene cry8Ha1, isolado da estirpe S811 de B. thuringiensis e selecionar variantes com atividade melhorada para pragas do algodoeiro. A biblioteca foi construída por meio da técnica de DNA shuffling e selecionada contra os insetos-praga Anthonomus grandis e Spodoptera frugiperda pela técnica de Phage display. As variantes foram selecionadas pela afinidade aos receptores presentes nas membranas dos intestinos do bicudo-do-algodoeiro (A.grandis) e da lagarta-do-cartucho (S. frugiperda), principais pragas do algodoeiro. Após expressão em fago, proteínas variantes foram testadas em bioensaios contra larvas dos insetos-alvo (A. grandis e S. frugiperda) e seqüenciadas. Os resultados de atividade, mostraram variantes mais efetivas para as duas pragas-alvo, quando comparado com a proteína original Cry8Ha1. O mutante Cry/BI-25 (ativo contra A. grandis) foi selecionado, por diferir estatisticamente do controle, e subclonado no vetor de expressão em bactéria. A proteína foi purificada e utilizada em bioensaio contra larvas de A. grandis. Os resultados indicaram um aumento de atividade entomotóxica de 333% da proteína mutante (Cry/BI-25) quando comparada com a proteína original (Cry8Ha1). A nova molécula, Cry/BI-25, está sendo utilizada em programas de melhoramento de plantas de algodão visando a obtenção de plantas resistentes à praga-alvo. / Bacillus thuringiensis is a gram-positive bacterium that produces protein crystals during its sporulation phase. These crystals are formed by Cry proteins that show specific toxicity to some insect-pest classes, which makes their use very common in agriculture. This work aimed at obtaining a library of cry8Ha1 gene variants, isolated from B. thuringiensis S811 and the selection of gene variants, whose products would have an improved insecticidal activity against cotton insect-pests. The library was constructed using DNA shuffling and selected against the insectpests Anthonomus grandis and Spodoptera frugiperda using Phage display. The variants were selected by affinity to Brush Border Membrane Vesicles (BBMVs) of A. grandis and S. frugiperda midguts. After phage expression, variant proteins were tested in bioassays against the target insects and their genes sequenced. The mutant Cry/BI-25 showed higher insecticidal activity against A. grandis and was subcloned to a bacterium expression vector. The purified expressed protein Cry/BI-25 is 333% more active when compared with protein original (Cry8Ha1). Gene variants selected against S. frugiperda are still under analysis. The new improved protein Cry/BI-25 will be used in cotton plant transformation experiments, with the purpose of developing insect-pest resistant GM cotton plants.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2017. / Texto parcialmente liberado pelo autor. Conteúdo restrito: Capítulos 3. Material e Métodos, 4. Resultados, 5. Discussão e 6. Conclusão. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-12-08T16:29:19Z No. of bitstreams: 1 2017_WilliamRosadeOliveiraSoares -PARCIAL.pdf: 1538532 bytes, checksum: 354ee29a5621a5fd17f76e08f9d418a2 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-02-08T21:45:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_WilliamRosadeOliveiraSoares -PARCIAL.pdf: 1538532 bytes, checksum: 354ee29a5621a5fd17f76e08f9d418a2 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-08T21:45:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_WilliamRosadeOliveiraSoares -PARCIAL.pdf: 1538532 bytes, checksum: 354ee29a5621a5fd17f76e08f9d418a2 (MD5) Previous issue date: 2018-02-08 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF). / Este trabalho visou caracterizar a diversidade de táxons do gênero Colletotrichum que estão associados às plantas de goiaba no Brasil, por meio de estudos moleculares, morfológicos, culturais e de patogenicidade. São relatadas a prevalência de cada espécie de Colletotrichum e sua respectiva distribuição geográfica. Esses tópicos não se encontram suficientemente compreendidos, mas são de grande interesse para a indústria da goiaba, pois a antracnose é geralmente considerada um dos fatores limitantes da produção de frutos de goiaba, causando elevadas perdas de produção. Apesar dos elevados danos econômicos ligados ao patossistema goiaba-antracnose, a etiologia da doença não é bem conhecida, embora essa informação seja muito importante para a recomendação de medidas de manejo eficientes. Portanto, o objetivo final é esclarecer a posição taxonômica dos isolados de Colletotrichum associados à antracnose da goiaba no Brasil em todas as regiões geográficas. O trabalho reuniu amostras de frutos (principalmente), folhas e flores de goiaba, e algumas outras Myrtaceae, de 13 unidades federativas do Brasil, cobrindo a maior parte do território nacional. Cento e setenta e um isolados (161 de goiaba) foram avaliados para patogenicidade e agressividade a frutos de duas variedades de goiaba (Cortibel SLG e Cortibel RM). Os isolados foram também estudados in vitro para características culturais e morfológicas, em diferentes temperaturas. Principalmente, toda coleção foi submetida a um estudo molecular detalhado, usando sequências parciais das regiões genômicas do rDNA-ITS, TUB2 e GAPDH. Os principais resultados estão listados a seguir: (a) Os isolados brasileiros de Colletotrichum em goiaba foram encontrados em quatro complexos e uma espécie conhecida, a saber, complexo C. gloeosporioides, complexo C. acutatum, complexo C. boninense, complexo C. gigasporum e na espécie C. cliviae; (b) O viii complexo mais prevalente na amostragem foi C. gloeosporioides (85,4%), seguido pelo complexo C. acutatum (9,4%); (c) um total de 16 espécies de Colletotrichum foram encontradas naturalmente associadas à antracnose da goiaba, uma das quais (dentro do complexo C. acutatum), possivelmente nova para a ciência: C. nymphaeaeae, C. melonis, C. paranaense, Colletotrichum sp., C. siamense, C. gloeosporioides, C. syzygiicola, C. asianum, C. fructicola, C. tropicale, C. theobromicola, C. musae, C. aeschynomenes, C. cliviae, C. gigasporum e C. karstii. Dessas, 12 espécies são aqui registradas pela primeira vez em P. guajava; (d) as espécies do complexo C. gloeosporioides incluíram as espécies mais agressivas à frutos de goiaba; (e) C. siamense foi a espécie mais prevalente, em todas as regiões geográficas, seguida por C. fructicola; (f) dentre todas as espécies, C. siamense, C. fructicola, C. syzygiicola e C. tropicale se destacaram como as mais agressivas, em ambas as variedades de goiaba; (g) frutos da variedade Cortibel SLG foram consistentemente mais resistentes à antracnose que frutos da variedade Cortibel RM. Adicionalmente, C. pseudoacutatum foi encontrada pela primeira vez causando antracnose em jambo-amarelo, Syzygium jambos. / This work aims to characterize the diversity of taxa in the genus Colletotrichum that are associated to the guava plant in Brazil, by molecular, morphological, cultural, and pathogenicity studies. The prevalence of each Colletotrichum species and respective geographic distribution are also described. These topics are yet poorly understood, and are of great interest to the domestic guava production, since anthracnose is generally considered one of the main disease limiting factors for guava production, causing important yield losses. In spite of the large economic losses linked to the guava anthracnose pathosystem, disease aetiology is insufficiently understood and this information is key to the recommendation of efficient management practices. Thus, the fundamental aim is to clarify the taxonomic positioning of the Colletotrichum isolates associated to guava anthracnose from all the Brazilian geographic regions. The work assembled fruit (mainly), leaf, and flower samples of guava, and some other Myrtaceae, from 13 states, covering most of the Brazilian territory. One hundred, seventy-one isolates of such samples (161 from guava) were evaluated as to their pathogenicity and aggressiveness to fruits of two guava varieties (Cortibel SLG and Cortibel RM). Isolates were also characterized in vitro as for cultural and morphological traits and growth in different temperatures. Especially, the collection was submitted to a detailed molecular study using partial sequences of the rDNA-ITS, TUB2 and GAPDH genomic regions. The main results are as follows: (a) Brazilian isolates of Colletotrichum were found to belong to four complexes and one known species, complex C. gloeosporioides, complex C. acutatum, complex C. boninense, complex C. gigasporum and the species C. cliviae; (b) Complex C. gloeosporioides was the most prevalent (85.4%), followed by the C. acutatum complex (9.4%); (c) a total of sixteen Colletotrichum species were found naturally associated to guava anthracnose, one of them x possibly a new species in the complex C. acutatum: C. nymphaeaeae, C. melonis, C. paranaense, Colletotrichum sp., C. siamense, C. gloeosporioides, C. syzygiicola, C. asianum, C. fructicola, C. tropicale, C. theobromicola, C. musae, C. aeschynomenes, C. cliviae, C. gigasporum, and C. karstii. Of these, 12 species are here reported to the first time in P. guajava; (d) species of the complex C. gloeosporioides included the most aggressive species; (e) C. siamense was found to be the most prevalent species in all Brazilian regions, followed by C. fructicola; (f) among all species, C. siamense, C. fructicola, C. syzygiicola and C. tropicale were the most aggressive to fruits of both guava varieties; (g) fruits of variety Cortibel SLG were found to be more consistently more resistant to anthracnose than fruits of variety Cortibel RM. Additionally, C. pseudoacutatum was found for the first time, causing anthracnose in Syzygium jambos.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-09-16T15:51:30Z No. of bitstreams: 1 2015_AthosSilvadeOliveira.pdf: 12748933 bytes, checksum: 9219eb4b52c4419292e5b3c66c671f0e (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-11-24T15:34:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_AthosSilvadeOliveira.pdf: 12748933 bytes, checksum: 9219eb4b52c4419292e5b3c66c671f0e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-24T15:34:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_AthosSilvadeOliveira.pdf: 12748933 bytes, checksum: 9219eb4b52c4419292e5b3c66c671f0e (MD5) / Tomato spotted wilt virus (TSWV) bem como outras espécies de tospovírus (Família Bunyaviridae) é responsável por perdas substanciais na produção de vegetais ao redor do mundo. Tospovírus são transmitidos de maneira circulativa e propagativa por tripes (Ordem Thysanoptera). Como para outros patógenos, ações contra tospovírus exigem um olhar holístico, envolvendo uma combinação de táticas culturais, fitosanitárias, químicas e biológicas, quando apropriadas, além do uso de cultivares resistentes. Entretanto, o controle de doenças causadas por tospovírus tem se mostrado difícil, dado o grande espectro de hospedeiros desses vírus e a grande eficiência dos tripes vetores em transmiti-los. Além disso, a dependência e o aumento no uso de inseticidas de baixo custo tem exacerbado a presença de tospovírus pela forte pressão de seleção sobre os tripes vetores que se tornam resistentes a diferentes inseticidas. Para solucionar de forma simples todas as questões financeiras e ambientais associadas ao uso abusivo de inseticidas para o controle de tripes, esforços têm aumentado para a obtenção de cultivares geneticamente resistentes como um componente integral das estratégias de controle de doenças. Até o momento existem duas fontes de resistência disponíveis para o melhoramento genético de hortaliças à TSWV. Uma dessas fontes é o cluster genético Sw-5, o qual foi encontrado em Solanum peruvianum L., uma espécie de tomate selvagem do Peru, e tem sido introduzido em cultivares de S. lycopersicum L. (tomate comercial). Após mapeamento gênico, pelo menos cinco parálogos compõem o cluster genético Sw-5 em S. peruvianum, os quais foram nomeados de Sw-5a a Sw-5e. Esses parálogos codificam receptores do tipo NB-LRR, uma classe de proteínas citoplasmática que ativam resistência após reconhecimento direto ou indireto de patógenos que tenham ultrapassado as primeiras barreiras de defesa do sistema imune vegetal. Transformação de plantas de tabaco com os parálogos Sw-a e Sw-5b revelou que somente o último ativa resistência contra isolados de TSWV. Com a disponibilidade do genoma do tomate, genes ortólogos também foram mapeados em S. lycopersicum. Esta tese inicia-se com uma descrição detalhada do sistema imune vegetal e descobertas anteriores sobre o cluster genético Sw-5 (Capítulo 1). Como parte da introdução, os problemas causados por tospovírus e suas características são descritas. Tendo essas informações como ponto de partida, esta tese focou no entendimento de pontos-chaves da resistência mediada pela proteína Sw-5b contra tospovírus com uma atenção especial nos eventos moleculares e celulares envolvidos atrás desse mecanismo de resistência. Análises funcionais foram realizadas para esclarecer as delimitações genéticas entre os ortólogos funcionais e não funcionais do cluster Sw-5 no reconhecimento de tospovírus e ativação de resistência. Já que transformantes de N. tabacum com o gene Sw-5b feitos anteriormente não apresentaram resposta hipersensitiva (HR) após inoculação com TSWV, plantas de N. benthamiana foram transformadas com o gene Sw-5b buscando linhas transgênicas que poderiam responder com HR e assim facilitar a identificação do determinante de avirulência (Avr) de TSWV (Capítulo 2). Enquanto N. tabacum foi transformada com o gene Sw-5b sob controle de seus próprios elementos regulatórios, N. benthamiana foi transformada com o gene Sw-5b sob controle do promotor 35S do Cauliflower mosaic virus (CaMV). De forma interessante, as plantas transformadas de N. benthamiana apresentaram forte HR após inoculação de suas folhas com TSWV e outras quatro espécies de tospovírus: Alstroemeria necrotic streak virus (ANSV), Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Groundnut ringspot virus (GRSV) and Impatiens necrotic spot virus (INSV) (Capítulos 2 e 7). Para identificação do Avr, os genes de TSWV foram clonados e expressos individualmente em folhas de N. benthamiana expressando Sw-5b e em isolinhas de tomate resistentes (contendo Sw-5) para monitoramento de HR. Como resultado, HR foi induzida após expressão da proteína não-estrutural NSM do isolado BR-01 de TSWV que induz resistência, mas não do isolado GRAU de TSWV que quebra resistência (Capítulo 2). Foco sobre a proteína NSM seguiu no capítulo 3. Versões truncadas dessa proteína foram transientemente co-expressas com Sw-5b em folhas de N. benthamiana (wild type). Tais versões truncadas excluíam domínios anteriormente associados com formação de túbulos, movimento viral célula-célula e sistêmico. Proteínas NSM truncadas faltando até 50 aminoácidos (aa) de ambos N e C terminais (NSM inteira contém 301 aa) ainda induziram HR, sugerindo que funções associadas ao movimento viral e comportamento como Avr são características independentes para NSM. No capítulo 4 experimentos foram realizados para caracterizar uma nova espécie de tospovírus observado em plantas de feijão que apresentavam sintomas de mosaico necrótico em São Paulo, Brasil (2006). Microscopia eletrônica de folhas sintomáticas revelou partículas pleiomórficas agrupadas em vesículas. Devido ao fato de feijão ser um hospedeiro não usual e pelo resultado negativo em testes de ELISA para outras espécies já conhecidas por circular no Brasil, testes biológicos, sorológicos e moleculares foram realizados para caracterização de uma provável nova espécie de tospovírus. Este vírus apresentou um estreito espectro de hospedeiros, infectando sistemicamente três de vintes espécies de plantas indicadoras e apresentou propriedades sorológicas únicas quando comparado com outras espécies de tospovírus encontradas no Brasil. O sequenciamento do genoma deste tospovírus revelou uma nova espécie que, junto com Soybean vein necrosis-associated virus (SVNaV), representa uma nova linhagem evolutiva de tospovírus circulando no continente americano. Este tospovírus foi tentativamente chamado Bean necrotic mosaic virus (BeNMV). Já que a proteína Sw-5b reconhece pelo menos cinco espécies de tospovírus de origem “americana”, a proteína NSM do BeNMV também foi testada para monitoramento de HR através de sua co-expressão com Sw- 5b em folhas de N. benthamiana. O resultado, entretanto, mostrou que a proteína NSM do BeNMV não é um Avr cognato da proteína Sw-5b. No capítulo 5 é mostrado que a proteína Sw-5b induz HR dependentemente e independentemente da presença de NSM. A forma independente foi observada através da coexpressão da proteína Sw-5b com supressores de silenciamento gênico (p19 e NSS), os quais aumentaram a acumulação celular da proteína Sw-5b, induzindo auto-HR. Esta observação permitiu o screening de indução de HR e reconhecimento de NSM como eventos independentes para as outras proteínas Sw-5. Enquanto Sw-5a induziu auto-HR, ela não foi capaz de reconhecer NSM como Avr. De forma diferente, o ortólogo mais conservado das proteínas Sw- 5a e Sw-5b de S. lycopersicum susceptível a TSWV, nomeado Sw-5aS, não induziu qualquer tipo de HR. Através da co-expressão dos domínios individuais de Sw-5b, CC, NB-ARC, LRR ou de versões combinadas (CC-NB-ARC e NB-ARC-LRR) com NSM e com o supressor de silenciamento gênico p19, o papel desses domínios na indução de HR e no reconhecimento de NSM foram determinados. Enquanto NB-ARC foi suficiente para induzir auto-HR, NB-ARC-LRR induziu tanto auto quanto HR dependente de NSM, indicando que o domínio LRR especifica o reconhecimento do Avr. Já o domínio CC suprimiu HR induzida por NB-ARC em cis e trans, apontando para uma função regulatória de CC. A superexpressão do domínio NB-ARC de Sw- 5aS não resultou em HR, similar ao resultado da proteína Sw-5aS completa. Após alinhamento dos domínios NB-ARC, três variações de aminoácidos (aa) foram encontradas entre as proteínas Sw-5a, Sw-5b e Sw-5aS, os quais foram revertidos no último. Quando a glutamina da posição 599 foi convertida em uma arginina (Q599R), igual a proteína Sw-5b nesta posição, o domínio NB-ARC da proteína Sw-5aS tornou-se funcional para indução de HR. Modelagem deste domínio revelou que esta mutação encontra-se fora do domínio de ligação de ADP/ATP, o qual é importante para o switching entre os estados on e off dos domínios NB-ARC. Finalmente, a fusão do domínio LRR da proteína Sw-5b na variante Q599R do domínio NBARC de Sw-5aS resultou em auto-HR e HR dependente de NSM. Os construtos codificando os domínios da proteína Sw-5b também foram usados para estudos subcelulares no capítulo 6. Para este propósito, todas as proteínas estavam fusionadas a Green Fluorescence Protein (GFP) na porção N-terminal para tornar possível a visualização por microscopia confocal em tecido folhear. Enquanto a proteína Sw-5b inteira, os domínios CC, NB-ARC e LRR e o combinado CC-NB-ARC apresentaram distribuição nucleocitoplasmática, NB-ARC-LRR localizou-se somente no citoplasma, sugerindo que CC sinaliza o importe nuclear. Os domínios NB-ARC e LRR também foram investigados para uma possível interação direta com NSM através da técnica Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC). Enquanto interação direta não foi observada entre LRR e NSM, o domínio NB-ARC aparentou interagir com NSM. As especificidades para o reconhecimento de NSM como Avr são discutidas no capítulo 7, levando em consideração aspectos evolutivos de tomates e tospovírus. Um modelo da ativação da proteína Sw-5b é postulado no texto tendo como base a dissecção desta proteína e os ensaios de localização subcelular, além de sua putativa interação direta com NSM. / Tomato spotted wilt virus (TSWV) along with other tospovirus species (family Bunyaviridae) is responsible for substantial losses in crop production around the world. Tospoviruses are transmitted in a propagative and circulative manner by thrips vectors (Order Thysanoptera). As for other pathogens, disease management against tospoviruses pursues a holistic approach involving a combination of cultural, phytosanitary, chemical, and biological tactics, when suitable in addition to the use of resistant crops. Nevertheless, successful control has proven difficult given the broad host range of these viruses and their effective spread by thrips vectors. More importantly, increased reliance on the use of low-cost insecticides has exacerbated tospovirus spread by causing thrips resistance. To ease the financial and environmental constraints associated with insecticide abuse to control thrips, efforts have been increased to obtain genetically resistant cultivars as an integral component of disease management strategies. So far there are two resistance sources available for commercial breeding of vegetables against TSWV. One of these sources is the Sw-5 gene cluster, which has been found in Solanum peruvianum L., a wild species of tomato from Peru, and has been introgressed in S. lycopersicum L. cultivars (commercial tomatoes). After gene mapping, it has been reported that at least five paralogs compose the Sw-5 gene cluster in S. peruvianum, which were named Sw- 5a to Sw-5e. These paralogs encode NB-LRR receptors, a class of cytoplasmic proteins that activate disease resistance upon direct or indirect recognition of pathogens that have overcome the first lines of defense of the plant immune system. Transformation of tobacco plants with the paralogs Sw-5a and Sw-5b, revealed that only the latter triggers resistance against TSWV isolates. With the availability of the tomato genome, highly conserved orthologs have been mapped in S. lycopersicum as well. This thesis started off with a detailed description of the plant immune system and previous findings about the Sw-5 gene cluster (Chapter 1). As part of this introduction, the problems caused by tospoviruses, to which Sw-5b locus confers resistance and the characteristics of these viruses have been described. With this knowledge as a starting point, this thesis focused on unraveling the key features of Sw-5b-mediated resistance against TSWV with special attention to the molecular and cellular events underlying the resistance mechanism. Functional analyses have been performed towards clarification of the genetic delimitations between functional and non-functional Sw-5 orthologs considering tospovirus recognition and resistance triggering. Since earlier made N. tabacum transformants containing Sw-5b did not show a hypersensitive response (HR) upon challenging with TSWV, N. benthamiana have been transformed with Sw-5b aiming to obtain transgenic lines that would respond with a visual HR and thereby facilitate the identification of the avirulence determinant (Avr) from TSWV (Chapter 2). While N. tabacum plants were transformed with Sw-5b gene under control of its own regulatory elements, the N. benthamiana plants were transformed with the Sw-5b gene under control of the Cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter. Interestingly, the Sw-5btransformed N. benthamiana plants presented a strong HR upon challenging with TSWV and four other tospoviruses: Alstroemeria necrotic streak virus (ANSV), Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Groundnut ringspot virus (GRSV) and Impatiens necrotic spot virus (INSV) (Chapter 2 and 7). To identify the Avr, TSWV genes were cloned and expressed individually in leaves of Sw-5b-transformed N. benthamiana plants and Sw-5-resistant tomato isolines for HR monitoring. As a result, HR was triggered upon expression of the non-structural protein NSM from the resistance-inducing TSWV isolate BR-01, but not from the resistance-breaking TSWV isolate GRAU (Chapter 2). The research on NSM was continued in Chapter 3, in which truncated versions of this protein were transiently co-expressed with Sw-5b in wild type N. benthamiana leaves. These truncations lacked domains previously associated with tubule formation, cell-tocell and systemic viral movement. Truncated NSM proteins lacking up to 50 amino acids (aa) from either the N- or C-terminus (full NSM is 301 aa in size) still triggered Sw-5b-mediated HR, suggesting that viral movement functions of NSM and its fate as Avr are independent from each other. Chapter 4 described experiments to characterize a new tospovirus collected from bean plants showing necrotic mosaic symptoms during a field survey in São Paulo, Brazil (2006). Electron microscopy of symptomatic leaves revealed pleomorphic particles packed in vesicles. Due to its unusual natural host for a “Brazilian” tospovirus and being negative in ELISA for tospovirus species known to be circulating in Brazil, biological, serological, and molecular tests were performed to further characterize this putatively new tospovirus species. The virus appeared to have a narrow host-range, systemically infecting only three out of twenty test-plants of various species and presented unique serological properties when compared to other known tospovirus species. The genome sequencing of this tospovirus revealed a completely new species, which, together with Soybean vein necrosis-associated virus (SVNaV), represents a second evolutionary lineage of tospoviruses circulating in the American continent. This new tospovirus was tentatively named Bean necrotic mosaic virus (BeNMV). Since the Sw-5b protein recognizes at least five tospovirus species of “American” origin, the NSM protein of BeNMV was also tested for HR-triggering through co-expression with Sw-5b in N. benthamiana leaves. The outcome, however, indicated that the NSM protein of BeNMV is not a cognate Avr of the Sw-5b protein. In Chapter 5 it is shown that the Sw-5b protein triggers both NSM-dependent and - independent HR. The latter was achieved by co-expression of Sw-5b with RNA silencing suppressors (p19 and NSS), which increased the Sw-5b cellular accumulation and lead to auto- HR. This observation allowed the screening of HR-triggering and NSM-recognition as uncoupled events for other Sw-5 proteins as well. While Sw-5a could trigger auto-HR, it lacked the ability to recognize NSM as Avr. On the other hand, the highest conserved ortholog of Sw-5a and Sw-5b from susceptible S. lycopersicum, named here as Sw-5aS, lacked both auto-HR and NSMdependent HR. By co-expression of the individual Sw-5b domains CC, NB-ARC, LRR or combined versions (CC-NB-ARC and NB-ARC-LRR) with NSM and the silencing suppressor p19, the role of these domains in HR-triggering and NSM-recognition was determined. While NBARC was sufficient for auto-HR, NB-ARC-LRR triggered both auto- and NSM-dependent HR, indicating that LRR specifies the Avr recognition. The CC domain suppressed HR triggered by NB-ARC in cis and trans, pointing towards a regulatory function for CC. The overexpression of the NB-ARC domain from Sw-5aS did not result in HR, similar to the outcome with the full-length Sw-5aS protein. After alignment of the NB-ARC domain, three mismatches were found between Sw-5a, Sw-5b, and Sw-5aS which were reverted in the latter. When the glutamine at position 599 was converted into an arginine (Q599R), to mimic the situation in the Sw-5b protein at this position, the Sw-5aS NB-ARC domain became functional for auto-HR triggering. Modeling of this domain revealed that this mutation was outside of the ADP/ATP binding site, which is important for the switching between “on” and “off” states of NB-ARC domains. Finally, the fusion of the LRR domain of Sw-5b to the Q599R variant of the Sw-5aS NB-ARC domain resulted in both auto- and NSM-dependent HR. The constructs encoding the various Sw-5b domains were used for subcellular studies in Chapter 6. To this end, all constructs encoded proteins were fused with Green Fluorescence Protein (GFP) at their N-terminus, to enable easy visualization by confocal microscopy in leaf tissue. Whereas the full-length Sw-5b protein, the individual domains CC, NB-ARC, and LRR and the combined CC-NB-ARC version showed a nucleocytoplasmic distribution, NB-ARC-LRR localized only in the cytoplasm, suggesting that CC signalizes nuclear import. The subdomains NB-ARC and LRR were also investigated for a possible direct interaction with NSM using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC). While for LRR interaction with NSM was not observed, the NB-ARC domain seemed to directly bind to NSM. The specificities for NSM recognition have been discussed in Chapter 7 taking into consideration evolutionary aspects of tomatoes and tospoviruses. A model for Sw-5b activation is postulated throughout the text based on the dissection of this protein in HR-triggering and subcellular localization assays and on its putative direct interaction with NSM.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2015-11-19T15:35:07Z No. of bitstreams: 1 2015_LucianaRamalhodeFarias.pdf: 4779015 bytes, checksum: 7b81169103e721898ed9a99c2bf0ed62 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2015-12-04T12:57:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_LucianaRamalhodeFarias.pdf: 4779015 bytes, checksum: 7b81169103e721898ed9a99c2bf0ed62 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-04T12:57:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_LucianaRamalhodeFarias.pdf: 4779015 bytes, checksum: 7b81169103e721898ed9a99c2bf0ed62 (MD5) / Os percevejos representam uma ameaça à soja, principal cultura agrícola do país. A investigação de proteínas relacionadas à olfação representa uma abordagen atual que visa o desenvolvimento de novas ferramentas a partir da compreensão do sistema olfativo de insetos e sua relação com o comportamento desses indivíduos no campo. O trabalho teve como objetivo identificar transcritos relacionados à olfação em três espécies de percevejos pragas da soja - Euschistus heros (Fabricius, 1798), Chinavia ubica (Rolston, 1983) e Dichelops melacanthus (Dallas, 1851), analisar a afinidade das proteínas que se ligam a odorantes (OBPs – Odorant Binding Proteins) a sete moléculas odorantes testadas in vivo como mistura complexa de odores e analisar a ultraestrutura das sensilas das antenas do percevejo marrom E. heros. Os transcritos foram obtidos a partir de sequenciamento de alto desempenho de amostras de RNA extraídas das antenas dos insetos não acasalados. Os dados obtidos no sequenciamento permitiram a montagem de sequências que posteriormente, foram triadas para obtenção das sequências de interesse. As relações filogenéticas entre as OBPs com sequência completa foram estabelecidas utilizando o programa FastTree. A modelagem estrutural dessas proteínas foi realizada pelo programa MODELLER 9.10. O docking molecular realizado para verificar a afinidade das OBPs com os ligantes foi realizado pelo programa AutoDock Vina. A ultraestrutura das sensilas de E. heros foi estudada utilizando técnicas de microscopia eletrônica de transmissão. Foram identificadas nove OBPs com sequências completas, sendo quatro pertencentes às espécies E.heros e C.ubica e uma ao D. melacanthus. As relações filogenéticas observadas indicaram uma divergência intraespecífica e duas relações de proximidade interespecífica. Os modelos obtidos a partir de modelagem estrutural foram consistentes com aqueles resolvidos por cristalografia de raio-X e resonância nuclear magnética. Esse estudo revelou uma maior afinidade das OBPs para odorantes relacionados aos feromônios sexuais, exceto a OBP de D. melacanthus, que não apresentou afinidade significativa com nenhum ligante. Em relação à ultraestrutura sensilar, os resultados demonstram uma organização semelhante à outra espécie de hemíptera e diferente da organização em lepidópteros. Este trabalho possibilitou o aprofundamento dos conhecimentos relacionados aos processos olfatórios nas espécies analisadas, bem como o levantamento de estratégias que poderão levar ao desenvolvimento de biossensores que poderão ser aplicados no campo como alternativa às estratégias de controle tradicionalmente utilizadas e, muitas vezes, ineficientes. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Stink-bugs (Pentatomidae) include a complex of species major pests of soybean in Brazil. Development of new tools to manage this pest complex is an important goal. The investigation of proteins related to olfaction presents potential to be used in monitoring and/or developing sustainable managing tools to be implemented in holistic integrated pest management (IPM) programs. This study aimed to identify transcripts related to olfaction in three species of stink bug pests of soybean - Euschistus heros, Chinavia ubica and Dichelops melacanthus -, and to analyze the affinity of odorant binding proteins (OBPs - Odorant Binding Proteins) to seven odorant molecules tested in live as complex mixture of odors and to analyze the ultrastructure of sensilas of the most commun species, E. heros. The transcripts were obtained through next generation sequencing from RNA samples extracted from the antennas unmated insects. The sequencing data obtained enabled the assembly sequences that were screened for obtaining the sequences of interest. The phylogenetic relationships between full-length OBPs were established using the FastTree program. Structural modeling of these proteins was carried out by MODELLER 9.10 software. The molecular docking conducted to determine the affinity of ligands with OBPs was performed by Vina AutoDock program. The sensilla ultrastructure of E. heros was studied using electron transmission microscop. Nine full-length OBPs were identified four belonging to the species E.heros and C. ubica each and one from D. melacanthus. The phylogenetic relationships observed indicated an intraspecific divergence and two relations of interspecific proximity. The models obtained from structural modeling were consistent with those solved by X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance. This study revealed a greater affinity for the OBPs odorants related to sex pheromones, except OBP D. melacanthus, which showed no significant affinity with any odorant molecule. Regarding to sensilar ultrastructure, the results demonstrate an organization similar to other species of Hemiptera and different organization from Lepidoptera. This work enabled the development of knowledge related to olfactory processes in the analyzed species and raising strategies that may lead to the development of biosensors that can be applied in the field as an alternative to control strategies traditionally used and often inefficient.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-04-07T12:59:49Z No. of bitstreams: 1 2016_TadeuAraujoSouza.pdf: 1810896 bytes, checksum: 875d57d95829fcdd5ba22d41167265c1 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-04-07T16:48:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_TadeuAraujoSouza.pdf: 1810896 bytes, checksum: 875d57d95829fcdd5ba22d41167265c1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-07T16:48:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_TadeuAraujoSouza.pdf: 1810896 bytes, checksum: 875d57d95829fcdd5ba22d41167265c1 (MD5) / O tomateiro (Solanum lycopersicum) é um das hortaliças mais cultivadas em todo o mundo, inclusive no Brasil, principalmente pelas suas características nutricionais e pela sua importância sócio econômica. Essa cultura pode ser alvo de uma grande diversidade de pragas, incluindo alguns grupos de vírus. Entre os principais encontram-se as espécies dos gêneros Begomovirus, Tospovirus e Crinivirus. Os crinivírus são vírus emergentes, com duas espécies conhecidas em tomateiro Tomato chlorosis virus (ToCV) e Tomato infectious chlorosis virus (TICV) e que foram identificadas em meados da década de 90, nos Estados Unidos. No Brasil, até o momento, apenas ToCV foi relatado infectando o tomateiro. Geneticamente, o ToCV é composto por duas moléculas de RNA fita simples, encapsidadas em partículas virais longas e flexuosas. A transmissão é feita por três espécies de moscas-brancas: Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum e T. abutiloneus. Em tomateiro, o principal sintoma caracteriza-se por manchas cloróticas que desenvolvem uma clorose internerval intensa, visualizada principalmente nas folhas baixeiras. O primeiro relato de ToCV no Brasil ocorreu em 2008 e, desde então, este vírus tem sido encontrado nas principais regiões produtoras de tomate do país, porém ainda é pouco estudado. Devido a essa demanda de pesquisa, o objetivo desse trabalho foi determinar a gama de hospedeiros do ToCV no Brasil. Foram avaliadas 50 espécies dentre elas, plantas cultivadas e não cultivadas, inoculadas com ToCV pelo inseto vetor (B. tabaci biótipo B). Do total de plantas avaliadas, nove espécies foram suscetíveis ao isolado testado de ToCV, indicando a potencial capacidade dessas plantas de atuarem como hospedeiras alternativas de ToCV em campo. Concluiu-se então que é necessária maior preocupação com as plantas Amaranthus hibridus, Solanum americanum, Nicandra physaloides e Physalis angulata, pois além de suscetíveis a ToCV, são plantas altamente infestantes em lavouras de tomate e potenciais hospedeiras alternativas do vírus na ausência ou na presença da cultura. Na ausência de tomateiro nas áreas de produção, o virus pode permanecer nas hospedeiras alternativas e, na presença de tomateiro, tais hospedeiras são potencias fontes de inóculo de ToCV. O sinergismo entre ToCV e o tospovírus Tomato spotted wilt virus (TSWV) foi recentemente relatado na Espanha. Nessa interação, há aparentemente um favorecimento da infecção de TSWV em plantas resistentes (com gene Sw-5), quando previamente infectadas por ToCV. Por se tratar de um relato preocupante, parte desse trabalho foi então desenvolvido para avaliar esse sinergismo entre ToCV e tospovírus em tomateiro. Foram selecionadas as cultivares resistentes a tospovírus, Predador e Viradoro, e a cultivar suscetível Dominador, utilizada como controle nos ensaios. As cultivares de tomateiro resistentes foram previamente infectadas por ToCV pelo inseto vetor e, posteriormente, inoculadas com os tospovírus Tomato chlorotic spot virus (TCSV) e Groundnut ringspot virus (GRSV). Após a inoculação, as plantas resistentes não foram infectadas pelos tospovírus, avaliadas visualmente e por teste sorológico (Dot-Elisa). Adicionalmente, foi utilizado outro modelo biológico com Nicotiana benthamina não transgênica e transgênica, transformada constitutivamente com o gene Sw-5. As plantas transgênicas resistentes previamente infectadas por ToCV e posteriomente inoculadas com os tospovírus apresentaram sintoma de lesão local, indicando resistência e ausência de infecção sistêmica. A infecção prévia de ToCV não alterou a expressão do gene Sw-5, responsável por conferir resistência a tospovírus em plantas de tomate e N. benthamiana. Estudos para identificar hospedeiras alternativas de ToCV e compreender o comportamento dos vírus em casos de infecção mista constituem ações indispensáveis para o sucesso de qualquer estratégia de controle. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The tomato (Solanum lycopersicum) is one of the most cultivated vegetables around the world, including Brazil, mainly by their nutritional characteristics and socio-economic importance. This crop is affected by a large variety of pests and pathogens, including some viruses. The major species are found within the genus Begomovirus, Tospovirus and Crinivirus. The criniviruses are emerging viruses, with two known species in tomato Tomato chlorosis virus (ToCV) and Tomato infectious chlorosis virus (TICV). They were identified in the mid 90s, in the United States. In Brazil, only ToCV was reported in tomatoes. Genetically, ToCV consists of two single-stranded RNA molecules, encapsidated in long and flexuous viral particles. They are transmitted by three whitefly species: Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum and T. abutiloneus. In tomato, the main symptoms are characterized by chlorotic spots, which evolve to strong internerval chlorosis, mainly visualized in the lower leaves. The first report of ToCV in Brazil was made in 2006 and since then the virus has been found in the main producing regions of tomato of the country. However, it has been poorly studied. Due to this demand, the aim of this study was to determine the host range of ToCV in Brazil. A total of 50 species of cultivated and non-cultivated plants was tested in inoculation with ToCV by the insect vector (B. tabaci biotype B). Nine species were shown to be susceptible to ToCV infection, indicating the potential ability of these plants to act as alternative hosts of ToCV in the field. Therefore, it was concluded that the growers are concerned with the following plants: Amaranthus hibridus, Solanum americanum, Nicandra physaloides and Physalis angulata. They were all susceptible to ToCV, and are frequently found in tomato crops. They are potential virus alternative hosts in the absence of tomato plants, and when tomatoes are present, they can act as inoculum source of ToCV to these plants. The possible synergism between ToCV and the tospovirus Tomato spotted wilt virus (TSWV) was recently reported. In this interaction, apparently a ToCV infection foster TSWV infection in TSWV-resistant plants (contatining the Sw-5 gene). The interaction between two or more viruses can result in unexpected pathological consequences and because of this possible impact in the Brazilian tomato production, we evaluated this synergism between ToCV and tospovirus in tomatoes in the Brazilian conditions. The tospovirus-resistant cultivars Predador and Viradoro were selected, and the susceptible cultivar Dominador was used as control in the assays. Resistant tomato cultivars were previously infected with ToCV by the insect-vector and then inoculated with tospoviruses Tomato chlorotic spot virus (TCSV) and Groundnut ringspot virus (GRSV). After inoculation, the resistant plants were not infected, confirmed by visual inspection and a sorologic test (Dot-Elisa). In addition, a similas test was performed using transgenic and non-transgenic Nicotiana benthamiana plants, which are constitutively transformed with the gene Sw-5. The resistant transgenic plants previously infected with ToCV and subsequently inoculated with TCSV and GRSV showed local lesion symptoms, indicating resistance and absence of systemic infection. The prior infection of the resistant plants with ToCV did not alter the expression of the Sw-5 gene. It is believed that this absence of resistance breakdown is possibly associated with the tomato variety and the viral species that were used. The identification of alternative hosts of ToCV and undertanding the interaction of the viruses in cases of mixed infection are essential information to enable the success of any virus control strategy.