O sistema canabinóide parece participar de vários processos neurobiológicos, incluindo neuroproteção e plasticidade. Os objetivos deste estudo foram avaliar os efeitos de ablações retinianas sobre a expressão do receptor canabinóide CB1 e de proteínas estruturais no tecto óptico de pintos pelos métodos de imuno-histoquímica, immunoblotting e PCR em tempo real. Além disso, avaliamos os efeitos do tratamento com agonistas e antagonistas canabinóides em culturas de células do tecto óptico expostas ao NMDA por citometria de fluxo e quanto à morfologia. A ablação retiniana parece gerar um aumento da expressão da proteína CB1 no tecto óptico desaferentado, mas não dos níveis de RNAm. O tratamento das culturas com o agonista canabinóide diminuiu o número de células inviáveis e de DNA fragmentado gerados pelo NMDA. O aumento da expressão de CB1 após a ablação indica uma localização pós-sináptica desses receptores e sugere um papel do sistema canabinóide em processos de plasticidade. Os resultados da cultura de células sugerem um papel neuroprotetor do sistema canabinóide. / The cannabinoid system (CS) seems to have a role in several neurobiological processes, including neuroprotection and neuronal plasticity. The aims of this study were to verify the effects of unilateral retinal ablation on the expression of cannabinoid receptor CB1 and other structural proteins in the optic tectum of chick brain by immunohistochemistry, immunoblotting and real time PCR. Moreover, we evaluated the effects of cannabinoids agonists and antagonists treatment in optic tectum cell cultures exposed to the NMDA by flow cytometry and in the morphology. The retinal ablation seems to generate an increase in the expression of protein CB1 in the deafferented optic tectum, but not in the levels of mRNA. The treatment of the cultures with the cannabinoid agonist decreased the number of unviable cells and fragmented DNAs generated by NMDA. This increase of CB1 expression indicates a post-synaptic localization of these receptors and suggests a role of the CS in plasticity processes. The results of cell culture suggest neuroprotector role of the CS.

O sistema canabinóide parece participar de vários processos neurobiológicos, incluindo neuroproteção e plasticidade. Os objetivos deste estudo foram avaliar os efeitos de ablações retinianas sobre a expressão do receptor canabinóide CB1 e de proteínas estruturais no tecto óptico de pintos pelos métodos de imuno-histoquímica, immunoblotting e PCR em tempo real. Além disso, avaliamos os efeitos do tratamento com agonistas e antagonistas canabinóides em culturas de células do tecto óptico expostas ao NMDA por citometria de fluxo e quanto à morfologia. A ablação retiniana parece gerar um aumento da expressão da proteína CB1 no tecto óptico desaferentado, mas não dos níveis de RNAm. O tratamento das culturas com o agonista canabinóide diminuiu o número de células inviáveis e de DNA fragmentado gerados pelo NMDA. O aumento da expressão de CB1 após a ablação indica uma localização pós-sináptica desses receptores e sugere um papel do sistema canabinóide em processos de plasticidade. Os resultados da cultura de células sugerem um papel neuroprotetor do sistema canabinóide. / The cannabinoid system (CS) seems to have a role in several neurobiological processes, including neuroprotection and neuronal plasticity. The aims of this study were to verify the effects of unilateral retinal ablation on the expression of cannabinoid receptor CB1 and other structural proteins in the optic tectum of chick brain by immunohistochemistry, immunoblotting and real time PCR. Moreover, we evaluated the effects of cannabinoids agonists and antagonists treatment in optic tectum cell cultures exposed to the NMDA by flow cytometry and in the morphology. The retinal ablation seems to generate an increase in the expression of protein CB1 in the deafferented optic tectum, but not in the levels of mRNA. The treatment of the cultures with the cannabinoid agonist decreased the number of unviable cells and fragmented DNAs generated by NMDA. This increase of CB1 expression indicates a post-synaptic localization of these receptors and suggests a role of the CS in plasticity processes. The results of cell culture suggest neuroprotector role of the CS.

Orientador: Elaine Minatel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T19:48:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_LuisHenriqueRapucci_D.pdf: 3874036 bytes, checksum: 7d72faf59790ed5f085eb2edd9aba075 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Devido ao fato dos camundongos mdx, modelo experimental da distrofia muscular de Duchenne, apresentarem peroxidação lipídica da membrana causada pelo aumento da produção espécies reativas de oxigênio (EROs) no período que antecede o início da degeneração das fibras musculares, sugere-se que o estresse oxidativo pode ser um dos mecanismos primários da degeneração muscular distrófica, ao invés de ser um efeito secundário deste processo. Camundongos mdx tratados com o antioxidante N-acetilcisteína (NAC) apresentaram diminuição da degeneração muscular. De acordo com a literatura a associação de NAC com Deferoxamina (DFX) produz resultado mais efetivo contra o estresse oxidativo do que a administração de NAC isoladamente. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi de verificar, através de análises morfológica, celular e bioquímica, se o tratamento in vivo e in vitro com a associação de NAC e DFX diminui a produção das EROs. Para os estudos in vivo foram utilizados camundongos C57BL/10 (grupo controle) e camundongos mdx, com 14 dias de vida pós-natal. Os camundongos mdx e C57BL/10 foram divididos em 4 grupos experimentais: tratados com salina, tratados com NAC+DFX, tratados com DFX e tratados com NAC (150 mg/kg) por 14 dias. Todos os animais foram submetidos à análise de medida de força. Os músculos Esternomastóideo (STN), Diafragma (DIA) e Tibial Anterior (TA) foram retirados e submetidos às técnicas histológicas (HE, azul de Evans e reação de DHE), Western Blotting (TNF-?, NF-?B, MyoD, MAFbx e 4-HNE). Plasma sanguíneo foram utilizadas para determinação de creatina quinase (CK) e de citocinas inflamatórias. Nos experimentos in vitro foram utilizados os músculos do membro pélvico de camundongos C57BL/10 e mdx com 14 dias de vida. As culturas de células musculares foram utilizadas para análises de viabilidade celular (Trypan blue, MTT e vermelho neutro), análise de cálcio e Western Blotting após serem tratadas ou não com NAC e DFX. O tratamento com NAC, DFX e NAC+DFX apresentou efeito benéficos sobre as fibras musculares distróficas, tanto nos experimentos in vivo quanto in vitro, reduzindo a degeneração muscular, a inflamação exacerbada, a peroxidação lipídica e a produção de EROs. Tanto o tratamento isolado dos medicamentos quanto a associação apresentou potencial efeito, entretanto em alguns experimentos a associação mostrou-se mais eficaz contra os danos provocados pela distrofia / Abstract: Due the fact of mdx mice, an experimental model of Duchenne muscular dystrophy, presenting the lipid peroxidation of membrane caused by increased production of reactive oxygen species (ROS) in the period that preced the onset of muscle fibers degeneration, it is suggested that stress oxidative may be one of the primary mechanisms of dystrophic muscle degeneration, rather than a side effect of this process. Mdx mice treated with the antioxidant N-acetylcysteine (NAC) showed a decrease in muscle degeneration. According to the literature the association of NAC with Deferoxamine (DFX) produces more effective results against oxidative stress than NAC alone. Thus, the aim of this study was to verify, through morphological analysis, cellular and biochemistry, if the in vivo and in vitro treatment with the combination of NAC and DFX decreases the ROS production. For in vivo studies were used C57BL/10 mice (control group) and mdx mice, with 14 days postnatal. The mdx and C57BL/10 mice were divided into 4 experimental groups: treated with saline, treated with NAC + DFX, treated with DFX and treated with NAC (150 mg/kg) for 14 days. All animals were subjected to strength measurement analysis. The Sternomastoid (STN), Diaphragm (DIA) and Tibialis anterior (TA) muscles were removed and submitted to histological techniques (HE, Evans blue dye and DHE reaction), Western Blotting (TNF-?, NF-kB, MyoD, MAFbx and 4-HNE). Blood plasma was used for determination of Creatine kinase (CK) and inflammatory cytokines. In the in vitro experiments, the muscles of the pelvic limb of C57BL/10 and mdx mice with 14 days postnatal were used. The muscles culture cells were used for cell viability analysis (Trypan blue, MTT and Neutral red), calcium analysis and Western blotting after being treated or not with NAC and DFX. Treatment with NAC , DFX and NAC + DFX showed benefic effect on dystrophic muscle fibers, both in vivo and in vitro experiments, reducing muscle degeneration, exacerbated inflammation, lipid peroxidation, and ROS production. Either the isolated or the combination treatment of medication showed a potential effect, however in some experiments the combination was more effective against the damage caused by the disease / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Ein Schlüsselbefund der Parkinson-Krankheit auf zellulärer Ebene ist das Auftreten von Protein-Einschlusskörperchen, sogenannten Lewykörperchen. Der Hauptbestandteil dieser Lewykörperchen ist pathologisch aggregiertes, fibrilläres α-Synuklein, ein Protein, welches Einfluss auf präsynaptische Vesikel, Protein- und Enzymfunktionen sowie den Dopaminstoffwechsel und den axonalen Transport hat. Bis heute ungeklärt ist die Ursache der Aggregation des Proteins. Zahlreiche Forschungsaktivitäten werden in diese Richtung unternommen. Die pathologischen Mechanismen, die zur abnormen Aggregation von α-Synuklein führen, bleiben noch weitgehend unbekannt. Ein großer Teil der Literatur unterstützt die Hypothese, dass α-Synuklein bei Punktmutationen oder erhöhter Expression anfällig für Aggregationen ist und damit Neuronen geschädigt werden. Die Einzelheiten dieses sukzessiven Aggregationsprozesses und die Mechanismen, die dabei letztlich den Zelltod verursachen, bleiben unklar. Alterungsprozesse und Umweltfaktoren sind entscheidende Risikofaktoren. Obwohl es immer mehr Hinweise gibt, dass α-Synuklein-Aggregate eine wichtige pathophysiologische Rolle spielen, wird bisher noch unzulänglich verstanden, wie die für die dopaminergen Neurone toxische Wirkung entfaltet wird. Als gesicherter Pathomechanismus der Degeneration der dopaminergen Nervenzellen gilt ein erhöhter oxidativer Stress. Es wird vermutet, dass er zur Aggregation des α-Synukleins beitragen kann. Ziel dieser vorgelegten Arbeit ist es, durch die Verwendung eines geeigneten Zellkulturmodells zur Aufklärung der beschriebenen pathologischen Mechanismen beizutragen. In dieser Studie wurden zwei artifizielle Modellsubstanzen in einer dopaminergen Primärzellkultur eingesetzt, die Pestizide Rotenon und Paraquat, um die pathologischen Verhältnisse in der Substantia nigra zu simulieren. Sie erzeugen oxidativen Stress durch Hemmung der mitochondrialen Atmungskette bzw. Redoxreaktionen mit molekularem Sauerstoff, was zum dopaminergen Zelltod führt. Im Rahmen dieser Studie gelang es, beide Parkinson-Zellkulturmodelle anhand der Lokalisierung, des Aggregationsverhaltens, des Einflusses auf die Mikroglia-Aktivierung sowie des Abbaus von α-Synuklein näher zu charakterisieren. Hierzu wurde α-Synuklein durch Fluoreszenzfärbung, Westernblot und Immunpräzipitation analysiert. Eine kurzzeitige Behandlung mit hoch konzentrierten Toxinen löst eine akute Degeneration dopaminerger Neurone aus, die so nicht der des Idiopathischen Parkinsons entspricht. Beim IPS erfolgt die Degeneration über Jahre hinweg. Um auch den Einfluss der zellulären Alterung auf die α-Synuklein-Aggregation zu zeigen, wurden die in dieser Arbeit verwendeten Zellkulturen über 46 Tage kultiviert und die Pestizid-Konzentration so eingestellt, dass etwa 25-50 % der dopaminergen Neurone absterben. Es konnte gezeigt werden, dass es nach chronischer Behandlung mit dem jeweiligen Pestizid zu den verschiedenen Zeitpunkten Unterschiede in der Lokalisation sowie in der Konformation von α-Synuklein gibt. Die zum Vergleich nur bis zum Tag 11 kultivierten Zellkulturen zeigten nach kurzer Behandlung mit hochkonzentrierter Toxin-Menge eine Ansammlung von α-Synuklein im Soma, aber keine Auswanderung und Lokalisierung in und an den Neuriten, wie es nach chronischer Rotenon-Behandlung beobachtet werden konnte. Bei den Rotenon-behandelten Zellen ist ein Prozess der Verlagerung und Anhäufung des α-Synuklein aus dem Soma in die Neuriten bereits ab einem früheren Zeitpunkt zu beobachten als in den Kontrollen, welche sich aber mit zunehmendem Alter ähnlich verhalten. Außerdem konnte in den Kulturen, besonders bei den Rotenon-behandelten dopaminergen Neuronen, ein punktförmiges Verteilungsmuster und größere Ansammlungen des Proteins in den Neuriten beobachtet werden, was für eine aggregierte Form des α-Synukleins spricht. Diese Aggregate ließen sich durch die Proteo-Aggreosom-Färbung nachweisen. Auch der Nachweis von am Serin 129 phosphoryliertem α-Synuklein in diesen größeren Ansammlungen gilt als Zeichen für eine aggregierte Form. Die Beobachtung, dass α-Synuklein mit zunehmendem Kulturalter aus dem Soma in die Peripherie austritt, konnte bei der chronischen Paraquat-Behandlung so nicht getätigt werden. Unter Paraquat-Behandlung war keine Herauf-Regulierung der Gesamt-α-Synuklein Expression in der Kultur zu beobachten, wie dies sowohl bei Kontrolle als auch bei Rotenon der Fall ist. Wir vermuten im Paraquat-Modell, dass die sich im Soma ansammelnde Form von α-Synuklein durch vermehrte Einschleusung in den Zellkern zur Toxizität beitragen kann. Auch eine Interaktion von α-Synuklein mit der Zellmembran könnte unter Paraquat-Einfluss zum dopaminergen Zelltod beitragen. Durch Immunpräzipitation und Fluoreszenz-Doppelfärbung von α-Synuklein und Ubiquitin konnten wir den Abbau des fehlgefalteten α-Synukleins in der Zelle durch Ubiquitinierung nachweisen. Unter Rotenon ist ab DIV 14 eine starke Kolokalisation von α-Synuklein und Ubiquitin zu erkennen, die im Verlauf der Kultur nachlässt und nur noch in punktförmigen Aggregaten außerhalb der Zelle zu sehen ist. Unter Paraquat zeigte sich während der gesamten Kultivierung Polyubiquitinierung und Kolokalisation der beiden Proteine in der gesamten Zelle. Die Aggregationsform von α-Synuklein scheint das Proteinabbausystem durch Ubiquitinierung zu beeinflussen, da wir davon ausgehen, dass es sich bei der α-Synuklein-Konformation zu verschiedenen Zeitpunkten in den Paraquat-behandelten dopaminergen Neuronen nicht um die Aggregationsform handelt, die wir unter Rotenon beobachten konnten.

Ein Schlüsselbefund der Parkinson-Krankheit auf zellulärer Ebene ist das Auftreten von Protein-Einschlusskörperchen, sogenannten Lewykörperchen. Der Hauptbestandteil dieser Lewykörperchen ist pathologisch aggregiertes, fibrilläres α-Synuklein, ein Protein, welches Einfluss auf präsynaptische Vesikel, Protein- und Enzymfunktionen sowie den Dopaminstoffwechsel und den axonalen Transport hat. Bis heute ungeklärt ist die Ursache der Aggregation des Proteins. Zahlreiche Forschungsaktivitäten werden in diese Richtung unternommen. Die pathologischen Mechanismen, die zur abnormen Aggregation von α-Synuklein führen, bleiben noch weitgehend unbekannt. Ein großer Teil der Literatur unterstützt die Hypothese, dass α-Synuklein bei Punktmutationen oder erhöhter Expression anfällig für Aggregationen ist und damit Neuronen geschädigt werden. Die Einzelheiten dieses sukzessiven Aggregationsprozesses und die Mechanismen, die dabei letztlich den Zelltod verursachen, bleiben unklar. Alterungsprozesse und Umweltfaktoren sind entscheidende Risikofaktoren. Obwohl es immer mehr Hinweise gibt, dass α-Synuklein-Aggregate eine wichtige pathophysiologische Rolle spielen, wird bisher noch unzulänglich verstanden, wie die für die dopaminergen Neurone toxische Wirkung entfaltet wird. Als gesicherter Pathomechanismus der Degeneration der dopaminergen Nervenzellen gilt ein erhöhter oxidativer Stress. Es wird vermutet, dass er zur Aggregation des α-Synukleins beitragen kann. Ziel dieser vorgelegten Arbeit ist es, durch die Verwendung eines geeigneten Zellkulturmodells zur Aufklärung der beschriebenen pathologischen Mechanismen beizutragen. In dieser Studie wurden zwei artifizielle Modellsubstanzen in einer dopaminergen Primärzellkultur eingesetzt, die Pestizide Rotenon und Paraquat, um die pathologischen Verhältnisse in der Substantia nigra zu simulieren. Sie erzeugen oxidativen Stress durch Hemmung der mitochondrialen Atmungskette bzw. Redoxreaktionen mit molekularem Sauerstoff, was zum dopaminergen Zelltod führt. Im Rahmen dieser Studie gelang es, beide Parkinson-Zellkulturmodelle anhand der Lokalisierung, des Aggregationsverhaltens, des Einflusses auf die Mikroglia-Aktivierung sowie des Abbaus von α-Synuklein näher zu charakterisieren. Hierzu wurde α-Synuklein durch Fluoreszenzfärbung, Westernblot und Immunpräzipitation analysiert. Eine kurzzeitige Behandlung mit hoch konzentrierten Toxinen löst eine akute Degeneration dopaminerger Neurone aus, die so nicht der des Idiopathischen Parkinsons entspricht. Beim IPS erfolgt die Degeneration über Jahre hinweg. Um auch den Einfluss der zellulären Alterung auf die α-Synuklein-Aggregation zu zeigen, wurden die in dieser Arbeit verwendeten Zellkulturen über 46 Tage kultiviert und die Pestizid-Konzentration so eingestellt, dass etwa 25-50 % der dopaminergen Neurone absterben. Es konnte gezeigt werden, dass es nach chronischer Behandlung mit dem jeweiligen Pestizid zu den verschiedenen Zeitpunkten Unterschiede in der Lokalisation sowie in der Konformation von α-Synuklein gibt. Die zum Vergleich nur bis zum Tag 11 kultivierten Zellkulturen zeigten nach kurzer Behandlung mit hochkonzentrierter Toxin-Menge eine Ansammlung von α-Synuklein im Soma, aber keine Auswanderung und Lokalisierung in und an den Neuriten, wie es nach chronischer Rotenon-Behandlung beobachtet werden konnte. Bei den Rotenon-behandelten Zellen ist ein Prozess der Verlagerung und Anhäufung des α-Synuklein aus dem Soma in die Neuriten bereits ab einem früheren Zeitpunkt zu beobachten als in den Kontrollen, welche sich aber mit zunehmendem Alter ähnlich verhalten. Außerdem konnte in den Kulturen, besonders bei den Rotenon-behandelten dopaminergen Neuronen, ein punktförmiges Verteilungsmuster und größere Ansammlungen des Proteins in den Neuriten beobachtet werden, was für eine aggregierte Form des α-Synukleins spricht. Diese Aggregate ließen sich durch die Proteo-Aggreosom-Färbung nachweisen. Auch der Nachweis von am Serin 129 phosphoryliertem α-Synuklein in diesen größeren Ansammlungen gilt als Zeichen für eine aggregierte Form. Die Beobachtung, dass α-Synuklein mit zunehmendem Kulturalter aus dem Soma in die Peripherie austritt, konnte bei der chronischen Paraquat-Behandlung so nicht getätigt werden. Unter Paraquat-Behandlung war keine Herauf-Regulierung der Gesamt-α-Synuklein Expression in der Kultur zu beobachten, wie dies sowohl bei Kontrolle als auch bei Rotenon der Fall ist. Wir vermuten im Paraquat-Modell, dass die sich im Soma ansammelnde Form von α-Synuklein durch vermehrte Einschleusung in den Zellkern zur Toxizität beitragen kann. Auch eine Interaktion von α-Synuklein mit der Zellmembran könnte unter Paraquat-Einfluss zum dopaminergen Zelltod beitragen. Durch Immunpräzipitation und Fluoreszenz-Doppelfärbung von α-Synuklein und Ubiquitin konnten wir den Abbau des fehlgefalteten α-Synukleins in der Zelle durch Ubiquitinierung nachweisen. Unter Rotenon ist ab DIV 14 eine starke Kolokalisation von α-Synuklein und Ubiquitin zu erkennen, die im Verlauf der Kultur nachlässt und nur noch in punktförmigen Aggregaten außerhalb der Zelle zu sehen ist. Unter Paraquat zeigte sich während der gesamten Kultivierung Polyubiquitinierung und Kolokalisation der beiden Proteine in der gesamten Zelle. Die Aggregationsform von α-Synuklein scheint das Proteinabbausystem durch Ubiquitinierung zu beeinflussen, da wir davon ausgehen, dass es sich bei der α-Synuklein-Konformation zu verschiedenen Zeitpunkten in den Paraquat-behandelten dopaminergen Neuronen nicht um die Aggregationsform handelt, die wir unter Rotenon beobachten konnten.

Lack of host-specific cell cultures necessitated initiation of primary cell cultures from ictalurid catfish. Cell cultures from the fin tissues of hybrid catfish ( channel catfish x blue catfish) were developed, characterized, and species of origin molecularly authenticated. Blue catfish alloherpesvirus (BCAHV) is an Ictalurid herpesvirus. When BCAHV was inoculated onto various fish cell lines from different families, the cytopathic effects were restricted to cell lines from family Ictaluridae indicating the host-specificity of virus. A virus challenge using channel, blue, and hybrid catfish indicated mortality due to BCAHV was significantly higher in blue and hybrid catfish. Crowding influenced BCAHV pathogenesis indicated by significantly higher mortality in highly stocked tanks. Host susceptibility to BCAHV differed with age. Temperature had a significant role in the activation and pathogenesis of BCAHV. The enhanced virulence of BCAHV in blue and hybrid catfish reveals its potential to be a significant pathogen in catfish culture.

Submitted by Maria Anália Conceição (marianaliaconceicao@gmail.com) on 2016-06-23T11:30:40Z No. of bitstreams: 1 Publico-NOVO-03.pdf: 1761339 bytes, checksum: 1ec50dfc6d5850f1b16cf857655b8101 (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Anália Conceição (marianaliaconceicao@gmail.com) on 2016-06-23T11:32:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Publico-NOVO-03.pdf: 1761339 bytes, checksum: 1ec50dfc6d5850f1b16cf857655b8101 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-23T11:32:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Publico-NOVO-03.pdf: 1761339 bytes, checksum: 1ec50dfc6d5850f1b16cf857655b8101 (MD5) Previous issue date: 2014 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: A Engenharia Tecidual (ET) tem como objetivo a fabricação de órgãos e tecidos. Preconiza-se o uso de células autólogas para evitar a incompatibilidade imunológica, porém, pela escassez do número de células obtidas na fonte celular, muitas passagens se tornam necessárias para atingir um número adequado de células. As culturas primárias freqüentemente sofrem diferenciação indesejada, modificando o comportamento e o destino celular. O uso de enzimas proteolíticas durante as passagens celulares é potencialmente lesivo à fisiologia celular, todavia pouca relevância tem sido dada a este aspecto na ET. Essas enzimas, ao digerir a matriz extracelular (MEC), também alteram proteínas de superfície (PS), interferindo na interação célula-célula (ICC). Consequentemente podem alterar a sinalização celular, a expressão gênica, o comportamento e o destino. Objetivo: Avaliar a expressão gênica na via de sinalização TGFβ/BMP, em matriz extracelular e em moléculas de adesão, das células tronco mesenquimais de polpa dental humana (hDPSC) obtidas diretamente do tecido e sob cultura primária até a terceira passagem. Métodos: Foi analisada a expressão gênica por qRT-PCR array da via de sinalização TGFβ/BMP, matriz extracelular e moléculas de adesão após três passagens celulares na cultura primária de hDPSC. Resultados: Os genes COL16A1(p=0,045), TIMP1(p=0,003), THBS1(p=0,027), TGFBI(p=0,001), ITGA8(p=0,002), FN1(p=0,035), CD44(p=0,046),TSC22D1(p=0,026) e RPL13A(p=0,017) tiveram sua expressão aumentada e os genes NCAM1(p=0,047), BGLAP(p=0,037) e ID1(p=0,027) tiveram sua expressão diminuída em relação às células de tecido de origem. Conclusão: Houve alteração da expressão gênica na cultura celular de hDPSC após três passagens. Porém, um gene solitariamente pode não exercer função chave na diferenciação de células, influenciada pela relação com a MEC e com o ambiente extracelular. O controle por modulação da diferenciação celular representa um aspecto importante no desenvolvimento da ET. / Introduction: Tissue Engineering (TE) aims to manufacture organs and tissues and advocates the use of autologous cells to avoid immune incompatibility. However, a longer culture time is necessary to achieve that purpose. Primary cultures often suffer undesirable differentiation, modifying behavior and cell fate. The use of proteolytic enzymes during cell passages is potentially harmful to cell physiology, but little importance has been given to this aspect in ET. These enzymes which digest the extracellular matrix (ECM) also alter surface proteins (SP) and interfere with cell-cell interactions (ICC). Consequently, may alter cell signaling by modifying gene expression, behavior and cell fate. Objective: To assess gene expression in the signaling TGFβ / BMP pathway, in extracellular matrix and in adhesion molecules, of mesenchymal human dental pulp cells from tissue and cultured until third passage. Methods: We had evaluated gene expression by qRT-PCR array of signaling TGFβ / BMP pathway, in extracellular matrix and in adhesion molecules, of mesenchymal cells from primary and third passage cultured human dental pulp Results: COL16A1(p=0,045), TIMP1(p=0,003), THBS1(p=0,027), TGFBI(p=0,001), ITGA8(p=0,002), FN1(p=0,035), CD44(p=0,046),TSC22D1(p=0,026) and RPL13A(p=0,017) genes had their expression increased and NCAM1(p=0,047), BGLAP(p=0,037) and ID1(p=0,027) genes had reduced expression compared to primary cells. Conclusion: There were modifications in gene expression after three passages. However, a single gene could not be enough to exert a key role in cell differentiation that is broadly affected by its relationship with the ECM and extracellular environment. The control by modulation of cellular differentiation, is an important aspect in the development of ET. / FAPESP: 2013/00288-4

The trigeminal ganglion (TG) is a complex sensory structure and multiple lines of evidence suggest that significant differences exist in anatomical, neurochemical and physiological properties between it and its equivalent structure in the somatosensory system, the dorsal root ganglion (DRG). This is likely to be a reflection, first on the unique areas of tissue innervation of the TG and second, on the unusual responses to injury which give rise to distinct pain symptoms such as toothache, migraine and temporomandibular joint disorders. In an attempt to address this disparity in knowledge, we have carried out an in-depth in vivo study investigating neurochemical populations and cell size distributions of sensory neurons within the rat TG. We have performed a detailed analysis of expression patterns for receptor components of important inflammatory mediators, NGF (TrkA), TNFα (p55) and IL-6 (gp130), along with the thermo-transducers TRPV1 and TRPM8. For each analysis we have compared our findings with those of the rat DRG. We have shown a significantly larger population of NF200+ neurons within the TG (51%) compared to the DRG (40%), and most interestingly, the majority of NF200+ neurons in the TG were within the small to medium cell size range, conferring a nociceptive phenotype. We have for the first time, determined expression of p55 and gp130 protein levels within neurochemically defined subpopulations of the TG. We show that a large proportion (33%) of TG neurons, in particular 27% of NF200+ neurons co-express p55, and thereby have the potential to respond directly to TNFα. Furthermore, we have observed gp130 protein expression to be ubiquitous within the TG, suggesting all neurons, including non-nociceptors, could respond to IL-6. In addition, we have utilised biochemical and electrophysiological techniques in vitro to measure the functional outcome of exposure of TG neurons to IL-6. We have demonstrated that IL-6 activates the JAK/STAT signalling pathway, preferentially within NF200+ neurons. Furthermore, we have shown that IL-6 sensitises the response of TG neurons to the TRPV1 agonist capsaicin, altering the gating properties and prolonging the opening time of the channel. Taken together, our findings support the emerging picture of a complex combinatorial pattern of co-expression of sensory neurochemicals, transducers and receptor components that help to define TG neuronal modality and function. We would advocate caution in making generalisations across sensory ganglia in particular in extrapolating data from the DRG to the trigeminal ganglion.

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est une structure retrouvée au niveau des capillaires cérébraux. Elle représente un véritable obstacle pour les actifs qui doivent se rendre au cerveau pour y exercer un effet pharmacologique. Durant les étapes du développement du médicament, des modèles cellulaires in vitro sont utilisés pour l’évaluation de la perméabilité au cerveau des nouveaux médicaments. Le modèle assemblé avec des cellules endothéliales (CEs) isolées des capillaires des cerveaux de souris présente un intérêt particulier pour la recherche en raison de sa facilité d’obtention et sa pertinence pour le criblage des médicaments. Le but de ce projet a été de construire et de caractériser un modèle monocouche de CEs primaires de souris. En parallèle, un modèle monocouche de la lignée murine b.End3 a été investigué. L’évaluation de ces modèles a été basée sur les valeurs de TEER et de perméabilité aux marqueurs fluorescents, ainsi que sur la présence des protéines spécifiques de la BHE. La validation du modèle a été établie par la corrélation des résultats de perméabilité obtenus avec le modèle développé (in vitro) avec ceux obtenus chez la souris (in vivo). L’intégrité et l’expression des protéines spécifiques de la BHE du modèle primaire se sont montrées supérieures au modèle bEnd.3. La corrélation in vitro/in vivo du modèle primaire a abouti à un r2 = 0,765 comparé au r2 = 0,019 pour le modèle bEnd.3. Ce travail de recherche montre que le modèle primaire monocouche issu de cellules endothéliales cérébrales de souris est un modèle simple et fiable pour la prédiction de la perméabilité des actifs à travers la BHE. / The blood-brain barrier (BBB), a central nervous system structure, is found in the cerebral capillaries. It represents a major obstacle for the drugs that have to reach the brain in order to exercise their pharmacological effect. In the early stages of the drug development, in vitro cell models are used to evaluate the brain permeability of new drugs. Models assembled using primary endothelial cells (ECs) isolated from mouse brain capillaries are of particular interest for research, as for their ease of obtaining and relevance for the drug screening. Thus, the goal of this project was to build and characterize a primary mouse monolayer model. At the same time, a murine b.End3 cell line monolayer model was investigated. The evaluation of these models was based on the TEER and fluorescent marker permeability values, as well as on the presence of the BBB hallmark proteins. The model validation was established by the correlation of the permeability data obtained with the in vitro model and the data obtained in mice (in vivo). As a result, the primary mouse model showed superior monolayer integrity and higher expression of the tight junction and membrane transporter proteins when compared with the bEnd.3 cell line model. The in vitro/in vivo correlation of the primary model resulted in r2 = 0.765 compared to the bEnd.3 model with r2 = 0.019. This research work shows that the primary monolayer mouse model is a simple and reliable model for predicting the drug permeability across the BBB.