Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-04-15T12:45:36Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Emanuela Paz Rosas Final.pdf: 1301979 bytes, checksum: 812637acf4c6404700fd08c4dbcc4009 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-15T12:45:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Emanuela Paz Rosas Final.pdf: 1301979 bytes, checksum: 812637acf4c6404700fd08c4dbcc4009 (MD5) Previous issue date: 2015-08-27 / CAPEs / Os produtos finais de glicação avançada (AGEs) são compostos heterogêneos gerados a partir da reação não enzimática, irreversível, conhecida como reação de Maillard ou Glicação. Essa reação ocorre entre açúcares redutores e seus metabólitos reativos ou lipídeos oxidados e proteínas ou ácidos nucléicos. Os AGEs são formados endógena (hiperglicemia e estresse oxidativo) e exogenamente (alimentos e fumo), e podem ser acumulados em vários tecidos causando efeitos deletérios em diversas patologias relacionadas a idade e a diabetes. Uma de suas principais ações é gerar estresse oxidativo através do aumento da expressão de mediadores inflamatórios. Os macrófagos são células fundamentais no reconhecimento, degradação e remoção dessas substâncias, além disso, têm papel crucial na produção de espécies reativas de nitrogênio (RNS) na resposta imune, e podem estar envolvidos com variadas patologias. Neste estudo avaliou-se o efeito dos AGEs sobre a produção de óxido nítrico e a viabilidade celular em macrófagos. Macrófagos J774 foram incubados com diferentes concentrações de BSA- AGE (15, 30, 60, 120 ou 240μg/mL) por 24 ou 48 h e em seguida foram expostas (ou não) ao LPS (100ng/ml) por 24h. Para analisar a produção de óxido nítrico e a viabilidade celular utilizaram-se os métodos de Griess e de MTT, respectivamente. As células J774 submetidas ao tratamento com AGE apresentaram alterações nos níveis de NO e na viabilidade celular. Notou-se que os macrófagos quando incubados com AGE nas maiores concentrações (60, 120, 240μg/mL), sem LPS, produziram um aumento significativo na liberação de NO por 24 h. Também foi visto que o tratamento com AGE nas concentrações 120 e 240μg/mL, e com LPS, também elevaram os níveis de NO significativamente. Os resultados mostraram um aumento na produção de NO quando as células foram tratadas com AGE em todas as concentrações (15, 30, 60, 120 e 240μg/mL) por 48 h. A incubação de células J774 com AGE nas concentrações de 240 μg/ml por 24h com LPS, como também as concentrações de 120 e 240 μg/ml por 48h sem LPS, reduziram a viabilidade celular quando comparados com seus respectivos controles. Em conclusão, os AGEs podem causar aumento da produção de NO por macrófagos quando estes são estimulados ou não por LPS, e por consequência conduzir a morte celular. / The advanced glycation end products (AGEs) are heterogenic compounds generated from Maillard reaction or Glycation reaction. It is an irrevesible nonenzymatic reaction involving reductive sugars and reactive metabolites or oxidated lipids, proteins or nucleic acids. AGEs could be originated by endogenous way (hyperglycemia or oxidative stress) and by exogenous way (certain types of food and tobacco). They could be accumulated in several organic tissues causing deleterious effects seen in diabetes and age-related diseases. One of the main AGE effects is the induction and maintenance of stress oxidative through inflammatory mediators increasing expression. In this scenario, macrophages are fundamental cells on the recognition, degradation and clearance of AGEs. They also play an important role on immune response by stimulating reactive nitrogen species production (RNS), which could be involved on the evolution of several diseases. The present study evaluated the AGE effect on the macrophages nitric oxide production as well as the cell viability. J774 macrophages were incubated with different concentrations of BSA- AGE (15μg, 30μg, 60μg, 120μg ou 240μg/mL) by 24 or 48 hours, following a second incubation with or without LPS (100ng/mL) by 24 hours. Nitric oxide production was evaluated by Griess reaction and cell viability by MTT production. Macrophages incubated with AGE presented nitric oxide and cell viability alterations. It was noted that macrophages when incubated with AGE in higher concentrations (60, 120, 240μg/mL) without LPS produced a significant increase in the release of NO for 24 h. It has also been seen that treatment with AGE concentrations 120 and 240μg/mL and stimulation by LPS have also increased NO levels significantly. The results showed an increase in NO production when cells were treated with AGE at all concentrations (15, 30, 60, 120 and 240μg/ mL) for 48 h. The incubation J774 cells with AGE at concentrations of 240 μg/ mL for 24 hours with LPS, as well as the concentrations of 120 and 240 μg/ mL for 48h without LPS, reduced the cell viability compared to their respective controls. In conclusion, AGEs can cause increased production of NO by macrophages when these are stimulated or not with LPS, leading to cell death.

INTRODUÇÃO: Produtos de glicação avançada (AGE) encontram-se aumentados no diabete melito e contribuem independentemente para o risco cardiovascular. O reconhecimento dos AGE pelo receptor para produtos de glicação avançada (RAGE) potencializa vias de sinalização pró-aterogênicas. Antagonistas do receptor de angiotensina II (ANGII) do tipo 1 (AT-1) diminuem a expressão de RAGE em área de lesão aterosclerótica. No presente projeto, avaliou-se, na aorta de camundongos dislipidêmicos (knockout para apoE) tratados ou não com inibidor do receptor AT-1 (losartana, LOS), o efeito do tratamento crônico com albumina-AGE sobre o infiltrado de lípides, a expressão de mRNA e proteínas envolvidas no eixo AGE/RAGE, ANGII/AT-1, modulação da resposta inflamatória e fluxo de lípides, além da secreção de citocinas inflamatórias por macrófagos tratados com albumina controle ou AGE, concomitantemente ou não a losartana, isolados da cavidade peritoneal de camundongos apoE knockout. MÉTODOS: Camundongos machos knockout para apoE de 12 semanas de idade foram mantidos em dieta padrão e divididos, aleatoriamente, em quatro grupos experimentais (n = 20/grupo): grupo Controle (C), C+LOS, albumina-AGE (AGE) e AGE+LOS. Os animais receberam injeção intraperitoneal diária, durante 30 dias, de 2 mg de albumina controle (grupos C e C+LOS) ou albumina AGE (AGE e AGE+LOS). Os animais C+LOS e AGE+LOS foram tratados durante todo o período experimental com losartana (100 mg/L água). Secções do arco aórtico foram utilizadas para imunofluorescência para RAGE, carboximetil-lisina (CML), AT-1 e 4-hidroxinonenal (4-HNE) e determinação infiltrado lipídico por coloração com Oil Red-O. Análise do mRNA de Ager (RAGE), Agtr1a (AT-1), Orl1 (LOX-1), Msr1 (MCP-1), Ccl2 (SR-A), Cybb (Nox2), Nfkb (NF-kB), Tnf (TNF-alfa), Abca1 (ABCA-1), Abcg1 (ABCG-1) e Agt (angiotensinogênio) foi realizada por de qRT-PCR. Ensaio in vitro para secreção de IL-6 por ELISA e expressão de Il1b (IL-1beta) e Il18 (IL-18) por alfaRT-PCR, foi realizado com macrófagos peritoneais isolados camundongos apoE knockout incubados com albumina C ou AGE (2 mg/mL), concomitante ou não ao tratamento com losartana (1 uM). RESULTADOS: Não houve diferença entre os grupos em relação ao peso corporal, colesterol total, triglicérides e glicose plasmáticos, no período basal e final. A pressão arterial sistólica foi reduzida nos animais tratados com losartana quando comparados aos não tratados (p < 0,05). Não foi detectada a presença de infiltrado macrofágico na aorta por meio de ensaios de imunofluorescência para CD-68 e pela análise de coloração com hematoxilina-eosina. Todavia, o infiltrado de lípides foi 5,3 e 2 vezes maior no grupo AGE quando comparado, respectivamente, ao grupo C e AGE+LOS (p < 0,05). O conteúdo proteico de RAGE e CML, assim como do marcador de peroxidação lipídica (4-HNE) foi maior no grupo AGE em comparação aos demais grupos, o que não prevenido no grupo AGE+LOS (p < 0,05). A expressão do mRNA de Ager, Orl1 e Tnf foi maior no grupo AGE em comparação ao C, ao passo que o tratamento com losartana impediu o aumento da expressão destes genes (p < 0,05). Isto não foi observado para aumento de Cybb estimulado por albumina-AGE. A losartana diminuiu o mRNA de Agtr1a (AT-1) em ambos os grupos tratados. Não foram observadas diferenças na expressão do mRNA de Msr1, Ccl2, Abca1, Abcg1, Agt e Nfkb. Macrófagos tratados com albumina-AGE apresentaram secreção de IL-6 aumentada em 1,4 vezes em comparação ao grupo C, o que foi prevenido pela losartana (p < 0,05). Nestas mesmas células, a albumina-AGE aumentou a expressão de Il1b e Il18, em comparação à albumina-C, o que não foi prevenido pela losartana. CONCLUSÃO: A administração crônica de albumina-AGE em modelo animal de dislipidemia isento de DM, aumentou o infiltrado de lípides no aorco aórtico, independentemente de variação na pressão arterial, lípides plasmáticos e da modulação local de componentes do sistema renina-angiotensina. A ação da albumina-AGE foi consequente ao maior insulto oxidativo e inflamatório associado ao maior conteúdo de RAGE e CML. A losartana, por reduzir o insulto oxidativo e inflamatório contrapõe-se à albumina-AGE, contribuindo para prevenção da aterogênese / INTRODUCTION: Advanced glycated end-products (AGE) elevated in diabetes mellitus and independently contribute to cardiovascular risk. The AGE binding to the receptor for AGE (RAGE) potentializes pro-atherogenic signaling pathways. Antagonists of angiotensin II receptor type 1 (AT-1) diminish RAGE expression in atherosclerotic plaques. In this study, we evaluated in the aortic arch of dyslipidemic mice (apoE knockout), treated or not with AT-1 blocker losartan (LOS), the effect of chronic treatment with AGE-albumin in aortic root lipid infiltration, mRNA expression and protein content of components of AGE/RAGE, ANGII/AT-1 axes and modulators of lipid flux and inflammation, and also the secretion of inflammatory cytokines by peritoneal macrophages treated either with control (C) or AGE-albumin, together with or not by losartan treatment,. METHODS: 12-week old male apoE knockout mice were fed chow diet and ramdomly assigned into four groups (n = 20/group): Control (C), C+LOS, AGE-albumin (AGE) and AGE+LOS. Animals received daily intraperitoneal injection of 2 mg of C- albumin (C and C+LOS) or AGE-albumin (AGE and AGE+LOS) during 30 days. LOS groups were treated with losartan (100 mg/L water). Immufluorescence for RAGE, AT-1, carboxymethyllysine (CML) and 4-hydroxynonenal (4-HNE), and Oil red-O staining for lipid infiltration was performed in sections from the aortic arch. mRNA expression of Ager (RAGE), Agtr1a (AT-1), Orl1 (LOX-1), Msr1 (MCP-1), Ccl2 (SR-A), Cybb (Nox2), Nfkb (NF-kB), Tnf (TNF-alfa), Abca1 (ABCA-1), Abcg1 (ABCG-1) e Agt (angiotensinogen) was evaluated by qRT-PCR. In vitro assay for IL-6 secretion was performed by ELISA and Il1b (IL-1beta) and Il18 (IL-18) mRNA expression was performed by qRT-PCR in peritoneal macrophages from of apoE knockout mice after treatment with C or AGE-albumin (2 mg/mL), with or without losartan (1 ?M). RESULTS: No differences among groups were observed in body weight, plasma total cholesterol, triglycerides and glucose in basal and final periods. Sistolic blood pressure was reduced in both LOS groups when compared to non-treated groups (p < 0.05). It was not observed CD-68 infiltration in the arterial wall. However, lipid infiltration was, respectively, 5.3 and 2 times greater in AGE group in comparison to C and AGE+LOS groups (p < 0.05). RAGE and CML protein and the lipid peroxidation marker (4-HNE) were greater in AGE group when compared to other groups, which was prevented in AGE+LOS (p < 0.05). Ager, Orl1 and Tnf mRNA expression was increased in AGE group when compared to C, and losartan was able to prevent this event (p < 0.05), except for Cybb. Losartan decreased Agtr1a mRNA expression in both groups (p < 0.05). No differences were observed among groups for Msr1, Ccl2, Abca1, Abcg1, Agt and Nfkb mRNA expression. Macrophages treated with AGE-albumin presented 1.4 times great IL-6 secretion, which was prevented by losartan (p < 0.05). In these cells, AGE-albumin increased Il1b and Il18 mRNA expression in AGE group, but this was not prevent by losartan. CONCLUSION: Chronic administration of AGE-albumin in non diabetic dyslipidemic mice increased aortic lipid infiltration, independently of changes in blood pressutre, plasma lipids and local modulation of renin angiotensin system components. The role of AGE-albumin was consequent to the enhanced inflammatory and oxidative insult associated to the higher content of CML and RAGE. Losartan by reducing oxidation and inflammation counteracts the effects of AGE-albumin contributing to prevent atherogenesis

No diabete melito, produtos de glicação avançada (AGE) reduzem o efluxo de colesterol celular o que agrava o desenvolvimento da aterosclerose. Neste estudo, investigou-se o papel da albumina modificada por glicação avançada (albumina-AGE) sobre a sensibilização de macrófagos à resposta inflamatória e o impacto da secreção de citocinas, quimocinas e moléculas de adesão sobre o efluxo de colesterol mediado por apolipoproteína A-I e subfrações de HDL. Além disso, determinou-se a capacidade da HDL em modular a resposta inflamatória em macrófagos tratados com albumina-AGE. Macrófagos de peritônio de camundongo foram tratados com ou sem sobrecarga de colesterol, na presença de 2 mg/mL de albumina-controle (albumina-C) ou albumina-AGE, por 72 h, seguindo-se de incubação, por 24 h, com calgranulina S100B (20 g/mL) ou lipopolissacarídeo (LPS; 1 g/mL). Em comparação com albumina-C, a albumina-AGE, isenta em endotoxinas, isoladamente não alterou a secreção de citocinas em macrófagos. No entanto, a albumina-AGE sensibilizou macrófagos não enriquecidos em colesterol a uma maior secreção de interleucina 6 (IL-6), fator de necrose tumoral alfa (TNF-), proteína quimoatraente de monócitos 1 (MCP-1), interlucina 1 beta (IL-1) e molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1) após estimulação com S100B ou LPS, o que foi potencializado pela sobrecarga de colesterol celular. Em macrófagos não estimulados, o meio condicionado, advindo das incubações de células com albumina-AGE e S100B (meio enriquecido em citocinas), reduziu o efluxo de 14C-colesterol mediado por apoA-I, HDL2 e HDL3 em, respectivamente, 23%, 43% e 20%, em comparação com células incubadas com meio isolado do tratamento com albumina-C e S100B. De forma similar, o efluxo de 14C-colesterol mediado por apoA-I, HDL2 e HDL3 foi reduzido em macrófagos tratados com meio advindo de incubações com albumina-AGE e LPS, respectivamente, 37%, 47% e 8,5% em comparação ao tratamento com albumina-C e LPS. Em macrófagos tratados com albumina-C e S100B, a incubação prévia com HDL reduziu a secreção de IL-6, TNF-, MCP-1 e VCAM-1 em, respectivamente, 72%, 57%, 50% e 41% quando comparada à incubação na ausência de HDL. Em incubações com albumina-C, a secreção de IL-6, TNF-, MCP-1, IL-1 e VCAM-1 induzida por LPS foi respectivamente, 58%, 54%, 42%, 74% e 45% menor mediante incubação com HDL, em comparação a incubações similares, porém na ausência desta lipoproteína. Por outro lado, em macrófagos tratados com albumina-AGE e S100B, a HDL não foi capaz de reduzir a secreção de TNF-, IL-1 e VCAM-1 e aumentou a secreção de IL-6 (54%) e MCP-1 (20%). Nas células tratadas com albumina-AGE e LPS, a HDL também não reduziu a secreção de TNF-, MCP-1 e IL-1 e aumentou a secreção de IL-6 (16%) e VCAM-1 (20%). Redução na secreção de mediadores inflamatórios foi observada em macrófagos tratados com albumina-AGE apenas quando a HDL foi incubada juntamente com S100B ou LPS. Em conclusão, a albumina-AGE sensibiliza macrófagos à resposta inflamatória induzida por calgranulina S100B e LPS, prejudicando o transporte reverso de colesterol de macrófagos. Além disso, a albumina-AGE reduz as propriedades anti-inflamatórias da HDL, o que pode agravar a aterosclerose no diabete melito / In diabetes mellitus, advanced glycation end products (AGE) reduces the cholesterol efflux from cells, which aggravates the development of atherosclerosis. In this study, we investigated the role of advanced glycated albumin (AGE-albumin) on macrophage inflammatory response and the impact of cytokines, chemokines and adhesion molecules secretion on cholesterol efflux mediated by apolipoprotein A-I (apoA-I) and HDL subfractions. Furthermore, the HDL ability in modulating inflammatory response in macrophages treated with AGE-albumin was also determined. Mouse peritoneal macrophages previously enriched or not with cholesterol were treated in the presence of 2 mg/mL of control-albumin (C-albumin) or AGE-albumin, for 72 h, followed by incubation, for 24 h, with S100B calgranulin (20 g/mL) or lipopolysaccharide (LPS; 1 g/mL). In comparison to free endotoxin-C-albumin, AGE-albumin, by itself did not alter cytokine secretion by macrophages. However, AGE-albumin primed non-cholesterol enriched macrophages to a higher secretion of interleukin -6 (IL-6), tumor necrosis factor alpha (TNF-), monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1), interleukin 1 beta (IL-1) and vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) after stimulation with S100B or LPS, which was potentiated by cell cholesterol overload. In non-stimulated macrophages, conditioned medium, derived from incubation with AGE-albumin and S100B (cytokine enriched-medium), reduced the 14C-cholesterol efflux mediated by apoA-I, HDL2 and HDL3 in, respectively, 23%, 43% and 20%, in comparison to cells incubated with conditioned medium isolated from treatment with C-albumin and S100B. Similarly, 14C-cholesterol efflux mediated by apoA-I, HDL2 and HDL3 was reduced in macrophages treated with medium derived from incubation with AGE-albumin and LPS, respectively, 37%, 47% and 8,5% in comparison to treatment with C-albumin and LPS. In macrophages treated with C-albumin and S100B, previous incubation with HDL reduced the secretion of IL-6, TNF-, MCP-1 and VCAM-1 in, respectively 72%, 57%, 50% and 41% in comparison to incubation in the absence of HDL. In incubations with C-albumin, the secretion of IL-6, TNF-, MCP-1, IL-1 and VCAM-1 induced by LPS was respectively, 58%, 54%, 42%, 74% and 45% lower in cells treated with HDL in comparison to similar incubations in the absence of this lipoprotein. On the other hand, in macrophages treated with AGE-albumin and S100B, HDL was unable to reduce the TNF-, IL-1 and VCAM-1 secretion and increased the secretion of IL-6 (54%) and MCP-1 (20%). In cells treated with AGE-albumin and LPS, HDL was unable to reduce the secretion of TNF-, MCP-1 and IL-1 and increased IL-6 (16%) and VCAM-1 (20%). Reduction in inflammatory mediators was observed in macrophages treated with AGE-albumin only when HDL was incubated simultaneously with S100B or LPS. In conclusion, AGE-albumin primes macrophages to an inflammatory response elicited by S100B calgranulin and LPS, impairing macrophage reverse cholesterol transport. Moreover, AGE-albumin impairs the HDL anti-inflammatory properties, which can aggravate the atherosclerosis in diabetes mellitus

Produtos de glicação avançada (AGE) alteram o metabolismo de lípides e, em especial, o efluxo de colesterol de macrófagos, por meio da redução dos receptores ABCA-1 e ABCG-1. Isto prejudica o transporte reverso de colesterol, sistema que favorece o fluxo de colesterol de macrófagos arteriais ao fígado, permitindo sua excreção na bile e eliminação fecal. Óxidos de colesterol modulam favoravelmente a homeostase lipídica em macrófagos e favorecem o transporte reverso de colesterol, embora o acúmulo de 7-cetocolesterol, 7-hidroxicolesterol e 7-hidroxicolesterol associe-se à aterogênese e morte celular. Neste estudo, avaliou-se o efeito do tratamento com glicolaldeído (GAD; oxoaldeído que induz rápida geração intracelular de AGE), em macrófagos sobrecarregados com LDL oxidada e incubados com HDL ou HDL e indutor de LXR (T0901317) sobre: 1) a distribuição seletiva de óxidos de colesterol e o conteúdo total de esteróis intracelulares e 2) o conteúdo de ABCA-1 e ABCG-1. Colesterol total e os diversos subtipos de óxidos de colesterol foram determinados por cromatografia a gás acoplada à espectrômetro de massa. O conteúdo dos receptores de HDL (ABCA-1 e ABCG-1) foi avaliado por imunoblot. Em macrófagos controles (C), a adição de HDL ou HDL + T0901317 promoveu redução no conteúdo de esteróis totais (colesterol + óxidos de colesterol), colesterol e 7-cetocolesterol. No entanto, isto não foi observado em macrófagos GAD. Nas diversas condições experimentais, não houve diferença no conteúdo intracelular dos outros subtipos de óxidos de colesterol, em células C e GAD. Macrófagos GAD apresentaram menor conteúdo de ABCA-1 (45%), quando comparados aos macrófagos C, mesmo após adição de HDL ou HDL + T0901317. O conteúdo de ABCG-1 foi 36,6% menor em macrófagos GAD, na presença de HDL, em comparação às células C. Em conclusão, em macrófagos sobrecarregados com LDL oxidada, o tratamento com glicolaldeído diminui a exportação celular de colesterol e 7-cetocolesterol, mediada pela HDL. Isto é decorrente do menor conteúdo dos receptores ABCA-1 e ABCG-1 em macrófagos tratados com glicolaldeído, e pode contribuir para o desenvolvimento de aterosclerose no diabete melito / Advanced glycation end products (AGE) alter lipid metabolism and reduce the macrophage expression of ABCA-1 and ABCG-1 which impairs the reverse cholesterol transport, a system that drives cholesterol from arterial wall macrophages to the liver, allowing its excretion into the bile and feces. Oxysterols favors lipid homeostasis in macrophages and drive the reverse cholesterol transport, although the accumulation of 7-ketocholesterol, 7- hydroxycholesterol and 7- hydroxycholesterol is related to atherogenesis and cell death. We evaluated the effect of glycolaldehyde treatment (GAD; oxoaldehyde that induces a fast formation of intracellular AGE) in macrophages overloaded with oxidized LDL and incubated with HDL alone or HDL plus LXR agonist (T0901317) in: 1) the intracellular content of oxysterols and total sterols and 2) the contents of ABCA-1 and ABCG-1. Total cholesterol and oxysterol subspecies were determined by gas chromatography/mass spectrometry and HDL receptors content by immunoblot. In control macrophages (C), incubation with HDL or HDL + T0901317 reduced the intracellular content of total sterols (total cholesterol + oxysterols), cholesterol and 7-ketocholesterol, which was not observed in GAD macrophages. In all experimental conditions no changes were found in the intracellular content of other oxysterol subspecies comparing C and GAD macrophages. GAD macrophages presented a 45% reduction in ABCA-1 protein level as compared to C cells, even after the addition of HDL or HDL + T0901317. The content of ABCG-1 was 36.6% reduced in GAD macrophages in the presence of HDL as compared to C macrophages. In conclusion, in macrophages overloaded with oxidized LDL, glycolaldehyde treatment reduces the HDL-mediated cholesterol and 7-ketocholesterol efflux which is ascribed to the reduction in ABCA-1 and ABCG-1 protein level. This may contribute to atherosclerosis in diabetes mellitus

INTRODUÇÃO: Produtos de glicação avançada (AGE) encontram-se aumentados no diabete melito e contribuem independentemente para o risco cardiovascular. O reconhecimento dos AGE pelo receptor para produtos de glicação avançada (RAGE) potencializa vias de sinalização pró-aterogênicas. Antagonistas do receptor de angiotensina II (ANGII) do tipo 1 (AT-1) diminuem a expressão de RAGE em área de lesão aterosclerótica. No presente projeto, avaliou-se, na aorta de camundongos dislipidêmicos (knockout para apoE) tratados ou não com inibidor do receptor AT-1 (losartana, LOS), o efeito do tratamento crônico com albumina-AGE sobre o infiltrado de lípides, a expressão de mRNA e proteínas envolvidas no eixo AGE/RAGE, ANGII/AT-1, modulação da resposta inflamatória e fluxo de lípides, além da secreção de citocinas inflamatórias por macrófagos tratados com albumina controle ou AGE, concomitantemente ou não a losartana, isolados da cavidade peritoneal de camundongos apoE knockout. MÉTODOS: Camundongos machos knockout para apoE de 12 semanas de idade foram mantidos em dieta padrão e divididos, aleatoriamente, em quatro grupos experimentais (n = 20/grupo): grupo Controle (C), C+LOS, albumina-AGE (AGE) e AGE+LOS. Os animais receberam injeção intraperitoneal diária, durante 30 dias, de 2 mg de albumina controle (grupos C e C+LOS) ou albumina AGE (AGE e AGE+LOS). Os animais C+LOS e AGE+LOS foram tratados durante todo o período experimental com losartana (100 mg/L água). Secções do arco aórtico foram utilizadas para imunofluorescência para RAGE, carboximetil-lisina (CML), AT-1 e 4-hidroxinonenal (4-HNE) e determinação infiltrado lipídico por coloração com Oil Red-O. Análise do mRNA de Ager (RAGE), Agtr1a (AT-1), Orl1 (LOX-1), Msr1 (MCP-1), Ccl2 (SR-A), Cybb (Nox2), Nfkb (NF-kB), Tnf (TNF-alfa), Abca1 (ABCA-1), Abcg1 (ABCG-1) e Agt (angiotensinogênio) foi realizada por de qRT-PCR. Ensaio in vitro para secreção de IL-6 por ELISA e expressão de Il1b (IL-1beta) e Il18 (IL-18) por alfaRT-PCR, foi realizado com macrófagos peritoneais isolados camundongos apoE knockout incubados com albumina C ou AGE (2 mg/mL), concomitante ou não ao tratamento com losartana (1 uM). RESULTADOS: Não houve diferença entre os grupos em relação ao peso corporal, colesterol total, triglicérides e glicose plasmáticos, no período basal e final. A pressão arterial sistólica foi reduzida nos animais tratados com losartana quando comparados aos não tratados (p < 0,05). Não foi detectada a presença de infiltrado macrofágico na aorta por meio de ensaios de imunofluorescência para CD-68 e pela análise de coloração com hematoxilina-eosina. Todavia, o infiltrado de lípides foi 5,3 e 2 vezes maior no grupo AGE quando comparado, respectivamente, ao grupo C e AGE+LOS (p < 0,05). O conteúdo proteico de RAGE e CML, assim como do marcador de peroxidação lipídica (4-HNE) foi maior no grupo AGE em comparação aos demais grupos, o que não prevenido no grupo AGE+LOS (p < 0,05). A expressão do mRNA de Ager, Orl1 e Tnf foi maior no grupo AGE em comparação ao C, ao passo que o tratamento com losartana impediu o aumento da expressão destes genes (p < 0,05). Isto não foi observado para aumento de Cybb estimulado por albumina-AGE. A losartana diminuiu o mRNA de Agtr1a (AT-1) em ambos os grupos tratados. Não foram observadas diferenças na expressão do mRNA de Msr1, Ccl2, Abca1, Abcg1, Agt e Nfkb. Macrófagos tratados com albumina-AGE apresentaram secreção de IL-6 aumentada em 1,4 vezes em comparação ao grupo C, o que foi prevenido pela losartana (p < 0,05). Nestas mesmas células, a albumina-AGE aumentou a expressão de Il1b e Il18, em comparação à albumina-C, o que não foi prevenido pela losartana. CONCLUSÃO: A administração crônica de albumina-AGE em modelo animal de dislipidemia isento de DM, aumentou o infiltrado de lípides no aorco aórtico, independentemente de variação na pressão arterial, lípides plasmáticos e da modulação local de componentes do sistema renina-angiotensina. A ação da albumina-AGE foi consequente ao maior insulto oxidativo e inflamatório associado ao maior conteúdo de RAGE e CML. A losartana, por reduzir o insulto oxidativo e inflamatório contrapõe-se à albumina-AGE, contribuindo para prevenção da aterogênese / INTRODUCTION: Advanced glycated end-products (AGE) elevated in diabetes mellitus and independently contribute to cardiovascular risk. The AGE binding to the receptor for AGE (RAGE) potentializes pro-atherogenic signaling pathways. Antagonists of angiotensin II receptor type 1 (AT-1) diminish RAGE expression in atherosclerotic plaques. In this study, we evaluated in the aortic arch of dyslipidemic mice (apoE knockout), treated or not with AT-1 blocker losartan (LOS), the effect of chronic treatment with AGE-albumin in aortic root lipid infiltration, mRNA expression and protein content of components of AGE/RAGE, ANGII/AT-1 axes and modulators of lipid flux and inflammation, and also the secretion of inflammatory cytokines by peritoneal macrophages treated either with control (C) or AGE-albumin, together with or not by losartan treatment,. METHODS: 12-week old male apoE knockout mice were fed chow diet and ramdomly assigned into four groups (n = 20/group): Control (C), C+LOS, AGE-albumin (AGE) and AGE+LOS. Animals received daily intraperitoneal injection of 2 mg of C- albumin (C and C+LOS) or AGE-albumin (AGE and AGE+LOS) during 30 days. LOS groups were treated with losartan (100 mg/L water). Immufluorescence for RAGE, AT-1, carboxymethyllysine (CML) and 4-hydroxynonenal (4-HNE), and Oil red-O staining for lipid infiltration was performed in sections from the aortic arch. mRNA expression of Ager (RAGE), Agtr1a (AT-1), Orl1 (LOX-1), Msr1 (MCP-1), Ccl2 (SR-A), Cybb (Nox2), Nfkb (NF-kB), Tnf (TNF-alfa), Abca1 (ABCA-1), Abcg1 (ABCG-1) e Agt (angiotensinogen) was evaluated by qRT-PCR. In vitro assay for IL-6 secretion was performed by ELISA and Il1b (IL-1beta) and Il18 (IL-18) mRNA expression was performed by qRT-PCR in peritoneal macrophages from of apoE knockout mice after treatment with C or AGE-albumin (2 mg/mL), with or without losartan (1 ?M). RESULTS: No differences among groups were observed in body weight, plasma total cholesterol, triglycerides and glucose in basal and final periods. Sistolic blood pressure was reduced in both LOS groups when compared to non-treated groups (p < 0.05). It was not observed CD-68 infiltration in the arterial wall. However, lipid infiltration was, respectively, 5.3 and 2 times greater in AGE group in comparison to C and AGE+LOS groups (p < 0.05). RAGE and CML protein and the lipid peroxidation marker (4-HNE) were greater in AGE group when compared to other groups, which was prevented in AGE+LOS (p < 0.05). Ager, Orl1 and Tnf mRNA expression was increased in AGE group when compared to C, and losartan was able to prevent this event (p < 0.05), except for Cybb. Losartan decreased Agtr1a mRNA expression in both groups (p < 0.05). No differences were observed among groups for Msr1, Ccl2, Abca1, Abcg1, Agt and Nfkb mRNA expression. Macrophages treated with AGE-albumin presented 1.4 times great IL-6 secretion, which was prevented by losartan (p < 0.05). In these cells, AGE-albumin increased Il1b and Il18 mRNA expression in AGE group, but this was not prevent by losartan. CONCLUSION: Chronic administration of AGE-albumin in non diabetic dyslipidemic mice increased aortic lipid infiltration, independently of changes in blood pressutre, plasma lipids and local modulation of renin angiotensin system components. The role of AGE-albumin was consequent to the enhanced inflammatory and oxidative insult associated to the higher content of CML and RAGE. Losartan by reducing oxidation and inflammation counteracts the effects of AGE-albumin contributing to prevent atherogenesis

No diabete melito, produtos de glicação avançada (AGE) reduzem o efluxo de colesterol celular o que agrava o desenvolvimento da aterosclerose. Neste estudo, investigou-se o papel da albumina modificada por glicação avançada (albumina-AGE) sobre a sensibilização de macrófagos à resposta inflamatória e o impacto da secreção de citocinas, quimocinas e moléculas de adesão sobre o efluxo de colesterol mediado por apolipoproteína A-I e subfrações de HDL. Além disso, determinou-se a capacidade da HDL em modular a resposta inflamatória em macrófagos tratados com albumina-AGE. Macrófagos de peritônio de camundongo foram tratados com ou sem sobrecarga de colesterol, na presença de 2 mg/mL de albumina-controle (albumina-C) ou albumina-AGE, por 72 h, seguindo-se de incubação, por 24 h, com calgranulina S100B (20 g/mL) ou lipopolissacarídeo (LPS; 1 g/mL). Em comparação com albumina-C, a albumina-AGE, isenta em endotoxinas, isoladamente não alterou a secreção de citocinas em macrófagos. No entanto, a albumina-AGE sensibilizou macrófagos não enriquecidos em colesterol a uma maior secreção de interleucina 6 (IL-6), fator de necrose tumoral alfa (TNF-), proteína quimoatraente de monócitos 1 (MCP-1), interlucina 1 beta (IL-1) e molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1) após estimulação com S100B ou LPS, o que foi potencializado pela sobrecarga de colesterol celular. Em macrófagos não estimulados, o meio condicionado, advindo das incubações de células com albumina-AGE e S100B (meio enriquecido em citocinas), reduziu o efluxo de 14C-colesterol mediado por apoA-I, HDL2 e HDL3 em, respectivamente, 23%, 43% e 20%, em comparação com células incubadas com meio isolado do tratamento com albumina-C e S100B. De forma similar, o efluxo de 14C-colesterol mediado por apoA-I, HDL2 e HDL3 foi reduzido em macrófagos tratados com meio advindo de incubações com albumina-AGE e LPS, respectivamente, 37%, 47% e 8,5% em comparação ao tratamento com albumina-C e LPS. Em macrófagos tratados com albumina-C e S100B, a incubação prévia com HDL reduziu a secreção de IL-6, TNF-, MCP-1 e VCAM-1 em, respectivamente, 72%, 57%, 50% e 41% quando comparada à incubação na ausência de HDL. Em incubações com albumina-C, a secreção de IL-6, TNF-, MCP-1, IL-1 e VCAM-1 induzida por LPS foi respectivamente, 58%, 54%, 42%, 74% e 45% menor mediante incubação com HDL, em comparação a incubações similares, porém na ausência desta lipoproteína. Por outro lado, em macrófagos tratados com albumina-AGE e S100B, a HDL não foi capaz de reduzir a secreção de TNF-, IL-1 e VCAM-1 e aumentou a secreção de IL-6 (54%) e MCP-1 (20%). Nas células tratadas com albumina-AGE e LPS, a HDL também não reduziu a secreção de TNF-, MCP-1 e IL-1 e aumentou a secreção de IL-6 (16%) e VCAM-1 (20%). Redução na secreção de mediadores inflamatórios foi observada em macrófagos tratados com albumina-AGE apenas quando a HDL foi incubada juntamente com S100B ou LPS. Em conclusão, a albumina-AGE sensibiliza macrófagos à resposta inflamatória induzida por calgranulina S100B e LPS, prejudicando o transporte reverso de colesterol de macrófagos. Além disso, a albumina-AGE reduz as propriedades anti-inflamatórias da HDL, o que pode agravar a aterosclerose no diabete melito / In diabetes mellitus, advanced glycation end products (AGE) reduces the cholesterol efflux from cells, which aggravates the development of atherosclerosis. In this study, we investigated the role of advanced glycated albumin (AGE-albumin) on macrophage inflammatory response and the impact of cytokines, chemokines and adhesion molecules secretion on cholesterol efflux mediated by apolipoprotein A-I (apoA-I) and HDL subfractions. Furthermore, the HDL ability in modulating inflammatory response in macrophages treated with AGE-albumin was also determined. Mouse peritoneal macrophages previously enriched or not with cholesterol were treated in the presence of 2 mg/mL of control-albumin (C-albumin) or AGE-albumin, for 72 h, followed by incubation, for 24 h, with S100B calgranulin (20 g/mL) or lipopolysaccharide (LPS; 1 g/mL). In comparison to free endotoxin-C-albumin, AGE-albumin, by itself did not alter cytokine secretion by macrophages. However, AGE-albumin primed non-cholesterol enriched macrophages to a higher secretion of interleukin -6 (IL-6), tumor necrosis factor alpha (TNF-), monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1), interleukin 1 beta (IL-1) and vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) after stimulation with S100B or LPS, which was potentiated by cell cholesterol overload. In non-stimulated macrophages, conditioned medium, derived from incubation with AGE-albumin and S100B (cytokine enriched-medium), reduced the 14C-cholesterol efflux mediated by apoA-I, HDL2 and HDL3 in, respectively, 23%, 43% and 20%, in comparison to cells incubated with conditioned medium isolated from treatment with C-albumin and S100B. Similarly, 14C-cholesterol efflux mediated by apoA-I, HDL2 and HDL3 was reduced in macrophages treated with medium derived from incubation with AGE-albumin and LPS, respectively, 37%, 47% and 8,5% in comparison to treatment with C-albumin and LPS. In macrophages treated with C-albumin and S100B, previous incubation with HDL reduced the secretion of IL-6, TNF-, MCP-1 and VCAM-1 in, respectively 72%, 57%, 50% and 41% in comparison to incubation in the absence of HDL. In incubations with C-albumin, the secretion of IL-6, TNF-, MCP-1, IL-1 and VCAM-1 induced by LPS was respectively, 58%, 54%, 42%, 74% and 45% lower in cells treated with HDL in comparison to similar incubations in the absence of this lipoprotein. On the other hand, in macrophages treated with AGE-albumin and S100B, HDL was unable to reduce the TNF-, IL-1 and VCAM-1 secretion and increased the secretion of IL-6 (54%) and MCP-1 (20%). In cells treated with AGE-albumin and LPS, HDL was unable to reduce the secretion of TNF-, MCP-1 and IL-1 and increased IL-6 (16%) and VCAM-1 (20%). Reduction in inflammatory mediators was observed in macrophages treated with AGE-albumin only when HDL was incubated simultaneously with S100B or LPS. In conclusion, AGE-albumin primes macrophages to an inflammatory response elicited by S100B calgranulin and LPS, impairing macrophage reverse cholesterol transport. Moreover, AGE-albumin impairs the HDL anti-inflammatory properties, which can aggravate the atherosclerosis in diabetes mellitus

Produtos de glicação avançada (AGE) alteram o metabolismo de lípides e, em especial, o efluxo de colesterol de macrófagos, por meio da redução dos receptores ABCA-1 e ABCG-1. Isto prejudica o transporte reverso de colesterol, sistema que favorece o fluxo de colesterol de macrófagos arteriais ao fígado, permitindo sua excreção na bile e eliminação fecal. Óxidos de colesterol modulam favoravelmente a homeostase lipídica em macrófagos e favorecem o transporte reverso de colesterol, embora o acúmulo de 7-cetocolesterol, 7-hidroxicolesterol e 7-hidroxicolesterol associe-se à aterogênese e morte celular. Neste estudo, avaliou-se o efeito do tratamento com glicolaldeído (GAD; oxoaldeído que induz rápida geração intracelular de AGE), em macrófagos sobrecarregados com LDL oxidada e incubados com HDL ou HDL e indutor de LXR (T0901317) sobre: 1) a distribuição seletiva de óxidos de colesterol e o conteúdo total de esteróis intracelulares e 2) o conteúdo de ABCA-1 e ABCG-1. Colesterol total e os diversos subtipos de óxidos de colesterol foram determinados por cromatografia a gás acoplada à espectrômetro de massa. O conteúdo dos receptores de HDL (ABCA-1 e ABCG-1) foi avaliado por imunoblot. Em macrófagos controles (C), a adição de HDL ou HDL + T0901317 promoveu redução no conteúdo de esteróis totais (colesterol + óxidos de colesterol), colesterol e 7-cetocolesterol. No entanto, isto não foi observado em macrófagos GAD. Nas diversas condições experimentais, não houve diferença no conteúdo intracelular dos outros subtipos de óxidos de colesterol, em células C e GAD. Macrófagos GAD apresentaram menor conteúdo de ABCA-1 (45%), quando comparados aos macrófagos C, mesmo após adição de HDL ou HDL + T0901317. O conteúdo de ABCG-1 foi 36,6% menor em macrófagos GAD, na presença de HDL, em comparação às células C. Em conclusão, em macrófagos sobrecarregados com LDL oxidada, o tratamento com glicolaldeído diminui a exportação celular de colesterol e 7-cetocolesterol, mediada pela HDL. Isto é decorrente do menor conteúdo dos receptores ABCA-1 e ABCG-1 em macrófagos tratados com glicolaldeído, e pode contribuir para o desenvolvimento de aterosclerose no diabete melito / Advanced glycation end products (AGE) alter lipid metabolism and reduce the macrophage expression of ABCA-1 and ABCG-1 which impairs the reverse cholesterol transport, a system that drives cholesterol from arterial wall macrophages to the liver, allowing its excretion into the bile and feces. Oxysterols favors lipid homeostasis in macrophages and drive the reverse cholesterol transport, although the accumulation of 7-ketocholesterol, 7- hydroxycholesterol and 7- hydroxycholesterol is related to atherogenesis and cell death. We evaluated the effect of glycolaldehyde treatment (GAD; oxoaldehyde that induces a fast formation of intracellular AGE) in macrophages overloaded with oxidized LDL and incubated with HDL alone or HDL plus LXR agonist (T0901317) in: 1) the intracellular content of oxysterols and total sterols and 2) the contents of ABCA-1 and ABCG-1. Total cholesterol and oxysterol subspecies were determined by gas chromatography/mass spectrometry and HDL receptors content by immunoblot. In control macrophages (C), incubation with HDL or HDL + T0901317 reduced the intracellular content of total sterols (total cholesterol + oxysterols), cholesterol and 7-ketocholesterol, which was not observed in GAD macrophages. In all experimental conditions no changes were found in the intracellular content of other oxysterol subspecies comparing C and GAD macrophages. GAD macrophages presented a 45% reduction in ABCA-1 protein level as compared to C cells, even after the addition of HDL or HDL + T0901317. The content of ABCG-1 was 36.6% reduced in GAD macrophages in the presence of HDL as compared to C macrophages. In conclusion, in macrophages overloaded with oxidized LDL, glycolaldehyde treatment reduces the HDL-mediated cholesterol and 7-ketocholesterol efflux which is ascribed to the reduction in ABCA-1 and ABCG-1 protein level. This may contribute to atherosclerosis in diabetes mellitus

Advanced glycation end products the (AGE) comprise a series of compounds, quite different, whose activity is related to their ability to modify the chemical and functional properties of diverse biological structures. Several studies, including that used animals, indicate that AGE restriction in the diet can have many protective effects. Furthermore, the use of certain medicinal plants appears to offer additional benefits, especially to individuals suffering from disorders associated with excessive accumulation of AGE. It is believed that plants combiam antiglicantes and antioxidant properties, have positive effects on the inhibition of glycation. This fact has attracted the interest of the scientific community, as it can provide important therapeutic potential. Although any further component is particularly suitable as reducing AGEs in the context of the human body, some substances in vitro studies demonstrated the anti-AGE effects important and worth further investigation such as pyridoxamine, alilcisteína (garlic extract component), phenolics, vitamins C and E, thiamin, taurine and carnosine, recognized for its antioxidant properties. Therefore the aim of this proposal was to determine the antiglicante activity of extracts of plants native to the brasileleira flora of recognized antioxidant activity. All the studied extracts are part of the bank of plant extracts belonging to the Laboratory for Research on Natural Resources (LPqRN), the Institute of Chemistry and Biotechnology - UFAL. Therefore, this thesis was divided into three parts, which generated three articles. The first titled "Antioxidant activity of native plant extracts of flora by ABTS methods, DPPH, FRAP and ORAC", aimed to investigate the antioxidant capacity of different plant extracts, by different in vitro assays (ABTS, DPPH, FRAP , ORAC), and determine whether there is correlation between the tested methods. In this proposal, 49 plant samples were studied, the tests of antioxidant capacity, DPPH; ABTS; FRAP and ORAC. Further tests were conducted to see if there was a correlation between the methods. The results were screened for to follow up the research, specifically, the antiglicante activity, believed to be related to the antioxidant activity. So the second article entitled "antiglicante in vitro activity of native plant extracts of flora", aimed to determine the antiglicante activity of native plant extracts of brazilian flora, with recognized antioxidant activity and the possibility of correlation between tests, antiglicante and antioxidants. For this 18 extracts, which had been classified as important sources of antioxidant compounds were tested for activity antiglicante. From the most promising extract, Auxemma oncocalyx Taub. (Bark) for activity, an isolated quinone thereof was tested in Oncocalixona A. This may be an important antiglicante agent, which resulted in the third section, "Oncocalyxone The functions of an anti-glycation agent in vitro", that this was submitted to the journal FOOD CHEMISTRY, ISSN: 0308-8146, Impact factor 3.259, on 02/12/14, in the form of Short communication. The particular this thesis is of importance, since investigations of this nature favors the development of research investigating potential therapeutic products, and that in turn may be useful in treating diseases associated with excessive accumulation of AGE / Os produtos de glicação avançada (AGE) englobam uma série de compostos, bastante diferentes entre si, cuja atividade está relacionada à capacidade destes de modificar as propriedades químicas e funcionais das mais diversas estruturas biológicas. Diversos estudos, inclusive que utilizaram animais, apontam que a restrição de AGE na dieta pode exercer diversos efeitos protetores. Além disso, o uso de determinadas plantas medicinais parece oferecer benefícios adicionais, especialmente, para indivíduos que sofrem com transtornos associados ao acúmulo exagerado de AGE. Acredita-se que plantas que combinam propriedades antiglicantes e antioxidantes, exercem efeitos positivos sobre a inibição da glicação. Este fato tem atraído o interesse da comunidade científica, visto que pode oferecer importante potencial terapêutico. Embora nenhum componente seja ainda especificamente indicado como redutor de AGEs no contexto do corpo humano, em estudos in vitro algumas substâncias demonstraram efeitos anti-AGE importantes e merecem investigações adicionais, tais como piridoxamina, alilcisteína (componente do extrato de alho), compostos fenólicos, vitaminas C e E, tiamina, taurina e carnosina, reconhecidos por suas propriedades antioxidantes. Por esta razão o objetivo da presente proposta foi determinar a atividade antiglicante de extratos de plantas nativas da flora brasileira, que tenham reconhecida atividade antioxidante. Todos os extratos estudados fazem parte do banco de extratos vegetais pertencentes ao Laboratório de Pesquisas em Recursos Naturais (LPqRN), do Instituto de Química e Biotecnologia – UFAL. Para tanto, a presente tese foi dividida em três partes, que geraram três artigos. O primeiro deles entitulado “Atividade antioxidante de extratos de plantas nativas da flora brasileira pelos métodos ABTS, DPPH, FRAP e ORAC”, teve como objetivo investigar a capacidade antioxidante de diferentes extratos de plantas, por diferentes ensaios in vitro (ABTS, DPPH, FRAP, ORAC), e determinar se existe correlação entre os métodos testados. Nesta proposta, foram estudadas 49 amostras vegetais, pelos ensaios de capacidade antioxidante, DPPH; ABTS; FRAP e ORAC. Adicionalmente foram realizados testes para verificar se existia correlação entre os métodos. Os resultados foram uma triagem para dar sequência às pesquisas, especificamente, da atividade antiglicante, que se acredita haver relação com a atividade antioxidante. Assim o segundo artigo entitulado “Atividade antiglicante in vitro de extratos de plantas nativas da flora brasileira”, teve como objetivo determinar a atividade antiglicante de extratos de plantas nativas da flora barasileira, com reconhecida atividade antioxidante e a possibilidade de correlação entre os testes, antiglicante e antioxidantes. Para isto 18 extratos, que haviam sido classificados como importantes fontes de componentes antioxidantes, foram testados para atividade antiglicante. A partir do extrato mais promissor, Auxemma oncocalyx Taub. (entrecasca) para a atividade, foi testada uma quinona isolada do mesmo, a Oncocalixona A. Esta demonstrou ser um importante agente antiglicante, o que resultou no terceiro artigo, “Oncocalyxone A functions as an anti-glycation agent in vitro”, este que foi submetido à revista FOOD CHEMISTRY, ISSN: 0308-8146, Fator de impacto 3.259, no dia 02.12.14, na forma de Short communication. A presente tese se reveste de particular importância, uma vez que investigações desta natureza favorecem o desenvolvimento de pesquisas que investiguem potenciais produtos terapêuticos, e que por sua vez, possam ser úteis no tratamento de doenças associadas ao acúmulo exagerado de AGE

A glicação não enzimática das proteínas é um fator comum para a fisiopatologia de uma série de transtornos relacionados ao envelhecimento e a doenças como o diabetes mellitus (DM). O geração dos produtos de glicação, os AGEs (do inglês: Advanced Glycation End Products) se dá através de reações de glicação da mariz extracelular (MEC) na derme e têm sido apontado como um dos fatores responsáveis pela perda de elasticidade e deficiência de cicatrização da pele. A permeação cutânea de compostos anti-AGE é uma limitação importante para eficiência terapêutica de compostos que devem atingir camadas mais profundas da pele. Modelos de pele reconstruída contendo equivalente dérmico glicado são estruturas tridimensionais geradas in vitro que mimetizam a pele humana e representam um eficiente modelo para o estudo de células e modificações provocadas na MEC no processo de envelhecimento e DM. O modelo 3D de pele reconstruída tem características metabólicas, de permeabilidade e atividade semelhantes à da pele original, potencializando seu papel nas investigações sobre permeabilidade de drogas, toxicidade, irritação, eficácia e segurança de compostos e diferenciação de queratinócitos. Uma série de compostos naturais ou sintéticos inibidores de AGEs têm sido descobertos e apresentados recentemente e podem representar inovação terapêutica no tratamento de modificações causadas pela a formação e acúmulo destes AGEs também na pele. Este estudo avaliou o desenvolvimento da pele reconstruída glicada e posteriormente, a avaliação da eficácia e toxicidade de compostos anti-glicação como aminoguanidina e carnosina em modelo de pele reconstruída glicada. Em perspectiva, este estudo contribuiu para o desenvolvimento de uma nova tecnologia in vitro, a pele reconstruída glicada, que auxiliará a compreensão da biologia da interação célula-MEC mimetizando processos fisiopatológicos importantes como o envelhecimento e o DM. / The Advanced Glycation End Products (AGEs) of proteins is a common factor to the pathophysiology of a number of disorders related to aging and diseases such as diabetes mellitus (DM). The generation of the AGEs products on skin occurs mainly through non-enzymatic glycation reactions of the dermal extracellular matrix and has been touted as one of the factors responsible for loss of elasticity and disability of skin healing. The skin permeation of compounds is an important limitation for therapeutic/cosmetic efficacy of anti-AGE compounds, which must reach the deepest layers of the skin. Reconstructed skin model containing dermal equivalent modified by in vitro glycation is able to mimic the elderly human skin and represent an efficient model for the study of cells interactions and changes in extracellular matrix induced by aging and diabetes. The 3D reconstructed skin model has metabolic characteristics, permeability and activity similar to the original skin, reinforcing its role in drug permeability of investigations toxicity, irritation, safety and efficacy evaluation of compounds and differentiation of keratinocytes. A number of natural or synthetic AGEs inhibitor compounds have been recently discovered and displayed and can represent therapeutic innovation for the treatment of changes caused by the aging of the skin. In this study we performed the development of reconstructed glycated skin model and evaluated the efficacy and toxicity of anti-glycation compounds such as aminoguanidine and carnosine. In perspective, this study has contributed to the development of a new technology in vitro, and for the understanding cell-extracellular matrix interaction during the aging of skin.

Introdução: Diabetes Mellitus é caracterizada por hiperglicemia crônica, e este aumento excessivo de glicose circulante pode gerar danos vasculares e microvasculares pela deposição de produtos de gliclação avançada (AGE), principalmente em estruturas com alta vascularização, como é o caso da sinóvia. Por todas estas razões, o presente estudo estabeleceu, de maneira temporal, o processo de acomentimento sinovial, através do grau de remodelamento e as proteínas envolvidas neste processo, tido como o gatilho na lesão da articulação do joelho. Foram utilizados ratos wistar (n=60), divididos em três grupos, conforme tempo de indução ( 7, 30 e 60 dias), cada grupo era composto de 10 animais diabéticos, induzido por estreptozotocina (35mg/kg de peso) e 10 animais controle, recebendo infusão do mesmo volume de solução salina, após o tempo estipulado os animais foram sacrificados e a sinóvia coletada para as análises propostas. Análise morfológica através de colorações de hematoxilina-eosina para análise do perfil celular do tecido sinovial e Picrosírius para avaliação da histoarquitetura das fibras colágenas. A quantificação das fibras colágenas foi realizada pela coloração do Picrosírius em microscópio de luz polarizada e a caracterização e distribuição de seus tipos por imunofluorescência, para quantificação total da proteina de colágeno foi realizado a medição da 4-hidroxiprolina (HPO). Os produtos de glicação avançada foram analisados e quantificados por imufluorescência. A detecção e quantificação da imunoexpressão de marcadores bioquímicos como ET-1, TGF-B e IL17 foi realizado por método estereológico de contagem de pontos em reticulo, e como método de confirmação dos achados imunohistoquimicos foi realizado análise de expressão gênica dos Colágenos I,III, e V alfa- 1, alfa-2), por Reação de Transcrição Reversa com amplificação por PCR em Tempo Real (qRT-PCR). Resultados: Foi observado modificação da estrutura sinovial de forma temporal, acometendo inicialmente os vasos subsinoviais e tecidos adjacentes a ele, isso foi observado em tanto em análise morfológica como confirmado em quantificação por Picro em luz polarizada, as modificações se mostraram significantes nos grupos de 30 e 60 dias, quando comparado ao respectivo grupo controle, houve aumento do colágeno total, através do Picrosirius, como por dosagem de HOP. Os resultados foram confirmados por imunofluorescência com o aumento progressivo do COLI e diminuição de COLIII e COLV, o RAGE e AGE também tiveram sua expressão aumentada conforme a evolução no tempo de indução dos animais. Em análise da expressão de outras proteínas foi possível observar a detecção da ET-1 e da IL-17 nos animais diabéticos em comparação ao controle, houve também expressão significativa do TGF-B quando comparado ao respectivo controle. Na análise da expressão gênica foi possível observar aumento do COLV inicialmente, principalmente da cadeia alfa 2, do COLIII e COLI, confirmando achados histomorfométricos. Conclusão: O tecido sinovial demonstra remodelamento precoce ao redor dos vasos, essa mediação envolve o COL1 e os produtos de glicação avançada. Esta alteração no tecido sinovial pode ser responsável por desencadear o acometimento articular no diabetes mellitus / Introduction: Diabetes Mellitus is characterized by chronic hyperglycemia, and this excessive increase of circulating glucose can cause vascular and microvascular damage by the deposition of advanced glycation products (AGE), especially in structures with high vascularization, as is the case of synovium. For all these reasons, the present study established, in a temporal way, the process of synovial concomitance, through the degree of remodeling and the proteins involved in this process, considered as the trigger in the lesion of the knee joint. Wistar rats (n = 60), divided into three groups, according to induction time (7, 30 and 60 days), each group consisted of 10 diabetic animals, induced by streptozotocin (35 mg / kg body weight) and 10 animals control, receiving infusion of the same volume of saline solution, after the stipulated time the animals were sacrificed and the synovium collected for the proposed analyzes. Morphological analysis using hematoxylineosin staining for analysis of the cellular profile of the synovial tissue and Picrosírius for evaluation of the histoarchitecture of the collagen fibers. The quantification of the collagen fibers was performed by the Picrosírius staining in a polarized light microscope and the characterization and distribution of its types by immunofluorescence, the measurement of 4-hydroxyproline (HPO) was performed for the total quantification of the collagen protein. Advanced glycation products were analyzed and quantified by impuluorescence. The detection and quantification of the immunoexpression of biochemical markers such as ET- 1, TGF-B and IL17 was performed by stereological method of reticule dot counting, and as a method of confirming the immunohistochemical findings, the analysis of the collagen I, III , and V alpha-1, alpha-2), by Reverse Transcription Reaction with Real-Time PCR Amplification (qRT-PCR). Results: Modification of the synovial structure was observed temporally, initially affecting subsynovial vessels and tissues adjacent to it, this was observed in both morphological analysis and confirmed in quantification by Picro in polarized light, the modifications were significant in the groups of 30 and 60 days, when compared to the respective control group, there was increase of the total collagen, through Picrosirius, as per HOP dosage. The results were confirmed by immunofluorescence with progressive increase of COLI and decrease of COLIII and COLV, RAGE and AGE also had their expression increased as the evolution in the induction time of the animals. In the analysis of the expression of other proteins it was possible to observe the detection of ET-1 and IL-17 in diabetic animals in comparison to the control, there was also significant expression of TGF-B when compared to the respective control. In the analysis of the gene expression it was possible to observe an increase of the COLV initially, mainly of the alpha 2 chain, of the COLIII and COLI, confirming histomorphometric findings. Conclusion: Synovial tissue demonstrates early remodeling around vessels, this mediation involves COL1 and advanced glycation products. This change in synovial tissue may be responsible for triggering joint involvement in diabetes mellitus