Globally, cancer is one of the leading causes of mortality, with an estimated 18.1 million cancer cases, 10 million deaths, and 1.9 million new cases diagnosed in 2020 (Sung et al., 2021). However, during the past several decades, cancer survival has improved such that 82% of children and >2/3 of adults diagnosed with cancer will survive beyond five years (World Health Organization (WHO) - Childhood Cancer, 2021). Skeletal muscle atrophy and fibrosis are long-term adverse effects experienced by 80% of cancer survivors for which there is no available therapy (Paulino, 2004). These long-term consequences are related to the toxicity from the cancer treatment, leading to alterations in skeletal muscle function which can lead to comorbidities and increased mortality among cancer survivors (Paulino, 2004; Williams et al., 2016). Thus, novel approaches to address the long-term effects of cancer therapy on skeletal muscle are critically needed. Exercise training is a potential non-pharmacological strategy that improves common cancer- and treatment-related side effects (Mustian et al., 2012). Specifically, exercise programs that combine resistance and endurance training (RET) have been shown to improve muscle strength and cardiovascular fitness in cancer survivors (Tong et al., 2020). The mechanisms responsible for these effects remain unknown. The remarkable plasticity of skeletal muscle relies primarily on muscle stem (satellite) cells (MuSCs) (Lepper et al., 2011) that are regulated, in part, by muscle-resident stromal cells (Bentzinger et al., 2013). These different stromal cell types, including: vascular endothelial cells (ECs), immune cells, and mesenchymal progenitors, also known as fibro-adipogenic progenitors (FAPs), create the muscle stem cell niche (Yin et al., 2013). FAPs possess a dual role as they are involved in skeletal muscle maintenance and regeneration by secreting pro-myogenic trophic factors (Biferali et al., 2019; Joe et al., 2010; Uezumi et al., 2010; Wosczyna et al., 2019), but also contribute to fibrotic and fatty tissue accumulation in chronic degenerative conditions (Uezumi et al., 2010). The divergent features of FAPs highly depend on signals they receive from their microenvironment (Giuliani et al., 2021); however, FAP's contribution to cancer treatment-induced muscle pathology in cancer survivors remains unknown. The overall objective of this thesis is to begin to develop an understanding of the role of FAPs in cancer treatment-induced muscle pathology and to determine if RET represents an effective therapy to prevent the long-term muscle defects of juvenile cancer plus therapy.

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Le développement du système nerveux central (SNC) chez les vertébrés est un processus d'une extrême complexité qui nécessite une orchestration moléculaire très précise. Certains gènes exprimés très tôt lors du développement embryonnaire sont d'une importance capitale pour la formation du SNC. Parmi ces gènes, on retrouve le facteur de transcription à Lim homéodomaine Lhx2. Les embryons de souris mutants pour Lhx2 (Lhx2-/-) souffre d'une hypoplasie du cortex cérébral, sont anophtalmiques et ont un foie de volume réduit. Ces embryons mutants meurent in utero au jour embryonnaire 16 (e16) dû à une déficience en érythrocytes matures. L'objectif principal de cette thèse est de caractériser le rôle moléculaire de Lhx2 dans le développement des yeux et du cortex cérébral. Lhx2 fait partie des facteurs de transcription à homéodomaine exprimé dans la portion antérieure de la plaque neurale avec Rx, Pax6, Six3. Le développement de l'oeil débute par une évagination bilatérale de cette région. Nous démontrons que l'expression de Lhx2 est cruciale pour les premières étapes de la formation de l'oeil. En effet, en absence de Lhx2, l'expression de Rx, Six3 et Pax6 est retardée dans la plaque neurale antérieure. Au stade de la formation de la vésicule optique, l'absence de Lhx2 empêche l'activation de Six6 (un facteur de transcription également essentiel au développement de l'œil). Nous démontrons que Lhx2 et Pax6 coopèrent en s'associant au promoteur de Six6 afin de promouvoir sa trans-activation. Donc, Lhx2 est un gène essentiel pour la détermination de l'identité rétinienne au niveau de la plaque neurale. Plus tard, il collabore avec Pax6 pour établir l'identité rétinienne définitive et promouvoir la prolifération cellulaire. De plus, Lhx2 est fortement exprimé dans le télencéphale, région qui donnera naissance au cortex cérébral. L'absence de Lhx2 entraîne une diminution de la prolifération des cellules progénitrices neurales dans cette région à e12.5. Nous démontrons qu'en absence de Lhx2, les cellules progénitrices neurales (cellules de glie radiale) se différencient prématurément en cellules progénitrices intermédiaires et en neurones post-mitotiques. Ces phénotypes sont corrélés à une baisse d'activité de la voie Notch. En absence de Lhx2, DNER (un ligand atypique de la voie Notch) est fortement surexprimé dans le télencéphale. De plus, Lhx2 et des co-répresseurs s'associent à la chromatine de la région promotrice de DNER. Nous concluons que Lhx2 permet l'activation de la voie Notch dans le cortex cérébral en développement en inhibant la transcription de DNER, qui est un inhibiteur de la voie Notch dans ce contexte particulier. Lhx2 permet ainsi la maintenance et la prolifération des cellules progénitrices neurales. / Central nervous system (CNS) development in vertebrates is an extremely complex process that requires tight molecular control. Some very early expressed genes during embryonic development are of tremendous importance for CNS development. Among those, we find the LIM homeodomain protein Lhx2. Embryos that lack Lhx2 (Lhx2-/-) suffer from cerebral cortex hypoplasia, are anophtalmic and have smaller liver. The mutant embryos die in utero at embryonic day 16 (e16) due to a deficit in mature erythrocytes. The principal objective of this thesis was to characterize the molecular function of Lhx2 in eye and cerebral cortex development. Lhx2 is a part of the homeodomain transcription factors expressed in the anterior neural plate along with Rx, Pax6 and Six3. Eye development starts by a bilateral evagination of this region. We show here that Lhx2 expression is crucial for the first steps of eye formation. Indeed, in absence of Lhx2, Rx, Six3 and Pax6 expression is delayed in the anterior neural plate. At the optic vesicle stage, Lhx2 mutation precludes the initiation of Six6 expression (an homeodomain transcription factor essential for eye development). We demonstrate that Lhx2 and Pax6 bind to Six6 promoter and cooperate for its trans‐activation. So, Lhx2 is essential for retinal identity determination in the neural plate. Later on, it cooperates with Pax6 to establish definitive retinal identity and promote cell proliferation. Lhx2 is strongly express in the telencephalon, the embryonic region that will give rise to cerebral cortex. Lhx2 ablation causes a decrease in neural progenitor cells proliferation in this region. We show that the lack of Lhx2 causes a premature differentiation of the radial glia cells into intermediate progenitors and post‐mitotic neurons. These phenotypes correlate with a decrease activity of the Notch pathway. In Lhx2-/- telencephalon, the atypical Notch‐ligand DNER is strongly overexpressed. Furthermore, Lhx2 and co‐repressors associate at the DNER promoter region. We conclude that Lhx2 allows Notch pathway activation in the developing cerebral cortex. It does so by inhibiting DNER transcription, which is a Notch pathway repressor in this particular context. Thus, Lhx2 allows the maintenance and the proliferation of neural progenitor cells.

Lors du développement, la coordination d’évènements moléculaires et cellulaires mène à la production du cortex qui orchestre les fonctions sensori-motrices et cognitives. Son développement s’effectue par étapes : les cellules gliales radiaires (RGs) – les cellules souches neurales (NSCs) du cerveau en développement – et les cellules progénitrices de la zone ventriculaire (VZ) et de la zone sous ventriculaire (SVZ) génèrent séquentiellement des vagues distinctes de nouveaux neurones qui formeront les différentes couches corticales. Autour de la naissance, les RGs changent de devenir et produisent des cellules gliales. Cependant, une fraction persiste tout au long de la vie dans la SVZ qui borde le ventricule, perdant au passage leur morphologie radiale. Ces NSCs produisent ensuite les différents sous types d’interneurones du bulbe olfactif ainsi que des cellules gliales en fonction de leur origine spatiale dans la SVZ. Ces observations soulèvent d’importantes questions non résolues sur 1) le codage transcriptionnel régulant la régionalisation de la SVZ, 2) le potentiel des NSCs postnatales dans la réparation cérébrale, et 3) le lignage et les spécificités transcriptionnelles entre les NSCs et leur descendants. Mon travail de doctorat repose sur une étude transcriptionnelle des domaines de la SVZ postnatale. Celle-ci soulignait le fort degré d’hétérogénéité des NSCs et progéniteurs et identifiait des régulateurs transcriptionnels clés soutenant la régionalisation. J’ai développé des approches bio-informatiques pour explorer ces données et connecter l’expression de facteurs de transcription (TFs) avec la genèse régionale de lignages neuraux distincts. J’ai ensuite développé un modèle d’ablation ciblée pour étudier le potentiel régénératif des progéniteurs postnataux dans divers contextes. Finalement, j’ai participé au développement d’une procédure pour explorer et comparer des progéniteurs pré et postnataux à l’échelle de la cellule unique. Objectif 1 : Des expériences de transcriptomique et de cartographie ont été réalisées pour étudier la relation entre l’expression régionale de TFs par les NSCs et l’acquisition de leur devenir. Nos résultats suggèrent un engagement précoce des NSCs à produire des types cellulaires définis selon leur localisation spatiale dans la SVZ et identifient HOPX comme un marqueur d’une sous population biaisé à générer des astrocytes. Objectif 2 : J’ai mis au point un modèle de lésion corticale qui permet l’ablation ciblée de neurones de couches corticales définies pour étudier la capacité régénérative et la spécification appropriée des progéniteurs postnataux. Une analyse quantitative des régions adjacentes, incluant la région dorsale de la SVZ, a révélé une réponse transitoire de progéniteurs définis. Objectif 3 : Nous avons développé la lignée de souris transgénique Neurog2CreERT2Ai14, qui permet le marquage de cohortes de progéniteurs glutamatergiques et de leurs descendants. Nous avons montré qu’une large fraction de ces progéniteurs persiste dans le cerveau postnatal après la fermeture de neurogénèse corticale. Ils ne s’accumulent pas pendant le développement embryonnaire mais sont produits par des RGs qui persistent après la naissance dans la SVZ et qui continuent de générer des neurones corticaux, bien que l’efficacité soit faible. Le séquençage d’ARN sur cellule unique a révélé une dérégulation transcriptionnelle qui corrèle avec le déclin progressif observé in vivo de la neurogénèse corticale. Ensemble, ces résultats soulignent le potentiel des études transcriptomiques à résoudre mais aussi à soulever des questions fondamentales comme les changements trancriptionnels intervenant dans une population de progéniteurs au cours du temps et participant aux changements de leur destinée. Cette connaissance sera la clé du développement d’approches novatrices pour recruter et promouvoir la génération de types cellulaires spécifiques, incluant les sous-types neuronaux dans un contexte pathologique. / During development, a remarkable coordination of molecular and cellular events leads to the generation of the cortex, which orchestrates most sensorimotor and cognitive functions. Cortex development occurs in a stepwise manner: radial glia cells (RGs) - the neural stem cells (NSCs) of the developing brain - and progenitor cells from the ventricular zone (VZ) and the subventricular zone (SVZ) sequentially give rise to distinct waves of nascent neurons that form cortical layers in an inside-out manner. Around birth, RGs switch fate to produce glial cells. A fraction of neurogenic RGs that lose their radial morphology however persists throughout postnatal life in the subventricular zone that lines the lateral ventricles. These NSCs give rise to different subtypes of olfactory bulb interneurons and glial cells, according to their spatial origin and location within the postnatal SVZ. These observations raise important unresolved questions on 1) the transcriptional coding of postnatal SVZ regionalization, 2) the potential of postnatal NSCs for cellular regeneration and forebrain repair, and 3) the lineage relationship and transcriptional specificities of postnatal NSCs and of their progenies. My PhD work built upon a previously published comparative transcriptional study of defined microdomains of the postnatal SVZ. This study highlighted a high degree of transcriptional heterogeneity within NSCs and progenitors and revealed transcriptional regulators as major hallmarks sustaining postnatal SVZ regionalization. I developed bioinformatics approaches to explore these datasets further and relate expression of defined transcription factors (TFs) to the regional generation of distinct neural lineages. I then developed a model of targeted ablation that can be used to investigate the regenerative potential of postnatal progenitors in various contexts. Finally, I participated to the development of a pipeline for exploring and comparing select populations of pre- and postnatal progenitors at the single cell level. Objective 1: Transcriptomic as well as fate mapping were used to investigate the relationship between regional expression of TFs by NSCs and their acquisition of distinct neural lineage fates. Our results supported an early priming of NSCs to produce defined cell types depending of their spatial location in the SVZ and identified HOPX as a marker of a subpopulation biased to generate astrocytes. Objective 2: I established a cortical lesion model, which allowed the targeted ablation of neurons of defined cortical layers to investigate the regenerative capacity and appropriate specification of postnatal cortical progenitors. Quantitative assessment of surrounding brain regions, including the dorsal SVZ, revealed a transient response of defined progenitor populations. Objective 3: We developed a transgenic mouse line, i.e. Neurog2CreERT2Ai14, which allowed the conditional labeling of birth-dated cohorts of glutamatergic progenitors and their progeny. We used fate-mapping approaches to show that a large fraction of Glu progenitors persist in the postnatal forebrain after closure of the cortical neurogenesis period. Postnatal Glu progenitors do not accumulate during embryonal development but are produced by embryonal RGs that persist after birth in the dorsal SVZ and continue to give rise to cortical neurons, although with low efficiency. Single-cell RNA sequencing revealed a dysregulation of transcriptional programs, which correlates with the gradual decline in cortical neurogenesis observed in vivo. Altogether, these data highlight the potential of transcriptomic studies to unravel but also to approach fundamental questions such as transcriptional changes occurring in a population of progenitors over time and participating to changes in their fate potential. This knowledge will be key in developing innovative approaches to recruit and promote the generation of selected cell types, including neuronal subtypes in pathologies.

Afin de résoudre la problématique des substituts osseux faiblement vascularisés, un des challenges majeurs en ingénierie tissulaire osseuse est de favoriser le développement précoce d’une microvascularisation. La reproduction du microenvironnement local et l’organisation cellulaire in situ sont des approches innovantes pour optimiser la formation osseuse. En Biofabrication, la Bioimpression Assistée par Laser (LAB) est une technologie émergente permettant l’impression de cellules et de biomatériaux avec une résolution micrométrique. L’objectif de ce travail était d’étudier l’effet de l’organisation de la pré-vascularisation par LAB sur la régénération osseuse. La station de bioimpression Novalase a été utilisée pour imprimer des motifs de cellules endothéliales sur un « biopaper » constitué de collagène et de cellules souches issues de la papille apicale. Les paramètres d’impression, densités cellulaires et conditions de recouvrement ont été optimisés afin de favoriser la formation d’un réseau microvasculaire avec une architecture définie in vitro. Ce modèle a ensuite été transposé in vivo, grâce à la bioimpression in situ de cellules endothéliales au niveau de défauts osseux critiques chez la souris, afin d’évaluer si la prévascularisation organisée par LAB permettait de promouvoir et contrôler spatialement le processus de régénération osseuse. Les résultats ont montré que la bioimpression permettait d’augmenter la densité de vaisseaux dans les défauts osseux et de favoriser la régénération osseuse. / In order to solve the issue of poorly vascularized bone substitutes, development of a microvasculature into tissue-engineered bone substitutes represents a current challenge. The reproduction of local microenvironment and in situ organization of cells are innovating approaches to optimize bone formation. In Biofabrication, Laser-Assisted Bioprinting (LAB) has emerged as a relevant method to print living cells and biomaterials with micrometric resolution. The aim of this work was to study the effect of prevascularization organized by LAB on bone regeneration. The laser workstation Novalase was used to print patterns of endothelial cells onto a « biopaper » of collagen hydrogel seeded with stem cells from the apical papilla. Printing parameters, cell densities and overlay conditions were optimized to enhance the formation of microvascular networks with a defined architecture in vitro. This model was then transposed in vivo, through in situ bioprinting of endothelial cells into mouse calvarial bone defects of critical size, to investigate if prevascularization organized by LAB can promote and spatially control bone regeneration. The results showed that bioprinting allowed to increase blood vessel density in bone defects and promote bone regeneration.

Le développement du système nerveux central (SNC) chez les vertébrés est un processus d'une extrême complexité qui nécessite une orchestration moléculaire très précise. Certains gènes exprimés très tôt lors du développement embryonnaire sont d'une importance capitale pour la formation du SNC. Parmi ces gènes, on retrouve le facteur de transcription à Lim homéodomaine Lhx2. Les embryons de souris mutants pour Lhx2 (Lhx2-/-) souffre d'une hypoplasie du cortex cérébral, sont anophtalmiques et ont un foie de volume réduit. Ces embryons mutants meurent in utero au jour embryonnaire 16 (e16) dû à une déficience en érythrocytes matures. L'objectif principal de cette thèse est de caractériser le rôle moléculaire de Lhx2 dans le développement des yeux et du cortex cérébral. Lhx2 fait partie des facteurs de transcription à homéodomaine exprimé dans la portion antérieure de la plaque neurale avec Rx, Pax6, Six3. Le développement de l'oeil débute par une évagination bilatérale de cette région. Nous démontrons que l'expression de Lhx2 est cruciale pour les premières étapes de la formation de l'oeil. En effet, en absence de Lhx2, l'expression de Rx, Six3 et Pax6 est retardée dans la plaque neurale antérieure. Au stade de la formation de la vésicule optique, l'absence de Lhx2 empêche l'activation de Six6 (un facteur de transcription également essentiel au développement de l'œil). Nous démontrons que Lhx2 et Pax6 coopèrent en s'associant au promoteur de Six6 afin de promouvoir sa trans-activation. Donc, Lhx2 est un gène essentiel pour la détermination de l'identité rétinienne au niveau de la plaque neurale. Plus tard, il collabore avec Pax6 pour établir l'identité rétinienne définitive et promouvoir la prolifération cellulaire. De plus, Lhx2 est fortement exprimé dans le télencéphale, région qui donnera naissance au cortex cérébral. L'absence de Lhx2 entraîne une diminution de la prolifération des cellules progénitrices neurales dans cette région à e12.5. Nous démontrons qu'en absence de Lhx2, les cellules progénitrices neurales (cellules de glie radiale) se différencient prématurément en cellules progénitrices intermédiaires et en neurones post-mitotiques. Ces phénotypes sont corrélés à une baisse d'activité de la voie Notch. En absence de Lhx2, DNER (un ligand atypique de la voie Notch) est fortement surexprimé dans le télencéphale. De plus, Lhx2 et des co-répresseurs s'associent à la chromatine de la région promotrice de DNER. Nous concluons que Lhx2 permet l'activation de la voie Notch dans le cortex cérébral en développement en inhibant la transcription de DNER, qui est un inhibiteur de la voie Notch dans ce contexte particulier. Lhx2 permet ainsi la maintenance et la prolifération des cellules progénitrices neurales. / Central nervous system (CNS) development in vertebrates is an extremely complex process that requires tight molecular control. Some very early expressed genes during embryonic development are of tremendous importance for CNS development. Among those, we find the LIM homeodomain protein Lhx2. Embryos that lack Lhx2 (Lhx2-/-) suffer from cerebral cortex hypoplasia, are anophtalmic and have smaller liver. The mutant embryos die in utero at embryonic day 16 (e16) due to a deficit in mature erythrocytes. The principal objective of this thesis was to characterize the molecular function of Lhx2 in eye and cerebral cortex development. Lhx2 is a part of the homeodomain transcription factors expressed in the anterior neural plate along with Rx, Pax6 and Six3. Eye development starts by a bilateral evagination of this region. We show here that Lhx2 expression is crucial for the first steps of eye formation. Indeed, in absence of Lhx2, Rx, Six3 and Pax6 expression is delayed in the anterior neural plate. At the optic vesicle stage, Lhx2 mutation precludes the initiation of Six6 expression (an homeodomain transcription factor essential for eye development). We demonstrate that Lhx2 and Pax6 bind to Six6 promoter and cooperate for its trans‐activation. So, Lhx2 is essential for retinal identity determination in the neural plate. Later on, it cooperates with Pax6 to establish definitive retinal identity and promote cell proliferation. Lhx2 is strongly express in the telencephalon, the embryonic region that will give rise to cerebral cortex. Lhx2 ablation causes a decrease in neural progenitor cells proliferation in this region. We show that the lack of Lhx2 causes a premature differentiation of the radial glia cells into intermediate progenitors and post‐mitotic neurons. These phenotypes correlate with a decrease activity of the Notch pathway. In Lhx2-/- telencephalon, the atypical Notch‐ligand DNER is strongly overexpressed. Furthermore, Lhx2 and co‐repressors associate at the DNER promoter region. We conclude that Lhx2 allows Notch pathway activation in the developing cerebral cortex. It does so by inhibiting DNER transcription, which is a Notch pathway repressor in this particular context. Thus, Lhx2 allows the maintenance and the proliferation of neural progenitor cells.

Les ephrines et leurs récepteurs Eph constituent une famille multigénique de facteurs de guidage cellulaire et axonal. Ces facteurs jouent un rôle-clé dans l’établissement de cartes neurales topographiques, notamment au niveau des connexions thalamocorticales, réseau neuronal majeur du cerveau des mammifères.<p><p>Notre projet visait initialement à étudier l’implication des ephrines corticales dans la génèse des connexions thalamocorticales par une approche de gain de fonction. Pour ce faire, nous avons généré des souris transgéniques présentant une expression ectopique spécifique de l’ephrine-A5 dans le cortex en développement, en utilisant une technique de transgénèse d’addition par chromosome artificiel de bactéries (BAC). <p><p>De façon surprenante, l’analyse de ces souris nous a révélé que les ephrines, à côté de leurs rôles classiques de facteurs de guidage, influençaient la taille du cortex cérébral en régulant l’apoptose des progéniteurs neuronaux. En effet, nous avons pu montrer que l’expression ectopique du ligand ephrine-A5 par les progéniteurs corticaux exprimant son récepteur EphA7 résultait en une déplétion précoce en progéniteurs corticaux par apoptose, et une diminution subséquente de la taille du cortex. Cette vague apoptotique est observée en l’absence de toute altération détectable de la prolifération, la différenciation et la migration neurale dans le cortex.<p><p>Nous avons étayé notre étude in vivo par des expériences in vitro, qui ont montré que l’ephrine-A5 recombinante était capable d’induire rapidement la mort des progéniteurs neuronaux dissociés. Nous avons également montré que cette mort cellulaire impliquait l’activation de la caspase-3, confirmant ainsi l’effet direct des ephrines et de leurs récepteurs sur une ou plusieurs cascades apoptotiques. Par contre, la stimulation des neurones post-mitotiques corticaux par l’ephrine-A5 est accompagnée d’une activation de la caspase-3 sans mort cellulaire apparente. La signalisation ephrine/Eph induirait donc l’activation de la caspase-3 dans différents types cellulaires, sans que celle-ci ne soit systématiquement le reflet d’une mort cellulaire programmée. <p><p>Parallèlement, afin d’évaluer l’importance physiologique de cette voie pro-apoptotique dépendante des ephrines, nous avons étudié des souris présentant une perte de fonction du récepteur EphA7. L’analyse de ces mutants nous a permis de mettre en évidence une diminution de l’apoptose des progéniteurs corticaux, une augmentation de la taille du cortex, ainsi qu’une hypercroissance exencéphalique de tout le cerveau antérieur dans les cas les plus extrêmes. Ces observations indiquent donc que les ephrines sont nécessaires au contrôle de la mort cellulaire programmée des progéniteurs du cortex cérébral. Nous avons également observé le même phénotype exencéphalique dans des mutants déficients en ephrines-A2, -A3 et -A5, dont l’analyse préliminaire suggère également des défauts de processus apoptotiques. <p><p>Nos diverses expériences, combinant une approche par gain et perte de fonction, à la fois in vivo et in vitro, ont ainsi permis de proposer un nouveau rôle des ephrines en marge de leur implication dans la guidance axonale, à savoir un rôle dans le contrôle de la taille cérébrale par induction de l’apoptose des progéniteurs corticaux.<p>La mise en évidence de cette nouvelle voie de signalisation pro-apoptotique pourrait avoir des implications importantes dans d’autres aspects de la biologie du développement et des cellules souches, ainsi que dans l’oncogénèse. <p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao de Thiago de Almeida Pereira.pdf: 7083594 bytes, checksum: b087de1012807ea82b96d6e7ada7b3cc (MD5) Previous issue date: 2010-03-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Hedgehog (Hh) pathway activation promotes many processes that occur during fibrogenic liver repair. Whether the Hh pathway modulates the outcomes of virally-mediated liver injury has never been examined. Gene-profiling studies of human hepatocellular carcinomas (HCC) demonstrate Hh pathway activation in HCCs related to chronic infection with hepatitis B virus (HBV) or hepatitis C virus (HCV). Because most HCC develop in cirrhotic livers, we hypothesized that Hh pathway activation occurs during fibrogenic repair of liver damage due to chronic viral hepatitis, and that Hh-responsive cells mediate disease progression and hepatocarcinogenesis in chronic viral hepatitis. Methods Immunohistochemistry and qRT-PCR analysis were used to analyze Hh pathway activation and identify Hhresponsive cell types in archival liver biopsies from 45 patients with chronic HBV or HCV with different stages of fibrosis (F0-4), some of which also presented HCC. Hh signaling was manipulated with cyclopamine in primary human hepatic stellate cells (HSC) and sinusoidal endothelial cells (SEC). Angiogenesis assay was used to investigate if the pathway plays a role in tube formation. SECs were incubated with recombinant Shh, conditioned media from HSC, cyclopamine, short hairpin RNA against smoothened or their respective controls and the length of vascular tubes were measured by morphometry. Hedgehog production was investigated in Huh7 cells infected with JFH-1 and in a rat hepatoma cell line that express the HBV X gene by qRT-PCR. Results We found increased hepatic expression of Hh ligands (Shh and Ihh) in all patients with chronic viral hepatitis (p<0.005), and demonstrated that infection with JFH-1 or ectopic expression of the HBV X gene stimulated cultured hepatocytes to produce Shh (p<0.005). The major cell populations that expanded during cirrhosis and HCC (i.e., liver myofibroblasts, activated endothelial cells, and progenitors expressing markers of tumor stem/initiating cells Krt7, CD133, Epcam and survivin) were Hh-responsive (Patched and Gli-2 positive) and higher levels of Hh pathway activity associated with cirrhosis and HCC (p<0.005). Inhibiting pathway activity in Hh-responsive target cells (HSC and SEC) reduced fibrogenesis (p<0.005 for &#945;SMA and p<0.05 for col1&#945;1 expression) and angiogenesis (p<0.05). Conclusions HBV/HCV infection increases hepatocyte production of Hh ligands in hepatocytes and expands types of Hh-responsive cells, including myofibroblasts and xiv sinusoidal endothelial cells that associate with fibrosis progression to cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Moreover, hedgehog-responsive progenitors that are undergoing epithelial-to-mesenchymal transition accumulate during the progression of viral hepatitis and may play a role in the development or progression of hepatocellular carcinoma. In vitro inhibition of Hh-signaling in primary human hepatic stellate cells and sinusoidal endothelial cells suggest the possibility of using Hh inhibitors as potential tools to prevent cirrhosis and hepatocellular carcinoma in patients with chronic hepatitis B and C / Ativação da via do Hedgehog (Hh) promove vários processos que ocorrem durante o reparo fibrogênico hepático. O papel da via do Hh na lesão causada pela hepatite crônica B e C ainda não foi investigado. Estudos de expressão global em carcinomas hepatocelulares (CHC) demostraram a ativação da via do Hh em pacientes com CHC relacionados à infecção crônica com o vírus da hepatite B (VHB) ou vírus da hepatite C (VHC). Como a maioria dos CHCs desenvolve em fígados cirróticos, levantamos a hipótese de que a ativação da via do Hh ocorre durante o reparo fibrogênico relacionado à hepatite viral crônica B e C e que células Hh-reatoras poderiam orquestrar a progressão da doença e a hepatocarcinogênese na hepatite viral crônica. Métodos Immunohistoquímica e análise por PCR quantitativo em tempo real (qRTPCR) foram utilizados para investigar a ativação da via do Hh e identificar os tipos celulares que respondem aos ligantes dessa via em biópsias arquivadas de 45 pacientes com hepatite crônica B ou C, de diferentes graus de fibrose (F0-4), sendo que 7 também apresentavam CHC. A via do Hh foi manipulada com Ciclopamina em células estreladas hepáticas (HSC) e em células endoteliais sinusoidais hepáticas (SEC) primárias humanas. O ensaio da angiogênese foi usado para investigar o papel da via do Hh na formação de tubos. SECs foram incubadas com Shh recombinante, meio condicionado de HSC, ciclopamina, short hairpin RNA (shRNA) contra o Smoothened ou os seus controles respectivos e o comprimento dos tubos vasculares foram quantificados por morfometria. A produção de ligantes Hh foi investigada por qRT-PCR em células Huh7 infectadas com o virus JFH-1 e em uma linhagem de hepatoma de rato que expressa o gene da proteína X do VHB. Resultados Observamos um aumento dos níveis de expressão de ligantes Hh (Shh e Ihh) em todos os pacientes com hepatite crônica viral (p<0,005) e demonstramos que a infecção pelo vírus da hepatite C JFH-1 ou a expressão ectópica do gene X do VHB estimulam culturas de hepatoma a produzirem Shh (p<0,005). Os principais tipos celulares que proliferam durante a cirrose e CHC (miofibroblastos, células endoteliais ativadas e progenitores que expressam marcadores de células tronco/iniciadoras de tumor CD133, Krt7, EpCAM e survivina) são reatores aos ligantes Hh e os níveis mais altos de expressão de componentes da via do Hh (Shh, Ihh, Gli-2 e Ptch) estão associados xii com cirrose e CHC (p<0,005). Inibição da via do Hh em células reatoras (HSC e SEC) reduziu fibrogênese (p<0,005 para expressão de &#945;SMA e p<0,05 para expressão de col1&#945;1) e angiogênese (p<0,05). Conclusões A Infecção pelo VHB/VHC aumenta a produção de ligantes hedgehog em hepatócitos e expande o número de células estreladas hepáticas e células endoteliais sinusoidais primárias humanas reatoras a esses ligantes, em relação direta com a progressão da fibrose para a cirrose e o carcinoma hepatocelular. Também induz o acúmulo progressivo de células progenitoras reatoras a via do Hh e que estão em processo de transição epitélio mesenquimal, o que pode estar relacionado com o desenvolvimento ou a progressão do carcinoma hepatocelular. A inibição in vitro da ativação da via do Hedgehog em células estreladas e em células sinusoidais endoteliais hepáticas primárias humanas sugere a possibilidade de investigar inibidores dessa via como potenciais ferramentas para reduzir a progressão da fibrose hepática para cirrose e carcinoma hepatocelular nas hepatites crônicas produzidas pelos vírus B e C

Les infections et l’activation du système immunitaire stimulent l’hématopoïèse. L’activation des récepteurs Toll-like (TLRs) des cellules souches hématopoïétiques, par leur reconnaissance de motifs moléculaires portés par des agents infectieux, en oriente la différenciation vers les voies myéloïdes, renforçant la capacité de notre organisme à lutter contre les infections. Ici, nous avons étudié si les agonistes TLRs peuvent, au contraire, induire au sein de la moelle osseuse l’émergence de progéniteurs hématopoïétiques présentant des propriétés immunorégulatrices. Nous montrons que l’incubation de moelle osseuse de souris en présence de l’agoniste TRL-9, CpG-B, entraîne l’émergence d’une population de progéniteurs au stade pro-B (appelée CpG-proBs). Le transfert adoptif de seulement 60,000 CpG-proBs par receveur, à l’apparition des premiers signes cliniques, confère une protection à long terme dans deux modèles expérimentaux de maladies auto-immunes, le Diabète de Type I (T1D) et l’Encéphalomyélite Auto-immune Expérimentale (EAE). La migration, la différenciation, et les mécanismes cellulaires et moléculaires de cette population protectrice sont décrits et comparés entre ces deux modèles. Dans les deux modèles, les CpG-proBs migrent vers le tissu cible de la réponse auto-immune et se différencient en cellules B matures régulatrices. Dans le T1D, l’interféron-γ (IFN-γ) produit par les cellules T s’avère essentiel pour induire la surexpression de FasL à la surface des CpG-proBs, entraînant l’apoptose des cellules T effectrices. De plus, l’IFN-γ produit par les CpG-proBs réduit la production par les cellules T de l’IL-21, une cytokine pathogène majeure dans le T1D. La descendance des CpG-proBs est composée de précurseurs transitionnels B, de cellules B de la zone marginale et de cellules B folliculaires, exprimant de forts niveaux de FasL et toujours capables d’induire l’apoptose des cellules T, prolongeant ainsi le contrôle des cellules effectrices T auto-immunes in vivo. Dans l’EAE, l’IFNγ est indirectement responsable de la rétention des cellules T, par l’internalisation de CCR7, au sein des ganglions lymphatiques, inhibant ainsi leur migration au système nerveux central (SNC). Dans la moelle épinière, tissu cible de l’EAE, les CpG-proBs se différencient en cellules B220+CD5+CD1dhiCD11b+, secrétant la cytokine anti-inflammatoire IL-10. Enfin, la mobilisation des progéniteurs hématopoïétiques par un cocktail de facteurs hématopoïétiques confère à une sous-population multipotente au stade MPP2 la propriété d’augmenter l’expansion des Foxp3+ Tregs et de prévenir la survenue du diabète de type 1. Nous montrons que les MPP2 mobilisés s’avèrent également capables d’exercer un effet protecteur envers l’EAE. Leur capacité à induire l’expansion de Treg Foxp3+ au sein du SNC et à la périphérie joue un rôle essentiel dans la protection des souris envers l’EAE, puisque la déplétion des Treg abolit la protection déjà établie. Pour conclure, nous avons mis en évidence que diverses stimulations de l’hématopoïèse induisent l’émergence de nouvelles populations de progéniteurs hématopoïétiques qui présentent des propriétés immunorégulatrices et constituent de nouveaux outils de thérapie cellulaire des maladies auto-immunes. / It is well known today that various infectious events or other stimuli of the immune system can trigger hematopoiesis. The hematopoeitic stem and/or progenitor cells express on their cell surface Toll-like receptors which can recognize molecular motifs of infectious agents. The stimulation of TLRs on hematopoietic stem cells favors their differentiation into myeloid lineages, reinforcing the capacity of our body to fight against the pathogens. Herein, we have investigated whether the stimulation of TLRs can induce, instead, the emergence within the bone marrow of selective progenitor cells with immunoregulatory properties. We show that incubation of bone marrow cells with the TLR-9 ligand CpG-B can induce a pro-B cell population (named CpG-proBs) whose adoptive transfer at low numbers of 60,000 cells provided long-lasting protection in two models of autoimmune diseases, Type I Diabetes (TID) and Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) at the onset of clinical signs. The migration, differentiation and molecular mechanism of action of this protective population is described and compared between these two models. In both models, the CpG-proBs migrate to the target tissue of autoimmune responses and differentiate into more mature regulatory B cells. In TID, IFN-γ produced by both T and CpG-proB cells is essential for the upregulation of FasL at the surface of CpG-proBs, inducing the apoptosis of the effector T cells. In addition, IFN-γ reduced the T-cell production of IL-21, a major pathogenic cytokine in TID. The progeny of the adoptively transferred CpG-proBs, including transitional precursors B cells, marginal zone and follicular B cells, display high expression of FasL, promote apoptosis of effector T cells and prolong the control of autoimmune effector T cells in vivo. In EAE, IFN-γ was responsible for the restriction of T cells to the lymph nodes, inhibiting their homing to the CNS. IFN-γ indirectly induced the internalization of CCR7, a receptor required for the migration across the blood-brain barrier. In the spinal cord (target tissue in EAE), CpG-proBs differentiated into B220+CD5+CD1dhiCD11b+ cells secreting the anti-inflammatory cytokine IL-10. Finally, hematopoietic progenitor populations mobilized to the periphery by a cocktail of G-CSF and Flt3l, at the stage of MPP2, have already been shown to protect against TID by expanding the Foxp3+ Tregs. We evaluated them in the EAE model, showing that the ability of these mobilized progenitor cells to trigger the expansion of Foxp3+ Treg within the CNS and the periphery was necessary for providing protection to EAE mice since Treg depletion abrogated the protection once established. In conclusion, we provide evidence for the emergence of new populations of hematopoietic progenitor cells which can display immunoregulatory properties and might be used for cell therapy of autoimmune diseases.

L’oncogène v-erbA transforme les progéniteurs érythrocytaires primaires aviaires (T2EC) en bloquantleur engagement d’un programme d’auto-renouvellement vers un programme de différenciation. Unecomparaison trancriptomique de T2EC exprimant soit v-erbA, soit une forme non transformante de verbAa été réalisée par SAGE et RT-qPCR. Seuls quelques uns, mais pas tous les messagers codant lesprotéines ribosomiques sont réprimés. Ces résultats suggèrent que v-erbA pourrait moduler lacomposition des ribosomes et/ou moduler les fonctions extra-ribosomiques de protéines ribosomiquesspécifiques. Ainsi, nous avons décidé d’analyser le taux des protéines ribosomiques associées auxribosomes par 2D-DIGE à partir des ribosomes purifiés. L’analyse statistique effectuée sur 4expériences indépendantes avec des marquages inversées a montré de manière significative que letaux de RPL11 est inférieur dans les T2EC exprimant v-erbA comparé à ceux exprimant la forme nontransformante de v-erbA. Ces données indiquent l’existence de ribosomes dépourvus de RPL11 dansles T2EC sous l’effet de v-erbA. Les résultats des expériences d’immunoprécipitation ont conforté cettehypothèse. L’ensemble des résultats obtenus suggèrent l’implication des protéines ribosomiques, etspécialement celle de RPL11, dans les processus de transformation induite par l’oncogène v-erbA, à lafois au niveau de la traduction, et probablement par sa fonction extra-ribosomique. L’analyse de lafonction biologique de RPL11 a montré qu’une sur-expression de RPL11 dans les T2EC retarderait laprolifération cellulaire. / The v-erbA oncogene transforms chicken erythroid progenitors by blocking their differentiation andpreventing them to exit a state of self-renewal. The transcriptome of primary avian erythroidprogenitors cells (T2EC) expressing either v-erbA or a non-transforming form of v-erbA werecompared by SAGE. Only some, but not all, mRNAs encoding ribosomal proteins were shown to beaffected. These results suggest that v-erbA could modulate the composition of ribosomes and/ormodulate the extraribosomal functions of specific ribosomal proteins. We therefore decided to analyzethe level of ribosomal proteins associated to ribosomes by 2D-DIGE performed on purified ribosomes.A statistical analysis performed on 4 independent flip-flop experiments demonstrated that the level ofRPL11 is significantly lower in T2EC expressing v-erbA as compared to the non-transforming form ofv-erbA. These data suggest the presence of ribosomes without RPL11 in T2EC expressing v-ErbA.Results obtained from immunoprecipitation experiments were strengthened this hypothesis. The set ofthese data evoke the involvement of ribosomal proteins, and specially RPL11, in the v-erbAtransformation process both at the translational level and possibly in its extra-ribosomal function.Overexpression of RPL11 in T2EC showed a decrease of cell proliferation.