A progesterona (P4) apresenta papel fundamental nos processos de estabelecimento e manutenção da gestação em fêmeas bovinas. A manipulação deste esteroide em momentos estratégicos durante programas de sincronização da ovulação pode aumentar o sucesso gestacional, especialmente em vacas leiteiras de alta produção devido a alta metabolização hepática de esteroides. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar a administração de P4 injetável de longa ação (P4LA), associado ou não ao tratamento com hCG, sobre a função luteínica e taxa de concepção de vacas leiteiras de alta produção. Para tanto, três experimentos foram realizados. Experimento 1, 12 dias após a ovulação sincronizada (-24 h), 29 vacas da raça Holandesa em lactação (fêmeas com P4 plasmática inferior a 1ng/mL) receberam um implante auricular de norgestomet e 500µg Cloprostenol Sódico (i.m.). Após 24h (0h), as fêmeas foram aleatoriamente distribuídas em um de quatro grupos experimentais: Controle (n=8), fêmeas sem tratamento adicional; e P4LA-300 (n=7), P4LA-600 (n=7) e P4LA-900 (n=7), fêmeas tratadas com 300, 600 e 900 mg de P4LA i.m., respectivamente. A P4 plasmática foi determinada a cada 24h totalizando 216 h. Verificou-se interação entre tratamento e tempo (P=0,002). As fêmeas tratadas com 900 mg de P4LA apresentaram maior P4 circulante durante todo o período experimental, enquanto as fêmeas tratadas com 300 e 600 mg de P4LA apresentaram superioridade somente nas primeiras 24 e 48h após o tratamento, respectivamente. No experimento 2, 3 dias após o momento esperado da IATF (Dia 3), 75 fêmeas da raça Holandesa em lactação foram alocadas em um de quatro grupos experimentais: Controle (n=20), fêmeas sem tratamento adicional; P4LA-900 (n=18), fêmeas receberam 900mg de P4LA i.m.; hCG (n=19), fêmeas receberam 2.000UI de hCG i.m.; P4LA-900+hCG (n=18), fêmeas receberam ambos os tratamentos, concomitantemente. Após o tratamento, amostras de sangue foram coletadas (Dias 3, 5, 9, 13 e 17) e exames ultrassonográficos foram realizados (Dias 5, 9 e 13) para avaliar a concentração (ng/mL) plasmática de P4 e mensurar o volume do corpo lúteo (CL). Verificou-se interação entre o tratamento com P4LA-900 e tempo (P=0,0001) e entre o tratamento com hCG e tempo (P=0,05) para concentração de P4 plasmática. Os animais tratados com P4LA-900 apresentaram maior concentração de P4 nos Dias 5 e 9. Enquanto que animais tratados com com hCG apresentaram maior concentração de P4 no Dia 9. Para o volume do CL observou-se interação entre o tratamento com hCG (P=0,002) e tempo. Animais tratados com hCG (P4LA-900+hCG e hCG) apresentaram maior volume do CL nos Dias 9 e 13 em relação aos grupos não tratados com hCG (controle e P4LA-900). No experimento 3, 982 vacas leiteiras da raça Holandesa previamente submetidas a IATF foram aleatoriamente distribuídas em um de quatro grupos experimentais, semelhantes aos descrito no Experimento 2 [Controle (n=250); P4LA-900 (n=245); hCG (n=237) e P4LA-900+hCG (n=250)]. A taxa de concepção aos 30 dias após IATF foi superior no grupo P4LA-900 (P=0,002). No entanto, nenhum efeito foi observado para o tratamento com hCG (P = 0,20) ou interação P4LA-900 e hCG (P =0,71). As taxas de concepção aos 60 dias, bem como de perda gestacional entre 30 e 60 dias pós IATF não foram influenciadas pelos tratamentos (P4LA-900 ou hCG). Houve interação entre tratamento com P4LA-900 e fazenda sobre a taxas de concepção aos 60 dias (P=0,09). Ainda observou-se interação entre o tratamento P4LA-900 e a época do ano (quente vs. não quente), sobre as taxas de concepção aos 30 (P = 0,04) e aos 60 (P = 0,07) dias após a IATF. Verificou-se efeito positivo do tratamento com P4LA-900 durante a época quente do ano. Desta forma, conclui-se que o tratamento de com P4LA-900 em fêmeas de alta produção da raça Holandesa inseminadas em tempo fixo foi positivo para taxa de concepção aos 30 dias, principalmente durante a época quente do ano. O tratamento com hCG aumentou as concentrações de P4 após o tratamento, entretanto, não foram observados efeitos positivos na taxa de concepção. / Progesterone (P4) has a key role in the establishment and maintenance processes of pregnancy in cows. The modulation of this steroid at strategic times during ovulation synchronization programs can increase pregnancy success, especially in high-producing dairy cows. Therefore, the objective of this study was to evaluate the administration long-acting injectable P4 (P4LA) on luteal function and conception rate of high producing dairy cows. Therefore three experiments were performed. In Experiment 1, 12 days after synchronized ovulation (-24h), 29 Holstein cows in lactation (with plasma P4 less than 1 ng / mL) were given a norgestomet implant and 500µg Cloprostenol Sodium (i.m.). After 24 hours (0h), females were randomly assigned to one of four groups: control (n = 8), females without further treatment and P4LA-300 (n = 7), P4LA-600 (n = 7) and P4LA -900 (n = 7) females treated with 300, 600 and 900 mg P4LA i.m., respectively. After treatment, the plasma P4 was determined every 24 hours until 216 hours. There was an interaction between treatment and time (p = 0.002). The females treated with 900 mg of P4LA showed higher P4 concentration during the entire experimental period, while females treated with 300 and 600 mg had greater P4 concentration during the first 24 e 48 h after treatment, respectively. In experiment 2, three days after synchronized ovulation (Day 3), 75 female Holstein lactating were assigned to one of four groups: control (n = 20), females without further treatment; P4LA-900 (n = 18), females received 900mg of P4LA i.m.; hCG (n = 19), females received hCG 2.000UI im; P4LA-900 + hCG (n = 18), females received both treatments simultaneously. After treatment, blood samples were collected (Days 3, 5, 9, 13 and 17) and ultrasound examinations were conducted (Days 5, 9 and 13) to assess the concentration (ng/mL) plasma P4 and measure the body volume luteum (CL). There was interaction between treatment with P4LA-900 and time (P = 0.001) and treatment with hCG and time for plasma concentration of P4. Animals treated with P4LA-900 presented greater P4 concentration during Days 5 and 9. On the other hand, animals treated with hCG had greater P4 concentration on Day 9. For the CL volume, an interaction was observed between treatment with hCG and time (P=0,002). Animals treated with hCG (P4LA-900+hCG and hCG groups) resulted in greater CL volume during Days 9 and 13 compared to the experimental groups not treated with hCG (Control and P4LA-900 groups). In experiment 3, 982 dairy Holstein cows previously submitted to FTAI were randomly assigned to one of four experimental groups, similar to those described in Experiment 2 [Control (n = 250); P4LA-900 (n = 245); hCG (n = 237) and P4LA-900 + hCG (n = 250)]. The conception rate after 30 days was higher in P4LA TAI-900 (P = 0.002), but no effect was seen with treatment with hCG (P = 0.20) or with P4LA + hCG interaction (P = 0.71). Conception rates at 60 days, as well as pregnancy loss between 30 and 60 days after TAI were not affected by treatments (P4LA-900 or hCG). There was an interaction between treatment and farm on conception rates at 30 (P = 0.001) and 60 days (P = 0.006). Still there was interaction between treatment with P4LA-900 and period of the year (warm vs not hot) on conception rates at 30 (P = 0.04) and 60 (P = 0.07) days after TAI. The positive effect of treatment with P4LA-900 on conception rate was observed when females were inseminated during the warm season. Thus, it is concluded that treatment with P4LA-900 in high producing Holstein females inseminated at fixed time was positive for pregnancy rate at 30, especially during the warm period of the year. Additionally, the hCG treatment increased de P4 concentration, however, no positive effect was verified for the conception rate.

Em bovinos, a mortalidade embrionária associada a falhas no processo de reconhecimento materno da prenhez atinge 30 a 40%. O sucesso da prenhez, depende de uma apropriada interação bioquímica entre o endométrio materno e o concepto. O objetivo dessa tese foi desenvolver uma técnica cirúrgica para monitorar o microambiente uterino de vacas cíclicas e prenhez nos dias 14 a 20 após o estro. Como objetivos específicos foram verificados se a implantação e a presença dos cateteres uterinos afetariam (1) a manutenção da prenhez, (2) a função luteal e (3) o desenvolvimento folicular. Em vacas holandesas, cíclicas e não lactantes, foram implantadas cateteres de silicone em cada corno uterino no segundo dia após o estro (fase preparatória). No dia 15 pós-estro os animais receberam uma injeção de D-clorprostenol e a ovulação foi confirmada por ultrasonografia transretal (US; dia experimental 1). No dia experimental 7, as vacas (n=6) receberam ou não (n=3) transferência de embriões via transcervical no corno uterino ipisilateral ao ovário contendo o corpo lúteo (CL). Nos dias experimentais 14, 16, 18 e 20, estruturas ovarianas foram avaliadas por US, e cada corno uterino foi lavado através dos cateteres implantados no lúmen uterino (três sessões de 6 ml cada). Amostras de sangue foram coletadas nos dias 1 a 20 da fase experimental e concentração de progesterona (P4) foi mensurada por radioimunoensaio. As vacas foram abatidas no dia experimental 20 e a prenhez diagnosticada por visualização macroscópica do concepto após a dissecação do útero. A taxa de presença do concepto no dia 20 experimental foi 0%. No dia experimental 7, um CL e um folículo grande (9 a 17 mm) estavam presentes nos ovários das vacas. A taxa de aumento da concentração de P4 entre os dias 1 a 5 foi de 0 ng/mL/dia em 7/9 vacas. Luteólise ocorreu antes do dia 15 em 3/9 vacas, entre os dias 16 e 20 foi 3/9, e após o dia 20 em 2/9 vacas. Não houve aumento de P4 na fase luteal em uma vaca. Foi verificado ovulação antes do dia 20 em 3/9 vacas. A taxa de aumento do último folículo dominante foi de 1,3mm/dia em 2/9 vacas e menor nos animais restantes. Cistos foliculares, CL sub-luteinizado e endometrite foram diagnosticados em 2/9, 2/9 e 1/9 vacas, respectivamente. Foi possível concluir que as alterações nas funções ovarianas e uterinas foram causadas pela presença e implantação dos cateteres e essas alterações foram incompatíveis com a manutenção da prenhez. A abordagem cirúrgica testada não foi adequada para estudar o microambiente uterino de vacas prenhez / In cattle, embryonic mortality associated with failure in the process of maternal recognition of pregnancy reaches 30 to 40%. Successful pregnancies depend on appropriate biochemical interactions between the maternal endometrium and conceptus. Overall objective was to develop a surgical technique to probe the uterine microenvironment of cyclic and pregnant cows days 14 to 20 post- estrus. Specific objectives were to verify whether presence and operation of uterine catheters would affect (1) maintenance of pregnancy, (2) luteal function and (3) follicular growth. Non-lactating, cyclic, Holstein cows were fitted with a silicone catheter in each uterine horn on day 2 after estrus. On day 15 they received an injection of D-cloprostenol and ovulations were confirmed by transrectal ultrasonography (US; experimental day 1). On experimental day 7, cows received (n=6) or not (n=3) embryos by trans-cervical transfer to the uterine horn ipsilateral to ovary containing the corpus luteum (CL). On experimental days 14, 16, 18 and 20, ovarian strutures were observed by US and each uterine horn was washed through the catheter (three sessions of 6 ml each). Blood samples were collected from experimental days 1 to 20 and progesterone (P4) concentrations were measured by radioimmnoassay. Cows were slaughtered on experimental day 20 and pregnancies were diagnosed by macroscopic visualization of a conceptus after dissection of uterus. Conception rate at day 20 was 0%. On experimental day 7, both a CL and a large follicle (9 to 17mm) were present in ovaries of all cows. Rate of increase of P4 concentrations from days 1 to 5 was 0ng/ml/day in 7/9 cows. Luteolysis occurred before day 15 in 3/9 cows, between days 16 and 20 in 3/9 cows and after day 20 on 2/9 cows. No luteal phase rise in P4 was noticed for one cow. Ovulation before day 20 was verified in 3/9 cows. Rate of growth of the last dominant follicle was 1.3mm/day in 2/9 cows and less in the remaining. Follicular cysts, poorly luteinized CL and endometries were diagnosed in 2/9, 2/9 and 1/9 cows respectively. In summary, alterations in ovarian and uterine functions were caused by presence and operation of uterine catheters and such alterations were incompatible with maintenance of pregnancy. In conclusion, the surgical approach tested was not adequate for studyng the uterine microenvironment of pregnant cows

A progesterona é um hormônio esteróide comumente utilizado na sincronização do estro em programas de manejo reprodutivo de bovinos. Sua administração por meio de implantes auriculares compostos de nanopartículas é uma estratégia promissora para a indústria farmacêutica veterinária. Este trabalho foi delineado com o intuito de produzir e estudar a cinética de liberação da progesterona (P4) encapsulada em nanopartículas de polímeros biodegradáveis produzida por meio supercrítico (SAS). Partículas de Poli-hidroxi-butirato e valerato (PHB-V) de três diferentes tamanhos (grupos PHB-V1, PHB-V2 e PHB-V3) e suas combinações com poli-e-caprolactano (PCL; grupos PHB-V1/PCL, PHB-V2/PCL e PHB-V3/PCL) foram impregnadas com P4, pesadas, suspendidas em 10 mL de solução de etanol/água 60:40 (v/v) e colocadas em banho-maria com agitação. Nos tempos 2min; 2h, 4h, 8h, 12h, 24h e 48h foram coletadas amostras de 1 mL. Após centrifugação (2.000 g por 10 min a 37°C) as amostras foram filtradas (0,45µm) e submetidas à análise por LC-MS/MS para quantificação de P4. Foi utilizado um espectrômetro de massas tripo-quadrupolo API-4000 Q TRAP (Applied Biosystems) equipado com fonte e ESI Turbo-V. As análises foram realizadas em modo MRM em modo positivo visando monitorar as transições 315.5>109.1 e 315.5>297.2. Utilizou-se um HPLC Agilent series 1100 para eluição isocrática do analito em metanol/água 50%, em tempo total de corrida de 2,5 min. A curva de calibração foi construída com triplicatas de 1, 5, 10, 25 e 50 ng/mL de P4. A análise estatística incluiu ANOVA e interação (tamanhos de PHB-V e presença/ausência de PCL), considerando o nível de significância de 5%. Observou-se que a associação do PHB-V1/PCL aumentou a quantidade de progesterona liberada em relação ao PHB-V1 isolado. O mesmo efeito foi observado para o grupo PHB-V3/PCL. No entanto, a associação PHB-V2/PCL levou à diminuição na liberação de progesterona em relação ao PHB-V2 isolado. A cinética de liberação diferiu entre os grupos nos diferentes tempos avaliados. Dessa maneira, os resultados demonstram que diferenças de tamanho de nanopartículas de PHB-V e suas associações ao PCL podem afetar a quantidade, bem como a cinética da liberação do fármaco na liberação in vitro usando solvente álcool/água. A utilização do meio super critico para produção da partículas, proporcionou uma carga maior de P4 e alterou a cinética de liberação. / Progesterone is a steroid hormone commonly used in estrus synchronization programs in reproductive management of cattle. His administration through ear implants composed of nanoparticles is a promising strategy for the veterinary pharmaceutical industry. This study was designed with the intent to produce and study the kinetics of release of progesterone (P4) encapsulated in nanoparticles of biodegradable polymers produced using supercritical (SAS). Particles of Poly-hydroxy-butyrate and valerate (PHB-V) of three different sizes (groups V1-PHB, PHB-PHB-V2 and V3) and their combination with poly-e-caprolactano (PCL; groups PHB-V1/PCL , and PHB-V2/PCL PHB-V3/PCL) were impregnated with P4, weighed, suspended in 10 mL of ethanol / water 60:40 (v / v) and placed in a water bath with agitation. In times 2min, 2h, 4h, 8h, 12h, 24h and 48h, samples of 1 mL. After centrifugation (2,000 g for 10 min at 37 ° C) samples were filtered (0.45 mm) and subjected to analysis by LC-MS/MS for the quantification of P4. We used a mass spectrometer tripo-quadrupole API-4000 Q TRAP (Applied Biosystems) equipped with ESI source and Turbo-V. Analyses were performed in MRM mode in positive mode in order to monitor the transitions 315.5> 109.1 and 315.5> 297.2. We used a HPLC Agilent 1100 series isocratic conditions for the analyte in methanol / water 50% in total running time of 2.5 min. The calibration curve was constructed with triplicates of one, five, 10, 25 and 50 ng / ml of P4. Statistical analysis included ANOVA and interaction (sizes of PHB-V and the presence / absence of PCL), considering the significance level of 5%. It was observed that the association of PHB-V1/PCL increased the amount of progesterone released in relation to PHB-V1 isolate. The same effect was observed for the group PHB-V3/PCL. However, the association PHB-V2/PCL led to a decrease in the release of progesterone in relation to isolated PHB-V2. The release kinetics differed between groups in different time periods studied. Thus, the results show that differences in size of nanoparticles of PHB-V and its associations with the PCL can affect the quantity and the kinetics of drug release in vitro release using solvent alcohol and water. The use of super critical means for producing particles, provided a greater burden of P4 and alters the release kinetics.

RESUMO A similaridade entre o tecido da mama e o da glândula salivar está bem estabelecida. A porção das estruturas acinares e ductais destes órgãos são basicamente semelhantes. Estes aspectos, associados ao fato de que uma coexistência de carcinomas da mama e de glândula salivar, têm sido relatados em uma incidência maior do que a esperada. Guiaram estudos tentando determinar a importância dos receptores de estrógeno e progesterona em adenomas pleomórficos (AP). A neoplasia é mais freqüente nas glândulas salivares e exibe uma predileção para o sexo feminino. Recentemente a presença do receptor de estrógeno (RE) e do receptor de progesterona (RP) tem sido investigada no AP, entre outras neoplasias de glândula salivar, questionando-se a possibilidade da existência da dependência hormonal. A expressão dos receptores hormonais nos carcinomas de mama é importante para determinar o prognóstico e a probabilidade de responder à manipulação hormonal. Neoplasias que apresentam positividade para ambos os receptores, estrógeno e progesterona, exibem maior probabilidade de resposta à terapia anti-estrogênica do que as neoplasias que são negativas para estes receptores. Baseando-se na literatura científica pertinente, o presente trabalho se propõe a investigar a presença da proteína RE e da proteína RP em APs humanos, relacionando-os com a proliferação de linhagens celulares sob a influência destes hormônios. A técnica utilizada foi a imuno-histoquímica para a pesquisa dos RE e RP em 10 APs emblocados em parafina pertencentes ao arquivo do Serviço de Patologia Cirúrgica da FOUSP, e de duas linhagens de APs estabelecidas no mesmo serviço: uma derivada de um paciente do sexo masculino e a outra de um paciente do sexo feminino. No meio de cultivo onde subculturas destas células proliferavam foram diluídos 17-b-estradiol e progesterona. Através de contagens destas células em períodos pré-determinados (24 horas, 48 horas e 72 horas), pretendeu-se verificar a influência dos respectivos hormônios na multiplicação celular. Como controle positivo utilizou-se uma linhagem denominada T-47D, que foi largamente estudada na literatura. A T-47D é derivada de um carcinoma metastático de mama, reconhecidamente hormônio dependente. E como controle negativo, utilizou-se de uma linhagem de carcinoma epidermóide, denominada HN30. Encontrou-se positividade para o RE em 7 de 10 APs estudados (4 em homens e 3 em mulheres) e positividade para o RP em 8 Aps estudados (4 em mulheres e 4 em homens). Pela análise estatística, constatou-se que existe uma diferença significativa no índice proliferativo entre o controle e as células submetidas à ação do 17-b-estradiol e da progesterona. Para a linhagem derivada do paciente do sexo masculino houve diferença entre o controle e as células expostas ao 17-b-estradiol e a progesterona somente nas últimas 72 horas. Para a linhagem derivada do sexo feminino constatou-se uma diferença significativa entre o controle e as células sob a influência da progesterona, a partir de 48 horas de proliferação celular. A diferença significativa entre o controle e as células sob a ação do 17-b-estradiol ocorreu somente a partir das 72 horas, sugerindo que o AP poderia ser uma neoplasia influenciada pela ação hormonal. / SUMARY It is well established the similarity between mammary and salivary glands especially between the acinic and ductile structures. These aspects, associated to the fact of coexistence of breast carcinomas and of salivary gland tumors been described, leaded studies in attempt to determine the importance of the ERs and Pr in pleomorphic adenomas (PA), the most frequent salivary gland tumor and with predilection for the females. Lately, the presence of ERs and of the PRs has been investigated in PA and other salivary gland tumors pointing out their hormonal dependency. The expression of hormone receptors in breast carcinomas is crucial to determine a presence for both receptors. These tumors exhibit better response to anti-estrogenic therapy than the negative ones. Basing on the pertinent scientific literature, the present study proposes to investigate the presence of the RE and of the RP in humans PA and connecting them with cellular proliferation in vitro, under the influence of these hormones. Immunohistochemistry technique was used for the detection of RE and RP in paraffin embedded 10 PAs from the files of the Department of Oral Pathology, School of Dentistry, University of São Paulo, and two PA cell lines one from a male patient and other female. The culture midia was supplied with, 17-b-estradiol and progesterone. A growth curve was performed (24 hours, 48 hours and 72 hours) to verify the influence of the respective hormones in the cellular proliferation. As a positive control T-47-D cells derived from a hormone dependent metastatic breast carcinoma were used, and as negative control HN30 cells, derived from a tongue squamous cell carcinoma. 7 of 10 PAs were positive (4 in men and 3 in women) for RP and 8 of 8 PAs (4 in women and 4 in men) for RE. The statistical analysis verified a significant difference in the proliferative index between the control cells and the ones submitted to the action of the 17-b-estradiol and of the progesterone: for male derived lineage a difference was only observed in the last 72 hours. In the other hand, for the female derived lineage a significant difference was verified starting from 48 hours, suggesting that PA can be influenced by hormonal action.

A ocorrência do pico pré-ovulatório de LH no proestro depende da pré-exposição aos estrógenos seguida da ação aguda da progesterona, hormônio responsável pela deflagração e amplitude desse pico. No entanto, a origem da progesterona durante essa fase do ciclo ainda é incerta. Enquanto alguns estudos sugerem que a adrenal contribui significativamente para secreção de progesterona nesse período, outros apontam a ovário como a fonteprincipal. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi estudar o perfil e a origem da secreção de progesterona durante o proestro e a sua relação com o pico pré-ovulatório de LH. Para tanto, às 7h00 da manhã do proestro ratas Wistar adultas foram submetidas apenas à canulação da veia jugular (controle) ou a esse procedimento seguido pela cirurgia fictícia de retirada do ovário e adrenal (Sham), oupela ovariectomia (OVX) ou pela adrenalectomia (ADX). Amostras sanguíneas foram coletadas a cada 15 minutos das 11h00 às 13h45 para dosagem de progesterona, estradiol e corticosterona e a cada hora das 14h00 às 19h00 para dosagem desses três hormônios e do LH. Adicionalmente, 7 dias depois da ovariectomia, ratas foram tratadas com óleo milho (OVO) ou 17-?-estradiol (OVE) por 3 dias consecutivos, para compreender melhor o padrão de secreção de progesterona pela adrenal e verficar essa secreção se essa secreção poderia ser modulada pelos estrógenos. Um,dois ou três dias depois da última injeção amostras de sangue foram coletadas conforme descrito acima. No proestro, nenhuma diferença significativa foi detectada entre os grupos controle e Sham em relação ao número de animais que apresentaram o pico pré-ovulatório de LH, ao número de oócitos presentes nos ovidutos na manhã do estro, bem como às concentrações plasmáticas de LH, progesterona, estradiol e corticosterona, sendo os dados referentes a esses dois grupos apresentados em um único grupo denominado Controle.A secreção de estradiol foi similar nos grupos Controle e ADX e significativamente reduzida no grupo OVX. Como esperado, a secreção de corticosterona foi completamente abolida no grupo ADX, enquanto foi similiar nos grupos Controle e OVX. Em todos os grupos experimentais as concentrações basais de progesterona foram em média de 2 pg/mL. Entre às12h00 e 14h00 o grupo Controleapresentou um aumento discreto, mas significativo,da secreção de progesterona (pico 1: de 3,5 ± 1,1 para 22,3 ± 2,7 ng/mL), e após às 15h00 um segundo pico de progesterona (pico 2: de 10,5 ± 2,2para 43,0 ± 2,5 ng/mL), como também o pico de LH (25,4 ± 2,4 ng/mL). Embora o grupo OVX não tenha apresentado o pico 2 de progesterona (de 5,7 ± 2,2 para 6,5 ± 1,2 ng/mL), o pico de LH (26,5 ± 3,9 ng/mL) foi similar ao do grupo Controle.Nessas ratas o pico 1 de progesterona foi atenuado para 12,3 ± 1,9 ng/mL. Ambos picos de progesterona 1 e 2 como o pico de LH, foram praticamente abolidos nas ratas ADX (pico 1: de 2,0 ± 0,3 para 4,5 ± 0,7 ng/mL; pico 2: de 2,2 ± 0,4 para8,9 ± 3,6 ng/mL). Nas ratas OVX, tratadas ou não com estradiol, um pico de progesterona (provavelmente de origem adrenal) foi observado diariamente por volta das 12h00, sendo que a amplitude desse pico não foi influenciada pelo estradiol (OVO: 19,0 ± 5,7 ng/mL; OVE: 22,9 ± 5,3 ng/mL). Esses dados, em conjunto, sugerem que: 1) o pico 1 de progesterona é de origem adrenal e está envolvido na gênese do pico de LH ; 2) esse pico parece ser circadiano uma vez que ratas OVX apresentam um ritmo diário de secreção de progesterona, com um pico por volta das 12h00; 3) opico 2 de progesterona é de origem ovariana e não é necessário para ocorrência do pico de LH; 4) existe uma comunicação endócrina entre ovário e a adrenal de forma que o ovário participa da regulação da secreção de progesterona pela adrenal e 5) o estradiol não está envolvido na regulação da secreção de progesterona pela adrenal. / It is well known that the occurrence of preovulatory surge on proestrus depends on estradiol pre-exposure followed by the acute action of progesterone, a hormone responsible for both the onset and amplitude of this peak. However the origin of progesterone during this period is not clear yet. While some authors argue that the adrenals contribute significantly to preovulatory progesterone, others consider the ovary as the main source. The origin of progesterone that regulates the LH preovulatory surge is not clear. Therefore, we determined here the profile and the source of progesterone secretion during proestrus and its relationship with the LH preovulatory surge. At 7:00h of the proestrus day, female rats were either submitted to jugular vein cannulation (control) or to cannulation followed by ovariectomy (OVX), adrenalectomy (ADX), or sham surgery (Sham). Blood samples were collected every 15 minutes between 11 and 13:45 h for progesterone, estradiol and corticosterone measurements and hourly between 14 and 19 h for progesterone, estradiol and corticosterone and LH measurements. Also, to betterunderstand the pattern of adrenal progesterone secretion and to verify if estrogen can modulate this secretion, seven-day ovariectomized rats were treated with corn oil (OVO) or 17-?estradiol (OVE) for 3 days. One, two, or three days after the last injection, blood samples were withdrawn as described above. Since no difference was observed between the control and Sham groups with regard to the preovulatory LH surge, the number of oocytes or the plasma concentration of LH, progesterone, estradiol and corticosterone, data from these groups were presented as a single group called Control. Upon proestrus, estradiol secretion was similar between Control and ADX groups and significantly decreased in OVX group. As expected, corticosterone secretion was completely abolished in ADX group, while it was similar between the Control and OVX groups. In all groups basal progesterone levels were around 2pg/mL. In Control group, we observed a significant increase in progesterone secretion, around 12-13h (surge 1: from 3.5 ± 1.1 to 22.3 ± 2.7 ng/mL) and after 15h a second progesterone surge (surge 2: from 10.5 ± 2.2 to 43.0 ± 2.5 ng/mL) as well as LH surge (25.4 ± 2.4 ng/mL). OVX group failed to present surge 2 of progesterone (from 5.7 ± 2.2 to 6.5 ± 1.2 ng/mL), but LH surge (26.5 ± 3.9 ng/mL) was identical to that of Control group. In these rats, surge 1 was attenuated to 12.3 ± 1.9 ng/mL. Both progesterone surges 1 and 2 as well as LH surge were absent in ADX group (surge 1: from 2.0 ± 0.3 to 4.5 ± 0,7 ng/mL; surge 2: from 2.2 ± 0.4 to 8.9 ± 3.6 ng/mL).In OVX rats, treated or not with estradiol, a surge of similar magnitude of progesterone (probably fromadrenal) was observed around noon (OVO: 19.0 ± 5.7 ng/mL; OVE: 22.9 ± 5.3 ng/mL). We may conclude that 1) the surge 1 of progesterone is from the adrenal glands and is important for the LH; 2) this surge seems to be circadian since the OVX rats displays a daily rhythm of progesterone secretion, with a surge around 12 h; 3) the surge 2 of progesterone surge originates from the ovary and isnot required for the genesis of the LH surge; 4) there is a potential crosstalk between the ovary and the adrenal gland. in a way that ovary influences adrenal progesterone secretion and 5) the adrenal progesterone secretion is not influenced by estradiol levels.

O objetivo deste estudo foi determinar os efeitos da aplicação de hCG no quarto dia após a inseminação a tempo fixo (IATF) sobre o tamanho do corpo lúteo (CL) existente, a indução de CL acessórios, a concentração de progesterona (P4) sérica e taxa de prenhez de vacas de corte em lactação. Nos três experimentos, vacas de corte multíparas (n=569), cruza Bos taurus, com período pós-parto entre 45 e 70 dias, foram sincronizadas com a administração de 2mg de benzoato de estradiol i.m. e a inserção de um dispositivo intravaginal contendo 0,750g de P4 (Dia -9). Sete dias após, administraram-se 150 μg de D-cloprostenol e 0,5 mg de cipionato de estradiol, i.m., no momento da retirada do dispositivo (Dia -2). Sessenta vacas de corte em lactação foram divididas aleatoriamente em dois grupos: hCG (n=30) tratadas com 1500UI i.m. de hCG e Controle (n=30) injetadas com 1,5 mL de solução salina i.m. no dia 4 depois do estro (Dia 0). Realizaram-se coletas sanguíneas dos animais para mensuração da concentração sérica de P4 nos Dias 4, 7, 10 e 14 do ciclo estral. Para acompanhamento da dinâmica ovariana, sessenta animais foram divididos aleatoriamente nos grupos hCG (n=30) ou Controle (n=30) e receberam o mesmo protocolo hormonal como citado anteriormente. No Dia 0, os ovários foram examinados por ultrassonografia transretal para determinar o diâmetro do folículo ovulatório; no Dia 4, o diâmetro do FD e presença do CL e no Dia 7 para mensurar a área luteal do CL e a presença de CL acessório. Quinhentas e sessenta e nove vacas (hCG, n= 269 e Controle, n= 300) foram inseminadas a tempo fixo 52-56 horas depois da retirada dos implantes de P4 e tratadas no Dia 4, conforme o protocolo descrito. O diagnóstico de prenhez foi realizado por ultrassonografia 30 dias após a IATF. Os resultados observados, mostraram que vacas tratadas com hCG no Dia 4 apresentaram maiores concentrações sérica de P4 no Dia 7, comparadas com as do grupo Controle (4,45 vs. 3,37ng/mL, respectivamente; p<0,05), mas níveis semelhantes de P4 nos Dias 10 e 14. Os animais do grupo hCG apresentaram CL com maior (p<0,01) área luteal no Dia 7, em relação ao grupo Controle (3,52 cm² vs. 2,66 cm², respectivamente) e uma incidência de 29,6 % de indução da ovulação do FD presente no Dia 4. Observou-se uma taxa de prenhez maior (p=0,071) no grupo tratado com hCG (53,9%) comparando-se com as vacas não tratadas (46,3%). Conclui-se que a administração de hCG no quarto dia do ciclo estral promove o aumento da área do CL, melhora função luteal, pode induzir a formação de CL acessório e tende a aumentar a taxa de prenhez de vacas de corte em lactação. / The aim of this study was to determine the effects of injection of hCG on the fourth day after the TAI on the size of the existing corpus luteum (CL), the induction of CL accessories, the concentration of progesterone (P4) levels and the possibility of increasing the rate of pregnancy of lactating beef cows subjected to synchronization of estrus and ovulation. Multiparous beef cows (n= 569), Bos taurus crossbreed with postpartum between 45 and 70 days were synchronized by administration of 2mg of estradiol benzoate im and the insertion of an intravaginal device containing 0,750g of P4 (Day -9). Seven days later, were administered 150mg of D- cloprostenol 0.5 mg of estradiol cypionate, im, at the time of device removal (Day -2). Sixty lactating beef cows were randomly divided into two groups: hCG (n= 30) treated with im 1500UI hCG and Control (n= 30) injected with 1.5 ml of saline im on day 4 after estrus (Day 0). There were blood collections of animals for measurement by radioimmunoassay of serum P4 on Days 4, 7, 10 and 14 of the estrous cycle. To evaluate the ovarian dinamics, sixty animals (hCG, n= 30 and Control, n = 30) received the same hormonal protocol and were uniformly distributed into groups according to the diameter of the ovulatory follicles on day 0 (estrus). On Day 0, the ovaries were examined by transrectal ultrasonography to determine the diameter of the ovulatory follicle, on Day 4, the diameter of the dominant follicle (DF) and the presence of CL on Day 7 to measure the area of the luteal CL and the presence of accessory CL. Five hundred and sixty-nine cows (hCG, n= 269 and Control, n= 300) were inseminated at a fixed time 52 to 56 hours after removal of the P4 devices treated on Day 4, according to the protocol described previously. The diagnosis of pregnancy were performed by ultrasonography 30 days after TAI. The results demonstrate that cows treated with hCG on Day 4 showed higher serum concentrations of P4 on Day 7, compared with the control group (4.45 vs. 3.37ng/mL, respectively, (p<0.05), but similar levels of P4 on Days 10 and 14. The animals of hCG group had greater (p<0,01) luteal area on Day 7, compared to the Control group (3.52cm² vs. 2.66cm², respectively) and a 29.6% incidence of induction DF ovulation present on Day 4. We observed a higher rate of pregnancy (p= 0.071) in the group treated with hCG (53.9%) comparing with untreated cows (46.3%). We conclude that administration of hCG on the fourth day of the estrous cycle increase the CL area, improves luteal function, can induce the formation of accessory CL and tends to increase the pregnancy rate of lactating beef cows.

A encefalopatia hipóxico-isquêmica neonatal, ou simplesmente hipóxia-isquemia (HI) neonatal, é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em neonatos humanos. De 20% a 50% dos recém-nascidos com HI severa morrem no período perinatal. Quando sobrevivem, 25% apresentam deficiências neuropsicológicas, como dificuldade de aprendizado, epilepsia e paralisia cerebral. Devido a isso, a eficácia de possíveis agentes neuroprotetores tem sido testada em modelos animais. Há razão para se pensar que a progesterona tem um forte potencial para o tratamento da HI neonatal, já que a sua utilização tem se mostrado benéfica em pesquisas relacionadas com lesão cerebral traumática, lesão cerebral isquêmica e outros modelos de lesão do sistema nervoso central (SNC) em adultos. Inúmeros estudos têm mostrado que o modelo animal de HI de Rice e Vannucci (1981) em animais neonatos, utilizado no presente trabalho, pode produzir lesões no sistema nervoso central relativamente previsíveis, e que estas lesões encefálicas parecem semelhantes às observadas clinicamente em humanos (SALMASO et al., 2014). Para a realização do modelo de HI foram utilizados ratos Wistar com idade de 7 dias (P7). Após a oclusão da carótida esquerda, os animais foram colocados em câmaras para exposição à atmosfera hipóxica com 8% O2/92% N2 por 90 minutos. Os animais foram divididos em cinco grupos experimentais: SHAM, HI, HI+PROG-PRÉ (PRÉ), HI+PROG-PÓS (PÓS), HI+PROG-PRÉ/PÓS (PP). Os termos PRÉ e PÓS referem-se à administração de progesterona (na dose de 5 mg/kg) antes ou após o procedimento de HI neonatal . Dependendo do grupo experimental, os animais foram tratados com progesterona imediatamente antes da isquemia e/ou 6 e 24 horas após o início da hipóxia. Foram analisados o peso corporal dos animais (imediatamente antes da isquemia e 6, 24 e 48 horas após o início da hipóxia), o volume de lesão cerebral, além da expressão das proteínas p-Akt e caspase-3 pela técnica de Western blotting. / Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy or simply neonatal hypoxia-ischemia (HI) is a main cause of morbidity and mortality in human neonates. Moreover, 25% of survivors show neuropsychological dysfunctions such as learning difficulties, epilepsy and cerebral palsy. Because of this, the effectiveness of potential neuroprotective agents has been tested in animal models. There is a reason to suppose that progesterone has a strong potential for the treatment of neonatal HI since its use has been shown to be beneficial in researches related to traumatic brain injury, ischemic brain injury and other central nervous system injury models (CNS) in adults. Several studies have shown that the newborn animal model of HI developed by Rice and Vannucci (1981), and used in the present study, can produce lesions in the central nervous system which are predictable and similar to those observed clinically in humans. In order to perform the HI model we used 7 days old (P7) Wistar rats. After occlusion of the left carotid, the animals were placed in hypoxic chambers and exposed to the hypoxic atmosphere (8% O2/92% N2 for 90 minutes). The animals were divided into five groups: SHAM, HI, HI+PROG-PRÉ (PRÉ), HI+PROG-PÓS (PÓS), HI+PROG-PRÉ/PÓS (PP).The PRÉ and PÓS terms refer to the administration of progesterone (5 mg/kg) before and/or after the HI procedure. Progesterone was administered immediately before ischemia, 6 and 24 hours after the beginning of hypoxia, depending on the experimental group. Body weight was evaluated immediately before ischemia and/or 6 and 24 hours after the start of hypoxia. The volume of brain damage, in addition to the expression of p-Akt and caspase-3 were also evaluated.

Maternal age is a significant risk factor for adverse pregnancy outcomes, and is strongly associated with an increased risk of aneuploidy of the conceptus, as well as a significantly higher frequency of serious pregnancy complications known as the "Great Obstetrical Syndromes", including miscarriage, pre-eclampsia and fetal growth restriction. In the last 40 years average maternal age has increased considerably in many wealthy countries, and in the UK the number of babies born to women aged 35 and over is set to surpass those born to women under 25. The high incidence of aneuploidy in older mothers can be attributed to abnormalities in the oocyte and embryo, however the "Great Obstetrical Syndromes" do not appear to be related to the oocyte and may instead be linked to abnormal development of the placenta. In this thesis, I show that advanced maternal age in the mouse is associated with a drastically increased variability of developmental progression in utero, including developmental delays and growth restriction, severe embryonic abnormalities and higher resorption rates. I find that these embryonic defects are always accompanied by gross morphological and transcriptomic abnormalities in the placenta. Notably, I show that the increased risk of these complications can be rescued by transfer of embryos from aged females to a young surrogate mother, thus implicating the aged maternal uterus as the basis for embryonic and placental defects. Transcriptomic analysis of the decidua compartment in placentas from aged pregnancies revealed abnormal expression of genes involved in the decidualization process, which occurs during early pregnancy and facilitates implantation and development of the conceptus. I show that these defects are already obvious in the peri-implantation window, with endometrial stromal cells from aged females being unable to mount an adequate decidualization response due to a decline in their ability to respond to pregnancy hormones. This blunted decidualization reaction in turn may lead to abnormal development of the placenta. These age-associated decidualization defects are cell-intrinsic and can be recapitulated in vitro. The detected insufficient activation levels and abnormal intracellular distribution of phospho-STAT3, combined with highly variable progesterone receptor expression, may be possible causes of these defects. In addition, I examined the possible effects of ageing on the epigenome as a potential contributor to the decline in endometrial function. My results indicate that ageing of the uterus displays some of the common epigenetic hallmarks of tissue ageing. However, more importantly, decidual cells of aged females exhibit abnormal distributions of the histone modification H3K4me3, and are refractory to the profound DNA methylation remodeling that I find takes place during pregnancy. These age-related changes in the epigenome may underpin, or contribute to, the observed decline in uterine function during pregnancy. Understanding the mechanism underlying these epigenomic and functional changes in the ageing reproductive tract may pave the way for new therapeutic strategies to improve maternal and fetal outcomes of pregnancy in older mothers.

Orientador: Gilson Hélio Toniollo / Banca: Renée Laufer Amorim / Banca: Antonio Carlos Alessi / Resumo: Os órgãos reprodutores das fêmeas caninas sofrem transformações morfológicas e funcionais durante o ciclo estral, sob influência do estrógeno e da progesterona. A proteína CYR61 (proteína rica em cisteína, 61kilodaltons), mediada por citocinas inflamatórias, interleucinas, integrinas e outros, regula processos como proliferação e diferenciação celular, quimiotaxia, angiogênese e tumorgênese. É identificada em endometriose em mulheres, ratas e fêmeas de babuíno, acometidas por endometriose ou hiperplasia endometrial. Objetivou-se com este estudo imunolocalizar e quantificar a expressão da CYR61 em órgãos reprodutores das fêmeas caninas saudáveis, sob diferentes níveis séricos de progesterona e estradiol, e acometidas por piometra. Os tecidos coletados das 100 fêmeas caninas foram submetidos à técnica de imunoistoquímica com anticorpo anti-CYR61, e apresentaram marcação citoplasmática positiva nos componentes epiteliais em maior intensidade quando comparada aos componentes estromais. Foi identificada correlação linear positiva de área com marcação citoplasmática no ovário, corno uterino e corpo do útero, na fase lútea do ciclo estral. As tubas uterinas demonstraram maior expressão e correlação linear positiva com a fase proliferativa do ciclo estral. É possível concluir que a expressão do CYR61 está diretamente relacionada com as alterações morfológicas e funcionais dos órgãos reprodutores femininos, provocadas pelos hormônios ovarianos nas diferentes fases do ciclo estral, de forma particular sobre cada tecido, de acordo com suas funções fisiológicas / Abstract: The reproductive organs of female dogs suffer morphological and functional changes during the estrous cycle, under the influence of estrogen and progesterone. CYR61 protein (cystein-rich protein, 61kilodaltons) mediated by inflammatory cytokines, interleukins, integrins and others, regulates the processes such as cell proliferation and differentiation, chemotaxis, angiogenesis and tumorgenesis. It was identified in endometriosis in women, rats and female baboon, who suffers from endometriosis or endometrial hyperplasia. The objective of this study was the immunolocalization and quantification of CYR61 expression in reproductive organs of healthy canine females under different levels of progesterone and estradiol, and females affected by pyometra. The tissues collected from 100 females dogs were subjected to immunohistochemistry analyses with anti-CYR61, and showed cytoplasmatic positive reaction in higher intensity on epithelial components, when compared with stromal components. This study identified positive linear correlation of cytoplasmatic area with positive reaction on the ovary and uterus in luteal phase of the estrous cycle. The fallopian tubes showed higher expression and positive linear correlation with estradiol, in proliferative phase of the estrous cycle. It was concluded that the CYR61 expression is directly related to the morphological and functional changes of the female reproductive organs, caused by the ovarian hormones at different stages of the estrous cycle in a particular way on each tissue, according to their physiological functions / Mestre

Em bovinos, a mortalidade embrionária associada a falhas no processo de reconhecimento materno da prenhez atinge 30 a 40%. O sucesso da prenhez, depende de uma apropriada interação bioquímica entre o endométrio materno e o concepto. O objetivo dessa tese foi desenvolver uma técnica cirúrgica para monitorar o microambiente uterino de vacas cíclicas e prenhez nos dias 14 a 20 após o estro. Como objetivos específicos foram verificados se a implantação e a presença dos cateteres uterinos afetariam (1) a manutenção da prenhez, (2) a função luteal e (3) o desenvolvimento folicular. Em vacas holandesas, cíclicas e não lactantes, foram implantadas cateteres de silicone em cada corno uterino no segundo dia após o estro (fase preparatória). No dia 15 pós-estro os animais receberam uma injeção de D-clorprostenol e a ovulação foi confirmada por ultrasonografia transretal (US; dia experimental 1). No dia experimental 7, as vacas (n=6) receberam ou não (n=3) transferência de embriões via transcervical no corno uterino ipisilateral ao ovário contendo o corpo lúteo (CL). Nos dias experimentais 14, 16, 18 e 20, estruturas ovarianas foram avaliadas por US, e cada corno uterino foi lavado através dos cateteres implantados no lúmen uterino (três sessões de 6 ml cada). Amostras de sangue foram coletadas nos dias 1 a 20 da fase experimental e concentração de progesterona (P4) foi mensurada por radioimunoensaio. As vacas foram abatidas no dia experimental 20 e a prenhez diagnosticada por visualização macroscópica do concepto após a dissecação do útero. A taxa de presença do concepto no dia 20 experimental foi 0%. No dia experimental 7, um CL e um folículo grande (9 a 17 mm) estavam presentes nos ovários das vacas. A taxa de aumento da concentração de P4 entre os dias 1 a 5 foi de 0 ng/mL/dia em 7/9 vacas. Luteólise ocorreu antes do dia 15 em 3/9 vacas, entre os dias 16 e 20 foi 3/9, e após o dia 20 em 2/9 vacas. Não houve aumento de P4 na fase luteal em uma vaca. Foi verificado ovulação antes do dia 20 em 3/9 vacas. A taxa de aumento do último folículo dominante foi de 1,3mm/dia em 2/9 vacas e menor nos animais restantes. Cistos foliculares, CL sub-luteinizado e endometrite foram diagnosticados em 2/9, 2/9 e 1/9 vacas, respectivamente. Foi possível concluir que as alterações nas funções ovarianas e uterinas foram causadas pela presença e implantação dos cateteres e essas alterações foram incompatíveis com a manutenção da prenhez. A abordagem cirúrgica testada não foi adequada para estudar o microambiente uterino de vacas prenhez / In cattle, embryonic mortality associated with failure in the process of maternal recognition of pregnancy reaches 30 to 40%. Successful pregnancies depend on appropriate biochemical interactions between the maternal endometrium and conceptus. Overall objective was to develop a surgical technique to probe the uterine microenvironment of cyclic and pregnant cows days 14 to 20 post- estrus. Specific objectives were to verify whether presence and operation of uterine catheters would affect (1) maintenance of pregnancy, (2) luteal function and (3) follicular growth. Non-lactating, cyclic, Holstein cows were fitted with a silicone catheter in each uterine horn on day 2 after estrus. On day 15 they received an injection of D-cloprostenol and ovulations were confirmed by transrectal ultrasonography (US; experimental day 1). On experimental day 7, cows received (n=6) or not (n=3) embryos by trans-cervical transfer to the uterine horn ipsilateral to ovary containing the corpus luteum (CL). On experimental days 14, 16, 18 and 20, ovarian strutures were observed by US and each uterine horn was washed through the catheter (three sessions of 6 ml each). Blood samples were collected from experimental days 1 to 20 and progesterone (P4) concentrations were measured by radioimmnoassay. Cows were slaughtered on experimental day 20 and pregnancies were diagnosed by macroscopic visualization of a conceptus after dissection of uterus. Conception rate at day 20 was 0%. On experimental day 7, both a CL and a large follicle (9 to 17mm) were present in ovaries of all cows. Rate of increase of P4 concentrations from days 1 to 5 was 0ng/ml/day in 7/9 cows. Luteolysis occurred before day 15 in 3/9 cows, between days 16 and 20 in 3/9 cows and after day 20 on 2/9 cows. No luteal phase rise in P4 was noticed for one cow. Ovulation before day 20 was verified in 3/9 cows. Rate of growth of the last dominant follicle was 1.3mm/day in 2/9 cows and less in the remaining. Follicular cysts, poorly luteinized CL and endometries were diagnosed in 2/9, 2/9 and 1/9 cows respectively. In summary, alterations in ovarian and uterine functions were caused by presence and operation of uterine catheters and such alterations were incompatible with maintenance of pregnancy. In conclusion, the surgical approach tested was not adequate for studyng the uterine microenvironment of pregnant cows