Submitted by Izabel Franco (izabel-franco@ufscar.br) on 2016-10-05T14:23:20Z No. of bitstreams: 1 DissLGGC.pdf: 1458194 bytes, checksum: 9a831e5e428caa60910456d73cc89db8 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T16:07:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissLGGC.pdf: 1458194 bytes, checksum: 9a831e5e428caa60910456d73cc89db8 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T16:07:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissLGGC.pdf: 1458194 bytes, checksum: 9a831e5e428caa60910456d73cc89db8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-20T16:07:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissLGGC.pdf: 1458194 bytes, checksum: 9a831e5e428caa60910456d73cc89db8 (MD5) Previous issue date: 2016-08-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / The neglected diseases are a group of diseases with a higher incidence in poor regions and tropical or subtropical climate. The leishmanioses are listed in this group of diseases, which may present themselves in two ways: tegumentary leishmaniasis or Visceral Leishmaniasis (VL). The VL in the new world has as the etiology Leishmania chagasi, which is transmitted by the bite of the sandfly, especially Lutzomya longipalpis. There are some medications used for the treatment of VL, however, still there are recurrence rates and high mortality. In addition to the severe side effects related to these therapies, as Nephrotoxicity, hepatotoxicity and cardiotoxicity. Not long ago it was developed the amphotericin B encapsulated the Liposomes, associated with mild side effects, however still with an onerous cost, being hard to use in regions devoid of resources. In this work we aim to evaluate the activity of 15 compounds with Schiff bases complexed or not the metals (copper, nickel, zinc and iron), to inhibit promastigotes of Leishmania chagasi in vitro, as well as the cytotoxicity of these front of macrophages and fibroblasts in vitro. For tests with the promastigotas 24 hour incubation was carried out to evaluate the feasibility of resazurin method was used. To evaluate the cytotoxicity of compounds was incubated for 24 or 48 hours, using the colorimetric method with MTT. Of the 15 compounds evaluated, 11 showed good activity in inhibiting the promastigotas in the concentrations tested, the cytotoxicity performed with these 11 compounds. Copper complexes (D1, D2, D3) presented best activities when compared with their respective free ligands. However, they also showed cytotoxicity. The compounds complexed with iron (C1 and C3) also showed activity against the promastigotes, showing no or low cytotoxicity front cells, except the C1 that presented certain toxicity front of macrophages. The Methoxy group was what showed best activity when compared to the other free ligands. Generally the free ligands, without metals, were the ones who presented lower cytotoxicity. / As Doenças Negligenciadas são um grupo de doenças com maior incidência em regiões pobres e de clima tropical ou subtropical, para quais existem pouco investimento das indústrias farmacêuticas na busca por novos fármacos. As Leishmanioses estão listadas nesse grupo de doenças, podendo se apresentar de duas formas: Leishmaniose Tegumentar ou Leishmaniose Visceral (LV). A LV no novo mundo tem como etiologia a Leishmania chagasi, sendo esta transmitida pela picada do Flebotomíneo, principalmente a Lutzomya longipalpis, no Brasil. Alguns medicamentos são utilizados para o tratamento da LV. Contudo, ainda há taxas de recidiva e de letalidade altas. Além disso, apresentam efeitos colaterais severos relacionados a essas terapias, como nefrotoxicidade, hepatotoxicidade e cardiotoxicidade. Dessa forma, nesse trabalho tivemos como objetivo avaliar a atividade de 15 compostos de bases de Schiff complexados ou não a metais (cobre, níquel, zinco e ferro) em inibir promastigotas de Leishmania chagasi in vitro. E ainda, determinar a citotoxicidade destes compostos em macrófagos e fibroblastos, in vitro. Para os ensaios com as promastigotas foi realizado incubação de 24 horas e para avaliação da viabilidade foi utilizado o método da resazurina. Para avaliação da citotoxicidade dos compostos contra macrófagos e fibroblastos, a incubação foi durante 24 ou 48 horas, utilizando o método colorimétrico MTT. Nossos resultados demonstraram que dos 15 compostos avaliados, 11 apresentaram boa atividade em inibir as promastigotas nas concentrações testadas, sendo a citotoxicidade realizadas apenas com estes 11 compostos. Os complexos com cobre (D1, D2, D3) apresentaram melhores atividades quando comparados com seus respectivos ligantes livres. Todavia, estes também apresentaram citotoxicidade contra células avaliadas. Entretanto, os compostos complexados com ferro (C1 e C3) também apresentaram atividade contra as promastigotas, no entanto, apresentaram baixa citotoxicidade frente as células, exceto o C1 que apresentou toxicidade discreta frente a macrófagos. O grupo methoxy foi o que apresentou melhor atividade quando comparado com os outros ligantes livres. Assim, nossos dados sugerem que esses compostos complexados com Fe, principalmente o composto C3, podem ser promissores na busca por compostos para o tratamento da Leishmaniose Visceral. Estudos futuros in vitro, com formas amastigotas, e em animais poderão comprovar sua eficácia em ensaios pré-clínicos.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-14T12:57:03Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jéssica Cristina dos Santos - 2015.pdf: 1711392 bytes, checksum: d1eea60511eac5a148136f47fc2cfe24 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-14T12:59:48Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jéssica Cristina dos Santos - 2015.pdf: 1711392 bytes, checksum: d1eea60511eac5a148136f47fc2cfe24 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-14T12:59:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jéssica Cristina dos Santos - 2015.pdf: 1711392 bytes, checksum: d1eea60511eac5a148136f47fc2cfe24 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Promastigote forms of Leishmania (V.) braziliensis can be mantained in vitro for use in research. The bovine fetal serum (BFS) is an important component in several culture medium, however, its composition varies from batch to batch. This work aims to evaluate the performance of different BFS batches for preparation of Leishmania (V.) braziliensis culture media, comparing information supplied by different known techniques. PPS6m and CSA7c leishmanias strains were from samples obtained from American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) patients and five different batches of BFS were tested in Grace’s medium. The parasite growth curve was evaluated by a daily hemocitometer counting, the metabolism was evaluated by the parasite’s ability to metabolize 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), the percentage of promastigote metacyclic forms was quantified by an agglutination test using Bauhinia purpuera (BPL) lectin and the ability to promote mice lesions evaluated by a weekly measurement of lesions. The biochemical components of the BFS batches was also performed. It was observed that two or more passages in culture were necessary to identify bad batches of BFS by the growth curve analysis, while the metabolic analysis showed that an inadequate BFS batch of provided a metabolic rate higher or equal to the best BFS batch. A lower percentage of metaciclic forms of PPS6m strain was observed in one of the media, however, the percentage of metacyclic promastigotes was similar among all the CSA7c culture media, independently of the parasite number. Besides, the stationary phase parasite’s ability to cause lesions in BALB/c mice did not depend on the SBF batch present in the cultures. Data reveals that the best method to select good culture serum is to observe the growth curve for two or more passages, besides this, bad SBF batches are able to produce parasites with the same ability to infect mice. / Formas promastigotas de Leishmania (V.) braziliensis podem ser mantidas in vitro para utilização em diversos estudos. O soro bovino fetal (SBF) é um componente importante em vários meios de cultura, no entanto, a sua constituição varia em diferentes lotes. Este trabalho teve como objetivo avaliar o desempenho de diferentes lotes de SBF no preparo de meio para cultura de Leishmania (V.) braziliensis, comparando as informações fornecidas por diferentes técnicas conhecidas. Foram utilizadas as cepas PPS6m e CSA7c de leishmânias obtidas de pacientes com leishmaniose tegumentar americana e foram testados cinco diferentes lotes de SBF em meio de Grace. A curva de crescimento dos parasitos no meio foi avaliada por contagem diária em hematocitômetro, o metabolismo avaliado pela capacidade do parasito em metabolizar o 3-(4,5-dimetilazol-2i)-2,5-difenil brometo de tetrazólio (MTT), a porcentagem de formas promastigotas metacíclicas quantificada pelo ensaio de aglutinação com lectina de Bauhinia purpurea (BPL) e a capacidade de produzir lesão em camundongos avaliada pelo acompanhamento semanal das lesões. Foi também realizada a dosagem dos constituintes bioquímicos dos diferentes lotes de SBF. Observou-se que são necessárias duas ou mais passagens dos parasitos em cultura para que sejam discriminados lotes de SBF ruins pelo acompanhamento da curva de crescimento enquanto a análise do metabolismo mostrou que um lote de SBF inadequado para cultura proporcionou um metabolismo maior ou igual que o melhor lote de SBF. Observou-se uma menor porcentagem de formas promastigotas metacíclicas geradas durante o cultivo da cepa PPS6m em um dos meios, porém, a porcentagem de metacíclicas foi semelhante para todos os meios de cultura de CSA7c, independente do número de parasitos obtido ao final da cultura. Além disto, a capacidade de parasitos em fase estacionária de cultura causarem lesões em camundongos BALB/c não dependeu do lote de soro presentes nas culturas. Os dados revelam que o melhor método para selecionar um bom soro para cultura é o acompanhamento da curva de crescimento por dois ou mais repiques, além disto, lotes ruins para a manutenção de leishmânia são capazes de gerar parasitos com a mesma capacidade de infectar camundongos.

Nas células eucariotas a maioria das proteínas citoplasmáticas não são degradadas nos lisossomas, mas em organelas altamente conservadas encontradas em humanos, arquibactérias, plantas e leveduras, os proteassomas. Esta estrutura multicatalítica é constituída por componentes menores, cujo núcleo funcional é o componente 20S, que contém várias atividades proteolíticas (tríptica, quimotríptica, de peptidilglutamil peptidase, BrAAP e SNAAP). Esse componente 20S, associado ao complexo regulatório 19S, que é composto de múltiplas ATPases, forma o complexo 26S, responsável pela degradação de proteínas conjugadas com a ubiquitina. Estas estruturas citosólicas certamente desempenham papel importante no desenvolvimento de protozoários parasitas e na sua interação com células dos hospedeiros permissivos. Nesta dissertação, apresentamos um estudo sobre o papel do proteassoma na interação e desenvolvimento de promastigotas de Leishmania chagasi em macrófagos murinos. Inicialmente, purificamos e caracterizamos parcialmente o proteassoma de promastigotas de L. chagasi. Observamos que o complexo presente na L. chagasi possui atividades proteolíticas frente a pelo menos dois substratos sintéticos, LLVY-AMC e LRR-AMC, que avaliam, respectivamente, as atividades quimiotripsina-símile e tripsina-símile. A atividade tripsina-simile é maior que a atividade quimiotripsina-simile; e além disso, esta última é totalmente inibida pela lactacistina, um inibidor específico do proteassoma, enquanto a atividade tripsina-simile é apenas parcialmente inibida. Utilizando a lactacistina foi possível analisar o papel desse complexo proteolítico durante a infecção e desenvolvimento intracelular da L. chagasi. Promastigotas mantidas em cultura na presença de 50μM de lactacistina tiveram seu crescimento bloqueado. Essas promastigotas eram capazes de infectar macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, mas não conseguiam sobreviver dentro desses macrófagos. Esta incapacidade de sobrevivência foi específica para os parasitas tratados com a lactacistina, não sendo observado nos parasitas tratados com outros inibidores de proteases. Estes resultados sugerem que o proteassoma pode ter um papel importante no desenvolvimento intracelular e na replicação das promastigotas de L. chagasi no hospedeiro vertebrado. / Proteasomes are multicatalitic and multisubunit endopeptidase complexes widely distributed in eukaryotic cells. These enzymes are central proteases in the cytosol and nucleus and are involved in removal of abnormal, misfolded or incorrectly assembled proteins, in processing and degradation of transcriptional regulators in stress response and in the processing of protein antigens. This multicatalytic proteinase complex is composed of a catalytic core, 20S proteasome, which have multiple proteolytic activities (trypsin-like, chymotrypsin-like, peptidylglutamtyl-peptide hydrolyzing, BrAAP and SNAAP). The 20S proteasome associates with the multisubunit complex 19S to produce the 26S proteasome. The 26S proteasome has specificity for ubiquitinylated protein substrates and hydrolyses ATP during proteolysis of ubiquitinylated proteins. In the present work we have purified a 20S form of proteasome from Leishmania chagasi and partially characterized it. The purified 20S proteasome has activity towards fluorogenic substrates that are cleaved by trypsin or chymotrypsin, and is sensitive to lactacystin, a specific inhibitor of the proteasome. We show that the L.chagasi proteasome the trypsin-like activity is higher than the chymotrypsin-like. Therefore the chymotrypsin-like activity is inhibited by lactacystin and the trypsin-like it is only partially inhibited. We show here that lactacystin blocks in vitro L chagasi promastigote replication at a final concentration of 50 µM. To evaluate the effect of proteasome inhibition on the infectivity and intracellular development of L. chagasi, murine macropages were challenged with promastigotes from early stationary phase treated with lactacystin. Infectivity of macrophages was the same in lactacystin-treated parasites as in the untreated ones. Contrarywise, the intracellular development of the parasite is impaired by pretreating promastigotes with lactacystin. These promastigotes were able to infect BALB/c peritoneal macrophages but they did not survive inside macrophages. These data indicate the important role of the proteasomes of L. chagasi promastigotes on the intracellular development and replication in host cells in vitro.

Nas células eucariotas a maioria das proteínas citoplasmáticas não são degradadas nos lisossomas, mas em organelas altamente conservadas encontradas em humanos, arquibactérias, plantas e leveduras, os proteassomas. Esta estrutura multicatalítica é constituída por componentes menores, cujo núcleo funcional é o componente 20S, que contém várias atividades proteolíticas (tríptica, quimotríptica, de peptidilglutamil peptidase, BrAAP e SNAAP). Esse componente 20S, associado ao complexo regulatório 19S, que é composto de múltiplas ATPases, forma o complexo 26S, responsável pela degradação de proteínas conjugadas com a ubiquitina. Estas estruturas citosólicas certamente desempenham papel importante no desenvolvimento de protozoários parasitas e na sua interação com células dos hospedeiros permissivos. Nesta dissertação, apresentamos um estudo sobre o papel do proteassoma na interação e desenvolvimento de promastigotas de Leishmania chagasi em macrófagos murinos. Inicialmente, purificamos e caracterizamos parcialmente o proteassoma de promastigotas de L. chagasi. Observamos que o complexo presente na L. chagasi possui atividades proteolíticas frente a pelo menos dois substratos sintéticos, LLVY-AMC e LRR-AMC, que avaliam, respectivamente, as atividades quimiotripsina-símile e tripsina-símile. A atividade tripsina-simile é maior que a atividade quimiotripsina-simile; e além disso, esta última é totalmente inibida pela lactacistina, um inibidor específico do proteassoma, enquanto a atividade tripsina-simile é apenas parcialmente inibida. Utilizando a lactacistina foi possível analisar o papel desse complexo proteolítico durante a infecção e desenvolvimento intracelular da L. chagasi. Promastigotas mantidas em cultura na presença de 50μM de lactacistina tiveram seu crescimento bloqueado. Essas promastigotas eram capazes de infectar macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, mas não conseguiam sobreviver dentro desses macrófagos. Esta incapacidade de sobrevivência foi específica para os parasitas tratados com a lactacistina, não sendo observado nos parasitas tratados com outros inibidores de proteases. Estes resultados sugerem que o proteassoma pode ter um papel importante no desenvolvimento intracelular e na replicação das promastigotas de L. chagasi no hospedeiro vertebrado. / Proteasomes are multicatalitic and multisubunit endopeptidase complexes widely distributed in eukaryotic cells. These enzymes are central proteases in the cytosol and nucleus and are involved in removal of abnormal, misfolded or incorrectly assembled proteins, in processing and degradation of transcriptional regulators in stress response and in the processing of protein antigens. This multicatalytic proteinase complex is composed of a catalytic core, 20S proteasome, which have multiple proteolytic activities (trypsin-like, chymotrypsin-like, peptidylglutamtyl-peptide hydrolyzing, BrAAP and SNAAP). The 20S proteasome associates with the multisubunit complex 19S to produce the 26S proteasome. The 26S proteasome has specificity for ubiquitinylated protein substrates and hydrolyses ATP during proteolysis of ubiquitinylated proteins. In the present work we have purified a 20S form of proteasome from Leishmania chagasi and partially characterized it. The purified 20S proteasome has activity towards fluorogenic substrates that are cleaved by trypsin or chymotrypsin, and is sensitive to lactacystin, a specific inhibitor of the proteasome. We show that the L.chagasi proteasome the trypsin-like activity is higher than the chymotrypsin-like. Therefore the chymotrypsin-like activity is inhibited by lactacystin and the trypsin-like it is only partially inhibited. We show here that lactacystin blocks in vitro L chagasi promastigote replication at a final concentration of 50 µM. To evaluate the effect of proteasome inhibition on the infectivity and intracellular development of L. chagasi, murine macropages were challenged with promastigotes from early stationary phase treated with lactacystin. Infectivity of macrophages was the same in lactacystin-treated parasites as in the untreated ones. Contrarywise, the intracellular development of the parasite is impaired by pretreating promastigotes with lactacystin. These promastigotes were able to infect BALB/c peritoneal macrophages but they did not survive inside macrophages. These data indicate the important role of the proteasomes of L. chagasi promastigotes on the intracellular development and replication in host cells in vitro.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-31 / Com o intuito de obter informações sobre a expressão de lipídeos de formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis, parasitas foram analisados durante o crescimento logarítmico e estacionário quanto à composição de glicolipídeos e fosfolipídeos. Em paralelo, dois anticorpos monoclonais (mAbs), denominados LST-1 e LST-2, foram produzidos, caracterizados e utilizados neste estudo. A expressão de fosfolipídeos em promastigotas durante o crescimento logarítmico e estacionário foi analisada por cromatografia em camada delgada de alta resolução (HPTLC). O extrato lipídico total de promastigotas de L. (L.) amazonensis apresenta fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS), fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), Liso-PI e inositol fosforilceramida (IPC), este último caracterizado por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa, contendo esfingosina (d18:1) e ácidos graxos, principalmente ácido esteárico (C18:0) e ácido palmítico (C16:0). Enquanto as proporções molares de IPC, PS, PE, Liso-PI aumentaram com o decorrer do tempo de cultura, as proporções molares de PI e PC diminuíram. O perfil cromatográfico dos glicolipídeos se manteve constante durante o crescimento logarítmico e estacionário. Os mAbs LST-1 e LST-2 foram produzidos contra a fração enriquecida em glicolipídeos e IPC de formas promastigotas de L. (L.) amazonensis. Os dois anticorpos pertencem a classe IgM. O mAb LST-1, por imunocoloração de placas de HPTLC, reconhece um componente lipídico acídico, eluído da coluna de DEAE-Sephadex com acetato de sódio 0,2 M, que apresenta migração cromatográfica característica de IPC, o qual é resistente à hidrólise alcalina e é corado com reagente de Dittmer-Lester. Já, o mAb LST-2 foi reativo com a fração de glicolipídeos não retida na coluna de DEAE-Sephadex, e visibilizada nas placas de HPTLC com orcinol/H2SO4. Por IFI, os dois mAbs mostraram alta reatividade com formas promastigotas de L. (L.) amazonensis. O tratamento dos parasitas com isopropranol:hexano:água (IPA:Hex:água) (55:20:25; v/v/v) aboliu a reatividade, indicando que os antígenos reconhecidos pelos mAbs estão presentes somente na fração lipídica. LST-1 não foi reativo com parasitas vivos, sugerindo que o IPC está críptico na membrana, sendo talvez expresso somente no folheto interno da membrana plasmática. Já, o mAb LST-2 apresentou forte reatividade com promastigotas vivos, aglutinando-os, indicando que os glicolipídeos reconhecidos por LST-2 encontram-se na superfície do parasita. Por imunofluorescência indireta com LST-1 e LST-2 verificou-se que amastigotas isoladas de lesão não são reconhecidos pelos mAbs, e por outro lado, forte fluorescência foi detectada com amastigotas axênicos. Por cromatografia em placas de HPTLC, de extratos lipídicos purificados de amastigotas, verificou-se que os amastigotas isolados de lesão de animais infectados por L. (L.) amazonensis, apresentam diferentes perfis cromatográficos de glicolipídeos e fosfolipídeos em relação aos promastigotas e aos amastigotas axênicos. Enquanto os amastigotas isolados de lesão são ricos em glicoesfingolipídeos, os amastigotas axênicos e promastigotas apresentam glicoinositolfosfolipídeos (GIPLs) reconhecidos pelo mAb LST- 2 e IPC reconhecido pelo mAb LST-1. O mAb LST-1 apresentou reatividade com formas promastigotas de todas as espécies de Leishmania analisadas, e também com formas epimastigotas de T. cruzi. Nestes parasitas, foi observado que LST-1 reconhece especificamente IPC, sendo o resíduo de inositol e a ceramida essenciais para a reatividade do mAb LST-1. Já, o mAb LST-2, por imunofluorescência indireta, apresentou forte marcação somente com formas promastigotas ou amastigotas axênicos de L. (L.) amazonenis, reconhecendo 4 componentes glicolipídicos denominados bandas a, b, c, e d, que correspondem a GIPLs. A porção carboidrato é fundamental para a reatividade do mAb LST-2. Analisando-se macrófagos infectados com promastigotas de L. (L.) amazonensis, verificou-se por imunofluorescência indireta com o mAb LST-2, que os promastigotas durante a adesão/infecção de macrófagos, secretam ou transferem para os macrófagos os antígenos glicolipídicos, reconhecidos pelo mAb LST-2. Forte fluorescência na superfície de macrófagos infectados é observada já na primeira hora de infecção, e com o decorrer da infecção (até 4 horas) observa-se, somente nos macrófagos infectados, pequenas vesículas fluorescentes, que não correspondem a fagossomos contendo os parasitas. Assim, nesta tese, foi demonstrado que amastigotas isolados de lesão em relação a amastigotas axênicas e promastigotas de L. (L.) amazonensis apresentam padrões distintos de glico(fosfolipídeos). Enquanto amastigotas isoladas de lesão expressam GSLs, amastigotas axênicas e promastigotas expressam IPC e GIPLs, sendo que estes últimos sendo liberados pelo promastigota durante a infecção de macrófagos. / In order to obtain information about the lipid expression of promastigote forms of Leishmania (Leishmania) amazonensis, the parasites lipid composition profile was analyzed during log and stationary phase. Two monoclonal antibodies (mAb) termed LST-1 and LST-2 were produced, characterized and used in this study. Promastigote phospholipid expression on log and stationary growth phases were analyzed by high performance thin layer chromatography (HPTLC). At either phase the total lipid extract of L. (L.) amazonensis promastigotes presents phosphatidylinostol (PI), phosphatidylserine (PS), phosphatidylcholine (PC) phosphatidylethanolamine (PE), Lyso- PI and inositol phosphorylceramide (IPC). IPC was characterized by GC/MS, and it was detected sphingosine (d18:1) and fatty acids, mainly palmitic acid (C16:0), and stearic acid (C18:0). It was noted that the molar proportions of IPC, PS, PE and Lyso-PI increased during the culture time, while the percentage of PI and PC decreased. Unlikely, the glycolipid chromatographic profile did not change during the promastigotes growth at log and stationary phases. The mAbs LST-1 and LST-2 were produced against a glycolipid and IPC enriched fraction purified from promastigote forms of L. (L.) amazonensis. Both antibodies are IgM. By HPTLC immunostaining it was demonstrated that mAb LST-1 recognized an acidic lipid component, eluted with 0.2 M of sodium acetate from DEAE-Sephadex column. The LST-1 reactive component presents: i) chromatographic migration characteristic of IPC, ii) is resistant to alkaline hydrolysis; iii) is stained with Dittmer-Lester reagent. On the other hand, the mAb LST-2 was reactive with the glycolipid fraction not retained in DEAE-Sephadex column, and this fraction was visualized on HPTLC by primuline and orcinol/H2SO4 staining. By indirect immunofluorescence, both antibodies showed high reactivity with L. (L.) amazonensis promastigotes. Parasites delipidation with isopropanol:hexane:water (55:20:25; v/v/v), abolished the mAbs reactivity, indicating that the antigens recognized by LST-1 and LST-2 are present exclusively in the lipid fraction. MAb LST-1 did not react with non-fixed parasites, suggesting that IPC is cryptic in the membrane, and maybe localized only in the inner leaf of plasma membrane. Contrasting, mAb LST-2, showed a strong reactivity with live L. (L.) amazonensis promastigotes, also parasite agglutination was observed, indicating that the glycolipids recognized by LST-2 are in parasite surface. By indirect immunofluorescence with LST-1 and LST-2 no reactivity was observed with amastigotes isolated from L. (L.) amazonensis infected hamsters, conversely axenic amastigotes showed a strong fluorescence with both mAbs. By HPTLC it was verified that the lipid fractions of promastigotes, axenic amastigotes and amastigotes isolated from footpad lesions, presented distinct glycolipids and phospholipids profiles. Amastigotes isolated from lesions are rich in glycosphingolipids, whereas axenic amastigotes and promastigotes present glycoinositolphospholipids (GIPLs) recognized by LST-2, and IPC recognized by mAb LST-1. The LST-1 antibody recognized promastigotes from all species of analyzed, and also T. cruzi epimastigotes. It was determined that LST-1 recognizes specifically IPC in these parasites, and it was established that the inositol residue and the ceramide are essential for LST-1 reactivity. By indirect immunofluorescence with mAb LST-2 a strong labeling of only L. (L.) amazonensis promastigotes and axenic amastigotes was observed. LST-2 recognizes 4 glycolipid components termed a, b, c and d, which correspond to GIPLs. It was demonstrated that the carbohydrate moiety is fundamental for LST-2 reactivity. L. (L.) amazonensis promastigotes infected macrophages showed by indirect immunofluorescence, that promastigotes during the macrophage adhesion/infection, secrete or transfer GIPLs recognized by mAb LST-2 to the macrophage. Strong fluorescence in infected macrophage was observed in the first hours of infection. During the next hours of infection (up to 4 hours) also small fluorescent vesicles were observed in the infected macrophages, which did not correspond to phagossomes containing parasites. Thus, these studies describe distinct (glyco)phospholipid profile in lesion amastigotes, axenic amastigotes and promastigotes, and GIPLs vesicles formation during macrophage infection by promastigotes. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-15T17:46:51Z No. of bitstreams: 1 amanda_b_r_b_macedo_ioc_bcm_0038_2011.pdf: 6569786 bytes, checksum: 14dd4b1254c99bb75e49af1ca06a9072 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-15T17:46:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 amanda_b_r_b_macedo_ioc_bcm_0038_2011.pdf: 6569786 bytes, checksum: 14dd4b1254c99bb75e49af1ca06a9072 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As Leishmanioses são doenças causadas por diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania, que afetam indivíduos em aproximadamente 88 países. Atualmente, a medida de controle da doença mais aceita é o desenvolvimento de uma vacina profilática; porém, para que uma vacina efetiva seja alcançada, torna-se necessário a compreensão dos fatores que regulam e participam na proteção durante e após a infecção natural. São comuns trabalhos em que a resposta imune do tipo Th1 é medida exclusivamente pela produção in vitro de IFN-γ, porém a avaliação de um só parâmetro nem sempre é suficiente para predizer proteção. O presente trabalho visou estudar a qualidade de resposta Th1 induzida por diferentes antígenos de Leishmania em pacientes com a forma cutânea de leishmaniose tegumentar americana (LTA) provenientes do RJ. Utilizando-se ensaios de citometria de fluxo multiparamétrica para marcadores de superfície, e para as citocinas IL-2, TNF-α e IFN-γ, bem como ELISA para IFN-γ, foram feitas comparações da resposta induzida pelos extratos totais de promastigotas de fase estacionária de L. (V.) braziliensis (LbT) e L. (L.) amazonensis (PH8T), assim como frações enriquecidas em componentes subcelulares de L. (L.) amazonensis, em células mononucleares de sangue periférico de pacientes com LTA, antes e 140 dias após o tratamento, e indivíduos controles sadios. A análise das subpopulações de linfócitos T por citometria de fluxo não identificou alterações significativas nos percentuais de células CD8 +, CD4+ e CD25+ induzidas pelos diferentes estímulos, dentro de um mesmo grupo, nem entre os grupos de pacientes e controles. A avaliação individual da MFI integrada (frequência de células produtoras de uma citocina multiplicada pela intensidade média de fluorescência) para cada citocina estudada, não evidenciou nenhuma diferença marcante na resposta imune do tipo Th1 induzida pelos diferentes estímulos; porém, através da avaliação da contribuição dos fenótipos CD4+ produtores de 3, 2 ou 1 única citocina na resposta imune do tipo Th1 total, observamos diferenças qualitativas bem distintas entre as respostas obtidas antes e após o tratamento, e entre os antígenos estudados. Todos os estímulos apresentaram aumento da porporção de células multifuncionais nos pacientes PT, em relação aos AT. Após o tratamento, LbT foi o estímulo que induziu maior proporção de células multifuncionais (produtoras de IL-2, TNF-α e IFN-γ, simultaneamente; 28%), seguido da fração de membrana de L. (L.) amazonensis (PH8M; 23%), enquanto que, PH8T induziu a menor proporção de células multifuncionais (10%), e a maior proporção de células simples produtoras de IFN-γ (38%). Corroborando alguns outros relatos da literatura, observamos que as células multifuncionais são as que possuem a maior intensidade média de fluorescência para as 3 citocinas estudadas. A avaliação quantitativa da produção de IFN-γ por ELISA, demonstrou que LbT foi o estímulo que induziu significativamente a maior produção desta citocina, em comparação aos demais estímulos, tanto antes como após o tratamento. Este último resultado parece se correlacionar com os dados de citometria já mencionados, em que este mesmo estímulo foi capaz de induzir o maior percentual de células T multifuncionais, células essas com a capacidade de produzir uma quantidade maior de citocinas, do que os outros fenótipos estudados, como evidenciado nos resultados de MFI. Nossos resultados levam a discussão sobre a importância da avaliação da qualidade de uma resposta imune do tipo Th1 medida por mais de um parâmetro, a nível de uma única célula, e sugerem que a avaliação das células multifuncionais é importante para correlacionar com a cura da doença. / Leishmaniasis is a group of disease caused by different species of protozoan parasites from the genus Leishmania, that affects 88 countries around the world. Currently, the most accepted approach to control the disease is a prophylactic vaccine. However, to develop such a vaccine, it becomes necessary to understand the factors that regulate and participate in the healing process as well as protection during and after natural infection. It is well established that Th1-immune response is important for the protection against intracellular parasites. Many studies evaluate this response only by the in vitro IFN-γ production, but the evaluation of this single parameter not always is sufficient to predict protection. The present work assessed the quality of the Th1-immune response induced by different Leishmania antigens in patients affected with the cutaneous form of American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) from Rio de Janeiro, Brazil. Using multiparametric flow cytometry to access surface markers and cytokines, such as IL-2, TNF-α and IFN-γ, as well as ELISA to measure IFN-γ in culture supernatants, we evaluated the immune responses induced by total antigens of stationary phase promastigotes of L. (V.) braziliensis (LbT) and L. (L.) amazonensis (PH8T), as well as subcellular components, composed of enriched fractions of L. (L.) amazonensis promastigotes, in peripheral blood mononuclear cells of ATL patients, before and 140 days after antimonial therapy, and healthy controls. Analysis of the T lymphocytes subpopulations by flow cytometry did not show significant variations in the percentage of CD4+, CD8+ and CD25+ cells induced by all different stimuli within the same group, or among the three studied groups. The individual evaluation of integrated MFI (frequency x MFI) for each cytokine assessed did not show any marked difference in the Th1-immune response induced by the different stimuli; however, by assessing the contribution of the CD4+ phenotypes producing 3, 2, or a single cytokine in the total Th1-immune response, we were able to identify very interesting differences. In the group of patients analyzed after treatment, LbT induced the highest proportion of multifunctional CD4+ T cells (producing IL-2, TNF-α and IFN-γ, simultaneously; 28%), followed by the membrane fraction of L. (L.) amazonensis (PH8M; 23%), whereas PH8T induced the lowest proportion of multifunctional CD4+ T cells (10%) and the highest proportion of single positive-cells for IFN-γ (38%). Corroborating previously published data, our results also showed that multifunctional CD4+T cells are those with the highest mean fluorescence intensity for the three cytokines studied. The quantitative evaluation of IFN-γ by ELISA showed that LbT significantly induced the higher production of this cytokine, in comparison to the other stimuli, both before and after treatment. This last result appears to show a relationship with our flow cytometry data, in which the same antigen was able to induce the highest percentage of multifunctional T cells, coincidently the cells that produced the larger amounts of cytokines, in comparison to the other CD4+ T cells phenotypes, as observed by the MFI values. Our results support the actual discussion about the importance of evaluating not only the quantity, but also the quality of a Th1-immune response by more than one parameter at a single-cell level, and indicate the importance of studying multifunctional CD4+ T cells in the cure of of ATL lesions.