Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2009 / Made available in DSpace on 2012-10-24T10:35:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 272741.pdf: 8966127 bytes, checksum: eca2ed49fd741e4a8192395e54ba46f8 (MD5) / O complexo Laurencia Lamouroux (Rhodophyceae) compreende quatro gêneros com grande variabilidade morfológica que representam os maiores produtores de metabólitos secundários do ambiente marinho. As substâncias provenientes destas algas são predominantemente sesquiterpenos, diterpenos e C15-acetogeninas que usualmente são caracterizados pela presença de átomos de halogênio em suas estruturas. Existem mais de 19 espécies catalogadas e na região sul observa-se a presença das espécies Laurencia obtusa, L. microcladia, L. majuscula, L. catarinensis e L. flagellifera. O estudo químico do extrato orgânico de Laurencia microcladia indicou a presença de um metabólito majoritário conhecido como elatol, encontrado em outras espécies de Laurencia Lamouroux. Estudos em cromatografia delgada demonstraram a presença dessa substância em extratos de organismos como ouriço do mar (Echinometra lucunter) e pepino do mar (Holothuria grisea). Foram realizados ensaios de herbivoria com ouriços do mar indicando que este composto apesar de apresentar atividade anti-herbivoria foi consumido pelos ouriços até a concentração de 0,2 mg/pellets. A investigação de atividades biológicas com o elatol obtido neste trabalho, indicou atividade tripanocida frente ao Trypanossoma cruzi (CI50 = 13,86 (12,39-15,51) µM) e leishmanicida frente a Leishmania amazonensis (CI50 = 2,54 (2,44-2,64) µM) e L. chagasi (CI50 = 2,56 (1,94-3,38) µM), mas não apresentou atividade antiviral frente aos vírus herpéticos do tipo 1 (2 cepas) [modelo viral de genoma DNA], e do rotavírus SA-11 [modelo viral de genoma RNA]. Também apresentou atividade antitumoral in vitro e in vivo para células B16F10 (melanoma). A investigação química do extrato orgânico de Laurencia catarinsensis resultou no isolamento de cerca de 40 compostos puros, dentre os quais, 21 possuem características estruturais semelhantes. Destes 21 compostos, treze compostos são inéditos na literatura e identificados como: o-metilfurocaespitano e seu estereoisômero, o isômero do caespitano, o derivado 5-acetoxi do caespitol, o derivado 5-acetoxi do caespitano, o derivado 5-acetoxi do 8-acetilcaespitol, o derivado 5-hidroxi do 8-acetilcaespitol, o derivado 5-acetoxi do laucapiranóide A, o derivado 5-hidroxi laucapiranóide, o derivado do isocaespitol, dois derivados do caespitol e derivado do sniderol. Adicionalmente, os compostos caespitol e isocaespitol foram submetidos a avaliação antitumoral em células T47D (tumor de mama), U373 (glioblastoma), A549 (câncer de pulmão) e PC3 (câncer de próstata) verificando-se atividade nas três últimas linhagens. Os compostos caespitol e derivado 5-acetoxi do caespitol não apresentaram atividade antiviral frente aos vírus herpéticos do tipo 1 (2 cepas) [modelo viral de genoma DNA], e do rotavírus SA-11 [modelo viral de genoma RNA]. O estudo químico do extrato aquoso de Laurencia flagellifera indicou a presença de dois compostos majoritários conhecidos como monogalactopiranosilglicerol e sulfoquinovosildiacilglicerol.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-31 / Com o intuito de obter informações sobre a expressão de lipídeos de formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis, parasitas foram analisados durante o crescimento logarítmico e estacionário quanto à composição de glicolipídeos e fosfolipídeos. Em paralelo, dois anticorpos monoclonais (mAbs), denominados LST-1 e LST-2, foram produzidos, caracterizados e utilizados neste estudo. A expressão de fosfolipídeos em promastigotas durante o crescimento logarítmico e estacionário foi analisada por cromatografia em camada delgada de alta resolução (HPTLC). O extrato lipídico total de promastigotas de L. (L.) amazonensis apresenta fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS), fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), Liso-PI e inositol fosforilceramida (IPC), este último caracterizado por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa, contendo esfingosina (d18:1) e ácidos graxos, principalmente ácido esteárico (C18:0) e ácido palmítico (C16:0). Enquanto as proporções molares de IPC, PS, PE, Liso-PI aumentaram com o decorrer do tempo de cultura, as proporções molares de PI e PC diminuíram. O perfil cromatográfico dos glicolipídeos se manteve constante durante o crescimento logarítmico e estacionário. Os mAbs LST-1 e LST-2 foram produzidos contra a fração enriquecida em glicolipídeos e IPC de formas promastigotas de L. (L.) amazonensis. Os dois anticorpos pertencem a classe IgM. O mAb LST-1, por imunocoloração de placas de HPTLC, reconhece um componente lipídico acídico, eluído da coluna de DEAE-Sephadex com acetato de sódio 0,2 M, que apresenta migração cromatográfica característica de IPC, o qual é resistente à hidrólise alcalina e é corado com reagente de Dittmer-Lester. Já, o mAb LST-2 foi reativo com a fração de glicolipídeos não retida na coluna de DEAE-Sephadex, e visibilizada nas placas de HPTLC com orcinol/H2SO4. Por IFI, os dois mAbs mostraram alta reatividade com formas promastigotas de L. (L.) amazonensis. O tratamento dos parasitas com isopropranol:hexano:água (IPA:Hex:água) (55:20:25; v/v/v) aboliu a reatividade, indicando que os antígenos reconhecidos pelos mAbs estão presentes somente na fração lipídica. LST-1 não foi reativo com parasitas vivos, sugerindo que o IPC está críptico na membrana, sendo talvez expresso somente no folheto interno da membrana plasmática. Já, o mAb LST-2 apresentou forte reatividade com promastigotas vivos, aglutinando-os, indicando que os glicolipídeos reconhecidos por LST-2 encontram-se na superfície do parasita. Por imunofluorescência indireta com LST-1 e LST-2 verificou-se que amastigotas isoladas de lesão não são reconhecidos pelos mAbs, e por outro lado, forte fluorescência foi detectada com amastigotas axênicos. Por cromatografia em placas de HPTLC, de extratos lipídicos purificados de amastigotas, verificou-se que os amastigotas isolados de lesão de animais infectados por L. (L.) amazonensis, apresentam diferentes perfis cromatográficos de glicolipídeos e fosfolipídeos em relação aos promastigotas e aos amastigotas axênicos. Enquanto os amastigotas isolados de lesão são ricos em glicoesfingolipídeos, os amastigotas axênicos e promastigotas apresentam glicoinositolfosfolipídeos (GIPLs) reconhecidos pelo mAb LST- 2 e IPC reconhecido pelo mAb LST-1. O mAb LST-1 apresentou reatividade com formas promastigotas de todas as espécies de Leishmania analisadas, e também com formas epimastigotas de T. cruzi. Nestes parasitas, foi observado que LST-1 reconhece especificamente IPC, sendo o resíduo de inositol e a ceramida essenciais para a reatividade do mAb LST-1. Já, o mAb LST-2, por imunofluorescência indireta, apresentou forte marcação somente com formas promastigotas ou amastigotas axênicos de L. (L.) amazonenis, reconhecendo 4 componentes glicolipídicos denominados bandas a, b, c, e d, que correspondem a GIPLs. A porção carboidrato é fundamental para a reatividade do mAb LST-2. Analisando-se macrófagos infectados com promastigotas de L. (L.) amazonensis, verificou-se por imunofluorescência indireta com o mAb LST-2, que os promastigotas durante a adesão/infecção de macrófagos, secretam ou transferem para os macrófagos os antígenos glicolipídicos, reconhecidos pelo mAb LST-2. Forte fluorescência na superfície de macrófagos infectados é observada já na primeira hora de infecção, e com o decorrer da infecção (até 4 horas) observa-se, somente nos macrófagos infectados, pequenas vesículas fluorescentes, que não correspondem a fagossomos contendo os parasitas. Assim, nesta tese, foi demonstrado que amastigotas isolados de lesão em relação a amastigotas axênicas e promastigotas de L. (L.) amazonensis apresentam padrões distintos de glico(fosfolipídeos). Enquanto amastigotas isoladas de lesão expressam GSLs, amastigotas axênicas e promastigotas expressam IPC e GIPLs, sendo que estes últimos sendo liberados pelo promastigota durante a infecção de macrófagos. / In order to obtain information about the lipid expression of promastigote forms of Leishmania (Leishmania) amazonensis, the parasites lipid composition profile was analyzed during log and stationary phase. Two monoclonal antibodies (mAb) termed LST-1 and LST-2 were produced, characterized and used in this study. Promastigote phospholipid expression on log and stationary growth phases were analyzed by high performance thin layer chromatography (HPTLC). At either phase the total lipid extract of L. (L.) amazonensis promastigotes presents phosphatidylinostol (PI), phosphatidylserine (PS), phosphatidylcholine (PC) phosphatidylethanolamine (PE), Lyso- PI and inositol phosphorylceramide (IPC). IPC was characterized by GC/MS, and it was detected sphingosine (d18:1) and fatty acids, mainly palmitic acid (C16:0), and stearic acid (C18:0). It was noted that the molar proportions of IPC, PS, PE and Lyso-PI increased during the culture time, while the percentage of PI and PC decreased. Unlikely, the glycolipid chromatographic profile did not change during the promastigotes growth at log and stationary phases. The mAbs LST-1 and LST-2 were produced against a glycolipid and IPC enriched fraction purified from promastigote forms of L. (L.) amazonensis. Both antibodies are IgM. By HPTLC immunostaining it was demonstrated that mAb LST-1 recognized an acidic lipid component, eluted with 0.2 M of sodium acetate from DEAE-Sephadex column. The LST-1 reactive component presents: i) chromatographic migration characteristic of IPC, ii) is resistant to alkaline hydrolysis; iii) is stained with Dittmer-Lester reagent. On the other hand, the mAb LST-2 was reactive with the glycolipid fraction not retained in DEAE-Sephadex column, and this fraction was visualized on HPTLC by primuline and orcinol/H2SO4 staining. By indirect immunofluorescence, both antibodies showed high reactivity with L. (L.) amazonensis promastigotes. Parasites delipidation with isopropanol:hexane:water (55:20:25; v/v/v), abolished the mAbs reactivity, indicating that the antigens recognized by LST-1 and LST-2 are present exclusively in the lipid fraction. MAb LST-1 did not react with non-fixed parasites, suggesting that IPC is cryptic in the membrane, and maybe localized only in the inner leaf of plasma membrane. Contrasting, mAb LST-2, showed a strong reactivity with live L. (L.) amazonensis promastigotes, also parasite agglutination was observed, indicating that the glycolipids recognized by LST-2 are in parasite surface. By indirect immunofluorescence with LST-1 and LST-2 no reactivity was observed with amastigotes isolated from L. (L.) amazonensis infected hamsters, conversely axenic amastigotes showed a strong fluorescence with both mAbs. By HPTLC it was verified that the lipid fractions of promastigotes, axenic amastigotes and amastigotes isolated from footpad lesions, presented distinct glycolipids and phospholipids profiles. Amastigotes isolated from lesions are rich in glycosphingolipids, whereas axenic amastigotes and promastigotes present glycoinositolphospholipids (GIPLs) recognized by LST-2, and IPC recognized by mAb LST-1. The LST-1 antibody recognized promastigotes from all species of analyzed, and also T. cruzi epimastigotes. It was determined that LST-1 recognizes specifically IPC in these parasites, and it was established that the inositol residue and the ceramide are essential for LST-1 reactivity. By indirect immunofluorescence with mAb LST-2 a strong labeling of only L. (L.) amazonensis promastigotes and axenic amastigotes was observed. LST-2 recognizes 4 glycolipid components termed a, b, c and d, which correspond to GIPLs. It was demonstrated that the carbohydrate moiety is fundamental for LST-2 reactivity. L. (L.) amazonensis promastigotes infected macrophages showed by indirect immunofluorescence, that promastigotes during the macrophage adhesion/infection, secrete or transfer GIPLs recognized by mAb LST-2 to the macrophage. Strong fluorescence in infected macrophage was observed in the first hours of infection. During the next hours of infection (up to 4 hours) also small fluorescent vesicles were observed in the infected macrophages, which did not correspond to phagossomes containing parasites. Thus, these studies describe distinct (glyco)phospholipid profile in lesion amastigotes, axenic amastigotes and promastigotes, and GIPLs vesicles formation during macrophage infection by promastigotes. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A paracoccidioidomicose (PCM) é a infecção fúngica sistêmica de maior prevalência na América Latina, cujo agente etiológico, Paracoccidioides brasiliensis, é um fungo com estrutura de parede celular complexa constituída de proteínas, glicoproteínas, polissacarídeos, lipídeos, polipeptídios e melanina que reúnem condições físico-químicas e biológicas para atuarem como antígenos. Anticorpos direcionados contra antígenos presentes na parede de P. brasiliensis podem interferir no curso da doença. Os mecanismos com os quais anticorpos específicos medeiam à proteção contra fungos estão em processo de elucidação por vários grupos de pesquisadores. No entanto, estas moléculas podem ser protetoras, proporcionando o aumento da eficácia de células efetoras do hospedeiro contra o fungo e modular a produção de citocinas, entre outros processos. O tratamento da PCM é relativamente eficiente, porém, é muito longo, por isso alguns pacientes desistem ou não seguem adequadamente o tratamento, resultando em reativação do foco infeccioso. Nesse sentido, avaliamos o efeito da transferência passiva de anticorpos policlonais contra glicolipídios acídicos por meio de protocolos profiláticos e terapêuticos em animais infectados com P. brasiliensis. Nos ensaios in vivo, os resultados mostraram que os animais tratados apresentaram diminuição significante da carga fúngica e de danos nos tecidos dos pulmões. A dosagem de citocinas apontou aumento de IFN-? e IL-12, modulando a resposta imune para o padrão Th1. Ensaios in vitro demonstraram que o tratamento com anticorpos policlonais gerados contra os glicolipídios acídicos foram capazes de aumentar a atividade fagocítica, a produção de óxido nítrico e morte das leveduras de Pb 18, por macrófagos peritoneais J774. O tratamento com anticorpos policlonais contra antígenos de natureza glicolipídica mostrou ser importante ferramenta para a busca da cura da PCM. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic fungal infection most prevalent in Latin America, whose etiologic agent, Paracoccidioides brasiliensis, is a yeast with a complex cell wall structure consisting of proteins, glycoproteins, polysaccharides, lipids, and melanin polypeptides that gather physical, chemical and biological conditions to serve as antigens. Antibodies against antigens present in the wall of P. brasiliensis can interfere with the course of the disease. The mechanisms by which antibodies mediate protection against fungi are in the process of elucidation by several research groups. However, these molecules may be protective, providing increased efficiency of effector cells of the host against the fungus and modulating the production of cytokines, among other things. Treatment of PCM is relatively efficient, however, it takes long time and some patients drop out before it ends or do not follow the treatment properly resulting in reactivation of infectious focus. Accordingly, we evaluated the effect of passive transfer of antibodies against acidic glycolipids by prophylactic and therapeutic protocols in animals infected with P. brasiliensis. The results of in vivo tests, showed that the treated animals had a significant reduction in fungal load and tissue damage in the lungs. The noted increase in cytokine IFN-? and IL-12 modulated the immune response to Th1. In vitro assays have shown that treatment with polyclonal antibodies generated against the acidic glycolipids were able to increase the phagocytic activity, production of nitric oxide and killing of yeast Pb 18 by peritoneal macrophages. Treatment with antibodies against glycolipids antigens proved to be an important tool to search for the cure of PCM.

Glicoesfingolipídios (GSLs) podem se inserir em regiões específicas das membranas (lipid rafts) quando adicionados em culturas celulares, modulando sua função. Nós avaliamos se GSLs de Paracoccidioides brasiliensis, glucosilceramida (CMH) e glicoinositolfosfoceramida (GIPC) possuem atividade imuno-moduladora. Foram estudados indivíduos com (grupo curado) ou sem histórico de paracoccidioidomicose (grupo controle). CMH elevou a expressão de CD80 e CD86 em monócitos, a linfoproliferação em PBMCs no grupo controle e reduziu a capacidade de DCs em induzir linfoproliferação. No grupo curado, CMH inibiu proliferação em culturas com CMA e gp43, reduziu a produção de IL-10 por DCs e aumentou a produção de IL-12. Já GIPC aumentou a produção de citocinas Th1, elevou a fagocitose de leveduras, reduziu a maturação de DCs e sua capacidade de induzir linfoproliferação. A avaliação de células iNKT não mostrou diferença no número de células, na expansão e produção de citocinas entre os grupos. Em conclusão, GSLs de P. brasiliensis alteram a função de células do sistema imune. / Glycosphingolipids (GSL) may insert into specific membrane regions (lipid rafts) when added to cell culture, modulating its function. We evaluated whether glucosylceramide (CMH) and glycoinositol-phosphoceramide (GIPC), extracted from Paracoccidioides brasiliensis, are able to modulate immune cells functions of cured paracoccidioidomycosis (PCM) patients (control group) or individuals who never had PCM (cured group). CMH increased CD80 and CD86 expression on monocytes, increased lymph-proliferation on PBMCs and reduced lympho-proliferation in co-cultures with dendritic cells (DCs). In cured groups, CMH decreased gp43 and CMA- induced lymph proliferation, reduced IL-10 and increased IL-12 production by DCs. GIPC increased phagocytic capacity, reduced the maturation levels on DCs and DC capacity to induce lymph-proliferation. iNKT cells were analyzed and there were no differences in iNKT cells number, expansion capacity and cytokines production among the groups. In conclusion, GSL extracted from P. brasiliensis are able to modulate immune cells functions.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This work has as objective to investigate the production of biosurfactant employing strain of Pseudomonas aeruginosa using as source of carbon residual soybean oil from several foods frying. In the first assay the Pseudomonas aeruginosa were used ATCC 9027, isolated Pseudomonas aeruginosa from Landfarming REDUC (PALR) and a Pseudomonas aeruginosa PACL strain, isolated from a lagoon hydrocarbon-contaminated soil. To evaluate the results of the assay a two levels complete factorial experimental design was used, studying as variables the microorganism strain, the concentrations of residual soybean oil (OSR), the concentrations of nitrate of ammonium (AN) and brewery residual yeast (YRB). The experiments were performed in 500-mL Erlenmeyer flasks containing 50 mL of production medium, at 170 rpm and 30±1ºC, for a 48-hour fermentation period. Biosurfactant production has been monitored by measurements of rhamnose concentration (RM), surface tension (TS) and emulsifying activity (IE). The P. aeruginosa PALR, ATCC 9027 and the PALC were capable to reduce the superficial tension of the initial medium of 61± 1dynes/cm for 33,9; 28 e 26 dynes/cm, to produce g/L 0,25; 0,77 e 1,39 of rhamnose, with emulsification index of 60, 100 and 100%, respectively. The results obtained by experimental design proved that isolated Pseudomonas aeruginosa PALC presented potential greater to produce biossurfactante, being, therefore, selected for the other experiments carried out in at study. The optimization of OSR, AN, and RBY was accomplished by a central composite design (CCD) and their results analyzed by surface response analysis. The best planned results, was located on the central point, have corresponded to 22 g/L of RSO, 5.625 g/L of AN, and 11.5 g/L of RBY. The greater obtained concentration of rhamnose after 48 hours of fermentation, was 2,3 g/L with emulsifying activity of 100%. Employed the best result obtained in PCC, was determined, using a bioreactor, the best conditions of aeration rate (vvm) and agitation speed (rpm) using a complete factorial experimental design. In the optimized conditions, of 0,5 vvm (KLa of 10,2 h-1) and speed of agitation of 550 rpm, were obtained the superficial tension of 26,0 dyne/cm and synthesis of rhamnose of 3,26 g/L. Under the optimized conditions, the biosurfactant production from a mixture of waste frying soybean oil was compared with non used soybean oil (NUSO) and waste soybean oils used to fry in separate meats (MFSO), salty (SAFSO), and potatoes (POFSO). Finally was made a kinetic study, seeking to determine a model to represent the experimental data of rhamnose production and the nutrients consumption. After recovery and purification of the biosurfactant the rhamnose concentration increased in 80% in the final product, that is, 6,8 g/L. / Este trabalho tem como objetivo investigar a produção de biossurfactante empregando culturas de Pseudomonas aeruginosa utilizando como fonte de carbono óleos de soja residual proveniente da fritura de diversos alimentos. Nos primeiros ensaios foram empregados a Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Pseudomonas aeruginosa isolada do Landfarming REDUC (PALR) e a Pseudomonas aeruginosa PALC, isolada de solo de uma lagoa contaminada com hidrocarbonetos. Para selecionar a Pseudomonas e avaliar os resultados dos ensaios foi utilizado um planejamento fatorial a dois níveis, estudando como variáveis a linhagem de microrganismo, as concentrações de óleo de soja residual (OSR), de nitrato de amônio (NA) e de levedura cervejeira residual (LCR). Os experimentos foram realizados em Erlenmeyers de 500 mL de capacidade contendo 50 mL do meio de produção, a 170 rpm e temperatura de 30 ± 1ºC durante 48 h de fermentação. A produção de biossurfactante foi monitorada pelas determinações da tensão superficial (TS), da concentração de raminose (RM) produzida e da atividade emulsificante (IE). As P. aeruginosa PALR, ATCC 9027 e a PALC foram capazes de reduzir a tensão superficial do meio de 62 dina/cm ± 1 para 33,9; 28 e 26 dina/cm, produzir em g/L 0,25; 0,77 e 1,39 de raminose, com índice de emulsão de 60, 100 e 100%, respectivamente. Os resultados obtidos nestes planejamentos experimentais demonstraram que a Pseudomonas aeruginosa isolada PALC apresentou maior potencial para produzir biossurfactante, sendo, portanto, selecionada para os demais experimentos realizados neste estudo. A otimização das concentrações do OSR, NA e da LCR foram obtidas a partir de um planejamento de experimento composto central (PCC) e seus resultados analisados pelas superfícies de resposta. Os melhores resultados do planejamento foram encontrados no ponto central, correspondendo a 22 g/L de OSR, 5,625 g/L de NA e 11,5 g/L de LCR. A maior concentração obtida de raminose após 48 horas de fermentação, foi 2,3 g/L com índice de emulsão de 100%. A partir do melhor resultado obtido no PCC, determinou-se, utilizando um bioreator, as melhores condições de taxa de aeração (vvm) e velocidade de agitação (rpm) empregando um planejamento fatorial completo. Nas condições otimizadas, de 0,5 vvm (KLa de 10,2 h-1) e velocidade de agitação de 550 rpm, foram obtidos a tensão superficial de 26,0 dina/cm e síntese de raminose de 3,26 g/L. A partir das condições otimizadas, a produção de biossurfactante proveniente da mistura de óleo de soja residual foi comparada com óleo de soja in natura (OSN) e óleo de soja residual usado na fritura em separado de carnes (OSRC), salgados (OSRS) e batatas (OSRB). Finalmente foi feito um estudo cinético, visando determinar um modelo que representasse os dados experimentais de produção de raminose e de consumo de nutrientes. Após recuperação e purificação do biossurfactante a concentração de raminose aumentou em 80% no produto final, ou seja, 6,8 g/L. / Doutor em Engenharia Química

Glicoesfingolipídios (GSLs) podem se inserir em regiões específicas das membranas (lipid rafts) quando adicionados em culturas celulares, modulando sua função. Nós avaliamos se GSLs de Paracoccidioides brasiliensis, glucosilceramida (CMH) e glicoinositolfosfoceramida (GIPC) possuem atividade imuno-moduladora. Foram estudados indivíduos com (grupo curado) ou sem histórico de paracoccidioidomicose (grupo controle). CMH elevou a expressão de CD80 e CD86 em monócitos, a linfoproliferação em PBMCs no grupo controle e reduziu a capacidade de DCs em induzir linfoproliferação. No grupo curado, CMH inibiu proliferação em culturas com CMA e gp43, reduziu a produção de IL-10 por DCs e aumentou a produção de IL-12. Já GIPC aumentou a produção de citocinas Th1, elevou a fagocitose de leveduras, reduziu a maturação de DCs e sua capacidade de induzir linfoproliferação. A avaliação de células iNKT não mostrou diferença no número de células, na expansão e produção de citocinas entre os grupos. Em conclusão, GSLs de P. brasiliensis alteram a função de células do sistema imune. / Glycosphingolipids (GSL) may insert into specific membrane regions (lipid rafts) when added to cell culture, modulating its function. We evaluated whether glucosylceramide (CMH) and glycoinositol-phosphoceramide (GIPC), extracted from Paracoccidioides brasiliensis, are able to modulate immune cells functions of cured paracoccidioidomycosis (PCM) patients (control group) or individuals who never had PCM (cured group). CMH increased CD80 and CD86 expression on monocytes, increased lymph-proliferation on PBMCs and reduced lympho-proliferation in co-cultures with dendritic cells (DCs). In cured groups, CMH decreased gp43 and CMA- induced lymph proliferation, reduced IL-10 and increased IL-12 production by DCs. GIPC increased phagocytic capacity, reduced the maturation levels on DCs and DC capacity to induce lymph-proliferation. iNKT cells were analyzed and there were no differences in iNKT cells number, expansion capacity and cytokines production among the groups. In conclusion, GSL extracted from P. brasiliensis are able to modulate immune cells functions.

A paracoccidioidomicose (PCM) é a infecção fúngica sistêmica de maior prevalência na América Latina, cujo agente etiológico, Paracoccidioides brasiliensis, é um fungo com estrutura de parede celular complexa constituída de proteínas, glicoproteínas, polissacarídeos, lipídeos, polipeptídios e melanina que reúnem condições físico-químicas e biológicas para atuarem como antígenos. Anticorpos direcionados contra antígenos presentes na parede de P. brasiliensis podem interferir no curso da doença. Os mecanismos com os quais anticorpos específicos medeiam à proteção contra fungos estão em processo de elucidação por vários grupos de pesquisadores. No entanto, estas moléculas podem ser protetoras, proporcionando o aumento da eficácia de células efetoras do hospedeiro contra o fungo e modular a produção de citocinas, entre outros processos. O tratamento da PCM é relativamente eficiente, porém, é muito longo, por isso alguns pacientes desistem ou não seguem adequadamente o tratamento, resultando em reativação do foco infeccioso. Nesse sentido, avaliamos o efeito da transferência passiva de anticorpos policlonais contra glicolipídios acídicos por meio de protocolos profiláticos e terapêuticos em animais infectados com P. brasiliensis. Nos ensaios in vivo, os resultados mostraram que os animais tratados apresentaram diminuição significante da carga fúngica e de danos nos tecidos dos pulmões. A dosagem de citocinas apontou aumento de IFN-? e IL-12, modulando a resposta imune para o padrão Th1. Ensaios in vitro demonstraram que o tratamento com anticorpos policlonais gerados contra os glicolipídios acídicos foram capazes de aumentar a atividade fagocítica, a produção de óxido nítrico e morte das leveduras de Pb 18, por macrófagos peritoneais J774. O tratamento com anticorpos policlonais contra antígenos de natureza glicolipídica mostrou ser importante ferramenta para a busca da cura da PCM. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic fungal infection most prevalent in Latin America, whose etiologic agent, Paracoccidioides brasiliensis, is a yeast with a complex cell wall structure consisting of proteins, glycoproteins, polysaccharides, lipids, and melanin polypeptides that gather physical, chemical and biological conditions to serve as antigens. Antibodies against antigens present in the wall of P. brasiliensis can interfere with the course of the disease. The mechanisms by which antibodies mediate protection against fungi are in the process of elucidation by several research groups. However, these molecules may be protective, providing increased efficiency of effector cells of the host against the fungus and modulating the production of cytokines, among other things. Treatment of PCM is relatively efficient, however, it takes long time and some patients drop out before it ends or do not follow the treatment properly resulting in reactivation of infectious focus. Accordingly, we evaluated the effect of passive transfer of antibodies against acidic glycolipids by prophylactic and therapeutic protocols in animals infected with P. brasiliensis. The results of in vivo tests, showed that the treated animals had a significant reduction in fungal load and tissue damage in the lungs. The noted increase in cytokine IFN-? and IL-12 modulated the immune response to Th1. In vitro assays have shown that treatment with polyclonal antibodies generated against the acidic glycolipids were able to increase the phagocytic activity, production of nitric oxide and killing of yeast Pb 18 by peritoneal macrophages. Treatment with antibodies against glycolipids antigens proved to be an important tool to search for the cure of PCM.

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:01:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Banny Silva Barbosa.pdf: 3257736 bytes, checksum: aa77c1eca753a92a01d30a721f2da598 (MD5) Previous issue date: 2013-01-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Seeing the importance of fish for amazonian people, it potential in the market, it nutritive value, and information shortages relative to the lipid composition of amazonian fish, it was aimed to determinate the lipid composition attendant in dorsal muscle of six amazonia fish species, jaraqui, curimatã, pacu, sardinha, pescada and surubim, through fatty acids analyses constituent of their diferent classes of lipids and attendant steroids in their unsaponifiable lipids. This study involved the development and methodology application for extraction of total lipids, separation of lipid class, extraction of unsaponifiable lipids, derivatization of fatty acids and steroids, analyses of gas chromotagraphy with detector of flames ionization and with mass spectrometry for quantitative and qualitative evaluation of steroids and fatty acids of lipids in class. And also approached the determination of lipids nutritional quality through atherogenicity, thrombogenicity index and quantity of hypercholesterolemic fatty acids. The results indicated the fish in study have interesting lipids, having bigger quantity of total lipids the fishes curimatã and pacu, with bigger participation of neutral lipids, and cholesterol as majority steroid for all fishes. The unsaturated fatty acids, essentials for human health, it was found in bigger quantity in fishes sardinha and pacu in phospholipids class and in pescada (whitefish), curimatã, jaraqui and surubim in neutral lipids class. Besides pacu fish has shown bigger quantity of omega 3 and 6 fatty acids, the fish pescada (whitefish) highlighted for nutritional quality. / Considerando a importância do pescado para o povo amazônico, o seu potencial no mercado, a sua valorização nutritiva, e à escassez de informações referentes à composição lipídica dos peixes amazônicos objetivou-se determinar a composição lipídica presente no músculo dorsal de seis espécies de peixes amazônicos, jaraqui, curimatã, pacu, sardinha, pescada e surubim, através das análises dos ácidos graxos constituintes de suas diferentes classes de lipídeos e dos esteróides presentes em seus lipídeos insaponificáveis. O estudo envolveu o desenvolvimento e a aplicação de metodologias para extração dos lipídeos totais, separação de classes de lipídeos, extração de lipídeos insaponificáveis, derivatização de ácidos graxos e esteróides, análises por cromatografia gasosa com detector de ionização de chamas e com espectrometria de massas para avaliação quanti e qualitativa de esteróides e de ácidos graxos dos lipídeos em classes. E ainda abordou a determinação da qualidade nutricional dos lipídeos através dos índices de aterogenecidade, de trombogenecidade e pela quantidade de ácidos graxos hipocolesterolêmicos. Os resultados indicaram que os peixes em estudo contêm lipídeos interessantes, possuindo maior quantidade de lipídeos totais os peixes curimatã e pacu, com maior participação dos lipídeos neutros, e colesterol como esteróide marjoritário para todos os peixes. Os ácidos graxos insaturados, essenciais para a saúde humana, foi encontrado em maior quantidade nos peixes sardinha e pacu na classe dos fosfolipídeos e nos peixes peixes curimatã, pescada, jaraqui e surubim na classe dos lipídeos neutros. Apesar de o peixe pacu ter mostrado maior quantidade de ácidos graxos de ômega 3 e 6 o peixe pescada se destacou pela qualidade nutricional.