Les phospholipides sont à la base de l’architecture de la membrane plasmique bactérienne. La composition de celle-ci est en permanence contrôlée par les conditions extérieures afin d’adapter sa fluidité et maintenir l’homéostasie. Les différentes étapes de la voie de biosynthèse des phospholipides dans la membrane interne de E. coli sont bien connues. En revanche, on connaît peu l’organisation supramoléculaire et la régulation génétique des enzymes, ce qui correspond aux deux grands axes de recherche développés dans cette thèse.Des études par double hybride bactérien ont mis en évidence un réseau d’interactions protéine-protéine,suggérant l’existence d’un complexe formé par les enzymes de la synthèse des phospholipides dans la membrane. Pour tester cette hypothèse, j’ai voulu étudier ces interactions en conditions natives, en utilisant des techniques comme le FRET, le BRET ou la purification TAP. Pour cela, j’ai développé de nouvelles cassettes permettant la construction systématique de souches de E.coli produisant des protéines étiquetées avec des rapporteurs fluorescents ou des tags d’affinité, en condition d’expression physiologique. Ceci m’a permis d’étudier la localisation et la stoechiométrie des enzymes de synthèse des phospholipides dans la membrane.J’ai également étudié la régulation en réponse au stress du gène plsB, qui code pour la première enzyme de la voie de biosynthèse des phospholipides, et de dgkA, qui code pour une diacylglycerolkinase permettant le recyclage des phospholipides. Ces deux gènes, divergents sur le chromosome,sont régulés de façon antagoniste en réponse à trois types de stress : le facteur de réponse au stress extracytoplasmique σE active plsB et inhibe dgkA; le système à deux composants BasRS active dgkAet inhibe plsB ; la réponse stringente active dgkA et inhibe plsB. Ces résultats montrent que le locusplsB-dgkA est finement régulé par toute une série de régulateurs qui intègrent des signaux de stress multiples afin de contrôler l’activité de la voie de biosynthèse des phospholipides / Phospholipids are the building blocks of the bacterial plasmic membrane. The composition of the membrane is continuously controlled by environment conditions, in order to adapt its fluidity and maintain the homeostasis. The enzymatic steps of the phospholipid synthesis pathway in the intermembrane of E. coli are well known. However, little is known about the supramolecular organizationand the genetic regulation of the enzymes catalyzing these reactions, these questions constituting the two main axes developed in this thesis.Two-hybrid studies have evidenced a network of protein-protein interactions, suggesting the existence of a membrane protein complex formed by phospholipid synthesis enzymes. To test this hypothesis, I wanted to assay these interactions in native conditions, by using techniques such as FRET, BRET or Tandem Affinity Purification. Toward this goal, I have developed novel cassettes permitting tosystematically construct E. coli strains that produce proteins tagged with fluorescent or affinity tags,under physiological expression. This allowed me to study the localization and stoechiometry of phospholipid synthesis enzymes in the membrane. Furthermore, I have studied the regulation in response to stress of the plsB gene that codes for the firstenzyme of the phospholipid synthesis pathway, and of dgkA that codes for a diacylglycerol kinase that recycles phospholipids. These two neighboring and divergent genes are inversely regulated in response to three stress responses: the extracellular stress σE factor activates plsB and inhibits dgkA; the two componentsystem BasRS activates dgkA and inhibits plsB; stringent response activates dgkA andinhibits plsB. These results show that the plsB-dgkA locus is regulated by a series of regulators that integrate multiple stress signals, in order to control the activity of the phospholipids synthesis pathway

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Arf1 est une petite protéine G (pG), essentiellement impliquée dans le trafic vésiculaire. Arf1 oscille entre deux conformations, l'une active liée au GTP et l'autre inactive associée au GDP. Arno est un des facteurs d'échange (GEF) capable d'activer Arf1 en stimulant l'échange GDP/GTP. Suractivée dans les cellules invasives du cancer du sein, Arf1 joue un rôle important dans la migration et la prolifération des cellules cancéreuses.Le but de ma thèse s'inscrit dans l'étude et la modulation de l'interaction pG-GEF, et plus spécifiquement, le couple Arf1-Arno. Mon travail a été planifié autour de deux axes: (1) L'étude fine de l'interaction entre Arf1 et Arno, et sa modulation avec un inhibiteur connu la Bréféldine A (BFA). (2) La mise en place d'une stratégie de conception d'inhibiteurs de l'interaction protéine-protéine du couple Arf1-Arno.Dans un premier temps, nous avons mis en place une méthode basée sur la résonance plasmonique de surface (SPR) permettant la détermination des paramètres cinétiques de l'interaction entre Arf1 et Arno. Nous avons précisé aussi les conséquences des partenaires allostériques (GDP, GTP, et Mg2+) et de la BFA sur les paramètres cinétiques de l'interaction. Ceci a permis une analyse fine de la régulation allostérique et du mode d'action de la BFA. Appliquée à d'autres inhibiteurs, cette méthode permettra d'examiner leur mécanisme d'inhibition.Dans la deuxième partie j'expose, la stratégie que nous avons utilisé pour la conception rationnelle d'inhibiteur de l'interaction entre Arf1 et Arno. Elle est basée sur le criblage virtuel de fragments au niveau des résidus clé « hotspots » de l'interaction, la validation des molécules-touches par des techniques biophysiques, et l'élimination de molécules artefacts. Les structures des complexes fragments-Arno ont été résolues, ce qui confirme la validité de cette stratégie ouvrant la voie vers l'optimisation moléculaire pour obtenir des inhibiteurs plus efficaces. / Arf1 is a small GTPases, essentially involved in the vesicular traffic. Arf1 switch between two conformations, an active form bound to GTP and an inactive form bound to GDP. Arno is one of the exchange factors (GEF) that can activate Arf1, through its catalytic Sec7 domain, promoting the exchange of GDP by GTP. Activated in breast cancer cells, Arf1 plays an important role in the migration and proliferation of cancer cells.The aim of my thesis was the study and the modulation of the interaction between small G proteins and their GEFs, more precisely the Arf1-Arno interaction. My work has been planned around two axes: (1) the study of the interaction between Arf1 and Arno, and its modulation with a known inhibitor Brefeldin A (BFA). (2) The development of a rational strategy for designing inhibitors of protein-protein interaction for the Arf1-Arno complex.In the first part of my PhD work, we set up a Surface Plasmon Resonance (SPR) method allowing to determine the kinetic parameters of the interaction between Arf1 and Arno. We also studied the effects of allosteric partners such as GDP, GTP and Mg2+ as well as the known uncompetitive inhibitor (Brefeldin A). This SPR approach allowed a very informative analysis at qualitative and quantitative levels of the various complexes taking place during the exchange reaction that should help to solve the inhibitory mechanism for the known inhibitors reported in the literature. In the second part of my thesis, we propose a strategy for targeting the interaction between Arf1and Arno. This approach is based on virtual screening of fragments at hotspot regions. Using biophysical techniques such fluorescence techniques, SPR, NMR and X-Ray crystallography, we identified and validated Hits, showing by crystallographic structural data their modes of interaction with the target protein Arno. A fluorescence polarization test was also developed to identify false positive fragments to eliminate promiscuous aggregators. Taken together, our work proposes a method based on SPR allowing the study of known inhibitors of GEFs, understanding at molecular level their mode of action. We also propose a general strategy for finding Hit fragments that designing competitive inhibitor of the interaction small G protein with its GEFs, that can be the scaffold for designing more powerful inhibitors.

Le développement des anticorps thérapeutiques s'est rapidement accéléré dans les 10 dernières années et concerne un nombre croissant de pathologies. La connaissance de l'épitope, à savoir la région de la cible à laquelle l'anticorps se fixe, est essentielle pour la compréhension des effets fonctionnels de ce dernier. Nous avons développé une méthode in silico, MAbTope, qui permet une prédiction précise de cet épitope, quand bien même aucune structure 3D de l'anticorps d’intérêt n'est résolue. Cette méthode se base sur une méthode d'amarrage protéine-protéine développée auparavant dans l’équipe BIOS. Le jeu d'apprentissage a été fortement enrichi en complexes anticorps-cibles, de nouvelles fonctions de score spécifiques ont été mises au point, et le plus important, l'objectif de l'apprentissage-machine a été modifié pour optimiser non plus la conformation de !'assemblage, mais la prédiction de l'épitope. Nous montrons que la méthode qui en résulte permet une prédiction précise et robuste de l'épitope, que la structure 3D de l'anticorps soit connue ou non. Nous montrons également comment les prédictions peuvent être facilement exploitées pour la validation expérimentale. Enfin, nous montrons comment la méthode peut être utilisée pour étudier à haut-débit le recouvrement d'épitopes par des anticorps ayant la même cible. / The development of therapeutic antibodies has been rapidly increasing in the last 10 years, with application to an increasing number of pathologies. The knowledge of the epitope, the region of the antigen to which the antibody binds, is crucial for understanding its functional effects. We have developed an in silico method, MAbTope, which allows the accurate prediction of the epitope, regardless of the availability of the 3D structure of the antibody of interest. This method is based on a protein-protein docking method previously developed in the BIOS group. The learning dataset was enlarged in antibody-antigen complexes, new specific scoring functions have been designed, and very importantly, the objective of machine-learning was switched from the conformational perspective towards the epitope determination perspective. We show that the resulting method allows robust and accurate prediction, whether or not the 3D structure of the antibody is available. We also show how the predictions can be easily exploited for experimental validation. Finally, we show how this method can be used for high-throughput epitope binning.

Les interactions protéine–protéine (IPP) jouent un rôle primordial dans les processus physiologiques. L’inhibition de ces interactions ouvre la voie à la conception de nouvelles molécules à visée thérapeutique. Les structures secondaires en hélice α sont fréquemment impliquées dans les interactions entre protéines auxquelles elles peuvent contribuer de manière significative. La conception de molécules, mimant ce motif de reconnaissance et pouvant interagir avec la protéine cible tout en inhibant la reconnaissance avec le partenaire naturel, représente une voie innovante pour trouver de nouveaux candidats médicaments. Les oligomères d’urée aliphatique, une classe de foldamères qui adoptent une structure secondaire en hélice bien définie et proche de l’hélice α, ont été proposés comme mimes d’hélice α pour inhiber les IPP. Au cours de cette thèse, nous nous sommes d’abord intéressés à la conception de foldamères d’oligourée et de chimères oligoamide/oligourée pour cibler des surfaces de protéine. Nous avons sélectionné le récepteur nucléaire de la vitamine D (VDR) comme modèle d’étude en raison de son intérêt thérapeutique, et des connaissances structurales disponibles. Les protéines partenaires de VDR (coactivateurs) interagissant via une courte région structurée en hélice α, nos recherches ont portés sur des mimes d’hélices inspirés des séquences de coactivateurs. Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés à la génération et à l’étude de dimères covalents de foldamères, qui pourraient être utilisés pour couvrir des surfaces d’interaction plus larges. En effet, les interactions protéine-protéine montrent souvent un mode d’interaction plus complexe qu’une simple hélice, faisant intervenir des structures tertiaires et quaternaires de type coiled coils, qui peuvent aussi servir de point de départ pour la conception de nouvelles classes d’inhibiteurs. / Protein-protein interactions (PPI) have a key role in physiological processes. The inhibition of these PPI may lead to new therapeutic strategies. Secondary structures in α-helix are frequently involved in protein interactions where they may contribute significantly to binding. Designing molecules which mimic the helical motif for protein surface recognition and inhibition of the natural partner represents an innovative path to discover new drug candidates. Aliphatic urea oligomers, a class of foldamers that adopt a well-defined H-bonded helical secondary structure with good similarity to the α-helix have been proposed as possible α-helix mimics to inhibit protein-protein interactions. The first part of this PhD project was dedicated to the design and synthesis of oligoureas and oligourea/α-peptide chimeras for specific protein surface recognition. We have selected the vitamin D receptor as a potential target, mainly because (i) it is therapeutically relevant; (ii) its protein partner (coactivators) interact through a short region which adopts an α-helical structure upon binding and (iii) structures at atomic resolution were available to enable the design of effective mimetics. In the second part, we investigated methods to generate foldamer covalent dimers that could potentially be used to cover larger interaction surfaces. The rationale is that the binding interface is often more complex than a single helix and may involve tertiary and quaternary structures such as coiled coils which in turns may also serve as a basis for the design of new classes of inhibitors.

Avec 8,8 millions de décès dénombrés en 2015, le cancer est l’une des plus grandes causes de mortalité dans le monde. De nouvelles stratégies thérapeutiques ont émergé et l’identification de nouvelles cibles biologiques comme notamment la protéine Asf1, un chaperon d’histone H3-H4 surexprimée dans les cellules cancéreuses et en particulier le cancer du sein. Cette protéine possède différentes fonctions dans la cellule et agit à plusieurs endroits par des interactions protéine-protéines. Au cours de cette thèse de doctorat, nous avons développé une stratégie originale de design d’inhibiteurs d’interactions protéine-protéine avec des foldamères peptidomimes à base d’urées. Ces foldamères ont 1) la capacité de se replier en hélice 2,5, rappelant les hélices α des peptides et 2) d’être hautement tolérés et initiateurs d’hélicité lorsqu’ils sont conjugués à des fragments peptidiques. Nous avons développé des oligomères mixtes comprenant une alternance de segment(s) peptidique(s) et multi-urée, appelées chimères, ayant l’avantage de combiner la reconnaissance naturelle de peptides et la forte propension des oligourées à former des hélices stables. Après une étude structurale montrant qu’avec l’insertion d’un court segment à base d’urées dans un peptide hydrosoluble adoptant une conformation en hélice  la conformation hélicoïdale pour une majorité des chimères est conservée, des composés mimant la partie hélicoïdale C-terminale de l’histone H3 ont été élaborés. Une interaction de l’ordre du micromolaire avec Asf1 a été observée en solution puis validée à l’état solide par cristallographie aux rayons X. En vue d’optimiser la reconnaissance de ces chimères avec la surface d’Asf1 et leur sélectivité, un panel de modifications a été réalisée (i.e. séquence primaire, longueur du segment urée). Nous avons ainsi conçu des chimères α/urée possédant des affinités de liaison pour Asf1 comprises entre le nano- et micromolaire. Le composé le plus prometteur a été internalisé avec succès dans des cellules cancéreuses après conjugaison bioreductible avec un peptide vecteur et pourrait conduire à la mort cellulaire de la lignée tumorale étudiée. / In 2015, 8.8 million of death were due to cancer making it an important cause of death in the world. The necessity to develop new anticancer treatments led to the search and discovery of new biological targets, such as Asf1, a histone chaperone protein of H3-H4 which is overexpressed in cancer cells, in particular in breast cancer. This protein plays a role in different biological processes in cells through protein-protein interactions (PPIs). During this thesis, we developed an original strategy to design inhibitors of PPIs with urea-based peptidomimetics. These foldamers are able to fold into stable 2.5-helix reminiscent to the natural α-helix. Designed urea-based foldamers have been synthesized as hybrid oligomers consisting of α-peptide and oligourea segments. With a combination of the two backbones, these compounds named “chimeras” presents advantages of both species with the natural recognition of α-peptides and the innate helical stability of oligourea. First, a model study was performed to evaluate the impact of the introduction of short urea segments into a long water-soluble peptide. Circular dichroism experiments confirmed that the helical conformation was conserved. New series of compounds that mimic a helical part of H3 were synthesized and their interaction with Asf1 was studied in solution and in solid state using a range of biophysical methods. Several modifications into the sequence were performed (side chain substitution, size of the urea segment or compound) in order to improve the recognition of Asf1 surface as well as their selectivity. We conceived oligourea-peptide chimeras with affinity for Asf1 in the micromolar range. Our best compound linked to a cell penetrating peptide was shown to enter into cells and to induce cell death.

La neurofibromatose de type 1 est une maladie génétique fréquente puisqu'elle touche 1 individu sur 3500. Le gène responsable de la maladie a été identifié et code pour une protéine, la neurofibromine (Nf1), exprimée de manière ubiquitaire mais plus abondamment dans les neurones, les astrocytes, les cellules de Schwann et les oligodendrocytes. Il est un enjeu de taille de comprendre la régulation de cette protéine. Une étude modèle a été développée chez la levure afin de caractériser les bases moléculaires de l'interaction entre l'homologue de Nf1, Ira2p, et une protéine qui l'inhibe, Tfs1p. Cette étude a permis d'identifier les régions de Tfs1p importantes pour l'interaction à savoir l'extrémité N-terminale, la cavité de surface, ainsi qu'une région électropositive contenant ces deux déterminants. Nous nous sommes intéressés ensuite au rôle physiologique de Tfs1p dans les cellules. Des études systématiques ont suggéré un rôle prédominant de l'inhibition d'Ira2p dans des conditions de surproduction de Tfs1p. Ce rôle a été précisé et nous avons montré que Tfs1p participait, via cette inhibition, à la boucle de rétrocontrôle négatif de la réponse au stress. Sur la base de cette étude, nous avons cherché à savoir si l'interaction Ira2p/Tfs1p était conservée chez l'homme entre Nf1 et RKIP, homologue de Tfs1p. Nous avons en parallèle développé un crible double hybride sur Nf1 dans une banque d'ADNc de cerveau humain afin de mettre en évidence de nouveaux régulateurs de ses fonctions. 1464 candidats positifs ont été isolés. Actuellement, sur 8% de candidats identifiés 3 partenaires intéressants ont déjà pu être mis en évidence.

La neurofibromatose de type 1 est une maladie génétique fréquente puisqu'elle touche 1 individu sur 3500. Le gène responsable de la maladie a été identifié et code pour une protéine, la neurofibromine (Nf1), exprimée de manière ubiquitaire mais plus abondamment dans les neurones, les astrocytes, les cellules de Schwann et les oligodendrocytes. Il est un enjeu de taille de comprendre la régulation de cette protéine. Une étude modèle a été développée chez la levure afin de caractériser les bases moléculaires de l'interaction entre l'homologue de Nf1, Ira2p, et une protéine qui l'inhibe, Tfs1p. Cette étude a permis d'identifier les régions de Tfs1p importantes pour l'interaction à savoir l'extrémité N-terminale, la cavité de surface, ainsi qu'une région électropositive contenant ces deux déterminants. Nous nous sommes intéressés ensuite au rôle physiologique de Tfs1p dans les cellules. Des études systématiques ont suggéré un rôle prédominant de l'inhibition d'Ira2p dans des conditions de surproduction de Tfs1p. Ce rôle a été précisé et nous avons montré que Tfs1p participait, via cette inhibition, à la boucle de rétrocontrôle négatif de la réponse au stress. Sur la base de cette étude, nous avons cherché à savoir si l'interaction Ira2p/Tfs1p était conservée chez l'homme entre Nf1 et RKIP, homologue de Tfs1p. Nous avons en parallèle développé un crible double hybride sur Nf1 dans une banque d'ADNc de cerveau humain afin de mettre en évidence de nouveaux régulateurs de ses fonctions. 1464 candidats positifs ont été isolés. Actuellement, sur 8% de candidats identifiés 3 partenaires intéressants ont déjà pu être mis en évidence.

L'accroissement des connaissances, structurales et fonctionnelles, des protéines nous donne désormais une vision plus précise des phénomènes d'interaction. L'utilisation de ces informations pour le développement de ligands permettrait d'obtenir de nouveaux composés, capables d'interagir avec diverses cibles d'intérêt, et d'améliorer notre compréhension de ces interactions. Ce travail présente le développement d'une nouvelle méthode de conception de ligands protéiques, laquelle repose sur le transfert d'un groupe de résidus, appartenant à un ligand connu et contribuant de façon importante à la liaison avec une cible d'intérêt, sur une protéine hôte, de moins de 100 résidus (mini-protéines). L'identification de protéines hôtes, aptes à reproduire l'interaction après transfert du motif, est réalisée de manière systématique à partir des structures présentes dans la PDB. L'approche a été appliquée pour le développement de ligands du canal Kv1.2, à partir de connaissances structurales et fonctionnelles de l'interaction de ce même canal avec la toxine BgK. Trois ligands, possédant des constantes d'inhibition micro molaires, ont été ainsi conçus. Ces résultats démontrent la possibilité de mettre en application une méthode de conception de ligands, basée sur le transfert de motifs de « hotspots », sur une plateforme structurale de nature protéique, dont les aspects stérique et électrostatique sont compatibles avec une interaction donnée.

L'athérosclérose consiste en l'accumulation de cholestérol dans les artères causant la formation de plaques rigides pouvant causer attaques et malaises cardiaques. Il existe des molécules réduisant les taux de cholestérol dans le sang, mais sont inefficaces pour les patients souffrant d'hypercholestérolémie familiale. Il est donc crucial de développer de nouvelles molécules. L'inhibition de HDAC7 influence la conversion du cholestérol en acides biliaires en augmentant l'activité de la 7α-cholestérol hydroxylase, enzyme limitante du catabolisme du cholestérol. Ainsi cibler HDAC7 pourrait constituer une nouvelle stratégie pour réduire les taux de cholestérol. Le projet s'est articulé autour de deux principaux axes : comprendre et améliorer la spécificité des inhibiteurs de HDAC7 et explorer l'interaction SMRT-HDAC7 comme stratégie alternative d'inhibition de HDAC7. Des étapes successives d'ingénierie de HDAC7 ont été menées à l'aide de la technologie ESPRIT. Des essais de cristallisation et des tests d'inhibition avec un composé prometteur ont été effectués. Ce composé est un dérivé de SAHA, pan-inhibiteur des HDACs, modifié par substitution en position méta de son groupe phényle. Des essais de cristallisation sont en cours. ESPRIT a également été appliquée à la protéine SMRT. Les fragments solubles de SMRT ont été testés pour interaction avec HDAC7 par 15N-HSQC RMN. Un fragment de SMRT a été identifié comme interagissant avec HDAC7. Cette interaction a été confirmée par anisotropie de fluorescence et résonance plasmonique de surface. Des expériences de RMN complémentaires sont en cours pour attribuer les résidus impliqués dans l'interaction.