L’objectif était d’identifier le ou le(s) mécanismes contribuant à l’hypercoagulabilité associée aux anticorps anti-phospholipides. L’activation plaquettaire induite par les anticorps ainsi que l’interférence des complexes anticorps/antigène avec les réactions dépendantes des phospholipides ont été étudiées. Des anticorps monoclonaux murins dirigés contre la ß2-glycoproteine I et la prothrombine ont été utilisés comme modèle des anticorps anti-phospholipides. Les résultats obtenus montrent que ces anticorps ont un effet anticoagulant qui se traduit par une diminution de la génération de thrombine et un effet procoagulant qui se traduit par une inhibition de l’activité de la protéine C activée. Ces anomalies surviennent indépendamment de l’activation plaquettaire. La résultante globale est une hypercoagulabilité. Une activation plaquettaire, suffisamment intense, augmente la quantité de phospholipides procoagulants et neutralise partiellement l’effet anticoagulant des anticorps anti-phospholipides. Ainsi, l’activation plaquettaire contribue à renforcer l’hypercoagulabilité due à la résistance à la protéine C activée. Les complexes anticorps/antigène interfèrent avec les complexes pro- et anticoagulants au niveau des surfaces plaquettaires. Les avidités respectives de chacun des partenaires étudiés pour les surfaces phospholipidiques participent aux mécanismes conduisant à l'hypercoagulabilité associée aux anticorps anti-phospholipides. / The objective was to identify the mechanisms which contribute to the hypercoagulability associated with anti-phospholipid antibodies. Antibody-mediated platelet activation and interference of antibodies with phospholipid-dependent reactions were investigated. Murine monoclonal antibodies directed against ß2-glycoprotein I and prothrombin were used as model of anti-phospholipid antibodies. An anticoagulant effect, evidenced by impairment of thrombin generation and a procoagulant effect, by inhibition of activated protein C activity were shown. These phenomena occurs independently of platelet activation. The overall result was hypercoagulability. When immune-mediated platelet activation is sufficiently intense, it increases the amount of procoagulant phospholipids and antagonizes partially the anticoagulant effect of anti-phospholipid antibodies. Thus platelet activation contributes to reinforce the hypercoagulability due to activated protein C resistance. The antibody/antigen complexes interfere with pro- and anticoagulant complexes to the platelet surfaces. The avidity of each studied partners for the phospholipid surfaces take part in the mechanisms leading to hypercoagulability associated with antiphospholipid antibodies.

Le choc septique est la principale cause de mortalité dans les services de réanimation. Les glucocorticoïdes (GC) et la protéine C activée (APC) sont deux traitements adjuvants recommandés au cours du choc septique. Ce travail a pour objectif d'évaluer l'impact de la combinaison d'APC et des GC sur les paramètres hémodynamiques et la survie. Le sepsis expérimental se caractérise par une hypotension artérielle avec acidose lactique et une hyporéactivité vasculaire. L'administration de Dexa et/ou d'APC permet de diminuer les taux de lactates, d'interleukines et de nitrate/nitrite. Chez les groupes traités, la contraction est améliorée ainsi que la relaxation vasculaire des aortes et des artères mésentériques. L'administration d'APC et de Dexa, seul ou en association, entraine une diminution de l'expression induite d'iNOS et la restauration de la voie Akt. La combinaison APC et Dexa améliore le temps de survie de façon synergique. Nos résultats suggèrent que l'APC et les GC devraient être réévalués en association dans le traitement du choc septique / Sepsis remains the major cause of death in intensive care units. International guidelines for management of severe sepsis and septic shock recommend both stress-dose steroid therapy and recombinant activated protein C (APC). The aims of the present study were to compare the effects of APC and dexamethasone (Dexa) alone as well as in combination in resuscitated septic shock on survival, hemodynamics, and vascular reactivity. Sepsis was associated with a decrease in mean arterial pressure, elevation in plasma lactate and nitrite/nitrate concentration. Administration of APC, Dexa, and their combination improve arterial pressure and decrease lactate and nitrite/nitrate concentration. Both APC and Dexa improved arterial contractility and endothelial dysfunction resulting from septic shock in rats. The expression of iNOS was significantly reduced by the administration of Dexa, APC, and combination therapy. All treatments restore the Akt pathway. Moreover, their combination increased the length of survival. These findings suggest that APC and glucocorticoids should be further re-evaluated in combination in septic shock

Malgré le bénéfice observé par de nouvelles thérapeutiques, le devenir des patients hospitalisés pour une insuffisance cardiaque aigue (ICA) reste sombre. Ce pronostic péjoratif est en partie influencé par la survenue fréquente d’événements thrombotiques qui sont à parfois directement à l’origine du décès des patients. Les mécanismes physiopathologiques de cette hypercoagulabilité pourraient être considérés comme des cibles thérapeutiques d’intérêt. L’objectif de ce travail est de démontrer qu’une défaillance des systèmes biologiques contrôlant la thrombose est impliquée dans la physiopathologie de l’ICA. Notre travail met en évidence la présence d’une hypercoagulabilité de ces patients qui se caractérise par une génération de thrombine exagérée pendant la phase aigüe de la décompensation cardiaque et qui se normalise ensuite à distance. Cette élévation de la génération de thrombine est la conséquence d’une augmentation du nombre de microparticules procoagulantes circulantes et d’une altération de l'activité d’un système naturel anticoagulant représenté par la voie de la protéine C / Acute heart failure (AHF) is a syndrome with an increasing prevalence and a high mortality whose management is challenging given the incomplete understanding of its pathophysiology. This doomed prognosis is partly influenced by thromboembolic events and is often the cause of death. The present study demonstrates a significant shift towards a prothrombotic biological profile at the acute phase of decompensated heart failure. Using a comprehensive exploration of the dynamics of thrombin generation and inhibition, we found an increased overall thrombin-generating capacity in AHF patients during hospital course. Both increased in circulating procoagulant microparticles and impairment in the downregulation of thrombin generation by the anticoagulant C protein pathway represent mechanisms contributing to this hypercoagulable state in AHF

Il est désormais admis que le caractère invasif d'une tumeur est lié, non seulement, au génotype des cellules cancéreuses, mais aussi à leurs interactions avec le microenvironnement tumoral (MT). Au sein du MT, une déstabilisation de la matrice stromale favorise la progression tumorale et la dissémination métastatique. Le remaniement de la matrice extracellulaire est souvent piloté par des enzymes protéolytiques. En revanche, les effets de l'inhibition de la formation de cette matrice sont peu étudiés. C’est dans cette optique que nous nous sommes intéressés à la protéine C (PC) et son récepteur endothélial (EPCR) et à leur rôle dans la tumorigenèse des leucémies et des cancers solides.L’EPCR est exprimé par un grand nombre de lignées cellulaires cancéreuses. Il est aussi détecté dans le compartiment tumoral chez des patients atteints de pathologie tumorale. Son gène est hautement conservé. Il possède cependant plusieurs polymorphismes. Un de ces SNPs (single nucleotide polymorphism) - 6936A/G - se traduit par la libération d'une forme soluble circulante de l'EPCR (EPCRs) résultant de la protéolyse de la forme membranaire. Chez des patients leucémiques, une fréquence élevée du SNP 6936A/G est observée et associée à la survenue de thrombose. D'autre part, l’EPCR est détecté in situ dans la majorité des biopsies tumorales testées et sécrété en grande quantité dans les ascites. La fixation de la PC sur l’EPCR et son activation augmentent la survie et le potentiel migratoire des cellules cancéreuses. Aussi, la PCA est capable de moduler, par communication paracrine, la sécrétion de plusieurs interleukines et cytokines. Ainsi, la stimulation de cellules du cancer de l'ovaire par la PCA induit la synthèse d'une thrombopoéïtine ovarienne fonctionnelle. Cette cytokine étant régulatrice de la production de plaquettes, la PCA semble être de nouveau à l'interface entre troubles de l'hémostase et pathologie cancéreuse. L’élucidation du rôle complexe de la PCA et de son récepteur endothélial dans la carcinogenèse permettrait non seulement de dégager de nouvelles approches thérapeutiques, mais aussi de prévenir le risque de thrombose associée au cancer et d’en réduire la morbidité. / It is now recognized that the invasiveness of tumor cells is not only related to the genotype of these cells but also to their interaction with tumor microenvironment (TM). Within the TM, stromal matrix destabilization promotes tumor progression and metastatic dissemination. The extracellular matrix remodeling is often driven by proteolytic enzymes. However, few studies have investigated the effects of an impairment of the matrix formation. Given these facts and circumstances, we were interested in protein C (PC) and its endothelial receptor (EPCR), as well as in their role in tumorigenesis in leukemia and solid cancers. EPCR is expressed by a wide range of cancer cell lines. It is also detected within the tumor compartment in patients with malignant diseases. EPCR gene is highly conserved but nevertheless contains polymorphisms. One of these SNPs (single nucleotide polymorphism) - 6936A/G – reflects – in the release of a soluble circulating form (EPCRs) resulting from the proteolysis of membrane-associated form. In leukemic patients a high incidence of 6936A/G SNP is observed and associated with thrombosis events. Moreover, EPCR is detected in the majority of tumor biopsies and is abundantly secreted in ascitic fluid. The PC attachment to EPCR and its activation promotes cell survival and migratory potential of tumor cells. Also, APC is able to modulate, by a paracrine manner, interleukins and cytokines secretion. Thus, ovarian cancer cells stimulation by APC induces the synthesis of a functional ovarian thrombopoietin. As this cytokine has a regulatory effect on platelet production, APC may be once again at the interface between hemostasis disorders and coagulation. The elucidation of the intricate role of APC and its endothelial receptor could permit not only to identify new therapeutic approaches but also to prevent cancer-associated thrombosis risk and to decrease morbidity in cancer patients.

L'agression pulmonaire aiguë et le SDRA sont caractérisés par une augmentation de la perméabilité de la barrière alvéolo-capillaire à l'origine de l'exsudation d'un liquide d'oedème riche en protéines conduisant à une altération sévère des échanges gazeux. En dépit des progrès réalisés ces dernières années dans la prise en charge des patients, la mortalité demeure élevée (30-40%). L'agression pulmonaire aiguë est marquée par un état procoagulant et antifibrinolyique à l'origine de dépôts de fibrine et de membranes hyalines dans le poumon distal. La protéine C activée est un important régulateur de la coagulation et exerce des propriétés anti-inflammatoires pulmonaires. Ainsi, dans un premier temps, notre travail a consisté à caractériser l'équilibre pulmonaire au cours de l'administration de protéine C activée in vivo sur un modèle murin de pneumopathie aiguë à P. aeruginosa (Pa). Nos résultats ont montré que l'administration de PCa à la phase précoce de l'agression pulmonaire aiguë induite par Pa tendait à augmenter la formation de l'oedème pulmonaire avec une perte de la compartimentalisation de la réponse inflammatoire. Dans un deuxième temps, nous avons évalué l'équilibre hydrique pulmonaire dépendant du tonus β-adrénergique endogène au cours de la pneumonie aiguë à E. coli. L'inhibition du tonus β-adrénergique endogène induisait une augmentation de l'oedème pulmonaire en diminuant la résorption de l'oedème alvéolaire et en majorant le trouble de perméabilité vasculaire pulmonaire. Enfin, la stimulation β2-adrénergique exogène diminuait l'oedème pulmonaire au décours de la pneumonie à Pa. Ainsi, des approches pharmacologiques différentes peuvent moduler l'équilibre hydrique pulmonaire au cours des pneumonies aiguës. Les connaissances fondamentales acquises au cours de ce travail de thèse seront directement valorisables par la mise au point de nouvelles stratégies thérapeutiques au cours de l'agression pulmonaire aiguë secondaire à la pneumopathie aiguë

Ce travail porte sur le rôle des microparticules procoagulantes (MPs) générées par les cellules vasculaires en réponse à un état septique. Après une introduction rappelant la structure et les propriétés des microparticules et la réponse del’hôte à un agent pathogène, en particulier en terme d’activation de la coagulation, nous rapportons nos travauxexpérimentaux et cliniques. Le premier travail a été réalisé sur un modèle cellulaire de vésiculation induite par le LPS. Il nous a permis de caractériser le transfert du complexe CD14/TLR4 à différents types cellulaires in-vitro dépourvus du récepteur au LPS. Ainsi, les MPs monocytaires pourraient avoir un rôle d’amplification de la réponse inflammatoire mais aussi dans la réponse anti-inflammatoire secondaire en participant à l’apoptose lymphocytaire. Le second travail aété réalisé chez l’animal. Après induction d’un choc septique, nous avons observé une amélioration hémodynamique enréponse à la perfusion de protéine C activée associée à une modulation du phénotype des MPs. Réinjectées à des ratsnaïfs, les MPs issues des rats septiques traités par protéine C activée développaient une moindre vasoplégie. Enfin, nous avons réalisé une étude prospective sur 100 patients en choc septique. Nous avons ainsi pu caractériser la présence d’une concentration élevée de microparticules procoagulantes, avec une variation phénotypique en présence de coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) : réduction du contingent plaquettaire au profit des MPs d’origine leucocytaires qui deviennent prépondérantes et témoignent d’une activation leucocytaire accrue, et surtout une activation des cellules endothéliales avec génération de MPs porteuses d’endogline (CD105). En analyse multivariée,CD105+-MPs étaient fortement associée à la CIVD et pourraient constituer un marqueur précoce de l’atteinte endothéliale au cours du choc septique. / This work focused on procoagulant microparticles shed after vascular cells stress during sepsis. The first part gives an overview on MPs and host response during pathogen challenge. The first lab experimental work confirms direct and functional transfer of CD14/TLR4 LPS sensor by MPs shed to target cells after monocytic THP-1 challenge by LPS.CD14-MPs amplify LPS-induced apoptosis in monocytes but also prompted lymphocyte apoptosis and could play a role in secondary anti-inflammatory response. Then, septic shock was induced in rats after caecal ligature and puncture.Activated protein C (APC) infusion improved haemodynamic parameters and alter septic microparticular content. Infused in naïve rats, APC-treated MPs were associated with reduced hypotension and inflammatory response, confirming cytoprotective effect of both APC and APC-induced MPs. Finally, we performed a clinical prospective study in 3 medical ICU in France. Patients referred for septic shock had an increased level of circulating procoagulant MPs regardless disseminated intravascular coagulopathy (DIC) diagnosis. Nevertheless, DIC patients evidenced a specific pattern with lower platelet-MPs, increased leucocyte-MPs and specific endothelial cells activation with endoglin (CD105) shedding. In multiple logistic regression analysis, CD105-MPs were strongly associated with DIC and were evidenced before DIC diagnosis according to routine laboratory assays.

Le choc septique est caractérisé par une intense activation cellulaire marquée par une génération excessive de microparticules (MPs), libérées dans l’espace extracellulaire suite à un remaniement de la membrane plasmique. Les MPs participeraient à la dysfonction cardiovasculaire et à la coagulopathie du choc septique. Nous avons exploré l’intérêt des MPs circulantes comme marqueurs pathogènes, en étudiant l’effet d’acides gras exogènes sur le remodelage de la membrane plasmique et la genèse des MPs, in-vitro dans un modèle de cellules en culture stimulées par une endotoxine et in vivo chez le rat septique. Nous avons ensuite caractérisé l’activation cellulaire du choc septique chez l’homme, en utilisant les MPs circulantes comme témoins de la dysfonction du compartiment vasculaire, puis montré la place des MPs comme cibles thérapeutiques potentielles au cours du choc septique, par leur modulation pharmacologique dans un modèle de choc septique chez le rat.Nous montrons ainsi l’intérêt des MPs comme un nouvel outil dans l’exploration de nouvelles pistes physiopathologiques du choc septique et comme cibles pharmacologiquement modulables à des fins éventuellement thérapeutiques. / Septic shock is characterized by an intense cell activation marked by an excessive generation of microparticles (MPs), released into the extracellular space after plasma membrane remodeling. MPs take part in cardiovascular dysfunction and coagulopathy of septic shock. We investigated the role of circulating MPs as pathogenic markers, by studying the effects of exogenous fatty acids on plasma membrane remodeling and MP generation, in vitro with cultured cells stimulated by an endotoxin and and in vivo in septic rats. We have then characterized the cellular activation of septic shock in humans, using circulating MPs as evidence of vascular dysfunction and shown the place of MPs as potential therapeutic targets, through their pharmacological modulation in a rat model of septic shock.We have therefore shown the interest of MPs as a new tool to explore septic shock pathophysiology and as therapeutic targets than can be pharmacologically modulated.

L'objectif principal de ce travail était de comparer l'implication (i) de cellules vasculaires, cellules musculaires lisses vasculaires (CML) et cellules endothéliales (CE), ou des cellules circulantes, les plaquettes, et (ii) des microparticules (MP) issues de ces différentes cellules dans la génération de la thrombine mais également dans son inhibition par les systèmes anticoagulants de la protéine C activée (PCa) et de l'inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI), et d'identifier les mécanismes et les déterminants responsables des différences observées entre ces supports cellulaires pour la coagulation. Nous avons démontré que l'intégrine [alpha]v[gamma]3 qui est le récepteur pour la prothrombine sur les surfaces vasculaires était impliquée dans la génération de thrombine à la surface des CML soumises ou non à des déformations mécaniques cycliques. A l'état de base, les CML et les CE ont un potentiel thrombinique similaire, mais moins important que celui des plaquettes. Nous avons montré un rôle synergique du TFPI avec la PCa dans l'inhibition de la génération de thrombine à la surface de ces cellules plus importante avec les CML qu'avec les CE. L'ensemble de nos résultats suggère que les CML pourraient exercer des effets procoagulants comparables aux CE mais avec des régulations différentes en réponse aux facteurs pro- et anticoagulants, et que les MP issues de cellules vasculaires ont un pouvoir thrombogène très supérieur à leurs cellules d'origine / The main objective of this study was to compare the implication (i) of vascular cells, smooth muscle cells (SMC) and endothelial cells (EC), or circulating cells, platelets, and (ii) microparticles (MP) derived from these different cells in the generation of thrombin but also in its inhibition by the activated protein C (APC) and the tissue factor pathway inhibitor (TFPI), and to identify the mechanisms and determinants responsibles for observed differences between these different cell supports for coagulation. We have demonstrated that [alpha]v[gamma]3 integrin, the prothrombin receptor on the vascular surfaces, was involved in the generation of thrombin on the surface of these cells subjected or not subjected to cyclic mechanical deformations. At baseline, SMC and EC, have equivalent thrombin generating capacities, but less than that of platelets. We have shown a synergistic role of TFPI with APC in the inhibition of thrombin generation at the surface of these cells, more important with SMC than with EC. Taken together, our results suggest that SMC may exert procoagulant effects comparable to EC but with different regulations in response to pro-and anticoagulant factors, and that MP derived from vascular cells have a very higher thrombogenic activity compared to their parent cells

L'ischémie/reperfusion (I/R) est un phénomène très fréquent en clinique humaine. Ce phénomène est observé lors de la désobstruction d'une artère digestive, du traitement d'un état de choc, ainsi qu'au cours d'autres pathologies. L'interruption de la perfusion tissulaire (ischémie) et le rétablissement de celle-ci (reperfusion) sont la cause de la mise en place de troubles hémodynamiques et métaboliques. L'I/R est souvent présentée comme étant la principale source de l'hyperlactatémie et le moteur de la réponse inflammatoire lors des états de choc (cardiogénique, hypovolémique, septique). Parallèlement, elle est responsable de l'induction de la production de la libération des espèces réactives de l'oxygène, des cytokines et du monoxyde d'azote. Suite à un choc hémorragique par Ischémie/reperfusion chez le rat, nous avons montré que 1) le NaHS, donneur d'H2S limite la diminution de la pression artérielle moyenne et diminue le lactate plasmatique, témoin de la souffrance tissulaire, 2) cette amélioration hémodynamique est associée à une baisse de l'expression myocardique des ARNm d'iNOS, une diminution de la concentration des dérivés NOx plasmatiques et une diminution des concentrations aortiques et myocardiques de NO et d'anion superoxyde et 3) l'inhibition d'H2S par la DL-propargylglycine aggrave le tableau hémodynamique et les conséquences tissulaires du choc. Dans un autre modèle d'ischémie/reperfusion intestinale, les résultats obtenus, montrent que l'administration de la Protéine C activée (PCa) ou de la dexaméthaosne (Dexa) : 1) améliore la PAM et la réactivité vasculaire, 2) permet d'augmenter le pH et de diminuer la lactatémie, 3) diminue la production des cytokines pro-inflammatoires et 4) inhibe les médiateurs de l'apoptose. Ces résultats sont reliés à une down régulation d'iNOS, une restauration de la voie Akt/eNOS et à une resensibilisation des adrénorécepteurs alpha. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives cliniques dans les traitements de l'I/R / Ischemia/reperfusion (I/R) is a very common phenomenon, observed during intestinal artery surgery, shock treatment, as well as in several other diseases. The disruption of tissue perfusion (ischemia) and recovery (reperfusion) induce hemodynamic and metabolic dysfunction. Gut ischemia/reperfusion is often presented as the main source of lactate and the motor of the inflammatory response, such as cardiogenic, hypovolemic and septic shock. In parallel, gut reperfusion produces numerous mediators such as reactive oxygen metabolites, pro-inflammatory cytokines, and high concentrations of nitric oxide. In a model of ischemia/reperfusion induced by hemorrhagic shock, we found that 1) NaHS an injectable form of H2S, limited the decrease in arterial pressure induced by shock and decreased plasmatic lactate, a witness of tissue suffering, 2) this hemodynamic improvement was associated with a fall in myocardial iNOS mRNA expression, a reduction in the concentration of plasmatic NOx and a reduction of aortic and myocardial concentrations of NO and superoxide anion and 3) the inhibition of H2S with DL-propargylglycine worsened hemodynamics and tissue consequences of shock An experimental model of intestinal I/R has been developed, we demonstrated that the administration of APC or Dexa : 1) Improves MAP and vascular reactivity, 2) increased pH and decreased lactate, 3) decreased pro-inflammatory cytokines production and 4) inhibited apoptosis mediators expression. These results are related to a down regulation of iNOS, to a restoration of the AKT/eNOS pathway, and to alpha-adrenoreceptor resensitization. These results open new perspectives in clinical treatment of I/R

Ce travail porte sur le rôle des microparticules procoagulantes (MPs) générées par les cellules vasculaires en réponse à un état septique. Après une introduction rappelant la structure et les propriétés des microparticules et la réponse del'hôte à un agent pathogène, en particulier en terme d'activation de la coagulation, nous rapportons nos travauxexpérimentaux et cliniques. Le premier travail a été réalisé sur un modèle cellulaire de vésiculation induite par le LPS. Il nous a permis de caractériser le transfert du complexe CD14/TLR4 à différents types cellulaires in-vitro dépourvus du récepteur au LPS. Ainsi, les MPs monocytaires pourraient avoir un rôle d'amplification de la réponse inflammatoire mais aussi dans la réponse anti-inflammatoire secondaire en participant à l'apoptose lymphocytaire. Le second travail aété réalisé chez l'animal. Après induction d'un choc septique, nous avons observé une amélioration hémodynamique enréponse à la perfusion de protéine C activée associée à une modulation du phénotype des MPs. Réinjectées à des ratsnaïfs, les MPs issues des rats septiques traités par protéine C activée développaient une moindre vasoplégie. Enfin, nous avons réalisé une étude prospective sur 100 patients en choc septique. Nous avons ainsi pu caractériser la présence d'une concentration élevée de microparticules procoagulantes, avec une variation phénotypique en présence de coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) : réduction du contingent plaquettaire au profit des MPs d'origine leucocytaires qui deviennent prépondérantes et témoignent d'une activation leucocytaire accrue, et surtout une activation des cellules endothéliales avec génération de MPs porteuses d'endogline (CD105). En analyse multivariée,CD105+-MPs étaient fortement associée à la CIVD et pourraient constituer un marqueur précoce de l'atteinte endothéliale au cours du choc septique.