CCR5 est un récepteur couplé aux protéines G répondant aux CC-chimiokines MIP-1&61537; MIP-1&61538; RANTES et MCP-1. Le récepteur structurellement le plus proche est CCR2b, qui répond à MCP-1. CCR5 est exprimé à la surface des lymphocytes T mémoire, les monocytes, macrophages et cellules dendritiques. Ce récepteur joue un rôle important dans l'établissement des réponses inflammatoires contre les agents pathogènes, mais aussi dans la pathogenèse de maladies inflammatoires chroniques. CCR5 constitue aussi avec CXCR4 un des co-récepteurs qui permettent l'entrée du virus de l'immunodéficience humaine dans ses cellules cibles. CCR5 présente donc un grand intérêt en thérapeutique, et tous les éléments susceptibles de mieux comprendre sa structure, ses mécanismes d'activation ou ses cascades de signalisation sont à même de contribuer au développement d'agents à usage thérapeutique.<p>Deux nouveaux concepts sont apparus dans la littérature au cours des quelques années qui ont précédé le début de notre travail. D'une part, il est apparu que les récepteurs couplés aux protéines G pouvaient interagir directement avec un éventail de partenaires intracellulaires et réguler de cette façon des cascades de signalisation indépendamment des protéines G hétérotrimériques. D'autre part, un nombre croissant de récepteurs se sont révélés capables de former des homodimères et des hétérodimères. Nous avons dès lors appliqué ces deux concepts à l'étude de CCR5. <p>Nous avons donc recherché de nouveaux partenaires de CCR5 par deux approches complémentaires, le double hybride et le « GST-pulldown ». Dans les deux cas, nous nous sommes focalisé sur le domaine C-terminal du récepteur CCR5, d'une part parce que la majorité des interactions mises en évidence pour d'autres récepteurs concernent ce domaine, d'autre part parce que l'extrémité C-terminale de CCR5 est conservée dans l'évolution et comporte différents motifs dont la relevance fonctionnelle a été démontrée. Par ailleurs, nous avons appliqués les techniques d’immunoprécipitation et de BRET pour étudier les phénomènes d’homodimérisation de CCR5, ainsi que son hétérodimérisation avec le récepteur apparenté CCR2b. Les conséquences fonctionnelles de ces interactions ont ensuite été étudiées.<p>Par les techniques de double hybride et de pull-down, nous n’avons pas pu identifier de nouveaux partenaires de CCR5. Seules des interactions non-spécifiques ont pu être mises en évidence. Malgré une recherche intensive menée par d’autres groupes, un seul nouveau partenaire de CCR5 a été décrit entre-temps dans la littérature.<p>Lors des études d'oligomérisation de récepteurs, nous avons mis en évidence la formation d'homodimères de CCR5 et CCR2b par des expériences d’immunoprécipitations et de BRET, ainsi que d'hétérodimères CCR5-CCR2b. Les conséquences fonctionnelles de ces observations sur la liaison de chimiokines, la signalisation et l'internalisation des récepteurs ont été étudiées. Contrairement aux données de la littérature, nous n'avons pas montré de coopérativité positive entre les récepteurs co-exprimés, quant à leur capacité à induire la libération de calcium intracellulaire. Par contre, nous avons mis en évidence une coopérativité négative en termes de liaison de chimiokines. Il apparaît ainsi que chaque dimère ne peut lier qu'une seule chimiokine, et qu'en conséquence, les ligands d'un récepteur peuvent entrer en compétition avec la liaison d'un traceur sur l'autre récepteur au sein d'un hétérodimère. Ces dimères de récepteurs apparaissent cependant comme dissociables, suite à la liaison d'agonistes ou de chimiokines induisant leur internalisation, car aucun phénomène de co-internalisation ne peut être mis en évidence. Ces observations, qui sont originales dans le domaine des récepteurs couplés aux protéines G, peuvent sans doute être généralisées à l'ensemble des récepteurs de chimiokines, voire à d'autres classes de récepteurs. Elles sont importantes pour l'interprétation de la pharmacologie des récepteurs dans leur environnement naturel, et sont susceptibles de développements importants permettant de mieux comprendre la structure des dimères, la dynamique de leur association, et les mécanismes d'activation des récepteurs en général au sein de leur structure dimérique. / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Représentant environ 45% de tous les gliomes, le GBM est la tumeur cérébrale la plus agressive chez l’adulte. Comme nous l’avons décrit dans l’introduction de ce manuscrit, le caractère très hétérogène du GBM associé aux signatures moléculaires et expressions géniques, mais également aux conditions microenvironnementales hypoxique et inflammatoire, contribuent à la récidive quasi-systématique après exérèse complète-radio/chimiothérapie, et expliquent les nombreux échecs thérapeutiques. Malgré l’arsenal thérapeutique potentiellement disponible, appliqué parfois de manière multimodale, la survie des patients atteints de GBM n’est pas significativement améliorée, les défis à relever pour améliorer cette survie et la qualité de vie des patients restent énormes. Ainsi, l'identification de facteurs exprimés de manière différentielle qui pourraient mieux définir le comportement agressif des cellules de GBM fournirait une base pour le développement de thérapies innovantes et peut-être plus efficaces. Une des caractéristiques des GBMs est leur capacité très migratoire et invasive, relayées principalement par des facteurs chimiotactiques dans un microenvironnement tumoral hypoxique et inflammatoire. Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) et leurs ligands, particulièrement les RCPGs de chimiokines, surexprimés dans les GBMs et stimulant la migration chimiotactique, l’invasion et l’angiogenèse jouent un rôle majeur dans le développement des GBMs et l'acquisition d'un phénotype agressif. Dans ce contexte, notre équipe avait démontré que le récepteur UT de l’urotensine II (UII), une chimiokine peptidique pro-angiogénique et pro-inflammatoire, ainsi que le système chimiokine bien connu SDF-1a/CXCR4 semblent systématiquement co-exprimés dans les GBMs, plus spécifiquement dans les zones vasculaires et périnécrotiques, montrant une corrélation avec le grade des gliomes. In vitro, nous avions aussi établi que l’UII/UT stimule la migration chimiotactique des cellules de GBM via les couplages de type Gαi/PI3K et Gα13/Rho/ROCK, des couplages précédemment mis en évidence pour le système SDF-1α/CXCR4 et d’autres RCPGs chimiotactiques. De plus, une récente analyse de la base de données TCGA (The Cancer Genome Atlas) en composante principale réalisée par Alexandre Mutel, étudiant en thèse dans l’équipe, a permis d’identifier la signature d’expression des RCPGs exprimés dans les gliomes et particulièrement dans les GBMs, qui révèle un nombre très important de RCPGs chimiotactiques. Dans l’ensemble, leur expression et activité signalisante redondantes fréquemment associées à la tumorigenèse, en particulier dans les GBMs, soulignent l’intérêt d’étudier les noeuds de signalisation communs à l’ensemble de ces RCPGs chimiokines. Ces noeuds sont principalement représentés par les protéines G hétérotrimériques composées des sous-unité α, β et γ, qui couplent ces RCPGs et relayent les effecteurs secondaires intracellulaires, probablement essentiels à la régulation de l’agressivité des GBMs. Ainsi, l’objectif de mon travail de thèse était d’identifier les principales protéines Ga, b et g parmi les 31 protéines G exprimées chez l’Homme dans les gliomes et celles plus spécifiquement associées au degré de malignité, et à l’agressivité des GBMs puis à déterminer le rôle d’une de ces protéines G dans les mécanismes de prolifération et d’invasion de cellules de GBM. Dans un premier temps, nous avons analysé l’expression des 31 sous-unités (15α, 5β et 11γ) de protéines G sur la base de données transcriptomiques du The Cancer Genome Atlas (TCGA), et démontré que les niveaux d'ARNm codant pour les sous-unités Gαz, Gαi1, Gβ4, Gβ5 et Gγ3 sont relativement faibles dans les GBMs tandis que les sous-unités Gα12, Gα13, Gα15, Gαi2, Gαi3, Gβ2, Gγ5, Gγ11 et Gγ12 sont particulièrement surexprimées dans les GBMs et sont associées à un mauvais pronostic en termes de récidive et de survie du patient. / GBM is the most common (∼45% of all gliomas) and aggressive primary malignant brain tumor in adults. As described in this document's introduction, GBM highly heterogeneous phonotype associated with molecular signatures and gene expressions, but also with hypoxic and inflammatory microenvironmental conditions, contribute to frequent recurrence after complete resection-radio/chemotherapy, and explain the multiple therapeutic failures. Most of the current treatment options for GBM, although sometimes multimodal, the survival of GBM patients is not significantly improved, and the challenges to improve patient survival and quality of life remain enormous. Thus, the identification of differentially expressed factors that could better define the biological behavior of GBM, would provide a basis for the development of novel therapies and may be more effective. One of the characteristics of GBMs is their highly migratory and invasive properties, relayed mainly by chemotactic factors belonging to the hypoxic and inflammatory tumor microenvironment. G-protein coupled receptors (GPCRs) and their ligands, particularly the chemokines GPCRs, overexpressed in GBMs and stimulating migration, invasion and neoangiogenesis, play a key role in the development of GBM and the acquisition of an aggressive phenotype. In this context, our team demonstrated that UT, the receptor of urotensin II (UII), a pro-angiogenic and pro-inflammatory chemokine, as well as the well-known chemokine system SDF-1/CXCR4 are systematically co-expressed in GBMs particularly in vascular and perinecrotic areas and their expression are correlated with grade. We also demonstrated in vitro that UII/UT stimulate GBM cells chemotactic migration and invasion via activation of the pathways Gαi/PI3K and Gα13/Rho/ROCK, pathways that have previously been identified for the SDF-1α/CXCR4 system and other chemotactic GPCRs. In addition, a recent principal component analysis of TCGA (The Cancer Genome Atlas) database performed by Alexandre Mutel, PhD student in the team, has identified the expression signature of GPCRs in gliomas and particularly those which are overexpressed in mesenchymal GBM, among which many chemotactic GPCRs are included. Taking together, their redundant expression and signaling activity frequently associated with tumorigenesis, particularly in GBMs, raises the issue of studying signaling nodes common to all these GPCRs. These nodes, are primarily represented by heterotrimeric G proteins, composed of α, β and γ subunits, that couple these GPCRs relaying many intracellular secondary effectors, probably essentials in the regulation of GBM aggressiveness. In this context, the aim of my thesis work was to identify the main Ga, b and g subunits among the 31 G proteins expressed in human gliomas and those more specifically associated with the malignant grade, and the aggressiveness of GBMs and then to determine the role of one of these specific G proteins in GBM cells proliferation and invasion mechanisms. For that, we first analyzed the expression of the 31 subunits (15α, 5β and 11γ) of G proteins from the TCGA database and showed that the mRNA expression of Gαz, Gαi1, Gβ4, Gβ5 et Gγ3 are relatively low in GBMs while Gα12, Gα13, Gα15, Gαi2, Gαi3, Gβ2, Gγ5, Gγ11 and Gγ12 subunits, are particularly overexpressed in GBM and are associated with a poor prognosis in terms of recurrence and patient survival.

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) sont des protéines à sept domaines transmembranaires (TM) impliquées dans la médiation des stimuli tels la lumière, les odeurs, les neuromédiateurs et les hormones à travers la membrane plasmique. La détermination des bases structurales de la liaison et de l'activation des GPCRs est d'une importance capitale dans notre compréhension de ces phénomènes, et à plus forte raison dans le développement de nouveaux médicaments, comme en témoigne le fait que plus de la moitié des médicaments actuellement sur le marché ciblent directement ou indirectement ces récepteurs. Cependant, leur caractéristique membranaire défie les limites actuelles des méthodes de détermination de structure par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) ou par diffraction des rayons X et la seule structure de GPCR déterminée expérimentalement à ce jour est celle de la rhodopsine bovine (bRho) (PALCZEWSKI et al., 2000). Malgré une identité de séquence limitée entre ces récepteurs, la présence de plusieurs résidus strictement conservés dans les 7 TMs des GPCRs classés dans la famille A suggère qu'ils partagent un même mécanisme moléculaire d'activation. De plus, il a été montré que la mutation du résidu conservé N[indice supérieur 3.35] mène à l'activation constitutive de plusieurs GPCRs, dont les récepteurs PAF, B[indice inférieur 2], CXCR4 et hAT[indice inférieur 1]. Par ailleurs l'analyse du modèle du récepteur hAT[indice inférieur 1] basé sur l'homologie avec la bRho révèle une interaction entre le résidu N111[indice supérieur 3.35] et un résidu strictement conservé, D74[indice supérieur 2.50]. Fait intéressant, des expériences précédentes ont montré que la mutation du résidu D74[indice supérieur 2.50] conserve l'affinité du récepteur pour le ligand AngII mais empêche l'isomérisation de hAT[indice inférieur 1] dans une forme active capable d'activer la protéine G et de médier la transduction du signal à travers la membrane plasmique (HUNYADY et al., 1994). Dans la présente étude, une analyse approfondie du modèle du récepteur de type 1 de l'angiotensine II (hAT[indice inférieur 1]) combinée aux essais de production d'IP de récepteurs hAT[indice inférieur 1] mutants conçus de façon rationnelle appuie l'importance d'une interaction entre des résidus conservés (D74[indice supérieur 2.50] et N111[indice supérieur 3.35]) dans la stabilisation de l'état inactif du récepteur. Ainsi, la mutation de N111[indice supérieur 3.35] pour un résidu glycine déstabilise la forme inactive du récepteur, favorisant son isomérisation dans une forme active. Au contraire, la mutation du résidu D74[inidce supérieur 2.50] pour une asparagine stabilise hAT[indice inférieur 1] dans une forme inactive, empêchant l'isomérisation du récepteur dans une forme active.Les variations locales du potentiel électrostatique dans l'intérieur majoritairement hydrophobe du récepteur et de ses mutants suggèrent que la solvatation optimale de D74[indice supérieur 2.50] est critique dans l'isomérisation de hAT[indice inférieur 1] dans une forme active. La présence de plusieurs autres résidus conservés polaires à proximité de D74[indice supérieur 2.50] corrobore l'importance de la solvatation de ce résidu dans la perspective d'un mécanisme d'activation conservé pour tous les GPCRs de la famille A.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont impliqués dans la majeure partie des communications intercellulaires. Un grand nombre de RCPG ont été découverts en comparant la séquence des récepteurs connus avec les données fournies par le séquençage du génome humain. Pour plus d'une centaine de ces récepteurs, le ligand activateur ou agoniste est inconnu. Ces récepteurs sont dès lors qualifiés d'orphelins. Les LGR forment une sous-famille de RCPG structurellement proches de la rhodopsine qui comprend les récepteurs aux hormones glycoprotéiques (TSH, LH, hCG, FSH) et à la relaxine. LGR4 est un membre de cette famille dont ni la fonction précise, ni l'agoniste ne sont connus. Dans un premier temps, une cartographie détaillée de l'expression de Lgr4 chez la souris a été obtenue. Nous avons tiré parti de l'existence d'une lignée de souris transgéniques dont le gène Lgr4 a été interrompu par l'introduction d'une cassette comportant deux marqueurs histologiques. L'activité beta-galactosidase d'un de ces marqueurs a été analysée chez les souris hétérozygotes. Ces dernières ne présentent pas de phénotype particulier, ce qui permet d'estimer que l'expression des marqueurs rend effectivement compte de l'expression normale du gène Lgr4. Lgr4 est exprimé dans un grand nombre de structures, notamment dans le cartilage, le rein, les appareils reproducteurs mâle et femelle et certaines cellules du système nerveux. Ensuite, le phénotype des souris homozygotes pour l'inactivation de Lgr4 (LGR4KO) a été exploré. Ces souris présentent à la naissance un poids inférieur à leurs congénères des autres phénotypes. Les mâles sont stériles à cause d'une malformation des tubules efférents et de l'épididyme. Un blocage au niveau des tubules efférents reliant le testicule à l'épididyme contraint les spermatozoïdes à s'accumuler à la sortie du testicule, dans la région du rete testis. De plus, les tubes de l'épididyme, pourtant normaux à la naissance, ne s'allongent pas pour former la structure convolutée habituelle. L'épithélium de ces tubes est aplati et est entouré d'une quantité anormalement élevée de mésenchyme. Dans un troisième temps, des outils nécessaires aux futures tentatives d'identification de l'agoniste naturel de LGR4 ont été réalisés. Il s'agit : (1) d'anticorps monoclonaux dirigés contre la partie extracellulaire du récepteur humain. (2) d'un appât moléculaire pour la ‘pêche au ligand’. Cet appât est constitué du domaine extracellulaire du récepteur humain couplé à un marqueur histologique. (3) d'une construction peptidique constituée du domaine extracellulaire du récepteur humain couplé à une queue poly-histidine. Cette construction est destinée à servir de greffon lors de chromatographies d'affinités devant permettre de purifier le ligand. (4) de lignées cellulaires exprimant le récepteur LGR4 humain ainsi que le système æquorine devant permettre de détecter l'activation de ce récepteur. Les données apportées par ce travail montrent un rôle important du récepteur LGR4 au cours du développement et permettent de circonscrire le champ des recherches futures. Ceci, ainsi que les outils moléculaires développés, constitue une base pour l'identification future de l'agoniste et la détermination précise de la fonction de LGR4.

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) constituent la plus grande famille de protéines localisées à la membrane plasmique. Toutefois, les mécanismes moléculaires régissant leur liaison avec leurs ligands et la transduction du signal qui s’ensuit sont encore mal compris. Nous avons donc cherché à mieux comprendre le mécanisme de liaison d’un ligand avec son récepteur, et ainsi caractériser le premier événement de la cascade pharmacologique déclenché par ces GPCR. Nous nous sommes intéressés au récepteur de l’urotensine-II (UT), car celui-ci fait partie de la catégorie des récepteurs peptidergiques qui demeure encore à ce jour peu comprise au niveau de leur structure et de leur mode de liaison. D’un point de vue physiologique, ce récepteur joue notamment un rôle important au niveau cardiovasculaire ainsi que dans certaines pathologies comme l’hypertension ou le diabète. Nous avons donc cherché à identifier l’ensemble des résidus participant à la pochette de liaison du récepteur UT en appliquant la méthode SCAM (Substituted Cysteine Accessibility Method) et en procédant à la substitution individuelle des résidus des TM1, TM2, TM3, TM4 et TM5 avec une cystéine. Par la suite, les paramètres pharmacologiques de ces mutants ont été mesurés à l’aide d’études de radioliaison avec le ligand [[indice supérieur 125]I]UII. Suite au traitement avec de l’hydrobromure de 2-aminoethyl-méthanethiosulfonate (MTSEA), nous avons ainsi pu mettre en évidence que les mutants I54C[indice supérieur (1.35)] du TM1, Y100C[indice supérieur (2.53)], S103C[indice supérieur (2.56)], F106C[indice supérieur (2.59)], I107C[indice supérieur (2.60)], T110C[indice supérieur (2.63)] et Y111C[indice supérieur (2.64)] du TM2, L126C[indice supérieur (3.28)], F127C[indice supérieur (3.29)], F131C[indice supérieur (3.33)] et M134C[indice supérieur (3.36)] du TM3 et M184C[indice supérieur (4.60)] et I188C[indice supérieur (4.64)] du TM4, n’étaient plus capables de lier [indice supérieur 125]I-UII, démontrant ainsi une orientation de ces positions face à la pochette de liaison du récepteur UT. L’ensemble de ces travaux nous ont permis d’acquérir une meilleure compréhension des déterminants moléculaires de la liaison menant à l’activation du récepteur UT. En associant ces résultats avec nos travaux précédents, nous sommes en mesure de présenter un modèle moléculaire complet de la pochette de liaison du récepteur UT de rat en complexe avec le ligand UII. Cette étude permet ainsi d’offrir une meilleure compréhension du processus de liaison et d’activation des GPCR peptidergiques de la classe A. En absence de structure cristalline du récepteur UT, ce modèle constitue un outil pharmacologique de choix qui pourra servir notamment à la conception rationnelle de nouveaux ligands thérapeutiques ciblant le système urotensinergique.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont la famille de récepteurs membranaires la plus représentée chez les vertébrés, et la plus grande cible thérapeutique chez l'Homme. L'évolution du paradigme initial qui énonçait une stœchiométrie récepteur : protéine G : effecteur de 1 :1 :1 sera présentée sur le modèle des récepteurs aux chimiokines CXCR4 et CCR2. Grâce à la technique de transfert d'énergie par bioluminescence (BRET), les travaux réalisés durant cette thèse montrent (1) que c'est par un couplage alternatif de CXCR4 à Gα13 au lieu de la voie classique Gαi que les cellules de cancer du sein migrent pour former des métastases, (2) que la désensibilisation de CXCR4 implique le recrutement d'une combinaison définie de protéines (GRK et arrestines) permettant l'arrêt sélectif des multiples voies engagées en réponse à l'agoniste, et (3) que le protomère CXCR4 a un rôle déterminant dans l'engagement de la protéine Gαi et le recrutement de la β-arrestine par l'hétéro-oligomère CXCR4/CCR2 lorsque CCR2 est activé. Dans cette dernière et principale étude, les résultats montrent également que le dimère CCR2 peut s' assembler au dimère CXCR4 pour former un tétramère, et que l'activation de CCR2 influence la conformation du dimère CXCR4. Les phénomènes de coopérativité et d'activation asymétrique déjà rapportés pour cet hétérodimère pourraient donc impliquer l'interaction de quatre protomères. En conclusion les travaux effectués durant cette thèse démontrent une régulation supplémentaire de l'activité des récepteurs chimiokines au niveau de leur structure quaternaire, de leur signalisation, et de l'arrêt de cette signalisation. / G protein coupled receptors (GPCR) are the most represented cell surface receptors among vertebrates, and the major therapeutic target in humans. The initial paradigm stating a 1 :1 :1 stoichiometry for receptor :G protein :effector has evolved to a more complex model, as illustrated here with the example of the chemokine receptors CXCR4 and CCR2. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) was used to demonstrate that (1) CXCR4 is able to couple Gα13 instead of Gαi to promote breast cancer metastasis, (2) the multiple pathways engaged by stimulation of CXCR4 are selectively desensitized by the specific recruitment of a defined combination of proteins (GRKs and arrestins) and (3) the CXCR4 protomer plays a crucial role during Gαi engagement and β-arrestin recruitment by the CXCR4/CCR2 heterodimer upon CCR2 activation. In this last and main study, the results shown also demonstrate that CCR2 dimers could assemble with CX CR4 dimers into hetero-tetramers, and that CCR2 activation leads to a conformational change in the CXCR4 dimer. Former results showing cooperativity and asymmetric activation of a simple CXCR4/CCR2 heterodimer could then be applied to a tetramer. To conclude, the work done during this thesis demonstrates a more sophisticated regulation of chemokine receptors than previously suspected at 3 different levels: quaternary structure of the protomers, G protein signalling, and signalling termination

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la famille de récepteurs membranaires la plus étendue. Présentement, 30% des médicaments disponibles sur le marché agissent sur plus ou moins 4% des RCPG connus. Cela indique qu’il existe encore une multitude de RCPG à explorer, qui pourraient démontrer un potentiel thérapeutique intéressant pour des pathologies encore sans traitement disponible. La douleur chronique, qui affecte 1 canadien sur 5, fait partie de ces affections pour lesquelles les thérapies sont faiblement efficaces. Dans le but éventuel de pallier à ce problème, le projet de ce mémoire consistait à mieux comprendre les mécanismes régissant l’adressage membranaire du récepteur de la neurotensine de type 2 (NTS2), un RCPG dont l’activation induit des effets analgésiques puissants de type non opioïdergique. Des données du laboratoire ayant révélé une interaction entre la 3e boucle intracellulaire de NTS2 et la sécrétogranine III (SgIII), une protéine résidente de la voie de sécrétion régulée, notre objectif était de caractériser le rôle de SgIII dans la fonctionnalité du récepteur NTS2. Pour ce faire, l’interaction entre les deux protéines a d’abord été vérifiée par co-immunoprécipitation, GST pull down, essais de colocalisation subcellulaire et par FRET. Nous avons également utilisé un outil d’interférence à l’ARN (DsiRNA) pour invalider la protéine SgIII dans un modèle cellulaire neuronal et chez l’animal. Des essais de radioliaison sur le modèle cellulaire ont révélé une diminution de l’adressage de NTS2 à la membrane plasmique lorsque SgIII était supprimée. De la même façon, une invalidation de SgIII chez le rat inhibe les effets analgésiques d’un agoniste NTS2-sélectif (JMV-431), qui sont normalement observés dans le test de retrait de la queue (douleur aiguë). Nous avons cependant identifié que des stimulations au KCl, à la capsaïcine et à la neurotensine induisaient plutôt une insertion du récepteur à la membrane dans les cellules neuronales. Puisque l’interaction entre SgIII et la 3e boucle intracellulaire du récepteur NTS2 est peu probable selon un système de sécrétion classique, un modèle hypothétique de transition dans les corps multi-vésiculaires a été vérifié. Ainsi, la présence de NTS2 et de SgIII a été révélée dans des préparations exosomales de DRG F11, en plus d’une transférabilité du récepteur par le milieu extracellulaire. En somme, ces résultats démontrent la dépendance du récepteur NTS2 envers SgIII et la voie de sécrétion régulée, en plus d’identifier certains facteurs pouvant augmenter son expression à la surface cellulaire. Le projet contribue ainsi à ouvrir la voie vers des approches pour potentialiser les propriétés de NTS2 in vivo¸ en plus d’une piste d’explication concernant le trafic intracellulaire du récepteur.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le système somato-sensoriel permet à l'organisme de percevoir une large palette de stimuli externes/internes, qui peuvent être soit agréables, soit nocifs. Le corps cellulaire des neurones somato-sensoriels, responsables de ces processus et qui innervent tous les organes du corps, est situé dans les ganglions de la racine dorsale. La douleur est perçue par les nocicepteurs qui constituent un ensemble hétérogène de neurones, aussi bien d'un point de vue fonctionnel, électrophysiologique que moléculaire. Afin de mieux comprendre la spécialisation fonctionnelle des nocicepteurs, une des stratégies de l'équipe a été d'identifier de nouveaux marqueurs moléculaires exprimés par des sous-populations des neurones du DRG et de mettre en place des outils génétiques pour étudier leur fonction spécifique. Nous avons mis en évidence un nouveau gène, qui définit une sous-population de nocicepteurs. Suite à mes travaux de thèse, qui ont révélés la fonction moléculaire de la protéine associée à ce gène, nous l'avons nommé GINIP pour Galpha INhibitory Interacting Protein. Au cours de ma thèse, j'ai montré que : - GINIP interagit physiquement avec les protéines G-alpha inhibitrices- la perte de fonction de GINIP (souris GINIP KO) amplifie les douleurs de type neuropathique- le mécanisme sous-jacent fait intervenir la signalisation GABAergique Les douleurs pathologiques sont, entre autres, dues à un disfonctionnement des nocicepteurs, et leurs mécanismes restent mal connus. Dans ce contexte, l'ensemble de mes résultats met en évidence une nouvelle voie impliquée dans la régulation négative des nocicepteurs, qui pourra à l'avenir être la cible de stratégies thérapeutiques. / The somato-sensory system allows our organism to detect a myriad of external and internal stimuli that can range from innocuous stimuli (pleasant touch,etc) to noxious ones (burns, tissue injury, etc). The somato-sensory neurons involved in these processes innervate the entire organism and have their cell bodies clustered within the dorsal root ganglion. Pain is a modality of the somatosensory system, sensed through nociceptors. Nociceptors represent a heterogeneous class of somato-sensory neurons with respect to functional, electrophysiological and molecular criteria. In order to expand the knowledge of the functional specialization of nociceptors, our team's strategy aimed at identifying new molecular markers of nociceptors subsets. Subsequent design of the corresponding genetic tools allowed us investigating their specific function. Therefore, we found a gene that was never described before and that marks a specific subset of nociceptors. We named it GINIP (Gaplha Inhibitory Interacting Protein) as during my thesis I showed that:- GINIP physically interacts with inhibitory G-proteins- GINIP loss of function (GINIP knock out mouse) leads to the amplification of neuropathic pain- the associated mechanism involves GABAergic signalingPathological pain (chronic inflammatory pain and neuropathic pain) is, among others, a consequence of nociceptor dysfunction. Importantly, the mechanisms leading to this aberrant function are still not totally understood. Altogether, my results underscore a new pathway involved in the negative control of nociceptors under neuropathic pain conditions, and this opens a path for new therapeutic strategies.

L'étirement est un stimulus hypertrophique qui active de nombreuses voies de signalisation similaires à celles mises en évidence lors de l'étude de l'hypertrophie cellulaire. L'objectif principal de mon travail de thèse était de caractériser les évènements moléculaires impliqués dans l'activation des MAPKinases (MAPK), ERK et JNK lors de l'étirement. Nous avons étudié ces protéines par 2 approches différentes. D'une part, nous nous sommes intéressés aux rôles de protéines potentiellement nécessaires à l'activation des MAPK. D'autre part, nous avons cherché à mettre en évidence des interconnexions moléculaires entre les différentes voies de signalisation activées par l'étirement cellulaire, en montrant notamment la formation de complexes protéiques nécessaires à l'activation des différents partenaires. Nous montrons ainsi que deux protéines à activité tyrosine kinase, l'Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) et la Proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2), sont respectivement nécessaires à l'activation de ERK et de JNK lors de l'étirement. Ces cascades de transduction peuvent être dépendantes de la petite protéine G Ras. Bien que les voies des MAPK et de PI3K/Akt soient considérées comme indépendantes, nous montrons également que Akt participe à l'activation de ERK par l'étirement. Enfin, nous avons montré la formation d'un complexe Protein Kinase C (PKC)/Calcineurine nécessaire à l'activation et à la translocation de la PKC lors de l'étirement. Cette étude de différentes voies de signalisation et des interactions protéiques apporte une meilleure connaissance des mécanismes activés par l'étirement cellulaire et permet donc de mieux comprendre la signalisation impliquée dans l'hypertrophie ventriculaire / Cardiomyocyte stretch is a major determinant of ventricular hypertrophy. It stimulates numerous signalling pathways leading to the Mitogen Activated Protein kinases (MAPK) activation. The objective of this thesis was to evaluate the molecular events involved in MAPK ERK and JNK activations during stretch. We studied these pathways by 2 different approaches. We analysed the role of several pivotal proteins involved in ERK and JNK activations and next we evaluated the molecular interactions between different signalling pathways by protein complexes formation induced by stretch and necessary for protein activations. We show that 2 tyrosine Kinases, the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) and the Proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) are necessary for ERK and JNK activations respectively during stretch with a possible involvement of the small G protein Ras. MAPK and PI3/Akt pathways are generally considered independent but we show that ERK activation is PI3K/Akt dependent during stretch. Thus, we demonstrate that 2 other pathways are associated since PKC and calcineurin form a complex necessary for PKC activation and translocation. This study of signalling pathways and protein interactions sheds a new light on intracellular pathways leading to MAPK activation and may have implications for the development of new drugs in the management of cardiac hypertrophy and failure