Nous avons identifié le gène GPR84 comme étant exprimé par la microglie, c'est-à-dire les macrophages du système nerveux central. Il code pour un récepteur couplé aux protéines G dont le ligand endogène, la fonction et la régulation demeurent inconnus. Dans cette étude, nous avons testé l'hypothèse que l'augmentation de la transcription du gène GPR84, dans la microglie, soit associée à des processus inflammatoires. Pour ce faire, nous avons induit une réaction inflammatoire systémique à la lipopolysaccharide (LPS) chez des souris normales ou déficientes en l'une ou l'autre des cytokines IL-1 et TNF. Par la combinaison des techniques d'hybridation in situ et d'immunohistochimie, il a été montré que, suite à une injection systémique de LPS ou intraparenchymale de TNF, les cellules microgliales et les macrophages du cerveau expriment fortement l'ARNm du gène GPR84. Cette activation est quasi-absente chez les souris normales. Finalement, nous avons démontré que la production du GPR84 par la microglie se présentait non seulement durant la phase aigûe de l'endotoxémie, mais également durant l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), un modèle de la sclérose en plaques. Nos résultats illustrent donc que le GPR84, nouveau marqueur, sensible, de l'activation microgliale, pourrait jouer un rôle important dans la régulation des processus neuroinflammatoires.

Les protéines-G hétérotrimériques, constituées des sous-unités α, β et γ, sont les premières actrices de la transduction du signal en interagissant directement avec les Récepteurs Couplés aux protéines-G (RCPG). Les protéines-G ont la capacité de lier soit une molécule de GDP lorsqu'elles sont inactives, soit une molécule de GTP quand elles sont activées par un RCPG. Cet échange de nucléotide va conduire à la dissociation de l'hétérotrimère avec d'une part la sous-unité α seule, et d'autre part le complexe βγ. Chacune de ces entités va ensuite propager le signal dans le compartiment intracellulaire. Les travaux effectués au cours de cette thèse ont pour but de mieux comprendre la dynamique des protéines-G hétérotrimériques et de leurs récepteurs par des techniques de mécanique moléculaire incluant la Dynamique Moléculaire (DM) et l'Analyse de Modes Normaux (AMN). Dans un premier temps une AMN nous a permis de décrire les possibles mouvements de larges amplitudes des protéine-G. Nous avons à l'occasion de cette étude mis au point une méthode de sélection de Modes Normaux (MN) pertinents que nous avons appelés modes représentatifs. Nous avons également développé une méthode d'extraction de ligand (ici le GDP) le long de ces MN. Ceci nous a permis de montrer qu'un mouvement concerté de toute la sous-unité α pouvait permettre l'ouverture de la poche et la sortie du GDP. Dans un deuxième temps, nous avons affiné nos résultats en reconstruisant des profils d'énergie libre le long de plusieurs chemins de sortie possibles pour le GDP. Ainsi nous avons pu proposer un mécanisme fin de sortie du ligand et plusieurs résidus clés impliqués dans cette sortie. Nous avons également étudié le processus de dissociation de l'hétérotrimère par la technique de la Dynamique Moléculaire Dirigée. Il a été possible, à l'issue de cette étude, de proposer un mécanisme à l'échelle moléculaire de la séparation des sous-unités α et βγ. Pour finir, nous avons également étudié le macro-complexe RCPG : protéine-G. Deux études traitent des mécanismes d'activation et de couplage des protéines-G à son récepteur. Nous avons notamment montré que l'hétérotrimère de protéine-G contraint très fortement les mouvements du récepteur. Un mouvement très largement retrouvé dans le complexe ainsi que dans plusieurs autres RCPGs dont les structures sont connues a été proposé comme étant le mouvement d'activation des RCPG une fois complexés à leurs protéines partenaires. / Heterotrimeric G-proteins, constituted of α, β and γ subunits are the first actresses of the intra-cellular signal transduction and interact directly with G-protein Coupled Receptors (GPCR). The heterotrimer is able to bind either a GDP molecule (inactive state) or a GTP molecule (active state). The nucleotide exchange is triggered by the interaction with an activated GPCR and leads to the dissociation of the whole heterotrimer into two independant entities : α and tightly bound βγ subunits. Both subunits further propagate the signal into the intracellular compartment. Goals of the present work were to better understand the mechanics of G-proteins and GPCR by combining several molecular mechanics techniques such as Molecular Dynamics (MD) and Normal Mode Analysis (NMA).Firstly, we described large amplitude motions of the whole G-protein heterotrimer. In this study we developped a method to select relevant Normal Modes (NM), we called representative NM. We also developped a method which consists to extract a ligand (in our case the GDP) out of its binding pocket along computed NM. With these two new methods, we showed that a concerted motion of the α subunit would promote the opening of the pocket and the release of the GDP.Secondly, to refine our results, we performed free energy profiles reconstructions along several putative exit pathways of the GDP. Thus, we proposed for the first time a fine-tuned mechanism of GDP exit at the molecular scale and putative key-residues. We proposed also a molecular scale mechanism for the dissociation of the heterotrimeric G-protein through the use of the Targeted Molecular Dynamics (TMD). Finally we were interested in the study of the GPCR:G-protein complex. We performed two studies related to the activation and to the coupling of the macro-complex. We showed that G-protein constrain drastically the GPCR motions. One over-represented motion in the complex that was also retrieved in other crystallized structures of several different GPCRs thus suggested that this motion could be the putative activation motion of a GPCR when complexed to its favorite protein partners.

Résumé : L’expression de surface des récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) est un processus hautement régulé et très important dans le maintien de l’homéostasie cellulaire. En effet, un déséquilibre dans leur niveau d’expression est souvent relié à différentes pathologies comme le cancer, le diabète, l’obésité, les maladies cardiovasculaires et les maladies neurodégénératives. C’est pourquoi la compréhension des mécanismes moléculaires influençant ce phénomène est si importante et nous permettra d’élaborer et/ou d’améliorer les médicaments ciblant la régulation de ce processus. Il est bien connu qu’un des acteurs importants dans le trafic vésiculaire des GPCRs est représenté par la famille des Rab GTPases. Effectivement plusieurs de ces dernières, soit les Rabs 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8 et 11 pour ne nommer que les plus connues, modulent l’expression de surface des GPCRs. De plus, certaines études soulèvent la possibilité qu’un GPCR soit lui-même capable de réguler son propre trafic intracellulaire, et ce grâce à son interaction avec les Rab GTPases. Toutefois, le mécanisme emprunté par le GPCR pour atteindre cette fin reste à élucider. Dans le présent travail, je démontre que le GPCR, β2AR, module non seulement la maturation de la petite protéine G Rab11a grâce à son interaction avec la Rab GéranylGéranylTransférase (RGGT), mais influence également son activation en modulant son ubiquitination via son association avec la E3-ubiquitine ligase, HACE1. De plus, je révèle que la sous-unité alpha de la RGGT (RGGTA) accroît significativement la maturation et le transport antérograde du récepteur β2AR, ce qui souligne ainsi un nouveau rôle cellulaire pour cette protéine. L’ensemble des résultats générés appuie l’hypothèse qu’un GPCR puisse contrôler son propre routage intracellulaire, et éclaircit les mécanismes utilisés pour réguler l’activé de la Rab GTPase avec laquelle il interagit. // Abstract : Cell surface expression of G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) is a highly regulated and very important phenomenon for keeping cellular homeostasis. In fact, dysregulation of their cell expression is related to many diseases like cancer, neurological disorders, obesity, diabetes and cardiovascular diseases. These facts illustrate how important understanding the molecular mechanisms involved in cell surface transport of those receptors is, which will help us in designing or improving drugs which actually target this pathway. Rab GTPases are proteins known for being essential regulators of GPCR vesicular trafficking. Indeed, an increasing number of studies report the implication of Rab1, 2, 4, 5, 6, 7, 8 and 11 (to cite the most frequently studied) cell surface transport of GPCRs. Moreover, some studies also put forward the possibility that a GPCR might be able to regulate its own cellular trafficking by interacting and controlling activation of Rab GTPases. However, the mechanism involved in this process remains to be clarified. In the present study, I demonstrate that the prototypic GPCR, β2AR, not only modulates prenylation/maturation of the small G protein Rab11a by interacting with Rab GeranylGeranylTransferase (RGGT), but also influences Rab11a activation by modulating its ubiquitination via its association with the E3-ubiquitin ligase, HACE1. Furthermore, I reveal that the α subunit of the RGGT (RGGTA) also promotes the maturation and anterograde transport of the receptor, which highlight a new cellular role for this protein. Altogether, those results support the hypothesis that GPCRs control their own trafficking, and shed light on some of the mechanisms that might be employed by those receptors in activation of Rab GTPases.

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) sont formés de sept domaines transmembranaires. Cette famille de récepteur fait l'objet d'études qui visent à comprendre leurs fonctions, leurs interactions avec leurs ligands, les changements de conformations produits suite à cette liaison ainsi que leur mécanisme d'activation. Notre hypothèse est que le récepteur humain de l'angiotensine II de type 1 (hAT1 ) possède des déterminants moléculaires responsables de sa liaison à l'angiotensine II (AngII). Nos objectifs sont d'identifier des déterminants moléculaires responsables de sa liaison à AngII, ainsi que d'identifier des changements de conformations générés suite à cette liaison. Dans un premier temps, les déterminants de la liaison de la position C-terminale de l'AngII ont été identifiés directement grâce à des études de photomarquage par affinité sur le récepteur hAT 1. Ces études nous ont permis d'observer que l'acide aminé photoactivable utilisé, le para -benzoyl- L -phénylalanine (Bpa), présentait une sélectivité prononcée pour la méthionine. Nous avons exploité cette sélectivité du Bpa pour mettre au point une nouvelle approche : l'essai de proximité aux méthionines (MPA). Afin de déterminer l'environnement tridimensionnel de la position C-terminale de l'AngII dans le récepteur hATI, nous avons dans un premier temps étudié les domaines transmembranaires (TMD) III, VI et VII en mutant individuellement chacune des positions par une méthionine. Cette étude a permis de déterminer l'orientation relative des résidus identifiés de chaque TMD formant la pochette de liaison. Nous avons fait une étude MPA comparative avec le mutant constitutivement actif N111G-hAT 1 , afin de pouvoir déterminer des changements de hAT1 qui surviennent lors de l'activation, sur les TMD III, VI et VII et avons trouvé qu'une seule différence. La conclusion de l'étude impliquait un mouvement du TMD VI lors de l'activation. Dans une autre étude, les 4 derniers TMD (I, II, IV, V) ont été étudiés à la fois à l'état basal et actif. Cette étude permit d'identifier que les TMD II et V participent à la formation de la pochette de liaison de l'AngII dans la forme active uniquement, impliquant des mouvements dans ces 2 TMD aussi. Suite à l'identification des résidus des TMD participant à la structure de la pochette de liaison, dans la forme active ou inactive, nous avons construit des modèles du récepteur hATI ligandé dans la forme inactive et de la forme constitutivement active et les avons comparés. L'ultime but de ce projet est de présenter un modèle d'activation général des GPCR mais plus concrètement une meilleure compréhension des bases moléculaires de la liaison, de l'activation et des changements conformationnels d'un GPCR.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

En France la prise en charge des grandes douleurs fait toute sa place à la morphine. Cependant la prise prolongée de morphine entraîne la tolérance et la dépendance. Une stratégie de protéomique différentielle a été entreprise afin d'identifier les adaptations cellulaires à un traitement par la drogue dans des cellules SH-SY5Y. Nous avons montré, notamment, qu'un traitement chronique entraîne la dégradation par le protéasome des protéines Gbeta et Ggamma2. Aussi, le niveau de dégradation de Gbeta est corrélé avec le niveau de sensibilisation de l'adénylyl cyclase (AC), phénomène impliqué dans la dépendance à la morphine. Globalement, l'analyse protéomique a permis de détecter environ 50 protéines et une centaine de phosphoprotéines modulées par la drogue. Mes travaux ont permis de proposer un nouveau mécanisme moléculaire responsable de la sensibilisation de l'AC et surtout suggèrent pour la première fois que le protéasome est impliqué dans les effets chroniques de la morphine.

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) constituent l’une des plus grandes familles de cibles pharmacologiques. Afin de pouvoir extraire tout leur potentiel thérapeutique, il faut d’abord comprendre et caractériser le premier événement dans la cascade pharmacologique, c’est-à-dire la liaison d’un ligand à son récepteur. Nous nous sommes intéressés au récepteur CXCR4, car il fait partie de la famille des récepteurs peptidergiques qui demeure peu comprise au niveau de la structure et de leur mode de liaison. Au niveau physiologique, ce récepteur joue un rôle important pour l’homéostasie du système immunitaire ainsi que dans certaines pathologies comme l’infection au VIH-1 et le cancer. Nous avons d’abord caractérisé la pochette de liaison du récepteur CXCR4 à l’aide de photoanalogues du T140, un composé peptidomimétique anti-VIH. Nous avons identifié que le domaine transmembranaire 4 (TM4) est impliqué dans la pochette de liaison orthostérique du récepteur CXCR4. Nous avons aussi généré un modèle par homologie de séquence de la liaison du T140 sur CXCR4. Ce modèle nous a permis de constater que le T140 peut lier profondément au niveau de la pochette de liaison du CXCR4 ainsi qu’au niveau des boucles extracellulaires 2 et 3. À l’aide de la méthode d'accessibilité des résidus cystéines substitués (SCAM), nous avons procédé à la substitution individuelle des résidus du domaine TM4 en cystéine. Nous avons caractérisé ces mutants pour leur affinité et leur expression à l’aide d'études de radioliaison. Nous avons identifié que les résidus Asp171[indice supérieur 4.60] et Pro170[indice supérieur 4.59] se situent face à la pochette de liaison du récepteur à l’état basal. À l’aide du mutant constitutivement actif Asn119[indice supérieur 3.35]Ser, nous avons identifié qu’il y avait un mouvement rotatoire anti-horaire du domaine TM4 permettant au résidu Ile173[indice supérieur 4.62] d'être accessible. Ce mouvement serait couplé à un changement conformationnel de la boucle extracellulaire 2 permettant aux résidus Ser178[indice supérieur 4.67] et Val177[indice supérieur 4.66] d'être accessibles dans un état actif. Ces résultats suggèrent que le domaine TM4 participe à la pochette de liaison du récepteur CXCR4 ainsi qu’aux mouvements conformationnels lors de l’activation.

Compte tenu de la grande distribution des gènes des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) dans le génome humain et du vaste potentiel thérapeutique de ces récepteurs, beaucoup d'efforts ont été déployés au cours des trois dernières décennies afin de comprendre les bases structurales de leurs mécanismes d'actions. Les travaux de recherches présentés dans le cadre de cette thèse rapportent le développement et l'utilisation d'approches biochimiques afin de caractériser la structure moléculaire d'un modèle de GPCR peptidergique, soit le récepteur de l'angiotensine II de type 1 (AT[indice inférieur 1]). Dans une première étude (J.Med.Chem.2006,49(7):2200-9), nous décrivons la synthèse stéréospécifique d'une sonde photoréactive, le p-[3-(trifluorométhyl)-3H-diazirin-3-yl]-L-phénylalanine (Tdf), ainsi que sa caractérisation en marquage par photoaffinité (MPA). Nous démontrons par l'utilisation du récepteur de l'angiotensine II de type 2 (AT[indice inférieur 2]) comme modèle de GPCR que le Tdf est plus réactif que le p-benzoyl-L-phénylalanine (Bpa, la sonde photoréactive la plus couramment utilisée), en plus de ne présenter aucune chimiosélectivité envers les méthionines. Ces propriétés font que le Tdf est non seulement complémentaire au Bpa, mais représente également un outil moléculaire permettant de déterminer avec précision les sites de contacts ligand/récepteur par MPA. Dans une deuxième étude (J.Med.Chem.2010; 53(5):2063-75), nous cherchons à identifier l'ensemble des domaines du site de liaison du récepteur AT[indice inférieur 1] qui contacte chacune des huit positions de l'angiotensine II (AngII) par MPA. À l'aide de deux séries de huit radio-analogues photoréactifs incorporant le Bpa ou le Tdf, nous démontrons qu'un mutant constitutivement actif (MCA) du récepteur AT[indice inférieur 1], AT[indice inférieur 1]-[N111G] (AT[indice inférieur 1],-MCA), possède une relation structure-activité (SAR) plus tolérante que le récepteur de type sauvage (TS). Nos résultats suggèrent que la portion N-terminale (NT) de l'AngII réside dans un environnement hydrophile et interagit avec différentes régions du récepteur MCA-AT[indice inférieur 1], dont plusieurs domaines extracellulaires (DEC). Dans une troisième étude (Manuscrit soumit [i.e. soumis]), nous utilisons l'essai de proximité aux méthionines (EPM) afin d'identifier précisement les résidus des DEC du récepteur AT[indice inférieur 1] qui forment le site de liaison pour l'AngII. Les données recueillies sont utilisées afin de générer in silico une structure tridimensionnelle du récepteur AT[indice inférieur 1] lié à l'AngII. Cette structure met en évidence le rôle central de plusieurs DEC, mais aussi des deux ponts disulfures, dans l'organisation de la topologie extracellulaire du site de liaison du récepteur AT[indice inférieur 1]. L'AngII y interagit alors simultanément avec l'ensemble des DEC, mais aussi profondément au sein des domaines transmembranaires (DTM). Nous émettons l'hypothèse que ce mode de liaison puisse être commun à d'autres GPCR peptidergiques.

GPCRs form the largest family of membrane proteins in human genome and mediate signal transmission in a wide panel of essential physiological processes, and they are thus a major source of pharmaceutical targets. Investigating GPCR interactions with their cognate ligands and their membrane environment is crucial to understand their function at a molecular level. While major breakthroughs in the determination of high resolution structures of GPCRs in inactive and active states have shed a new light on the structural basis of GPCR activation process, complementary approaches are needed to investigate its dynamic aspects in the context of a native lipid environment. Our research work falls within this scope and hinges on two main issues: on the one hand, understand which structural features of the agonist underlie the activation of S1P receptors; on the other hand determine if membrane lipids modulate the structure and the function of the vasopressin V2 receptor (V2R). First, we investigated the functional response of S1P1, S1P2, S1P4 and S1P5 receptors expressed in mammalian cells to a series of synthetic derivatives of the native ligand sphingosine-1-phosphate, of variable alkyl chain length. Our data demonstrated that the hydrophobic tail of the ligand is crucial to induce activation in S1P receptors family, and revealed subtype-specificities regarding the influence of the alkyl chain length. Our experimental results combined with molecular dynamics simulation lead us to propose an activation mechanism for S1P receptors family. In the second part of our work, we reconstituted purified V2R into systems of controlled lipid composition, mimicking the membrane bilayer. Structural and functional characterization of the receptor in different lipid environments, using infrared and fluorescence spectroscopy approaches, revealed that the lipid composition affects V2R conformation and its interaction with a specific ligand. Taken together, our research work contributes to a better understanding of GPCRs activation mechanism and its regulation by lipid environment. / Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) forment la plus grande famille de protéines membranaires du génome humain et contribuent à une kyrielle de processus physiologiques essentiels, qui leur confèrent un intérêt pharmacologique majeur. Étudier l'interaction de ces protéines avec leurs ligands et leur environnement membranaire est primordial pour appréhender leur fonctionnement à l’échelle moléculaire. Bien que de remarquables avancées dans la détermination de structures à haute résolution de GPCRs à l'état inactif et actif aient permis de comprendre certaines bases structurales du fonctionnement des récepteurs, des approches complémentaires donnant un aperçu des aspects dynamiques et dans un environnement natif sont nécessaires pour cerner pleinement leur mécanisme d'activation. Notre travail de thèse s'inscrit dans cette problématique et s'articule autour de deux sujets: d'une part, comprendre quelles caractéristiques structurales du ligand sous-tendent l'activation de la famille des récepteurs au sphingosine-1-phosphate (S1P); d'autre part, déterminer si les lipides de la membrane plasmique modulent la structure et la fonction du récepteur à la vasopressine V2. Pour répondre à notre première question, nous avons étudié la réponse fonctionnelle en système cellulaire des récepteurs S1P1, S1P2, S1P4 et S1P5 à des composés synthétiques dérivés du S1P, portant des chaînes alkyles de longueur variable. Nos données mettent en évidence que la longueur de la chaîne hydrocarbonée du ligand est un paramètre crucial dans sa capacité d'induire l'activation du récepteur et ce pour l'ensemble des sous-types étudiés. De plus, nos résultats suggèrent que le comportement vis-à-vis de la longueur de chaîne dépend du sous-type de récepteur considéré. Nos résultats expérimentaux, combinés à une approche de modélisation dynamique, ont abouti à proposer un mécanisme d'activation pour la famille des récepteurs au S1P. Dans le second volet de notre travail, nous avons reconstitué le récepteur V2 purifié dans des systèmes de composition lipidique contrôlée, mimant la bicouche membranaire. Nous avons procédé à la caractérisation structurale et fonctionnelle du récepteur inséré dans différentes types de lipides, par des méthodes spectroscopiques infrarouge et de fluorescence. Les données obtenues suggèrent que la composition lipidique affecte la conformation et la fonction du récepteur. L'ensemble de nos travaux contribue ainsi à une meilleure compréhension du mécanisme d'activation des GPCRs et de leur régulation par l'environnement lipidique. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.