L’autophagie est un processus catabolique par lequel certaines protéines cytosoliquessont dirigées vers le compartiment lysosomial, afin d’y être dégradées. Ce processus débutepar la séquestration de constituants cytoplasmiques par une structure multimembranaireappelée phagophore. La fermeture du phagophore donne naissance à une vésicule à doublemembrane nommée autophagosome, qui fusionne avec les lysosomes, ce qui conduit à ladégradation du contenu de sa lumière. Ainsi, la modulation de l’autophagie permet unremodelage dynamique du protéome cellulaire. Bien que des données récentes ont permis dedémontrer la dégradation autophagique de protéines impliquées dans la migration cellulaire,telles que des intégrines, ou encore les protéines RhoA et Src, l'impact fonctionnel del'autophagie sur la migration cellulaire demeure sujet à controverse. Alors que l'autophagie estdécrite comme un processus pro-migratoire et pro-invasif dans certaines études, d'autrestravaux indiquent que l'inactivation des protéines pro-autophagiques stimule l'invasion descellules cancéreuses. De plus, l'effet fonctionnel des RCPG chimiotactiques sur l’activitéautophagique reste totalement inexploré. Sur la base de ces données, les objectifs de mon travail de thèse ont été i) d’évaluer les effets des RCPG chimiotactiques, le CXCR4 et l’UT,sur le processus autophagique et ii) d’étudier l’impact de cette modulation sur la migrationcellulaire. Pour ce faire, nous avons utilisé des cellules HEK-293, transfectées à l’aide deconstruits permettant l’expression des RCPG CXCR4 et UT, ainsi que la lignée deglioblastome humain U87, exprimant ces deux récepteurs de manière endogène.Nous avons dans un premier temps évalué l’activité autophagique à l’aide de laprotéine de fusion EGFP-LC3, marqueur des autophagosomes. Nous avons ainsi démontréque l’activation du CXCR4 et de l’UT provoque une diminution significative de la biogénèsedes autophagosomes. Une étape essentielle de cette biogenèse est le recrutement des protéinesAtg16L1 et Atg5 à la membrane plasmique, conduisant à la formation d'endosomes Atg16L1-Atg5-positifs, appelés « endosomes pré-autophagiques ». Cette population d’endosomesconstitue une source importante de phospholipides nécessaire à l’expansion du phagophore etla formation d’un autophagosome mature. Afin d’évaluer l’impact des RCPG chimiotactiquessur le recrutement de la protéine Atg16L1 à la membrane plasmique, nous avons bloqué leprocessus d’endocytose par l’utilisation d’un inhibiteur de la dynamine, le Dynasore. Cettemolécule provoque une accumulation marquée de la protéine Atg16L1 dans les endosomespré-autophagiques en formation, retenus à la membrane plasmique. / Autophagy is a catabolic process by which certain cytosolic proteins are directed to thelysosomal compartment to be degraded. This process begins with the sequestration ofcytoplasmic components, by a multimembrane structure called the phagophore. The closure ofthe phagophore gives rise to a double membrane vesicle called autophagosome, which thenmerges with lysosomes in order to degrade its luminal content. Autophagy modulation allowsa dynamic remodeling of the cellular proteome. Although recent evidence has demonstratedautophagic degradation of key proteins involved in cell migration, such as integrins, RhoAand the Src kinase, the functional impact of autophagy on cell migration remainscontroversial. While autophagy is described as a pro-migratory and pro-invasive process insome studies, others indicate that the inactivation of pro-autophagic proteins stimulates thecancer cell invasion. In addition, the functional effect of chemotactic GPCR on autophagicactivity remains unexplored. On the basis of these data, the objectives of my thesis were i) toevaluate the effects of the chemotactic GPCRs for SDF-1 (CXCR4) and for the vasoactivepeptide urotensin II (UT), on the autophagic process and ii) to study the impact of thismodulation on cell migration. In order to do this, we used HEK-293 cells, transfected with constructs allowing the expression of CXCR4 and UT, as well as the human glioblastomaline, U87, which endogenously expresses these two receptors. Previous studies have demonstrated a direct interaction of Atg5 with membranes,suggesting that recruitment of Atg16L1 to the plasma membrane may depend on Atg5. This prompted us to evaluate the formation of Atg16L1-positive pre-autophagic endosomes,following depletion of Atg5 levels. Several interfering RNAs, targeting the transcriptencoding Atg5, have been tested and, as expected, these interfering RNAs completely blockedthe recruitment of Atg16L1 to forming pre-autophagic endosomes. We then tested the effectsof chemotactic GPCRs on the subcellular localization of the Atg5 protein. By confocalmicroscopy, we found that a significant fraction of Atg5 localized to the plasma membraneunder basal conditions. The activation of CXCR4 or UT is accompanied by a marked decreaseof the Atg5 pool localized at the plasma membrane. Furthermore, we have demonstrated thatthe anti-autophagic effects of chemotactic GPCRs are completely abrogated byoverexpression of a recombinant Atg5 protein, suggesting that chemotactic GPCRs exert theiranti-autophagic effects by reducing the membrane pool of Atg5, necessary for the productionof pre-autophagic endosomes, and the expansion of the phagophore.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'immunothérapie, en particulier l'utilisation d'inhibiteurs de PD-1 et de PD-L1, a révolutionné le traitement du cancer. Cependant, son efficacité varie, certains patients présentant une réponse limitée ou une rechute, souvent liée à une forte expression de PD-L1 dans le microenvironnement tumoral. Des recherches récentes suggèrent que les effecteurs de la voie Hippo, YAP et TAZ, pourraient jouer un rôle crucial dans la régulation de l'expression de PD-L1 dans les cellules cancéreuses, y compris celles du sein et du poumon. La voie Hippo, qui contrôle la survie cellulaire, la prolifération et la taille des organes, agit par l'inhibition médiée par la kinase Lats1/2 de YAP/TAZ. Lorsqu'ils ne sont pas phosphorylés, YAP/TAZ se déplacent vers le noyau, affectant l'expression de gènes tels que PD-L1 et PD-1. De plus, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), y compris le récepteur de type 1 à l'angiotensine II (AT1), ont été identifiés comme des modulateurs potentiels de la réponse immunitaire dans le cancer. Cette étude vise à développer et valider de nouveaux biosenseurs basés sur la BRET pour observer l'activité de la voie Hippo en suivant le mouvement de YAP et de TAZ du cytoplasme au noyau et pour évaluer la capacité de ces capteurs à surveiller différents signaux stimulants, y compris la stimulation AT1R, offrant ainsi des aperçus de nouvelles stratégies thérapeutiques en immuno-oncologie. L'immunothérapie est apparue comme une approche révolutionnaire pour pallier les limites des traitements anticancéreux traditionnels, introduisant des médicaments ciblant les points de contrôle immunitaires, tels que les inhibiteurs de PD-1 (protéine de mort cellulaire programmée 1) et de PD-L1 (ligand de mort cellulaire programmée 1). Cependant, certains patients présentent une réponse inadéquate ou une rechute après traitement, notamment ceux avec une expression accrue de PD-L1 dans le microenvironnement tumoral. En conséquence, la modulation de PD-1 et de PD-L1 émerge comme une branche potentielle des thérapies immuno-basées. Des investigations récentes suggèrent que les effecteurs de la voie Hippo, YAP et TAZ, pourraient influencer la réponse immunitaire en régulant transcriptionnellement PD-L1 dans diverses cellules cancéreuses, y compris celles du sein et du poumon. Mécanistiquement, la kinase Lats1/2 inhibe YAP/TAZ par phosphorylation directe, les séquestrant dans le cytoplasme, tandis que YAP/TAZ non phosphorylés se transloquent dans le noyau, médiatisant la sortie transcriptionnelle de gènes tels que PD-L1 et PD-1. La signalisation des RCPG a été proposée comme un modulateur 4 potentiel de la réponse immunitaire au cancer, avec le récepteur de type 1 à l'angiotensine II (AT1) suggéré comme un médicament combiné potentiel pour les traitements en immunooncologie. Par conséquent, ce travail vise à développer et valider de nouveaux biosenseurs basés sur la BRET pour évaluer la voie Hippo en surveillant la translocation de YAP et de TAZ du cytoplasme au noyau et pour évaluer la capacité de ces capteurs à surveiller différents signaux stimulants, y compris la stimulation AT1R. Cette étude visait à développer et à valider des biosenseurs pour surveiller l'activité de la voie Hippo en évaluant la translocation de YAP et de TAZ à l'aide du transfert d'énergie de résonance bioluminescente améliorée (ebBRET). Des défis techniques ont entravé la validation complète sous différents stimuli, mais la manipulation de la densité cellulaire a validé la fonctionnalité du capteur. L'identification du récepteur AT1 comme un modulateur de la relocalisation de YAP médiée par les RCPG souligne la nécessité d'explorer l'interaction entre la signalisation des RCPG et la voie Hippo. La sélection minutieuse des activateurs et la validation complète sont cruciales pour élucider le réseau régulateur de YAP/TAZ dans le développement du cancer. / Immunotherapy, particularly the use of PD-1 and PD-L1 inhibitors, has revolutionized cancer treatment. However, its effectiveness varies, with some patients showing limited response or relapse, often linked to high PD-L1 expression in the tumor microenvironment. Recent research suggests that the Hippo pathway effectors, YAP and TAZ, may play a crucial role in regulating PDL1 expression in cancer cells, including breast and lung cancers. The Hippo pathway, which controls cell survival, proliferation, and organ size, operates through the Lats1/2 kinase-mediated inhibition of YAP/TAZ. When not phosphorylated, YAP/TAZ move to the nucleus, affecting the expression of genes like PD-L1 and PD-1. Furthermore, G protein-coupled receptors (GPCRs), including the Angiotensin II type 1 (AT1) receptor, have been identified as potential modulators of the immune response in cancer. This study aims to develop and validate novel BRET-based biosensors to observe the Hippo pathway's activity by tracking the movement of YAP and TAZ from the cytoplasm to the nucleus and to assess various stimulatory signals, including AT1R stimulation, offering insights into new therapeutic strategies in immuno-oncology Immunotherapy has emerged as a revolutionary approach to address the limitations of traditional cancer treatments, introducing drugs that target immune checkpoints, such as PD-1 (Programmed Cell Death Protein 1) and PD-L1 (Programmed Cell Death Ligand 1) inhibitors. Yet, some patients exhibit inadequate response or experience relapse post-treatment, especially those with heightened PD-L1 expression in the tumor microenvironment. Consequently, modulation of PD-1 and PD-L1 has emerged as a potential branch of immuno-based therapies. Recent investigations propose that the Hippo pathway effectors, YAP and TAZ, may influence the immune response by transcriptionally regulating PD-L1 in various cancer cells, including breast and lung cancer. Mechanistically, Lats1/2 kinase inhibits YAP/TAZ through direct phosphorylation, leading to their sequestration in the cytoplasm, while unphosphorylated YAP/TAZ translocate to the nucleus, mediating the transcriptional output of genes such as PD-L1 and PD-1. G proteincoupled receptors (GPCRs) signaling has been proposed as a potential modulator of the immune response to cancer, with the Angiotensin II type 1 (AT1) receptor suggested as a potential combination drug for immune-oncology treatments. Therefore, this work aims to develop and validate new BRET-based biosensors to evaluate the Hippo pathway by monitoring the 6 translocation of YAP and Taz from the cytoplasm to the nucleus and to evaluate the ability of these sensors to monitor different stimulatory signals, including AT1R stimulation. This study aimed to develop and validate biosensors for monitoring Hippo pathway activity by assessing YAP and TAZ translocation using enhanced bioluminescence resonance energy transfer (ebBRET). Technical challenges hindered comprehensive validation under different stimuli, yet cell density manipulation validated sensor functionality. Identification of AT1 receptor as a modulator of GPCR-mediated YAP relocalization underscores the need to explore GPCR-Hippo pathway interplay. Meticulous activator selection and comprehensive validation are crucial for unraveling YAP/TAZ's regulatory network in cancer development.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’hyperphagie et l’obésité sont devenues des problèmes majeurs de notre société et touchent de manière différente les hommes et les femmes. Dès lors, il apparaît nécessaire de rechercher les bases physiologiques de ces troubles chez des modèles animaux, comme les rats développant l’hyperphagie induite par le stress et l’obésité induite par la diète (DIO). Dans ces modèles, l’étude du neuropeptide orexigène relaxine-3 semble être une piste prometteuse du fait de son implication dans la régulation du stress et de la prise alimentaire. Dans un premier temps, nous avons étudié ce neuropeptide chez un modèle animal de rat DIO. Ces rats sont hyperphagiques et défendent leur gain de poids corporel contre la restriction calorique. Nos résultats montrent une expression plus élevée de la relaxine-3 chez les rats DIO lorsqu’ils ont accès à la nourriture à volonté et une expression augmentée de son récepteur RXFP3 induite par la réalimentation suivant le jeûne, suggérant que la relaxine-3 serait impliquée dans le maintien du gain de poids corporel chez le phénotype DIO. Dans une deuxième étude, des rats mâles et femelles étaient soumis à un stress et une restriction alimentaire chronique. Nous avons observé que seules les femelles connaissaient des épisodes d’hyperphagie associés à un gain de poids corporel et une augmentation de l’expression de relaxine-3 qui pourrait être à la base de ce comportement sexuellement spécifique. Dans une troisième étude, par l’injection de relaxine-3 dans le cerveau des rats mâles et femelles, nous avons montré que ce neuropeptide avait un effet orexigène plus élevé chez les femelles que chez les mâles. Nous avons également observé une stimulation plus importante de l’axe corticotrope chez les mâles qui pourrait atténuer l’effet orexigène de la relaxine-3 tandis que, chez les femelles, la stimulation de l’expression de corticolibérine dans le noyau du lit de la strie terminale pourrait renforcer la motivation liée à la recherche de nourriture. En résumé, nos travaux démontrent le rôle du système relaxine-3/RXFP3 dans l’hyperphagie et le gain de poids corporel et montrent son rôle sexuellement spécifique dans la régulation de la prise alimentaire et de la réponse au stress. / Hyperphagia and obesity are major problems in our society that affect differentially men and women. Therefore, it is necessary to seek the physiological basis of these health problems using animal models such as stress-induced hyperphagia and diet-induced obesity (DIO) in rats, taking into account diet, stress and sex factors. Investigating the role of the orexigenic neuropeptide relaxin-3 appears to be promising because of its involvement in the regulation of stress and food intake. First, we studied the role of relaxin–3 system in DIO rat model. These rats are hyperphagic and defend their elevated body weight against caloric restriction. The results of this study showed higher expression of relaxin-3 in the DIO rats in free feeding conditions, and, in addition, refeeding after food deprivation led to increased expression of the cognate receptor of relaxin-3 RXFP3 in DIO rats suggesting that relaxin-3 is involved in the defense of elevated body weight in the DIO phenotype. In the second study, hyperphagia was developed in female but not male rats submitted to repeated episodes of food restriction and stress. We observed that female hyperphagic rats showed increased expression of relaxin-3 which could be a cause of this sexually specific behavior. In the third study, by the central injection of relaxin-3 in male and female rats, we showed that female rats were more sensitive to lower doses of relaxin-3 and demonstrated higher increase in food intake compared to male rats. We also observed a greater stimulation of the hypothalamic pituitary adrenal (HPA) axis in male rats that may limit the orexigenic effect of relaxin-3. Conversely, in female rats, stimulation of corticotropin-releasing factor expression in the bed nucleus of the stria terminalis may enhance feeding behavior. In summary, our work demonstrates the role of relaxin-3/RXFP3 system in hyperphagia and body weight gain and shows its sex-specific effects in food intake regulation and stress response.

Le but de ce travail était de mieux comprendre les mécanismes de régulation influençant le recrutement des macrophages cérébraux et leur activation dans différentes affections du système nerveux central. À cette fin, trois objectifs ont été définis : (1) Mettre en évidence le rôle du TNF dans l'infiltration et l'activation des macrophages dans un modèle de démyélinisation induit par la cuprizone; (2) Identifier les précurseurs sanguins des macrophages périvasculaires du cerveau et le rôle de l'angiopoïétine-2 dans leur recrutement suite à une endotoxinémie; (3) Définir le rôle du récepteur GPR84 lors de la réponse microgliale dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer. L'identification des différents facteurs pouvant influencer le phénomène de démyélinisation est un enjeu majeur de la recherche sur la sclérose de plaques. Dans cette maladie et dans les modèles animaux associés, l'expression de TNF par les macrophages cérébraux suggérait que la cytokine pro-inflammatoire jouerait un rôle dans le recrutement des macrophages dérivés du sang et de la microglie. Afin de déterminer quelles fonctions jouaient le TNF et ses récepteurs TNF-R1 et TNF-R2 sur les macrophages cérébraux, nous avons utilisé des souris chimériques dont le système hématopoïétique exprimait la GFP, et nous les avons traitées avec la toxine cuprizone pour reproduire un modèle de démyélinisation. Nous avons montré que les macrophages étaient très fortement recrutés depuis la périphérie et activés dans le SNC, mais selon un mécanisme indépendant du TNF. De plus, chez des souris déficientes en TNF traitées avec la cuprizone, l'étendue de la démyélinisation n'était pas diminuée par rapport aux souris contrôles. Finalement, par la technique d'hybridation in situ, il a été prouvé que le TNF n'était pas exprimé dans le cerveau dont la démyélinisation était provoquée par la cuprizone. Le système nerveux est infiltré de façon continue par les macrophages périvasculaires dérivés du système sanguin. Les précurseurs immédiats de ces cellules n'ont pas encore été identifiés et les mécanismes gouvernant leur recrutement sont encore largement méconnus. Dans cette étude, nous apportons la preuve que les monocytes CD68+GR1" pouvaient se différencier en macrophages périvasculaires chez des souris souffrant d'endotoxinémie. Après leur adhésion à l'endothélium, ces monocytes rampaient, adoptaient une morphologie dite en bâtonnet lors de leur passage dans les capillaires, pouvaient proliférer et former de longues protubérances cytoplasmiques. Ils étaient recrutés en grand nombre lors d'une endotoxinémie grâce à la combinaison de molécules vasorégulatrices, incluant le TNF, l'interleukine-ip et l'angiopoïétine-2. Après quelques heures, quelques unes de ces cellules traversaient l'endothélium afin d'accroître la population de macrophages périvasculaires du SNC. L'élimination des monocytes adhérents et des macrophages périvasculaires nouvellement recrutés pouvait être provoquée par l'injection d'une protéine de fusion couplant un peptide-Fc et un anti-angiopoïétine-2. Cette seconde étude permet ainsi une meilleure compréhension du comportement monocytaire à l'interface sang-cerveau et fournit une nouvelle façon de contrer leur infiltration dans le tissu nerveux en conditions inflammatoires. Le GPR84 est un récepteur transmembranaire couplé aux protéines G récemment identifié comme étant exprimé de façon sélective par la microglie chez des souris souffrant d'endotoxinémie ou d'encéphalomyélite autoimmune expérimentale, mais sa fonction demeure inconnue. Nos travaux rapportent que le GPR84 est également exprimé par les cellules microgliales entourant les plaques amyloïdes chez les souris transgéniques APP/PS1, un modèle de la maladie d'Alzheimer. Les symptômes d'une endotoxinémie ou de l'EAE ne différaient pas chez des souris déficientes en GPR84, mais un déclin cognitif plus précoce et plus sévère était observé chez les souris APP/PS1 déficientes en GPR84. Dans le cerveau de ces dernières, le nombre de microglies global ainsi que par plaque était diminué; toutefois, aucune différence de dépôt d'amyloïde n'était observée. Nous en concluons dans cette troisième étude que le GPR84 joue un rôle dans le recrutement des cellules microgliales lors de certaines conditions inflammatoires et que son absence réduit la capacité de la microglie à protéger partiellement le cerveau contre la P-amyloïde toxique sans pouvoir l'éliminer. L'ensemble de ces

La communication cellulaire est un phénomène important pour le maintien de l’homéostasie des cellules. Au court des dernières années, cette sphère de recherche sur la signalisation cellulaire a connue des avancées importantes au niveau de l’identification des acteurs principaux impliqués dans la reconnaissance extracellulaire des signaux, ainsi que la compréhension des voies de signalisation engagées par les cellules pour répondre aux facteurs extracellulaires. Malgré ces nouvelles informations, les diverses interrelations moléculaires entre les acteurs ainsi que les voies de signalisation cellulaire, demeurent mal comprises. Le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET) permet la mesure d’interactions protéiques et peut être utilisé dans deux configurations, le BRET480-YFP (connu aussi comme le BRET1) et le BRET400-GFP (connu aussi en tant que BRET2). Suite à l’oxydation de son substrat, la luciférase de renilla peut transférer son énergie à une protéine fluorescente, uniquement si elles sont à proximité l’une de l’autre (≤100Å). La combinaison dans un seul essai des BRET480-YFP et BRET400-GFP, a permis de suivre trois paires d’interactions, sur une même population cellulaire. Par contre, l’utilisation de deux substrats pour la réaction de bioluminescence rend impossible la mesure simultanée des différents signaux de BRET, pour ce trois nouvelles configurations de BRET ont été mises au point en utilisant des nouvelles protéines fluorescentes. Ainsi deux des nouvelles couleurs de BRET ayant des émissions résolues, le BRET400-BFP et le BRET400mAmetrine ont pu être combinées pour mesurer l’engagement par un RCPG d’une protéine G, ainsi que l’accumulation du second messager. La combinaison de ces BRET a également permis de révéler la formation d’un complexe entre le récepteur α2A adrénergique (α2AAR), Gαi1, le dimère Gβγ ainsi que la kinase des récepteurs couplés aux protéines G (GRK2), suite à l’activation du récepteur. De plus, seule l’entrée de GRK2 semble être en mesure de causer la désensibilisation du α2AAR, en s’intercalant entre Gαi1 et Gβγ. Par contre, la stabilisation de l’interaction entre α2AAR et la β-arrestine2 semble nécessiter l’activité kinase de GRK2. Une autre étude a révélé l’importance de différentes Gα pour la mobilisation du calcium, suite à l’activation du récepteur aux opioïdes de type delta (DOR). Suite à la surexpression de Gα de la famille Gαq, il a été possible de mesurer une influence de ces Gα sur la mobilisation du calcium. Toutefois, cette réponse calcique mesurée en présence des Gαq demeure sensible aux prétraitements à la toxine de Bordetella pertussis, qui inhibe sélectivement l’activité des Gαi. De plus, la co-expression de Gαi et Gαq permet de potentialiser la mobilisation de calcium, démontrant une interrelation entre ces deux familles de protéine Gα, pour la signalisation du DOR. Afin de démontrer l’interrelation directe, des expériences de BRET ont été réalisées entre différentes Gα. En plus de montrer la formation de complexes sélectifs entre les Gα, les expériences de BRET réalisées en parallèle d’analyses de séquences de Gα, ont également mis à jour un site de sélectivité d’interaction entre les Gα, l’hélice α4. Suite à la transposition de cette hélice α4 de Gα12 sur Gαi1, qui normalement n’interagissent pas, il a été possible de forcer l’interaction entre Gα12 et Gαi1, confirmant ainsi que cette hélice α contient l’information permettant une sélectivité d’interaction. Au cours de cette thèse, il a été possible de générer de nouvelles méthodes de mesure d’interactions protéiques qui permettent de multiplexer différents signaux, ce qui a permis de mettre à jour de nouvelles interactions entre divers effecteurs de la signalisation de RCGP / Cellular communication is an important phenomenon for the maintenance of cellular homeostasis. Recently, important progress has been made in the cell signalling research field concerning the identification of the major actors and the cellular pathways engaged in response to these extracellular factors. However, in spite of this new information, the interrelationships at the molecular level between the various cellular actors and the different signalling pathways remain badly understood. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) monitors interactions between proteins and can be used in two configurations, the BRET480-YFP (also known as BRET1) and the BRET400-GFP (also known as BRET2). Following oxidation of its substrate, renilla luciferase transfers its energy to a fluorescent protein, only if they are in close proximity (≤100Å). By combining the BRET480-YFP and BRET400-GFP in one assay, it is possible to follow three pair-wise interactions in the same cellular population. However, using two bioluminescence reaction substrates limits the possibility of measuring the different BRET signals simultaneously. In order to measure multiple BRET signals simultaneously, three new BRET configurations, based on the BRET400-GFP, were developed using fluorescent proteins with different emission wavelengths. Two of the new BRET colors which have resolved emission wavelengths, the BRET400-BFP and BRET400mAmetrine, were combined for measuring the heterotrimeric G protein engagement by the vasopressin V2 receptor, as well as the accumulation of the second messenger. Combining these new BRET techniques reveals for the first time the formation of a complex between the α2A adrenergic receptor (α2AAR), Gαi1, the Gβγ dimer and G protein-receptor kinase (GRK2) following receptor activation. Moreover, only the entry of GRK2 into the receptor complex is required for the α2AAR desensitization, by inserting between Gαi1 and Gβγ. On the other hand, the stabilization of the interaction between α2AAR and β-arrestin2 requires the kinase activity of GRK2. Another study revealed the importance of multiple Gα subunits for calcium mobilization induced upon activation of the delta opioid receptor (DOR). Gαq subfamily member overexpression altered the DOR-induced calcium mobilization, but this Gαq calcium mobilization remained sensitive to pre-treatement pertussis toxin, through selective inhibition of the activity of Gαi members. Moreover, Gαi and Gαq co-expression potentiated calcium mobilization, suggesting an interrelationship between these two Gα families in DOR signaling. This Gαi and Gαq interrelationship could result from the formation of a complex close to the receptor. In order to test this hypothesis, BRET experiments were performed, with the aim of measuring the presence of complexes between different Gα. In addition to demonstrating complex formation between Gα subunits, the BRET experiments in parallel with sequence analysis, also revealed a selective interaction site between the Gα, the α4 helix. By swapping the a4 helix of Gαi with the α4 helix of Gα12, which doesn’t normally interact with Gα12, it was possible to force the interaction between Gα12 and Gαi to confirm that this α helix contains information concerning the selectivity of interactions between Gα subunits. During this thesis, new methods were to detect protein interactions and multiplexing these methods allowed the detection of novel interactions between signalling effectors of GPCRs.

La communication cellulaire est un phénomène important pour le maintien de l’homéostasie des cellules. Au court des dernières années, cette sphère de recherche sur la signalisation cellulaire a connue des avancées importantes au niveau de l’identification des acteurs principaux impliqués dans la reconnaissance extracellulaire des signaux, ainsi que la compréhension des voies de signalisation engagées par les cellules pour répondre aux facteurs extracellulaires. Malgré ces nouvelles informations, les diverses interrelations moléculaires entre les acteurs ainsi que les voies de signalisation cellulaire, demeurent mal comprises. Le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET) permet la mesure d’interactions protéiques et peut être utilisé dans deux configurations, le BRET480-YFP (connu aussi comme le BRET1) et le BRET400-GFP (connu aussi en tant que BRET2). Suite à l’oxydation de son substrat, la luciférase de renilla peut transférer son énergie à une protéine fluorescente, uniquement si elles sont à proximité l’une de l’autre (≤100Å). La combinaison dans un seul essai des BRET480-YFP et BRET400-GFP, a permis de suivre trois paires d’interactions, sur une même population cellulaire. Par contre, l’utilisation de deux substrats pour la réaction de bioluminescence rend impossible la mesure simultanée des différents signaux de BRET, pour ce trois nouvelles configurations de BRET ont été mises au point en utilisant des nouvelles protéines fluorescentes. Ainsi deux des nouvelles couleurs de BRET ayant des émissions résolues, le BRET400-BFP et le BRET400mAmetrine ont pu être combinées pour mesurer l’engagement par un RCPG d’une protéine G, ainsi que l’accumulation du second messager. La combinaison de ces BRET a également permis de révéler la formation d’un complexe entre le récepteur α2A adrénergique (α2AAR), Gαi1, le dimère Gβγ ainsi que la kinase des récepteurs couplés aux protéines G (GRK2), suite à l’activation du récepteur. De plus, seule l’entrée de GRK2 semble être en mesure de causer la désensibilisation du α2AAR, en s’intercalant entre Gαi1 et Gβγ. Par contre, la stabilisation de l’interaction entre α2AAR et la β-arrestine2 semble nécessiter l’activité kinase de GRK2. Une autre étude a révélé l’importance de différentes Gα pour la mobilisation du calcium, suite à l’activation du récepteur aux opioïdes de type delta (DOR). Suite à la surexpression de Gα de la famille Gαq, il a été possible de mesurer une influence de ces Gα sur la mobilisation du calcium. Toutefois, cette réponse calcique mesurée en présence des Gαq demeure sensible aux prétraitements à la toxine de Bordetella pertussis, qui inhibe sélectivement l’activité des Gαi. De plus, la co-expression de Gαi et Gαq permet de potentialiser la mobilisation de calcium, démontrant une interrelation entre ces deux familles de protéine Gα, pour la signalisation du DOR. Afin de démontrer l’interrelation directe, des expériences de BRET ont été réalisées entre différentes Gα. En plus de montrer la formation de complexes sélectifs entre les Gα, les expériences de BRET réalisées en parallèle d’analyses de séquences de Gα, ont également mis à jour un site de sélectivité d’interaction entre les Gα, l’hélice α4. Suite à la transposition de cette hélice α4 de Gα12 sur Gαi1, qui normalement n’interagissent pas, il a été possible de forcer l’interaction entre Gα12 et Gαi1, confirmant ainsi que cette hélice α contient l’information permettant une sélectivité d’interaction. Au cours de cette thèse, il a été possible de générer de nouvelles méthodes de mesure d’interactions protéiques qui permettent de multiplexer différents signaux, ce qui a permis de mettre à jour de nouvelles interactions entre divers effecteurs de la signalisation de RCGP / Cellular communication is an important phenomenon for the maintenance of cellular homeostasis. Recently, important progress has been made in the cell signalling research field concerning the identification of the major actors and the cellular pathways engaged in response to these extracellular factors. However, in spite of this new information, the interrelationships at the molecular level between the various cellular actors and the different signalling pathways remain badly understood. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) monitors interactions between proteins and can be used in two configurations, the BRET480-YFP (also known as BRET1) and the BRET400-GFP (also known as BRET2). Following oxidation of its substrate, renilla luciferase transfers its energy to a fluorescent protein, only if they are in close proximity (≤100Å). By combining the BRET480-YFP and BRET400-GFP in one assay, it is possible to follow three pair-wise interactions in the same cellular population. However, using two bioluminescence reaction substrates limits the possibility of measuring the different BRET signals simultaneously. In order to measure multiple BRET signals simultaneously, three new BRET configurations, based on the BRET400-GFP, were developed using fluorescent proteins with different emission wavelengths. Two of the new BRET colors which have resolved emission wavelengths, the BRET400-BFP and BRET400mAmetrine, were combined for measuring the heterotrimeric G protein engagement by the vasopressin V2 receptor, as well as the accumulation of the second messenger. Combining these new BRET techniques reveals for the first time the formation of a complex between the α2A adrenergic receptor (α2AAR), Gαi1, the Gβγ dimer and G protein-receptor kinase (GRK2) following receptor activation. Moreover, only the entry of GRK2 into the receptor complex is required for the α2AAR desensitization, by inserting between Gαi1 and Gβγ. On the other hand, the stabilization of the interaction between α2AAR and β-arrestin2 requires the kinase activity of GRK2. Another study revealed the importance of multiple Gα subunits for calcium mobilization induced upon activation of the delta opioid receptor (DOR). Gαq subfamily member overexpression altered the DOR-induced calcium mobilization, but this Gαq calcium mobilization remained sensitive to pre-treatement pertussis toxin, through selective inhibition of the activity of Gαi members. Moreover, Gαi and Gαq co-expression potentiated calcium mobilization, suggesting an interrelationship between these two Gα families in DOR signaling. This Gαi and Gαq interrelationship could result from the formation of a complex close to the receptor. In order to test this hypothesis, BRET experiments were performed, with the aim of measuring the presence of complexes between different Gα. In addition to demonstrating complex formation between Gα subunits, the BRET experiments in parallel with sequence analysis, also revealed a selective interaction site between the Gα, the α4 helix. By swapping the a4 helix of Gαi with the α4 helix of Gα12, which doesn’t normally interact with Gα12, it was possible to force the interaction between Gα12 and Gαi to confirm that this α helix contains information concerning the selectivity of interactions between Gα subunits. During this thesis, new methods were to detect protein interactions and multiplexing these methods allowed the detection of novel interactions between signalling effectors of GPCRs.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont impliqués dans la majeure partie des communications intercellulaires. Un grand nombre de RCPG ont été découverts en comparant la séquence des récepteurs connus avec les données fournies par le séquençage du génome humain. Pour plus d'une centaine de ces récepteurs, le ligand activateur ou agoniste est inconnu. Ces récepteurs sont dès lors qualifiés d'orphelins.<p>Les LGR forment une sous-famille de RCPG structurellement proches de la rhodopsine qui comprend les récepteurs aux hormones glycoprotéiques (TSH, LH, hCG, FSH) et à la relaxine. LGR4 est un membre de cette famille dont ni la fonction précise, ni l'agoniste ne sont connus.<p>Dans un premier temps, une cartographie détaillée de l'expression de Lgr4 chez la souris a été obtenue. Nous avons tiré parti de l'existence d'une lignée de souris transgéniques dont le gène Lgr4 a été interrompu par l'introduction d'une cassette comportant deux marqueurs histologiques. L'activité beta-galactosidase d'un de ces marqueurs a été analysée chez les souris hétérozygotes. Ces dernières ne présentent pas de phénotype particulier, ce qui permet d'estimer que l'expression des marqueurs rend effectivement compte de l'expression normale du gène Lgr4. Lgr4 est exprimé dans un grand nombre de structures, notamment dans le cartilage, le rein, les appareils reproducteurs mâle et femelle et certaines cellules du système nerveux.<p>Ensuite, le phénotype des souris homozygotes pour l'inactivation de Lgr4 (LGR4KO) a été exploré. Ces souris présentent à la naissance un poids inférieur à leurs congénères des autres phénotypes. Les mâles sont stériles à cause d'une malformation des tubules efférents et de l'épididyme. Un blocage au niveau des tubules efférents reliant le testicule à l'épididyme contraint les spermatozoïdes à s'accumuler à la sortie du testicule, dans la région du rete testis. De plus, les tubes de l'épididyme, pourtant normaux à la naissance, ne s'allongent pas pour former la structure convolutée habituelle. L'épithélium de ces tubes est aplati et est entouré d'une quantité anormalement élevée de mésenchyme.<p>Dans un troisième temps, des outils nécessaires aux futures tentatives d'identification de l'agoniste naturel de LGR4 ont été réalisés. Il s'agit :(1) d'anticorps monoclonaux dirigés contre la partie extracellulaire du récepteur humain. (2) d'un appât moléculaire pour la ‘pêche au ligand’. Cet appât est constitué du domaine extracellulaire du récepteur humain couplé à un marqueur histologique. (3) d'une construction peptidique constituée du domaine extracellulaire du récepteur humain couplé à une queue poly-histidine. Cette construction est destinée à servir de greffon lors de chromatographies d'affinités devant permettre de purifier le ligand. (4) de lignées cellulaires exprimant le récepteur LGR4 humain ainsi que le système æquorine devant permettre de détecter l'activation de ce récepteur.<p>Les données apportées par ce travail montrent un rôle important du récepteur LGR4 au cours du développement et permettent de circonscrire le champ des recherches futures. Ceci, ainsi que les outils moléculaires développés, constitue une base pour l'identification future de l'agoniste et la détermination précise de la fonction de LGR4. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Récemment plusieurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) ont été caractérisés au niveau des membranes intracellulaires, dont la membrane nucléaire. Notre objectif était de déterminer si les sous-types de récepteurs β-adrénergiques (βAR) et leurs machineries de signalisation étaient fonctionnels et localisés à la membrane nucléaire des cardiomyocytes. Nous avons démontré la présence des β1AR et β3AR, mais pas du β2AR à la membrane nucléaire de myocytes ventriculaires adultes par immunobuvardage, par microscopie confocale, et par des essais fonctionnels. De plus, certains partenaires de signalisation comme les protéines GαS, Gαi, l’adénylate cyclase II, et V/VI y étaient également localisés. Les sous-types de βAR nucléaires étaient fonctionnels puisqu'ils pouvaient lier leurs ligands et activer leurs effecteurs. En utilisant des noyaux isolés, nous avons observé que l'agoniste non-sélectif isoprotérénol (ISO), et que le BRL37344, un ligand sélectif du β3AR, stimulaient l'initiation de la synthèse de l’ARN, contrairement à l'agoniste sélectif du β1AR, le xamotérol. Cette synthèse était abolie par la toxine pertussique (PTX). Cependant, la stimulation des récepteurs nucléaires de type B de l’endothéline (ETB) causaient une réduction de l'initiation de la synthèse d’ARN. Les voies de signalisations impliquées dans la régulation de la synthèse d’ARN par les RCPGs ont ensuite été étudiées en utilisant des noyaux isolés stimulés par des agonistes en présence ou absence de différents inhibiteurs des voies MAP Kinases (proteines kinases activées par mitogènes) et de la voie PI3K/PKB. Les protéines impliquées dans les voies de signalisation de p38, JNK, ERK MAP Kinase et PKB étaient présents dans les noyaux isolés. L'inhibition de PKB par la triciribine, inhibait la synthèse d’ARN. Nous avons ensuite pu mettre en évidence par qPCR que la stimulation par l’ISO entrainait une augmentation du niveau d'ARNr 18S ainsi qu’une diminution de l'expression d’ARNm de NFκB. En contraste, l’ET-1 n’avait aucun effet sur le niveau d’expression de l’ARNr 18S. Nous avons ensuite montré que la stimulation par l’ISO réduisait l’expression de plusieurs gènes impliqués dans l'activation de NFκB, tandis que l’inhibition de ERK1/2 et PKB renversait cet effet. Un microarray global nous a ensuite permis de démontrer que les βARs et les ETRs nucléaires régulaient un grand nombre de gènes distincts. Finalement, les βARs et ETRs nucléaires augmentaient aussi une production de NO de noyaux isolés, ce qui pouvait être inhibée par le LNAME. Ces résultats ont été confirmés dans des cardiomyocytes intacts en utilisant des analogues cagés et perméables d’ISO et de l'ET-1: l'augmentation de NO nucléaire détectée par DAF2-DA, causée par l'ET-1 et l'ISO, pouvait être prévenue par le LNAME. Finalement, l’augmentation de l’initiation de la transcription induite par l'ISO était aussi bloquée par le L-NAME ou par un inbitheur de PKG, le KT5823, suggérant que la voie NO-GC-PKG est impliquée dans la régulation de la transcription par les βAR. En conclusion, les βARs et les ETRs nucléaires utilisent des voies de signalisation différentes et exercent ainsi des effets distincts sur l’expression des gènes cardiaques. Ils représentent donc une avenue intéressante pour le développement de drogues pharmacologiques. / Recently several G protein-coupled receptors (GPCRs) have been shown to localize to intracellular membranes, in particular the nuclear membrane. As such, we sought to determine if the β-adrenergic receptor (βAR) subtypes and their associated signalling machinery are functionally localized to nuclear membranes. We demonstrated the presence of β1AR and the β3AR, but not the β2AR, in adult ventricular myocyte nuclei by western blotting, confocal microscopy and functional assays. Downstream signalling partners such as GαS, Gαi and adenylyl cyclase II and V/VI were also present. Nuclear-localized βARs were functional with respect to ligand binding and effector activation. In isolated nuclei, the non-selective βAR agonist isoproterenol (ISO) and the β3AR-selective ligand BRL37344, but not the β1AR-selective xamoterol, stimulated transcription initiation in a pertussis toxin (PTX)-sensitive manner. In contrast, stimulation of type B endothelin receptors (ETB), another GPCR family shown to be present on the nuclear membrane, decreased de novo RNA synthesis. To investigate the signalling pathway(s) involved in GPCR-mediated regulation of RNA synthesis, nuclei were isolated from intact adult rat hearts and treated with receptor agonists in the presence or absence of inhibitors of the PI3K/PKB and mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways. Components of p38, JNK, and ERK1/2 MAPK cascades as well as PKB were detected in nuclear preparations. Inhibition of PKB with triciribine converted the activation of the βAR from stimulatory to inhibitory with regards to transcription initiation. Analysis by qPCR indicated isoproterenol treatment increased 18S rRNA but decreased NFκB mRNA. In contrast, ET-1 had no effect on 18S rRNA expression. Further investigation using pathway-specific PCR arrays revealed that isoproterenol treatment also reduced the expression of several other genes involved in the activation of NFκB and that ERK1/2 and PKB inhibitors attenuated this effect. Subsequent genome-wide microarray analysis has revealed that nuclear βAR and ETB regulated a host of genes in an overlapping but distinct manner. Moreover, both ET-1 and ISO produced an L-NAME-sensitive increase in NO production in isolated cardiac nuclei. These observations were confirmed in intact cardiomyocytes using novel caged analogues of ISO and ET-1 and the cell-permable NO-sensitive fluorescent dye, DAF-2 DA. Briefly, both ET-1 and isoproterenol increased NO production, and this increase was prevented upon preincubation with L-NAME. Moreover, the ability of isoproterenol to increase transcription initiation in isolated nuclei was blocked by L-NAME or the PKG inhibitor KT5823, indicating the NO-GC-PKG pathway is involved in the regulation of gene expression by nuclear βARs. Hence, we have shown that βARs and ETRs in the nuclear membrane activate distinct signalling pathways, resulting in different effects on gene transcription and thus represent potentially important targets for drug development.