Le cancer colorectal représente la troisième forme de cancer la plus fréquente au Canada. Malgré les récents développements, aucun traitement curatif n’est disponible pour les patients diagnostiqués à un stade avancé de la maladie. Plusieurs évidences supportent un rôle important des prostaglandines dans cette maladie. En effet, une surexpression des récepteurs de type EP et FP est remarquée. Ces derniers ainsi que les molécules de signalisations intracellulaires qu’ils activent représentent donc de nouvelles cibles pour traiter ce cancer. Nous et d’autres groupes avons démontré que les protéines G monomériques sont des petits interrupteurs moléculaires importants dans la signalisation intracellulaire engagée par les récepteurs dans des cellules saines mais qu’un dérèglement de celles-ci est associé au cancer. L’objectif principal de ce projet de recherche vise donc à identifier les voies de signalisations par lesquelles le récepteur FP contribue aux capacités invasives des cellules tumorales d’origine colorectale. Notre hypothèse est que la protéine ARF6, une des 6 isoformes des ARFs, et la protéine RhoA, agissent pour coordonner l’activation des voies de signalisations associées à la migration et l’invasion cellulaire. Nos résultats ont indiqué que la stimulation des cellules HEK293 exprimant de façon stable le récepteur FP (HA-FP) ainsi que les cellules SW480, une lignée invasive de cancer colorectal, par le PGF2α augmentait les niveaux d’activation d’ARF6 mais également de la protéine RhoA. De plus, d’autres médiateurs et intermédiaires associés à la réorganisation du cytosquelette comme la cofiline et la chaine légère de la myosine (MLC) ont été hautement phosphorylés suite à la stimulation par la prostaglandine. Ces observations sont associées avec une augmentation des fibres de stress dans les cellules. Nous avons tenté de déterminer si l’inhibition de ces protéines G affectait la capacité du PGF2α à activer ces intermédiaires de signalisation ainsi que certains effets biologiques. Ainsi, nos expériences contribueront à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement du cancer colorectal. / Colorectal cancer is the third most common form of cancer in Canada. Despite recent developments, no curative treatment is available for patients diagnosed at an advanced stage of the disease. Several evidences support an important role of prostaglandins in this disease. Indeed, overexpression of EP-like and FP receptors is noticed. These and intracellular signaling molecules that are activated following receptor stimulation, represent new targets for treating cancer. We and others have demonstrated that monomeric G proteins are important molecular switches coordinating intracellular signaling cascades initiated by receptors in normal cells but that disruption thereof is associated with cancer. The main objective of this research project aims to identify the signaling pathways by which the FP receptor contributes to the invasive capacity of tumor cells of colorectal origin. Our hypothesis is that the proteins ARF6, one of the 6 ARF isoforms, and RhoA protein, act to coordinate the activation of signaling pathways associated with cell migration and invasion. Our results show that stimulation of HEK293 cells that stably express the FP receptor (HA-FP) and SW480 cells, a lineage of invasive colorectal cancer that endogenously express FP receptor, by PGF2α, increased the level of activation of ARF6, but also that of RhoA. In addition, other mediators and intermediates associated with cytoskeleton reorganization such as cofilin and the myosin light chain (MLC) were found highly phosphorylated following stimulation by prostaglandin PGF2α. These observations are associated with an increase of stress fibers in cells. Finally, we have examinated whether inhibition of ARF6 and RhoA, affected the ability of PGF2α to activate these effectors and some biological effects. Thus, our results will contribute to identify new potential therapeutic targets for the treatment of colorectal cancer.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le glutamate est le principal neurotransmetteur excitateur du système nerveux central. Il agit notamment sur huit récepteurs métabotropiques (mGluR) qui sont des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) responsables de la modulation de la transmission synaptique. Les mGluR constituent des cibles de choix pour le traitement de maladies neurologiques, psychiatriques et neurodégénératives comme la schizophrénie, la dépression, ou la maladie de Parkinson. Aucun médicament agissant sur les mGluR n'existe à l'heure actuelle, mais plusieurs molécules sont en phase clinique pour différentes pathologies. L'objectif principal de mon travail de thèse a été d'étudier la dynamique structurale des mGluR, pour lesquels le mécanisme moléculaire d'activation reste mal connu. Ces récepteurs forment des homodimères constitutifs, dont chaque sous-unité possède un grand domaine extracellulaire qui lie le glutamate et un domaine transmembranaire responsable de l'activation des protéines G et où se fixent des modulateurs allostériques synthétiques. Une des étapes clé de l'activation serait la réorientation relative des deux domaines extracellulaires induite par le glutamate au sein du dimère. En développant tout d'abord une stratégie de marquage orthogonale des sous-unités de mGlu par fusion avec des enzymes suicide (SNAP-/CLIP-tag) combinée à une technique de transfert d'énergie par résonance de type Förster en temps résolu (TR-FRET), nous avons montré qu'en système hétérologue, les mGluR peuvent s'associer sous forme d'hétérodimères fonctionnels. De plus, nos expériences ont révélé une spécificité d'association au sein de la famille des mGluR : les sous-unités mGlu du group I, mGlu1 et mGlu5, peuvent former des hétérodimères entre elles, mais pas avec celles du groupe II et III, qui elles peuvent toutes s'associer entre elles. Puis nous avons fait évoluer la technologie précédente pour développer le premier biosenseur conformationnel de l'activation des mGluR. Nous avons ainsi identifié sur cellules vivantes les changements conformationnels nécessaires à l'activation du récepteur, et démontré que la variation de signal de FRET entre les deux sous-unités au sein du dimère correspondant au réarrangement relatif des domaines externes est corrélée avec l'état d'activation du récepteur. Nous avons ainsi confirmé le modèle d'activation des mGluR initialement proposé à partir des premières structures cristallines des domaines extracellulaires isolés. D'autre part, ce senseur permet de discriminer facilement les agonistes partiels des agonistes complets, et permet de mieux comprendre les mécanismes allostériques régulant l'activité au sein des mGluR (notamment le mode d'action des modulateurs allostériques positifs et négatifs qui se lient dans le domaine membranaire). Cette stratégie de senseurs conformationnels a également pu être appliquée à l'étude d'autres récepteurs membranaires (RCPG et récepteurs tyrosines kinases), et au développement de tests de criblage à haut débit. Enfin, nous nous sommes attachés à développer de nouveaux types de molécules ciblant les mGluR, en utilisant des anticorps simple domaine provenant de lamas. Ces ligands qui agissent sur de nouveaux sites d'activation à la surface des mGluR, représentent de nouvelles pistes pour développer de meilleures solutions thérapeutiques. / Glutamate is the main excitatory neurotransmitter in the central nervous system. It notably acts on eight metabotropic glutamate receptors (mGluR), which are G protein coupled receptor responsible for the modulation of synaptic transmission. mGluRs are promising pharmacological targets to treat neurological, psychiatric or neurodegenerative diseases such as depression, schizophrenia or Parkinson's disease. Unfortunately, so far, no drug acting at mGluR is accessible to patients, but several molecules are in clinical trials. The main objective of my thesis has been the study of the structural dynamics of mGluR, for which the molecular mechanism allowing activation are still poorly understood. These receptors are known to form constitutive dimers, with each subunit composed of a large extracellular domain which bind glutamate and a transmembrane domain responsible for G protein activation and where synthetic allosteric modulators bind. A key step in the activation process could be the relative reorientation of the two extracellular domains in the dimer upon glutamate binding. We first developed an orthogonal labeling method of each mGlu subunits by fusion with a suicide enzyme (SNAP-/CLIP-tag) that we combined with time-resolved Förster resonance energy transfer measurements to show that in a heterologous system, mGlu subunits can associate as strict and functional heterodimers. Our experiments also revealed a specific association pattern: mGlu subunits from group I, mGlu1 and mGlu5, can associate with each other, but not with those from group II and III, which can also associate with each other. Then we improved the technology to develop the first conformational sensor to monitor mGluR activation. We were able to monitor in real time in live cells the conformational changes occurring in the mGlu receptor upon activation, and we proved that the variation in FRET signal is correlated with the activation state of the receptor. This allowed us to confirm the activation model proposed based on the crystal structures of the isolated extracellular domains, which consist of a relative movement of the dimer extracellulair domains upon activation. Moreover, this sensor makes it possible to easily discriminate between full and partial agonists, and to better understand the allosteric mechanisms occurring in the mGluR (especially the action mode of positive and negative allosteric modulators binding in the transmembrane domain). This conformational sensor strategy was further applied to study the activation of other receptors (GPCR or tyrosine kinase receptors), and to develop screening assays compatible with high-throughput formats. Finally, we developed innovative ligands acting on mGluRs using single-domain antibodies from llamas. These activating ligands seem to bind to a new site on the surface of the receptor, offering new possibilities to develop better treatment acting at mGluRs.

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Les catécholamines induisent la synthèse d’AMPc par une stimulation des récepteurs β-adrénergiques et contrôlent ainsi la fonction cardiaque en activant une pléiade de voies de signalisation intracellulaires. Les protéines Epac sont des facteurs d’échange pour les petites protéines G et sont directement activés par l’AMPc. Devant l’importance de la voie β-adrénergique dans la physiopathologie cardiaque et dans le but de mieux comprendre la régulation des processus cellulaires dépendants de l’AMPc dans le cœur, il apparaît essentiel de caractériser le rôle des facteurs d’échange Epac dans le myocarde. Dans une première partie, cette étude démontre que les effets de Epac sur l’hypertrophie des cardiomyocytes ventriculaires de rats nouveaux nés requièrent les GTPases H-Ras et Rap2B. Epac active la voie PLC/IP3/Ca2+ qui est nécessaire pour l’activation de H-Ras. Au niveau transcriptionnel, Epac induit l’export nucléaire de HDAC4 permettant l’activation d’un programme génique d’hypertrophie. Dans une deuxième partie, cette étude révèle l’implication de Epac1 dans l’hypertrophie des cardiomyocytes in vivo, chez la souris. La délétion de Epac1 protège du remodelage cardiaque induit par l’activation prolongée des récepteurs β-adrénergiques et améliore la fonction cardiaque. La surexpression de Epac1 spécifiquement dans le myocarde entraîne une hypertrophie des cardiomyocytes. Par ailleurs, la voie β-AR/Epac1 induit l’accumulation de protéines ubiquitinylées et provoque l’activation du processus d’autophagie in vitro et in vivo. L’autophagie protège des effets délétères de la voie β-adrénergique/Epac en participant à l’élimination des agrégats protéiques et en contrant les effets hypertrophiques de Epac1. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour le traitement de l’hypertrophie et de l’insuffisance cardiaque. / Catecholamines regulate cardiac function by stimulating β-adrenergic receptors (β-AR), leading to cAMP production and activation of a multiplicity of signaling pathways. Epac proteins are exchange factors for small G proteins which are directly activated by cAMP. Given the importance of the β-adrenergic pathway in cardiac physiopathology, it becomes essential to characterize functions of Epac protein in myocardium. In a first part, this study shows that H-Ras and Rap2B GTPases are involved in Epac-induced neonatal rat cardiac myocytes hypertrophy. Epac induces activation of the PLC/IP3/Ca2+ pathway which is necessary for H-Ras activation. At the transcriptional level, Epac causes HDAC4 nuclear export leading to activation of a hypertrophic gene program. In a second part, this study reveals implication of Epac1 in cardiac hypertrophy in vivo. Deletion of Epac1 in mice protects from cardiac remodeling induced by chronic isoproterenol infusion and enhances cardiac function. Cardiac specific overexpression of Epac1 in mice induces cardiac myocytes hypertrophy. Interestingly, β-AR/Epac1 pathway triggers ubiquitinated proteins accumulation and activation of autophagy both in vitro and in vivo. By eliminating aggregates and by counteracting hypertrophic effects of Epac, autophagy protects from deleterious effects of the β-AR/Epac pathway. These results open news insights into the treatment of cardiac hypertrophy and heart failure.

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Les tumeurs du cortex surrénalien sont variées et fréquentes dans la population. Bien que des mutations aient été identifiées dans certains syndromes familiaux, les causes génétiques menant à la formation de tumeur du cortex surrénalien ne sont encore que peu connues. Un sous-type de ces tumeurs incluent les hyperplasies macronodulaires et sont pressenties comme la voie d’entrée de la tumorigenèse du cortex surrénalien. L’événement génétique le plus fréquemment observé dans ces tumeurs est l’expression aberrante d’un ou plusieurs récepteurs couplés aux protéines G qui contrôle la production de stéroïdes ainsi que la prolifération cellulaire. L’événement génétique menant à l’expression aberrante de ces récepteurs est encore inconnu. En utilisant le récepteur au peptide insulinotropique dépendant du glucose (GIP) comme modèle, cette étude se propose d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans l’expression aberrante du récepteur au GIP (GIPR) dans les tumeurs du cortex surrénalien. Une partie clinique de cette étude se penchera sur l’identification de nouveaux cas de tumeurs surrénaliennes exprimant le GIPR de façon aberrante. Les patients étudiés seront soumis à un protocole d’investigation in vivo complet et les tumeurs prélevées seront étudiées extensivement in vitro par RT-PCR en temps réel, culture primaire des tumeurs, immunohistochimie et biopuces. Le lien entre le GIP et la physiologie normal sera également étudiée de cette façon. Une autre partie de l’étude utilisera les nouvelles techniques d’investigation à grande échelle en identifiant le transcriptome de différents cas de tumeurs exprimant le GIPR de façon aberrante. L’importance fonctionnelle des gènes identifiée par ces techniques sera confirmée dans des modèles cellulaires. Cette étude présente pour la première des cas de tumeurs productrices d’aldostérone présentant des réponses aberrantes, auparavant confinées aux tumeurs productrice de cortisol ou d’androgènes surrénaliens. Le cas probant présenté avait une production d’aldostérone sensible au GIP, le GIPR était surexprimé au niveau de l’ARNm et un fort marquage a été identifié dans la tumeur spécifiquement. Dans les surrénales normales, cette étude démontre que le GIP est impliqué dans le contrôle de la production d’aldostérone. Ces résultats ont été confirmés in vitro. Finalement, le profilage à grande échelle des niveaux d’expression de tous les gènes du génome a permis d’isoler une liste de gènes spécifiquement liés à la présence du GIPR dans des hyperplasies du cortex surrénalien. Cette liste inclus la périlipine, une protéine de stockage des lipides dans les adipocytes et la glande surrénale, dont l’expression est fortement réprimée dans les cas GIP-dépendant. Des études dans un modèle cellulaire démontrent que la répression de ce gène par siRNA est suffisante pour induire l’expression du récepteur au GIP et que cette protéine est impliquée dans la stimulation de la stéroïdogénèse par le GIP. En alliant des méthodes d’investigation in vivo de pointe à des techniques in vitro avancée, cette étude offre de nouveaux regards sur les liens entre le GIP et la physiologie de la glande surrénale, que ce soit dans des conditions normales ou pathologiques. / Tumors of the adrenal cortex are varied and frequently found in the population. Aside from rare family cases in which mutations have been identified, the genetic events leading to the formation of adrenocortical tumors remain obscure. A subtype of these tumors includes macronodular hyperplasias, now percieved as the entry point of adrenocortical tumorigenesis. The most commonly observed molecular event in these cases is the presence of aberrantly expressed G-protein coupled receptor that drive steroid production and cellular proliferation. The genetic events leading to these aberrant levels of expression are unknown. This study will use the Glucose-dependent Insulinotropic Polypeptide (GIP) receptor as a model to identify the molecular mecanisms leading to the aberrant expression of the GIP receptor (GIPR) in adrenocortical tumors. The first part of the study will be a clinical investigation of new cases of adrenocortical tumors to screen for aberrant responses to GIP in various types of these tumors. The patients will be evaluated by a thorough clinical investigation protocol and the resected tumors will be extensively analysed in vitro, using real-time RT-PCR, immunohistochemistry, microarray and primary cultures of the tumors. The link between GIP and the normal physiology of the adrenal cortex will also be assessed in normal subjects. The second part of the study will use novel large-scale investigation techniques to determine the transcriptome of different cases of adrenocortical tumors expressing aberrant levels of the GIPR. The functional importance of identified genes will be assessed in cellular models. This study presents the first cases of aldosterone-producing tumors with aberrant responses to hormones, previously confined to cortisol- or androgen producing tumors. The case presented showed an aldosterone production sensitive, among others, to GIP. The GIPR’s mRNA was strongly over expressed and a specific staining was observed in immunohistochemistry. The responses were confirmed in primary cultures of the tumor. In normal adrenals, a role for the control of aldosterone by GIP was also demonstrated. Finally, large-scale profiling of the transcriptome led to the identification of a list of genes with expression levels strictly related to the presence of the GIPR in adrenocortical hyperplasias. One of these genes, perilipin, was strongly repressed specifically in GIP-dependent cases. siRNA techniques were used in a cellular model and confirmed that the repression of perilipin is sufficient to induce the expression of GIPR and that this protein is implicated in the GIP induced steroidogenesis. Allying state-of-the-art in vivo investigation methods to advanced in vitro techniques, the present study identifies novel insights on the link between GIP and the normal adrenal physiology, in normal and pathological conditions.

Le sang provenant d’un cordon ombilical (SCO) représente une bonne source de cellules souches hématopoïétiques (CSH) pour des transplantations. Cependant, le nombre de cellules souches contenues dans ce sang est souvent insuffisant pour greffer un adulte. Le mécanisme intervenant dans la domiciliation de ces cellules au sein de la moelle osseuse (MO) est encore mal compris. On sait que l’interaction entre la chimiokine SDF-1 et le récepteur CXCR4, présent sur les cellules CD34+ de SCO, mène à la migration de ces cellules en direction de la MO. Nous pensons que l’augmentation de la proportion de cellules qui réussit à se greffer pourra pallier au problème du nombre. Les produits de dégradation, C3a et le C3desarg,, issus du système du complément, sont connus pour favoriser la réponse de cellules exprimant CXCR4 vers SDF-1. Nous avons analysé l’effet du C3adesarg, molécule non anaphylatoxique, sur la migration cellulaire vers SDF-1, de même que sur la prise de greffe des cellules CD34+ issues de SCO suite à une transplantation sur des souris NOD/SCIDyC-. Nos expériences ont démontré que le C3a ainsi que le C3adesarg augmentaient tous les deux la réponse des cellules CD34+ vers SDF-1. Toutefois, nous n’avons pas pu démontrer que ces molécules liaient directement le récepteur CXCR4. Par contre, le composé C3adesarg favorise la prise de greffe des cellules CD34+ de SCO. Il serait donc un bon candidat pour poursuivre une optimisation de ses propriétés. Nous avons également constaté que suite à une transplantation chez la souris, les cellules CD34+ de SCO subissent une hausse d’expression transitoire de leur CXCR4 environ quatre jours après la greffe. Cette hausse d’expression coïncide avec la multiplication des cellules CD34+ dans la MO. Nous avons également confirmé qu’une cellule CD34+ avec une forte expression de CXCR4 était dans un état prolifératif. Nos données suggèrent que l’interaction directe avec les cellules stromales soit responsable de cette hausse d’expression de CXCR4. / Since the first successful cord blood (CB) transplant was performed there has been a gradual increase in the use of CB for haematopoietic stem cell (HSC) transplantation, but the number of stem cells per CB is in general too low to ensure successful transplantation in adult patients. We would like to bypass the limitation of insufficient number of these cells in CB by enhancing the engraftment efficiency. The chemokine stromal-derived factor (SDF)-1, that binds to its receptor, CXCR4, plays an important and unique role in regulating the trafficking of HSC and their homing/retention in bone marrow (BM), but molecular regulatory mechanism of niches for HSC maintenance remains unclear. The complement C3 cleavage fragments, C3a and C3adesarg, modulate the responsiveness of CXCR4-expressing cell lines to SDF-1. We assessed the effect of the non anaphylatoxic complement fragment, C3adesarg, on SDF-1 responsiveness and engraftment of CB-HSC transplantation in a NOD/SCIDyC- mouse model. Complement breakdown products C3a and C3adesarg both increase the responsiveness of CD34+ cells to SDF-1. We find no evidence for direct interaction of complement fragments with CXCR4. Our data suggest that C3adesarg might contribute to optimize CB-HSC homing to bone marrow, and therefore efficacy of cord blood transplantation. We quantified the number of CXCR4 on the surface of CB-CD34+ after transplantation in mice. Our results showed that there is a transient overexpression of CXCR4 on the surface of HSC CD34+ found in the BM of NOD/SCIDyC- mice after 4-5 days post-injection. This transient overexpression correlated with multiplication of CD34+ cells in the BM. We confirm that the cells with an overexpression of CXCR4 are in a proliferation state. Our data suggested that this transient overexpression is caused by an interaction with the stomal cells.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont une famille très diversifiée de protéines membranaires capables de répondre à un grand nombre de signaux chimiques tels que des photons, des molécules odorantes, ou des hormones. En plus de cette diversité, l’étude des RCPG montre que des associations protéiques spécifiques multiplient les possibilités de signalisation de chacun de ces récepteurs. En permettant d’atténuer, de potentialiser, ou de générer une nouvelle voie de signalisation, l’association des RCPG en oligomères s’avère une importante source de diversité. L’utilisation du transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET) qui permet de détecter les interactions protéiques a révélé de nombreuses associations de RCPG. Durant cette thèse, des outils ont été développés pour combiner efficacement le BRET à des essais de complémentation de protéines (PCA) dans le but de savoir si l’oligomérisation des RCPG pouvait impliquer plus de deux récepteurs. Les résultats présentés montrent que les récepteurs de chimiokines CXCR4 et CCR2 forment des homo et hétéro tétramères, et que l’activation d’un dimère CCR2 peut moduler la conformation d’un dimère CXCR4 par un changement conformationnel trans-récepteur. La coopérativité négative de liaison de ligand qui a été démontrée auparavant entre CXCR4 et CCR2 dans des lymphocytes T CD4+ exprimant les récepteurs de manière endogène confirme la validité biologique de cette interaction. Les données présentées suggèrent également que ces complexes peuvent engager les effecteurs Gαi et β-arrestine2, indiquant qu’ils représentent la forme fonctionnelle de ces récepteurs. Enfin, nous avons pu confirmer que chaque récepteur de l’hétérodimère CXCR4-CCR2 est impliqué dans l’engagement des effecteurs lors de l’activation de CCR2. Un autre niveau de complexité dans la signalisation des RCPG est atteint par leur capacité à coupler de multiples protéines G. La liaison du facteur dérivé des cellules stromales (SDF-1) au récepteur CXCR4 permet la migration des lymphocytes T par une voie de signalisation dépendante de la protéine Gαi. Nous avons pu démontrer en revanche que la migration des cellules de cancer du sein était initiée par un couplage de CXCR4 à la voie Gα13-Rho pour former des métastases dans des organes distants. Enfin, un dernier niveau de régulation des RCPG a été abordé par l’étude de la phosphorylation de CXCR4 suite à son activation, qui permet la désensibilisation du récepteur et l’engagement de voies de signalisation dépendantes de la β-arrestine. Il apparaît que la désensibilisation de la voie du calcium serait médiée par la phosphorylation de CXCR4 par les kinases des RCPG (GRK) GRK2 et GRK6 et le recrutement de β- arrestine2, alors GRK3, GRK6 et la β-arrestine1 potentialiseraient l’activation des kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2). Nous suggérons également que c’est la phosphorylation de l’extrémité C-terminale de CXCR4 qui permettrait son association avec la β-arrestine. / G protein-coupled receptors (GPCRs) are a diverse family of membrane proteins capable of responding to a large number of extracellular stimuli including photons, odorant molecules and hormones. In addition to this diversity, it has been shown that GPCRs form specific protein:protein interactions, multiplying the signalling possibilities of each of these receptors. With the ability to diminish, to potentiate or even generate new signalling pathways, the oligomeric association of GPCRs plays an important role in generating this diversity. The use of bioluminescence resonance energy transfer (BRET), which allows the detection of interactions among proteins, has revealed numerous associations between GPCRs. During this thesis, tools have been developed that effectively combine BRET with protein complementation assays (PCA) with the goal of determining if interactions between GPCRs could involve more than two receptors. The results show that the chemokine receptors CXCR4 and CCR2 form both homo and hetero tetramers, and that the activation of a dimer of CCR2 can modulate the conformation of a CXCR4 dimer through a transreceptor conformational change. Negative cooperativity of ligand binding has previously been demonstrated between CXCR4 and CCR2 in CD4+ T lymphocytes endogenously expressing the receptors, confirming the biological validity of this interaction. The data presented also suggests that these complexes can engage the effector proteins Gαi and β- arrestin 2, indicating that they represent a functional form of the receptors. Furthermore, we have confirmed that each receptor of the CXCR4-CCR2 heterodimer is implicated in the engagement of effectors during the activation of CCR2. An additional level of complexity in GPCR-promoted signaling exists in their capacity to couple of multiple G proteins. Binding of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) to CXCR4 is known to promote T lymphocyte migration through a Gαi-dependent signalling pathway. In addition to this mechanism, we have demonstrated that breast cancer cell migration can initiated by a coupling of CXCR4 to the Gα13-Rho pathway, leading to the formation of metastases in distant organs. Finally, a novel level of GPCR regulation was revealed through the study of CXCR4 phosphorylation following its activation, which leads to the desensitization of the receptor and the engagement of β-arrestin-dependent signalling pathways. It appears that the desensitization of calcium signalling is mediated through the phosphorylation of CXCR4 by the GPCR kinases (GRKs) GRK2 and GRK6 and the recruitment of β-arrestin 2, whereas GRK3, GRK6 and β-arrestin 1 potentiate the activation of extracellular regulated kinase (ERK1/2). We also propose that the phosphorylation of the far C-terminal tail of CXCR4 is required for the interaction between the receptor and β-arrestin. / Thèse réalisée en cotutelle avec l'université Montpellier2 dans le laboratoire de pharmacologie moléculaire de Jean-Philippe Pin à l'institut de génomique fonctionnelle (IGF), Montpellier, France.

Récemment plusieurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) ont été caractérisés au niveau des membranes intracellulaires, dont la membrane nucléaire. Notre objectif était de déterminer si les sous-types de récepteurs β-adrénergiques (βAR) et leurs machineries de signalisation étaient fonctionnels et localisés à la membrane nucléaire des cardiomyocytes. Nous avons démontré la présence des β1AR et β3AR, mais pas du β2AR à la membrane nucléaire de myocytes ventriculaires adultes par immunobuvardage, par microscopie confocale, et par des essais fonctionnels. De plus, certains partenaires de signalisation comme les protéines GαS, Gαi, l’adénylate cyclase II, et V/VI y étaient également localisés. Les sous-types de βAR nucléaires étaient fonctionnels puisqu'ils pouvaient lier leurs ligands et activer leurs effecteurs. En utilisant des noyaux isolés, nous avons observé que l'agoniste non-sélectif isoprotérénol (ISO), et que le BRL37344, un ligand sélectif du β3AR, stimulaient l'initiation de la synthèse de l’ARN, contrairement à l'agoniste sélectif du β1AR, le xamotérol. Cette synthèse était abolie par la toxine pertussique (PTX). Cependant, la stimulation des récepteurs nucléaires de type B de l’endothéline (ETB) causaient une réduction de l'initiation de la synthèse d’ARN. Les voies de signalisations impliquées dans la régulation de la synthèse d’ARN par les RCPGs ont ensuite été étudiées en utilisant des noyaux isolés stimulés par des agonistes en présence ou absence de différents inhibiteurs des voies MAP Kinases (proteines kinases activées par mitogènes) et de la voie PI3K/PKB. Les protéines impliquées dans les voies de signalisation de p38, JNK, ERK MAP Kinase et PKB étaient présents dans les noyaux isolés. L'inhibition de PKB par la triciribine, inhibait la synthèse d’ARN. Nous avons ensuite pu mettre en évidence par qPCR que la stimulation par l’ISO entrainait une augmentation du niveau d'ARNr 18S ainsi qu’une diminution de l'expression d’ARNm de NFκB. En contraste, l’ET-1 n’avait aucun effet sur le niveau d’expression de l’ARNr 18S. Nous avons ensuite montré que la stimulation par l’ISO réduisait l’expression de plusieurs gènes impliqués dans l'activation de NFκB, tandis que l’inhibition de ERK1/2 et PKB renversait cet effet. Un microarray global nous a ensuite permis de démontrer que les βARs et les ETRs nucléaires régulaient un grand nombre de gènes distincts. Finalement, les βARs et ETRs nucléaires augmentaient aussi une production de NO de noyaux isolés, ce qui pouvait être inhibée par le LNAME. Ces résultats ont été confirmés dans des cardiomyocytes intacts en utilisant des analogues cagés et perméables d’ISO et de l'ET-1: l'augmentation de NO nucléaire détectée par DAF2-DA, causée par l'ET-1 et l'ISO, pouvait être prévenue par le LNAME. Finalement, l’augmentation de l’initiation de la transcription induite par l'ISO était aussi bloquée par le L-NAME ou par un inbitheur de PKG, le KT5823, suggérant que la voie NO-GC-PKG est impliquée dans la régulation de la transcription par les βAR. En conclusion, les βARs et les ETRs nucléaires utilisent des voies de signalisation différentes et exercent ainsi des effets distincts sur l’expression des gènes cardiaques. Ils représentent donc une avenue intéressante pour le développement de drogues pharmacologiques. / Recently several G protein-coupled receptors (GPCRs) have been shown to localize to intracellular membranes, in particular the nuclear membrane. As such, we sought to determine if the β-adrenergic receptor (βAR) subtypes and their associated signalling machinery are functionally localized to nuclear membranes. We demonstrated the presence of β1AR and the β3AR, but not the β2AR, in adult ventricular myocyte nuclei by western blotting, confocal microscopy and functional assays. Downstream signalling partners such as GαS, Gαi and adenylyl cyclase II and V/VI were also present. Nuclear-localized βARs were functional with respect to ligand binding and effector activation. In isolated nuclei, the non-selective βAR agonist isoproterenol (ISO) and the β3AR-selective ligand BRL37344, but not the β1AR-selective xamoterol, stimulated transcription initiation in a pertussis toxin (PTX)-sensitive manner. In contrast, stimulation of type B endothelin receptors (ETB), another GPCR family shown to be present on the nuclear membrane, decreased de novo RNA synthesis. To investigate the signalling pathway(s) involved in GPCR-mediated regulation of RNA synthesis, nuclei were isolated from intact adult rat hearts and treated with receptor agonists in the presence or absence of inhibitors of the PI3K/PKB and mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways. Components of p38, JNK, and ERK1/2 MAPK cascades as well as PKB were detected in nuclear preparations. Inhibition of PKB with triciribine converted the activation of the βAR from stimulatory to inhibitory with regards to transcription initiation. Analysis by qPCR indicated isoproterenol treatment increased 18S rRNA but decreased NFκB mRNA. In contrast, ET-1 had no effect on 18S rRNA expression. Further investigation using pathway-specific PCR arrays revealed that isoproterenol treatment also reduced the expression of several other genes involved in the activation of NFκB and that ERK1/2 and PKB inhibitors attenuated this effect. Subsequent genome-wide microarray analysis has revealed that nuclear βAR and ETB regulated a host of genes in an overlapping but distinct manner. Moreover, both ET-1 and ISO produced an L-NAME-sensitive increase in NO production in isolated cardiac nuclei. These observations were confirmed in intact cardiomyocytes using novel caged analogues of ISO and ET-1 and the cell-permable NO-sensitive fluorescent dye, DAF-2 DA. Briefly, both ET-1 and isoproterenol increased NO production, and this increase was prevented upon preincubation with L-NAME. Moreover, the ability of isoproterenol to increase transcription initiation in isolated nuclei was blocked by L-NAME or the PKG inhibitor KT5823, indicating the NO-GC-PKG pathway is involved in the regulation of gene expression by nuclear βARs. Hence, we have shown that βARs and ETRs in the nuclear membrane activate distinct signalling pathways, resulting in different effects on gene transcription and thus represent potentially important targets for drug development.