Le facteur de l’ADP-ribosylation 6 (ARF6) et Rac1 sont des petites protéines liant le GTP qui régulent plusieurs voies de signalisation comprenant le trafic de vésicules, la modification des lipides membranaires et la réorganisation du cytosquelette d’actine. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels ARF6 et Rac1 agissent de concert afin de contrôler ces différents processus cellulaires restent méconnus. Dans cette étude, nous montrons que, dans les cellules HEK293, ARF6 et Rac1 sont retrouvées en complexe suite à la stimulation du récepteur à l’angiotensine. Des expériences réalisées in vitro nous indiquent que ces deux GTPases interagissent ensemble directement, et que ARF6 s’associe préférentiellement avec la forme inactive de Rac1. L’inhibition de l’expression de ARF6 par interférence à l’ARN entraîne une activation marquée en cellule de Rac1 via le facteur PIX, indépendamment de la stimulation d’un récepteur, ce qui provoque la migration non contrôlée des cellules. Les arrestines, protéines de régulation de la désensibilisation des récepteurs couplés aux protéines G, servent de protéines d’échafaudage pour Rac1 et ARF6, en interagissant directement avec les GTPases et en augmentant leur association stimulée par l’angiotensine. De plus, les arrestines permettent l’activation, en s’en dissociant, de la MAP Kinase p38 qui régule l’activité de ARF6 et son interaction précoce avec les arrestines. Mis ensemble, ces résultats montrent que les arrestines contrôlent l’activité de ARF6, en influençant p38. ARF6 joue un rôle inhibiteur sur l’activation basale de Rac1 pour permettre ensuite son recrutement et son activation dépendante de l’angiotensine. Cette étude nous a permis de préciser le mode de régulation mis en jeu dans l’initiation de la migration cellulaire, suite à l’activation d’un récepteur couplé aux protéines G. Par le fait même, nous avons identifié certains des acteurs impliqués dans ce processus, offrant ainsi de nouvelles cibles pour le traitement des déséquilibres pathophysiologiques de la migration cellulaire. / The ADP-ribosylation factor 6 (ARF6) and Rac1 are small GTP-binding proteins that regulate several signaling events ranging from vesicle trafficking, to modification of membrane lipids and reorganization of the actin cytoskeleton. However, the molecular mechanisms by which ARF6 and Rac1 act in concert to control these different cellular processes remain unclear. Here, we show that in HEK 293 cells, ARF6 and Rac1 can be found in complex upon stimulation of the angiotensin receptor (ATR). In vitro experiments indicate that these two small G proteins can directly interact together, and that ARF6 preferentially interacts with the GDP-bound form of Rac1. Depletion of ARF6 by RNA interference leads to a marked PIX-dependent Rac1 activation in cells, independently of receptor stimulation, leading to uncontrolled cell migration. Arrestins, which are known for their role in G protein-coupled receptor desensitization, act as scaffold proteins toward Rac1 and ARF6, by directly interacting with the GTPases and by increasing their agonist-promoted association. Besides, arrestins allow p38 MAP Kinase activation, by releasing it, which regulates ARF6 activity and early association occurring between arrestins and ARF6. Taken together, this study shows that arrestins control ARF6 activity, by managing p38. ARF6 is an inhibitor of basal Rac1 activation to further allow the protein to be recruited and activated following angiotensin treatment. This study allowed us to precise how cell migration induction is regulated following G protein-coupled receptor activation. As a result, we identified some of the key players implicated in this process, providing new targets in the treatment of patho-physiological inbalance in cell migration.

L'étirement est un stimulus hypertrophique qui active de nombreuses voies de signalisation similaires à celles mises en évidence lors de l'étude de l'hypertrophie cellulaire. L'objectif principal de mon travail de thèse était de caractériser les évènements moléculaires impliqués dans l'activation des MAPKinases (MAPK), ERK et JNK lors de l'étirement. Nous avons étudié ces protéines par 2 approches différentes. D'une part, nous nous sommes intéressés aux rôles de protéines potentiellement nécessaires à l'activation des MAPK. D'autre part, nous avons cherché à mettre en évidence des interconnexions moléculaires entre les différentes voies de signalisation activées par l'étirement cellulaire, en montrant notamment la formation de complexes protéiques nécessaires à l'activation des différents partenaires. Nous montrons ainsi que deux protéines à activité tyrosine kinase, l'Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) et la Proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2), sont respectivement nécessaires à l'activation de ERK et de JNK lors de l'étirement. Ces cascades de transduction peuvent être dépendantes de la petite protéine G Ras. Bien que les voies des MAPK et de PI3K/Akt soient considérées comme indépendantes, nous montrons également que Akt participe à l'activation de ERK par l'étirement. Enfin, nous avons montré la formation d'un complexe Protein Kinase C (PKC)/Calcineurine nécessaire à l'activation et à la translocation de la PKC lors de l'étirement. Cette étude de différentes voies de signalisation et des interactions protéiques apporte une meilleure connaissance des mécanismes activés par l'étirement cellulaire et permet donc de mieux comprendre la signalisation impliquée dans l'hypertrophie ventriculaire

No description available.

No description available.

Mécanismes d’activation et conséquences fonctionnelles de la dimérisation des récepteurs aux chimiokines<p><p>Les chimiokines sont de petites protéines qui régulent la migration des cellules immunitaires. Elles exercent leur action en se liant à des récepteurs appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) dont la fonction est intimement liée à la régulation des cellules immunitaires. Notre laboratoire étudie depuis plusieurs années les relations reliant la structure et la fonction des récepteurs aux chimiokines. Ces dernières années, un nouveau concept est venu révolutionner le mode de fonctionnement des RCPGs. En effet, des travaux ont montré que la plupart des RCPGs sont capables de former des dimères. Le but de cette thèse de doctorat est d’étudier de manière systématique la dimérisation des récepteurs aux chimiokines et d’analyser les conséquences fonctionnelles de la dimérisation. <p><p>Dimérisation des récepteurs humains aux chimiokines et conséquences fonctionnelles<p><p>En utilisant une technique biophysique basée sur un transfert d’énergie de luminescence (BRET) nous avons montré au cours de ce travail de thèse que les récepteurs CCR1, CCR2, CCR5, CCR7 et CXCR4 sont capables de former des homodimères et des hétérodimères. De plus, une dimérisation entre ChemR23, dont le ligand naturel, la chémérine, est structurellement différent des chimiokines, et les récepteurs CCR7 et CXCR4, a également été identifiée. <p><p>D’un point de vue fonctionnel, des expériences réalisées au laboratoire dans le cadre d’un autre travail de thèse ont identifié une forme de compétition croisée entre CCR2, CCR5 et CXCR4 où la liaison de ligands (agonistes ou antagonistes) spécifiques de l'un des deux récepteurs inhibe la liaison des ligands spécifiques de l’autre. Ces effets ont été démontrés sur des cellules recombinantes mais aussi sur des cellules immunes et dans un modèle in vivo. (El-Asmar, 2005; Springael, 2006; Sohy, 2007; Sohy, 2009). Au cours de ce travail, nous nous sommes dans un premier temps focalisés sur les <p>hétéromères de ChemR23 avec CXCR4 et CCR7 et nous avons ensuite étudié plus en profondeur les hétéromères de CCR7. Concernant la dimérisation de ChemR23 avec les récepteurs aux chimiokines CCR7 et CXCR4, nous avons pu mettre en évidence une coopérativité négative de liaison entre les agonistes des récepteurs comme cela avait pu être démontré pour CCR2/CCR5/CXCR4. Par contre, nous n’avons observé aucun effet de compétition hétérologue ou d’inhibition fonctionnelle croisée de l’AMD3100 sur ChemR23 quand il est coexprimé avec CXCR4. De manière additionnelle, nous avons pu observer cette compétition croisée sur des cellules dendritiques murines immatures, démontrant l’existence des effets de l’hétérodimérisation lorsque les récepteurs sont exprimés à un niveau physiologique. Lors de l’étude approfondie des hétéromères de CCR7, nous avons montré que les conséquences fonctionnelles de l’hétérodimérisation de CCR7 sont différentes suivant le récepteur avec lequel il interagit. Pour l’hétérodimère CCR7/CCR2, nous avons identifié une forme de compétition croisée, où la liaison de ligands spécifiques de l'un des deux récepteurs inhibe la liaison des ligands spécifiques de l’autre, rejoignant les effets mis en évidence pour les hétéromères CCR2/CCR5/CXCR4. Ensuite, nous avons montré pour l’hétérodimère CCR7/CCR5 que les ligands de CCR7 sont capables d’inhiber la liaison des ligands spécifiques sur CCR5 mais que l’inverse n’est pas vrai. Enfin, pour l’hétérodimère CCR7/CXCR4, nous n’avons pas pu mettre en évidence d’inhibition croisée, que ce soit dans un sens ou dans l’autre. D’autre part, un effet inhibiteur de CCR7 a également été identifié pour les hétéromères CCR7/CCR5 et CCR7/CXCR4. Nous avons pu montrer que l’expression de CCR7 exerce un effet négatif sur la réponse fonctionnelle de certains récepteurs hétérologues comme CCR5 et CXCR4 mais pas CCR2 ou ChemR23.<p><p>L’ensemble de ces données permet de mieux comprendre les interactions entre récepteurs et pourrait mener à l’identification de nouvelles cibles pour les programmes de recherche de molécules thérapeutiques, qui, jusqu’à présent, ciblaient presque exclusivement un seul et unique récepteur.<p><p>Etude du mécanisme d’activation du récepteur CCR5 et étude de la relation entre activité constitutive et dimérisation.<p><p>De nombreux travaux ont été menés ces dernières années afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires à la base de l’activation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Il apparaît que les RCPGs peuvent se trouver dans plusieurs états conformationnels, dont certains sont favorisés par la présence d’agonistes ou d’antagonistes, ou encore d’anticorps reconnaissant des épitopes conformationnels. Certaines mutations peuvent également induire la stabilisation de certaines conformations, actives ou inactives. Pour les RCPGs appartenant à la famille de la rhodopsine, il en a résulté un modèle selon lequel les récepteurs sont maintenus dans une conformation inactive par un ensemble d’interactions ioniques impliquant l’arginine (R3.50) d’un motif DRY conservé, présent à l’extrémité cytosolique du troisième segment transmembranaire. Les interactions responsables de ce qu’on appelle le « DRY-lock » feraient intervenir notamment l’aspartate (D3.49) adjacent de l’arginine et un aspartate ou glutamate (D/E6.30) localisé au sein de l’hélice 6. Selon ce modèle, la liaison d’un agoniste, ainsi que certaines mutations, favoriseraient la rupture de ces interactions ioniques, et une conformation permettant aux récepteurs de se coupler plus efficacement aux protéines G. Des résultats du laboratoire indiquent cependant que ce modèle ne serait pas transposable complètement au récepteur CCR5. <p><p>CCR5 possède intrinsèquement une activité constitutive en absence d'agoniste. Cette activité peut être mise en évidence par l'action d'un des antagonistes de CCR5, le TAK-779, qui s'est révélé posséder une activité de type agoniste inverse. D'autre part, CCR5 possède au sein de l'hélice 6 une arginine en position 6.30 et non pas un glutamate ou un aspartate. Une arginine à cette position ne peut donc contribuer au maintien d’une conformation inactive par interaction avec R3.50 .Dans le but de tester le modèle de « DRY-lock » sur CCR5 et de mieux comprendre les interactions moléculaires impliquées dans l’activation du récepteur, plusieurs récepteurs mutants ont été construits au laboratoire. Tout d’abord, l’arginine 3.50 du motif DRY a été mutée en Asn (R3.50N) afin de rompre les interactions ioniques de ce résidu. L’aspartate 3.49 a été muté en Asn (D3.49N) ou en Val (D3.49V), afin de neutraliser une des interactions du « DRY-lock » (Lagane, 2005). L’arginine 6.30 a été mutée d’une part en Asp (R6.30D) ou en Glu (R6.30E), afin de rétablir une possibilité d’interaction avec R3.50, d’autre part en Ala (R6.30A) et en Gln (R6.30Q) afin de mieux cerner le rôle de la charge de l’arginine. Afin de tester l’hypothèse d’interaction entre le résidu 6.30 et le résidu 2.40, l’aspartate 2 .40 a été mutée en Ala (D2.40A) ou en Arg (D2.40R) et des récepteurs présentant les deux mutations ont également construits (D2.40A/R6.30A et D2.40R/R6.30D). L’ensemble des résultats obtenus par l’analyse de ces mutants a permis de montrer que la nature des interactions entre l’extrémité cytosolique des hélices 3 et 6 influence l’activité du récepteur CCR5 (Springael, 2007). Une interaction forte conduit à une forme de récepteur inactif alors qu’une interaction faible s’accompagne d’une augmentation d’activité constitutive. Cette propriété de CCR5 serait donc partagée avec d’autres récepteurs appartenant à la famille de la rhodopsine. Cependant les interactions inter-hélice stabilisant ces conformations seraient différentes pour CCR5. D’autre part, l’étude de la position 2.40 laisse supposer l'importance du résidu aspartate 2.40 dans le maintien d'une conformation permettant l'activité constitutive du récepteur. Nous avons également testé s’il existait une corrélation entre activité constitutive et capacité du récepteur CCR5 à former des dimères, mais les résultats ne nous ont pas permis de mettre en évidence une quelconque relation entre activité et dimérisation.<p><p> <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La dimérisation des récepteurs couplés aux protéines G est un nouveau concept apparu dans la littérature au cours des quelques années qui ont précédé le début de notre travail. Bien qu’il soit clairement établi que les récepteurs sont capables de former des homo et des hétérodimères, les conséquences fonctionnelles de telles interactions demeurent souvent peu claires. Dans une étude précédente, le laboratoire d’accueil a montré que les récepteurs aux chimiokines CCR2 et CCR5 forment des homo et des hétérodimères de manière constitutive et identifié une coopérativité négative de liaison de nature allostérique entre les deux sites de liaison de CCR2 et CCR5 dans des cellules co-exprimant les deux récepteurs. Dans ce travail, nous avons étendu cette étude au récepteur CXCR4, structurellement plus éloigné que CCR2 et CCR5 entre eux. Nous montrons par une méthode biophysique se basant sur le transfert d’énergie de bioluminescence (le BRET) que CCR2, CCR5 et CXCR4 forment des homodimères et des hétérodimères de manière constitutive. De plus nous démontrons une coopérativité négative de liaison de nature allostérique des deux sites de liaisons pour les hétérodimères CCR2/CXCR4 et CCR5/CXCR4. lorsque CXCR4 est co-exprimé avec CCR2 ou CCR5, la chimiokine spécifique de CXCR4 (SDF-1α) inhibe la liaison du traceur spécifique de CCR2 (MCP-1) ou du traceur spécifique de CCR5 (MIP-1β), et vice-versa. La nature allostérique de ces interactions est démontrée par des expériences mesurant la dissociation de traceurs en présence ou non de compétiteurs. La coopérativité négative de liaison de nature allostérique des deux sites de liaisons est montrée également dans des cellules primaires, excluant tout effet indésirable dû à la surexpression de récepteurs. Nous montrons également que l’antagoniste spécifique de CXCR4 (AMD3100) inhibe la liaison du traceur spécifique de CCR2 (MCP-1) ou du traceur spécifique de CCR5 (MIP-1β), et vice-versa (TAK-779 vs SDF-1α), uniquement quand CXCR4 est co-exprimé respectivement avec CCR2 ou CCR5. Il s’agit là de la première preuve montrant que les interactions allostériques au sein d’hétérodimères de récepteurs aux chimiokines impliquent aussi des antagonistes, et qu’un antagoniste de récepteur aux chimiokines influence la réponse fonctionnelle d’un autre récepteur aux chimiokines auquel il ne se lie pas. De tels effets fonctionnels ont été montré dans des expériences de mobilisation de Ca++, de chimiotactisme sur lymphoblastes et dans des expériences d’air pouch in vivo. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) représentent une famille génique parmi les plus nombreuses du génome humain avec plus de 1000 représentants identifiés. Ils ont été classés en sous-familles en fonction de leurs homologies de séquence, la structure de leurs ligands et leur rôle physiologique. Ils régulent un très grand nombre de fonctions physiologiques comme la tension artérielle, le métabolisme, la plupart des actions hormonales et de très nombreuses fonctions cérébrales, et constituent de ce fait des cibles privilégiées pour les agents thérapeutiques. <p>\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluRs) sont des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) modulant la transmission synaptique au sein du système nerveux central. D'un point de vue structural, ils ont la particularité de posséder un large domaine extracellulaire, le Venus Flytrap (VFT), où se lie leur ligand endogène, le glutamate. Leur domaine transmembranaire à 7 hélices, commun à tous les RCPGs, est connu pour être la cible d'une nouvelle classe de molécules à visée thérapeutique, les modulateurs allostériques. Au contraire, le VFT est le siège du développement de ligands compétitifs du glutamate et peu de choses sont connues quant à l'existence de modulateurs allostériques du VFT. Des études récentes ont mis en évidence une sensibilité des mGluRs aux ions extracellulaires et en particulier au chlore (Cl-), sans que son site de liaison ne soit identifié. Dans ce contexte, ce travail de thèse explore la possibilité d'une modulation allostérique endogène des mGluRs par les ions Cl-, en identifiant leur(s) site(s) de liaison(s) et leur effet sur la dynamique conformationnelle et la fonction des récepteurs. En combinant une approche pharmacologique, biophysique basée sur la technique de FRET, et la modélisation, nous avons tout d'abord confirmé que le Cl- potentialise l'action du glutamate sur tous les mGluRs et qu'il favorise la conformation active des récepteurs en se liant au niveau du VFT. Les mGluRs présentent également une sensibilité différente au Cl-, mGlu4 étant le plus sensible et mGlu2 le moins. Ceci s'explique notamment par le nombre de sites fonctionnels, tous les mGluRs dont mGlu4 possédant 2 sites par monomère à l'exception de mGlu2 qui n'en possède qu'un, en raison d'une mutation « clé » d'une sérine en aspartate dans le lobe 1 du VFT. D'autre part, le récepteur mGlu3 est apparu comme un cas particulier ayant une sensibilité accrue au Cl-, son domaine VFT cumulant la présence et l'orientation adéquate d'acides aminés formant un « verrou » Cl-, qui favorise de manière drastique la conformation active et une activité basale élevée de ce récepteur. Enfin, la modélisation de la variation de la concentration extracellulaire en Cl- lors d'une activité synaptique GABAergique est compatible avec une modulation des mGluRs les plus sensibles. En conclusion, le Cl- est un modulateur allostérique endogène des mGluRs et l'exploitation de ses sites de liaison au sein du VFT pourrait permettre le développement de nouveaux agents thérapeutiques. / Metabotropic glutamate receptors (mGluRs) are G coupled-protein receptors (GPCRs) playing key roles in synaptic transmission in the central nervous system. They display a large extracellular domain, the Venus Flytrap (VFT) where the endogenous ligand, glutamate, binds. Their 7 transmembrane helices spanning domain, common to all GPCRs, is known to be the target of new therapeutic compounds, called allosteric modulators. In contrast, VFT domain is used to develop glutamate competitive ligands and there are only few data about allosteric modulators targeting the VFT. Recent studies have shown mGluRs are sensitive to extracellular ions, particularly to chloride (Cl-), although its binding site has not been elucidated. This thesis work explores the possibility of an endogenous allosteric modulation of mGluRs by Cl-, aiming to delineate its binding site(s) and its effect on receptor conformational dynamics and function. Using pharmacological, FRET based biophysical approaches and modelling, we have first confirmed that Cl- potentiates glutamate action in all mGluRs and that this ion favors agonist induced active conformation by binding to the VFT. mGluRs are also differently sensitive to Cl-, mGlu4 being the most and mGlu2 the least. This difference is notably explained by the number of Cl- functional sites within the VFT, all mGluRs including mGlu4 displaying 2 sites per monomer whereas mGlu2 has only 1 site due to a serine-aspartate “key” mutation in VFT lobe 1. Besides, mGlu3 receptor appears to be a “special case”, as this receptor is highly sensitive to Cl- because its VFT domain is carrying amino acids creating a “Cl- lock”, which dramatically favors active conformation and a high level of basal activity. Finally, modelling of extracellular Cl- concentration variations in a GABAergic synapse is compatible with a modulation of the most sensitive mGluRs. In conclusion, Cl- is an endogenous allosteric modulator of mGluRs and exploiting its binding sites may yield to the development of innovative therapeutic tools.

L’autophagie est un processus catabolique par lequel certaines protéines cytosoliquessont dirigées vers le compartiment lysosomial, afin d’y être dégradées. Ce processus débutepar la séquestration de constituants cytoplasmiques par une structure multimembranaireappelée phagophore. La fermeture du phagophore donne naissance à une vésicule à doublemembrane nommée autophagosome, qui fusionne avec les lysosomes, ce qui conduit à ladégradation du contenu de sa lumière. Ainsi, la modulation de l’autophagie permet unremodelage dynamique du protéome cellulaire. Bien que des données récentes ont permis dedémontrer la dégradation autophagique de protéines impliquées dans la migration cellulaire,telles que des intégrines, ou encore les protéines RhoA et Src, l'impact fonctionnel del'autophagie sur la migration cellulaire demeure sujet à controverse. Alors que l'autophagie estdécrite comme un processus pro-migratoire et pro-invasif dans certaines études, d'autrestravaux indiquent que l'inactivation des protéines pro-autophagiques stimule l'invasion descellules cancéreuses. De plus, l'effet fonctionnel des RCPG chimiotactiques sur l’activitéautophagique reste totalement inexploré. Sur la base de ces données, les objectifs de mon travail de thèse ont été i) d’évaluer les effets des RCPG chimiotactiques, le CXCR4 et l’UT,sur le processus autophagique et ii) d’étudier l’impact de cette modulation sur la migrationcellulaire. Pour ce faire, nous avons utilisé des cellules HEK-293, transfectées à l’aide deconstruits permettant l’expression des RCPG CXCR4 et UT, ainsi que la lignée deglioblastome humain U87, exprimant ces deux récepteurs de manière endogène.Nous avons dans un premier temps évalué l’activité autophagique à l’aide de laprotéine de fusion EGFP-LC3, marqueur des autophagosomes. Nous avons ainsi démontréque l’activation du CXCR4 et de l’UT provoque une diminution significative de la biogénèsedes autophagosomes. Une étape essentielle de cette biogenèse est le recrutement des protéinesAtg16L1 et Atg5 à la membrane plasmique, conduisant à la formation d'endosomes Atg16L1-Atg5-positifs, appelés « endosomes pré-autophagiques ». Cette population d’endosomesconstitue une source importante de phospholipides nécessaire à l’expansion du phagophore etla formation d’un autophagosome mature. Afin d’évaluer l’impact des RCPG chimiotactiquessur le recrutement de la protéine Atg16L1 à la membrane plasmique, nous avons bloqué leprocessus d’endocytose par l’utilisation d’un inhibiteur de la dynamine, le Dynasore. Cettemolécule provoque une accumulation marquée de la protéine Atg16L1 dans les endosomespré-autophagiques en formation, retenus à la membrane plasmique. / Autophagy is a catabolic process by which certain cytosolic proteins are directed to thelysosomal compartment to be degraded. This process begins with the sequestration ofcytoplasmic components, by a multimembrane structure called the phagophore. The closure ofthe phagophore gives rise to a double membrane vesicle called autophagosome, which thenmerges with lysosomes in order to degrade its luminal content. Autophagy modulation allowsa dynamic remodeling of the cellular proteome. Although recent evidence has demonstratedautophagic degradation of key proteins involved in cell migration, such as integrins, RhoAand the Src kinase, the functional impact of autophagy on cell migration remainscontroversial. While autophagy is described as a pro-migratory and pro-invasive process insome studies, others indicate that the inactivation of pro-autophagic proteins stimulates thecancer cell invasion. In addition, the functional effect of chemotactic GPCR on autophagicactivity remains unexplored. On the basis of these data, the objectives of my thesis were i) toevaluate the effects of the chemotactic GPCRs for SDF-1 (CXCR4) and for the vasoactivepeptide urotensin II (UT), on the autophagic process and ii) to study the impact of thismodulation on cell migration. In order to do this, we used HEK-293 cells, transfected with constructs allowing the expression of CXCR4 and UT, as well as the human glioblastomaline, U87, which endogenously expresses these two receptors. Previous studies have demonstrated a direct interaction of Atg5 with membranes,suggesting that recruitment of Atg16L1 to the plasma membrane may depend on Atg5. This prompted us to evaluate the formation of Atg16L1-positive pre-autophagic endosomes,following depletion of Atg5 levels. Several interfering RNAs, targeting the transcriptencoding Atg5, have been tested and, as expected, these interfering RNAs completely blockedthe recruitment of Atg16L1 to forming pre-autophagic endosomes. We then tested the effectsof chemotactic GPCRs on the subcellular localization of the Atg5 protein. By confocalmicroscopy, we found that a significant fraction of Atg5 localized to the plasma membraneunder basal conditions. The activation of CXCR4 or UT is accompanied by a marked decreaseof the Atg5 pool localized at the plasma membrane. Furthermore, we have demonstrated thatthe anti-autophagic effects of chemotactic GPCRs are completely abrogated byoverexpression of a recombinant Atg5 protein, suggesting that chemotactic GPCRs exert theiranti-autophagic effects by reducing the membrane pool of Atg5, necessary for the productionof pre-autophagic endosomes, and the expansion of the phagophore.

Le but de ce travail était de mieux comprendre les mécanismes de régulation influençant le recrutement des macrophages cérébraux et leur activation dans différentes affections du système nerveux central. À cette fin, trois objectifs ont été définis : (1) Mettre en évidence le rôle du TNF dans l'infiltration et l'activation des macrophages dans un modèle de démyélinisation induit par la cuprizone; (2) Identifier les précurseurs sanguins des macrophages périvasculaires du cerveau et le rôle de l'angiopoïétine-2 dans leur recrutement suite à une endotoxinémie; (3) Définir le rôle du récepteur GPR84 lors de la réponse microgliale dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer. L'identification des différents facteurs pouvant influencer le phénomène de démyélinisation est un enjeu majeur de la recherche sur la sclérose de plaques. Dans cette maladie et dans les modèles animaux associés, l'expression de TNF par les macrophages cérébraux suggérait que la cytokine pro-inflammatoire jouerait un rôle dans le recrutement des macrophages dérivés du sang et de la microglie. Afin de déterminer quelles fonctions jouaient le TNF et ses récepteurs TNF-R1 et TNF-R2 sur les macrophages cérébraux, nous avons utilisé des souris chimériques dont le système hématopoïétique exprimait la GFP, et nous les avons traitées avec la toxine cuprizone pour reproduire un modèle de démyélinisation. Nous avons montré que les macrophages étaient très fortement recrutés depuis la périphérie et activés dans le SNC, mais selon un mécanisme indépendant du TNF. De plus, chez des souris déficientes en TNF traitées avec la cuprizone, l'étendue de la démyélinisation n'était pas diminuée par rapport aux souris contrôles. Finalement, par la technique d'hybridation in situ, il a été prouvé que le TNF n'était pas exprimé dans le cerveau dont la démyélinisation était provoquée par la cuprizone. Le système nerveux est infiltré de façon continue par les macrophages périvasculaires dérivés du système sanguin. Les précurseurs immédiats de ces cellules n'ont pas encore été identifiés et les mécanismes gouvernant leur recrutement sont encore largement méconnus. Dans cette étude, nous apportons la preuve que les monocytes CD68+GR1" pouvaient se différencier en macrophages périvasculaires chez des souris souffrant d'endotoxinémie. Après leur adhésion à l'endothélium, ces monocytes rampaient, adoptaient une morphologie dite en bâtonnet lors de leur passage dans les capillaires, pouvaient proliférer et former de longues protubérances cytoplasmiques. Ils étaient recrutés en grand nombre lors d'une endotoxinémie grâce à la combinaison de molécules vasorégulatrices, incluant le TNF, l'interleukine-ip et l'angiopoïétine-2. Après quelques heures, quelques unes de ces cellules traversaient l'endothélium afin d'accroître la population de macrophages périvasculaires du SNC. L'élimination des monocytes adhérents et des macrophages périvasculaires nouvellement recrutés pouvait être provoquée par l'injection d'une protéine de fusion couplant un peptide-Fc et un anti-angiopoïétine-2. Cette seconde étude permet ainsi une meilleure compréhension du comportement monocytaire à l'interface sang-cerveau et fournit une nouvelle façon de contrer leur infiltration dans le tissu nerveux en conditions inflammatoires. Le GPR84 est un récepteur transmembranaire couplé aux protéines G récemment identifié comme étant exprimé de façon sélective par la microglie chez des souris souffrant d'endotoxinémie ou d'encéphalomyélite autoimmune expérimentale, mais sa fonction demeure inconnue. Nos travaux rapportent que le GPR84 est également exprimé par les cellules microgliales entourant les plaques amyloïdes chez les souris transgéniques APP/PS1, un modèle de la maladie d'Alzheimer. Les symptômes d'une endotoxinémie ou de l'EAE ne différaient pas chez des souris déficientes en GPR84, mais un déclin cognitif plus précoce et plus sévère était observé chez les souris APP/PS1 déficientes en GPR84. Dans le cerveau de ces dernières, le nombre de microglies global ainsi que par plaque était diminué; toutefois, aucune différence de dépôt d'amyloïde n'était observée. Nous en concluons dans cette troisième étude que le GPR84 joue un rôle dans le recrutement des cellules microgliales lors de certaines conditions inflammatoires et que son absence réduit la capacité de la microglie à protéger partiellement le cerveau contre la P-amyloïde toxique sans pouvoir l'éliminer. L'ensemble de ces