INTRODUÇÃO: Injeções intravítreas de acetato de triancinolona são utilizadas no tratamento de uma série de doenças retinianas. Estudos in vitro demonstram toxicidade, mas não está ainda claro se está relacionada ao preservativo ácido benzílico. Recentemente, uma formulação sem preservativo (Triesence®) foi aprovada nos Estados Unidos da América para uso intraocular. Entretanto, não existem estudos avaliando os efeitos in vitro e in vivo desta formulação. OBJETIVOS: Avaliar os efeitos do Triesence® em culturas de células retinianas e em um modelo experimental animal. MÉTODOS: As culturas de células ARPE-­-19 e R28 foram tratadas por 24 horas com Triesence® em cristais (TRIc) nas doses de 1000, 500, 200 ou 100 g/mL, ou solubilizado (TRIs) nas doses de 1000, 500 ou 200 ?g/mL. O Triesence® foi solubilizado após a centrifugação da droga, descarte do sobrenadante contendo o veículo, e em seguida ressuspensão da droga em quantidade equivalente de dimetilsulfóxido (DMSO). A porcentagem de viabilidade celular (VC) foi avaliada em ensaio de exclusão com azul de tripan. O potencial de membrana mitocondrial, foi analisado com o ensaio JC1. A atividade da caspase-­-3/7 foi mensurada por ensaio com fluoróforos. Trinta coelhos borboletas (Oryctolagus Cuniculum) foram divididos em três grupos e receberam 3 quantidades diferentes de Triesence® intravítreo: 1, 4, ou 8 mg. Após a anestesia, o olho direito (OD) recebeu a droga, enquanto o olho esquerdo (OE) recebeu o mesmo volume de solução salina balanceada. Ao final de 30 dias, o eletrorretinograma (ERG) foi registrado. Após realização do ERG, os animais foram sacrificados e os olhos coletados para análise morfológica. Doze outros coelhos foram submetidos somente a análise morfológica após 7 dias da aplicação. OS ERGs foram registrados com o sistema RETIport (Roland Consult, Alemanha), com um estimulador Ganzfeld Q450 SC. O teste de postos com sinais de Wilcoxon foi utilizado para comparar as amostras relacionadas. Para estímulos escotópicos, o valor logarítmico das amplitudes médias da onda b foi relacionado ao valor logarítmico da intensidade luminosa de cada estímulo, e a amplitude máxima da onda b (Vmax), a intensidade luminosa necessária para se atingir 50% do valor do Vmax (k), e a inclinação da curva (n) foram analisados utilizando-­-se os testes estatísticos ANOVA e t de Student pareado bicaudal. Resumo RESULTADOS: TRIc causa diminuição significativa na viabilidade celular em todas as concentrações e linhagens testadas, o que é minimizado pela solubilização da droga. Mesmo o TRIs demonstrou aumento da regulação da caspase 3/7, indicativo de apoptose in vitro, mas não houve aumento da atividade no ensaio JC1. O ERG escotópico evidenciou uma queda estatisticamente significativa de aproximadamente 7% no Vmax no grupo recebendo 8 mg a droga, mas não houve alteração significativa nos parâmetros k ou n em nenhuma concentração testada. O ERG fotópico evidenciou amplitudes de onda b significativamente reduzidas nos grupos que receberam 4 ou 8 mg, mas não no que recebeu 1 mg. Observou-­-se redução na amplitude do flicker para 24 ou 30 Hertz (Hz) no grupo que recebeu 8 mg, e para 30 Hz no grupo que recebeu 4 mg. Não foram notadas diferenças nos ensaios Hematoxilina-­-Eosina (H&E), Tunnel, Fluoro-­-Jade B ou GFAP (proteína glial fibrilar ácida) entre retinas tratadas e controle após 30 dias. Entretanto, após 7 dias, observou-­-se marcação positiva para proteína glial fibrilar ácida nas células de Müller. CONCLUSÃO: TRIc causa uma diminuição significativa na viabilidade celular em culturas de células retinianas. Após solubilizada, a droga não causa este efeito ou tampouco altera-o. Mesmo o TRIs causa aumento dos níveis de caspase 3/7, sugerindo apoptose. No modelo experimental em coelhos, foram observadas alterações morfológicas e eletrorretinográficas após a injeção intravítrea de Triesence®. Células de Müller apresentaram expressão de GFAP após 7 dias, mas não após 30 dias, sugerindo ativação transitória deste tipo celular. Não foram encontrados sinais de necrose ou apoptose, mesmo nas doses mais elevadas. Os resultados do ERG sugerem toxicidade retiniana após aplicação intravítrea de 4 ou 8 mg de Triesence® (4 a 8 vezes a dose clínica terapêutica) / INTRODUCTION: Intravitreous triancinolone acetonide is used to treat various retinal disorders. In vitro studies show toxicity, but it is not clear if that is related to the preservative benzyl alcohol. Recently, a formulation without preservative (Triesence®) was approved for intraocular use. However, no in vitro or in vivo studies with this formulation have been reported in literature so far. OBJECTIVES: To evaluate the effects of the exposure of Triesence® on retinal cells in culture and on an in-­-vivo rabbit model. METHODS: ARPE-­-19 and R28 cell cultures were treated for 24 hours with 1000, 500, 200 or 100 ?g/mL of crystalline (TRIc) or 1000, 500 or 200 g/mL of solubilized (TRIs) Triesence®. The drug was solubilized by centrifuging it, discarding the supernatant containing the vehicle and then resuspending the pellet in an equivalent amount of Dimethyl sulfoxide (DMSO). Percentage of cell viability (VC) was evaluated by a trypan blue dye-­-exclusion assay. The mitochondrial membrane potential was analyzed with the JC-­-1 assay. The caspase-­-3/7 activity was measured by a fluorochrome assay. Thirty pigmented rabbits (Oryctolagus Cuniculum) were assigned to 3 different intravitreal drug concentrations of Triesence®: 1, 4 or 8 mg. The animals were anesthetized and the right eye (OD) received drug, while the left eye (OS) received balanced salt solution. After 30 days, electroretinogram (ERG) was recorded. ERGs were recorded with the RETIport system (Roland Consult, Germany) with a Ganzfeld Q450 SC stimulator. Wilcoxon signed rank test was used to compare related samples. After the ERG, the animals were euthanized and the eyes were collected for morphological analysis. Twelve other rabbits had histology only analysis after 7 days of injection. Dark-­-adapted b-­-wave mean amplitudes were plotted as log response versus log light intensity curves, and the maximum The mitochondrial membrane potential was analyzed with the JC-­-1 assay. The caspase-­-3/7 activity was measured by a fluorochrome assay. Thirty pigmented rabbits (Oryctolagus Cuniculum) were assigned to 3 different intravitreal drug concentrations of Triesence®: 1, 4 or 8 mg. The animals were anesthetized and the right eye (OD) received drug, while the left eye (OS) received balanced salt solution. After 30 days, electroretinogram (ERG) was recorded. ERGs were recorded with the RETIport system (Roland Consult, Germany) with a Ganzfeld Q450 SC stimulator. Wilcoxon signed rank test was used to compare related samples. After the ERG, the animals were euthanized and the eyes were collected for morphological analysis. Twelve other rabbits had histology only analysis after 7 days of injection. Dark-­-adapted b-­-wave mean amplitudes were plotted as log response versus log light intensity curves, and the maximum

O Vírus Respiratório Sincicial Humano, do inglês human Respiratory Syncytial Virus (hRSV), é uma das maiores causas de doenças respiratórias agudas, principalmente em crianças e bebês entre seis meses e dois anos de idade. Não há drogas eficazes ou vacina aprovada até o momento para esse vírus, apesar das décadas de intensa pesquisa e grande quantidade de dados sobre ele acumulados. O genoma do hRSV codifica onze proteínas e a compreensão das interações entre essas proteínas virais e as proteínas do hospedeiro é essencial para que possíveis alvos terapêuticos contra o hRSV sejam identificados. No laboratório, anteriormente, foi dado enfoque às interações entre as proteínas celulares e as proteínas virais de matriz (M), nucleoproteína (N) e fosfoproteína (P). Neste trabalho, analisamos as interações da proteína viral M2-1 (cofator essencial para a transcrição) através da mesma estratégia utilizada naqueles experimentos, de fusão a FLAG (gerando FLAG-M2-1) e imunoprecipitação com anticorpos contra esse peptídeo. As proteínas co-imunoprecipitadas, identificadas por espectrometria de massas, foram: poly(A)-binding protein cytoplasmic 1 (PABPC1), Y-box binding protein 3 (YBX3), e Nuclease-sensitive element-binding protein 1 (YBX1). M2-1 é capaz de integrar-se ao complexo chamado de semelhante a corpúsculos de inclusão (IB like, do inglês), formado por N e P, que é similar estruturalmente aos corpúsculos de inclusão encontrados em células infectadas (IBs). Essa propriedade foi usada para analisar que proteínas celulares seriam recrutadas para esse outro nível de organização dessas três proteínas virais, envolvidas na transcrição. O complexo FLAG-N/P/M2-1 co-imunoprecipitou as proteínas celulares: Hsp70, Hsp90 (Heat shock proteins 70 e 90), Npm (Nucleophosmin), que podemos agrupar como chaperonas; PABPC1, YBX1, YBX3, ligantes de RNA; e sub-unidade pICIn do metilossomo, associada a modificação pós-tradução. Detalhamos a análise para YBX3, obtendo evidências adicionais de sua interação com M2-1 em ensaios de complementação de proteína fragmentada (Split-NanoLuc), e de co-localização por imunofluorescência indireta. Finalmente, utilizamos a metodologia de expressão em bactérias para demonstrar a interação entre M2-1 e os domínios funcionais de PABPC1, porém esses ensaios não foram conclusivos. / Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is one of the leading causes of acute respiratory diseases, especially in children and infants between six months and two years of age. There is no effective drug or vaccine approved so far for this virus, despite decades of intensive research and large amount of data on it. The genome of hRSV encodes 11 proteins and the understanding of the interactions between these viral proteins and host proteins is essential to identify possible therapeutic targets against hRSV. In the lab, previously, was given focus to the interactions between cellular proteins and viral proteins matrix (M), nucleoprotein (N) and phosphoprotein (P). In this paper, we analyze the viral M2-1 (cofactor essential for transcription) protein interactions through the same strategy used in those experiments: fusion with FLAG (generating FLAG-M2-1) and immunoprecipitation with antibodies against this peptide. The co-immunoprecipitated proteins, identified by mass spectrometry, were: Poly (A)-binding protein cytoplasmic 1 (PABPC1), Y-box binding protein 3 (YBX3), and Nuclease-sensitive element-binding protein 1 (YBX1). M2-1 is able to integrate the complex called similar to inclusion bodies (IB like), formed by N and P, which is similar structurally to the inclusion bodies found in infected cells (IBs). This property has been used to analyze which cellular proteins would be recruited for this new level of organization of these three viral proteins involved in transcription. The cellular proteins co-immunoprecipitated with the complex FLAG-N/P/M2-1, were: Hsp70, Hsp90 (Heat shock proteins 70 and 90), Npm (Nucleophosmin), that we can group as chaperones; PABPC1, YBX1, YBX3, RNA ligands; and the methylosome sub-unit pICIn, post-translational modification-associated. We detailed the analysis for YBX3, obtaining additional evidence of its interaction with M2-1 in fragmented protein complementation tests (Split-NanoLuc), and co-localization by indirect immunofluorescence. Finally, we used the methodology of expression in bacteria to demonstrate the interaction between M2-1 and functional domains of PABPC1, but these tests were not conclusive.

INTRODUÇÃO: Sepse e choque séptico são doenças comuns em pacientes gravemente enfermos, evoluindo muitas vezes com síndrome de disfunção de múltiplos órgãos (SDMO) e morte. Este trabalho investiga a eficácia da administração precoce de dexametasona em evitar a progressão do choque séptico para SDMO e morte e o comportamento da proteína amilóide A sérica (SAA) e da proteína C-reativa (PCR) como marcadores da evolução e gravidade dos pacientes em choque séptico no período pós-operatório. MÉTODOS: Estudo prospectivo, aleatório, duplamente encoberto, realizado na Unidade de Terapia Intensiva pós-operatória do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, com 29 pacientes que no período pós-operatório evoluíram com choque séptico. Os participantes foram divididos de forma aleatória em dois grupos, de acordo com a solução administrada: dexametasona 0,2 mg/kg (grupo D) ou placebo (grupo P), repetidas a cada 36 horas. Os pacientes foram acompanhados durante sete dias de internação na UTI através do escore SOFA (Sequential Organ Failure Assessment) e dosagens séricas diárias de PCR, SAA e lactato. RESULTADOS: Os pacientes do grupo D, quando comparados aos pacientes do grupo P, permaneceram mais dias sem necessidade do uso do vasopressor (respectivamente 2,9±2,7 e 0,7±0,6, p=0,01) e mais tempo livre de ventilação mecânica (respectivamente 2,6±2,5 e 0,6±0,5, p=0,03). A mortalidade no grupo P foi de 67% (10 em 15) e no grupo D foi de 21% (3 em 14) (Risco Relativo=0,31, IC95% 0,11-0,88). Os valores de PCR e SAA apresentaram forte correlação durante o período de observação (R=0,91/p=0,002). PCR e SAA não tiveram correlação com o escore SOFA (respectivamente R=0,71/p=0,05 e R=0,52/p=0,18), nem com o lactato (p=0,88 e p=0,67). CONCLUSÕES: O tratamento precoce com dexametasona nos pacientes com choque séptico reduziu a mortalidade em 7 dias de acompanhamento. Os níveis séricos de PCR e SAA apresentaram-se elevados nos pacientes em choque séptico e tiveram forte correlação, porém não foram preditores de disfunção orgânica nem de mortalidade. / INTRODUCTION: Sepsis and septic shock are a very common condition in critically ill patients, leading to multiple organ dysfunction syndrome (MODS) and death. This study aimed at investigating the efficacy of early administration of dexamethasone in patients with septic shock in order to block the evolution to MODS and death. It also evaluated serum amyloid A protein (SAA) and C-reactive protein (CRP) as evolution and organ dysfunction markers in postoperative septic shock patients. METHODS: Prospective, randomized, double-blind study, developed in a surgical intensive care unit of Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo that involved 29 patients with septic shock. All eligible patients were prospectively randomized to receive either a dose of 0.2 mg/kg of dexamethasone (group D) or placebo (group P), repeated every 36 hours intervals. Patients were monitored over a 7- day period by Sequential Organ Failure Assessment score (SOFA) and daily measurements of CRP, SAA and lactate. RESULTS: Patients treated with dexamethasone had more vasopressor therapy-free days (2.9±2.7 versus 0.7±0.6, p=0.01) and more mechanical ventilation-free days (2.6±2.5 e 0.6±0.5, p=0.03). Mortality in group P was 67% (10 in 15) and in group D was 21% (3 in 14) (Relative Risk=0.31, 95%CI 0.11 to 0.88). CRP and SAA were strongly correlated during the 7 day period of observation (R=0.91/p=0.002). CRP and SAA did not correlate with SOFA (respectively R=0.71/p=0.05 and R=0.52/p=0.18) and lactate (p=0.88 and p=0.67). CONCLUSIONS: Early treatment with dexamethasone reduced 7-day mortality in septic shock patients. CRP and SAA levels were significantly elevated in septic shock and were strongly correlated to each other, but did neither correlate with organ dysfunction nor predict mortality.

Simulações moleculares podem fornecer informações e detalhes mecanísticos que são difíceis de obter de experimentos. No entanto, fenômenos bioquímicos como formação de complexos proteína-ligante e desenovelamento de proteína são lentos e difíceis de amostrar na escala de tempo geralmente atingida por simulações de dinâmica molecular (MD) convencionais. Esses fenômenos moleculares foram estudados aqui pela combinação de simulações de MD com diversos métodos e aproximações para aumentar a amostragem configuracional: método de energia de interação linear (LIE), a aproximação de ensemble ponderado (WE) e dinâmica molecular dirigida (SMD). Uma equação foi parametrizada para prever afinidades entre pequenas moléculas e proteínas baseada na aproximação LIE, que foca a amostragem computacional nos estados complexado e não-complexado do ligante. A flexibilidade proteica foi introduzida usando ensembles de configurações obtidos de simulações de MD. Diferentes esquemas de média foram testados para obter afinidades totais de complexos proteína-ligante, revelando que muitas configurações de complexo contribuem para as afinidades de proteínas flexíveis, enquanto as afinidades de proteínas rígidas são dominadas por uma configuração de complexo. O mutante L99A da lisozima T4 (T4L) é provavelmente a proteína mais frequentemente usada para estudar complexação de ligantes. Estruturas cristalográficas mostram que a cavidade de ligação artificial criada pela mutação é pouco acessível, portanto movimentos proteicos ou uma respiração conformacional são necessários para permitir a entrada e saída de ligantes. Simulações de MD foram combinadas aqui com a aproximação de WE para aumentar a amostragem de eventos infrequentes de saída do benzeno de T4L. Quatro possíveis caminhos foram encontrados e movimentações de alfa-hélices e cadeias laterais envolvidas na saída do ligante foram caracterizadas. Os quatro caminhos correspondem a túneis da proteína previamente observados em simulações de MD longas de T4L apo, sugerindo que a heterogeneidade de caminhos ao longo de túneis intrínsecos é explorada por pequenas moléculas para sair de cavidades de ligação enterradas em proteínas. Experimentos de microscopia de força atômica revelaram informações detalhadas do desenovelamento forçado e da estabilidade mecânica da rubredoxina, uma proteína ferro-enxofre simples. O desenovelamento completo da rubredoxina envolve a ruptura de ligações covalentes. Portanto, o processo de desenovelamento foi simulado aqui por simulações de SMD acopladas a uma descrição clássica da dissociação de ligações. A amostragem de eventos de desenovelamento forçado foi aumentada pelo uso de velocidades rápidas de esticamento. Os resultados foram analisados usando um modelo teórico válido para regimes de desenovelamento forçado lentos e rápidos. As simulações revelaram que mudanças no ponto de aplicação de força ao longo da sequência da rubredoxina levam a diferentes mecanismos de desenovelamento, caracterizados por variáveis graus de rompimento de ligações de hidrogênio e estrutura secundária da proteína. / Molecular simulations may provide information and mechanistic insights that are difficult to obtain from experiments. However, biochemical phenomena such as ligand-protein binding and protein unfolding are slow and hard to sample on the timescales usually reached by conventional molecular dynamics (MD) simulations. These molecular phenomena were studied here by combining MD simulations with several methods or approximations to enhance configurational sampling: linear interaction energy (LIE) method, weighted ensemble (WE) approach and steered molecular dynamics (SMD). An equation was parametrized to predict affinities between small molecules and proteins based on the LIE approximation, which focus computational sampling in ligand bound and unbound states. Protein flexibility was introduced by using ensembles of configurations obtained from MD simulations. Different averaging schemes were tested to obtain overall affinities for ligand-protein complexes, revealing that many bound configurations contribute to affinities for flexible proteins, while affinities for rigid proteins are dominated by one bound configuration. T4 lysozyme (T4L) L99A mutant is probably the protein most often used to study ligand binding. Crystal structures show the artificial binding cavity created by the mutation has low accessibility, so protein movements or conformational breathing are necessary to allow the entry and egress of ligands. MD simulations were combined here with the WE approach to enhance sampling of infrequent benzene unbinding events from T4L. Four possible pathways were found and motions on alpha-helices and side chains involved in ligand egress were characterized. The four pathways correspond to protein tunnels previously observed in long MD simulations of apo T4L, suggesting that pathway heterogeneity along intrinsic tunnels is explored by small molecules to egress from binding cavities buried in proteins. Previous atomic force microscopy experiments revealed detailed information on the forced unfolding and mechanical stability of rubredoxin, a simple iron-sulfur protein. Complete unfolding of rubredoxin involves rupture of covalent bonds. Thus, the unfolding process was simulated here by SMD simulations coupled to a classical description of bond dissociation. Sampling of forced unfolding events was increased by using fast pulling velocities. Results were analyzed using a theoretical model valid for both slow and fast forced unfolding regimes. Simulations revealed that changing the points of force application along the rubredoxin sequence leads to different unfolding mechanisms, characterized by variable degrees of disruption of hydrogen bonds and secondary protein structure.

A proteína Cdc42 (Cell Division Cycle 42) é um membro da família das Rho GTPases, sinalizadores intracelulares conhecidos pelo seu papel na regulação do citoesqueleto. Essa proteína e capaz de ciclar entre um estado ativo (ligado à GTP) e um estado inativo (ligado à GDP) e essa ativação é modulada por diversas proteínas, conhecidas como GEFs (guanine nucleotide-exchange factors), GAPs (GTPase-activating proteins) e GDIs (guanine nucleotide-dissociation inhibitors). Trabalhos recentes têm demonstrado um papel de Cdc42 na apoptose e na senescência, respostas relacionadas e comumente desencadeadas por estresse genotóxico. Neste contexto este trabalho procurou identificar interações de Cdc42 com outras proteínas, que podem ou não estar envolvidas nos mecanismos de resposta ao dano do DNA. Para isso foram utilizadas as linhagens celulares HeLa e MRC-5 submetidas a tratamento com radiação ultravioleta tipo C, a fim de provocar danos no DNA. Foram realizados dois diferentes tratamentos em cada uma das linhagens com diferentes tempos de incubação pós radiação UV, visando a busca de proteínas envolvidas em uma resposta rápida ou tardia ao dano causado. Os lisados celulares desses tratamentos foram submetidos ao pull-down com proteínas recombinantes GST, GST-Cdc42WT (Selvagem) e GST-Cdc42V12 (Mutação constitutivamente ativa). As proteínas purificadas foram digeridas e submetidas à análise por espectrometria de massa e os dados obtidos foram utilizados para a construção de redes de interação proteica. Dentre as proteínas identificadas as que despertaram maior atenção foram: Proibitina-2 (PHB2) encontrada nas amostras incubadas por 48 horas pós irradiação e Cullina-4A (CUL4A) e P53, encontradas em amostra incubada por 5 minutos pós radiação. Essas proteínas possuem papéis em apoptose e reparo de DNA e foram observadas em posições muito próximas de Cdc42 nas redes de interação, fazendo delas interessantes alvos para futuras validações de interação proteica por análises experimentais distintas / The Cdc42 protein (Cell Division Cycle 42) is a member of the Rho family of GTPases, intracellular signalling molecules well known for their role in the cytoskeleton regulation. This protein cycles between an active state (GTP-bound) and an inactive state (GDP-bound) and this regulation is modulated by proteins known as GEFs, GAPs and GDIs. Recent studies demonstrated roles for Cdc42 in apoptosis and senescence, cellular responses commonly triggered by genotoxic stress. This work sought to identify Cdc42 interactions with other proteins that possibly involved in response to DNA damage mechanisms. To reach this aims we used HeLa and MRC-5 cell lines submitted to treatments with ultraviolet C radiation to induce DNA damage. Two experimental conditions were used in each cell line with different times and doses post UV irradiation in order to search for proteins involved in either rapid or delayed response to the installed DNA damage. Cell lysates obtained from these treatments were subjected to pull-down experiments using recombinant proteins GST, GST-Cdc42-WT (Wild type) and GST-Cdc42-V12 (constitutively active mutant). Purified proteins were digested by trypsin, analyzed by mass spectrometry and th obtained data were used for the construction of protein-protein interaction (PPI) networks. Among the identified proteins those that seem more relevant to the aims of this project were: Prohibitin-2 (PHB2), found in samples incubated 48 hours post irradiation; Cullin-4A (CUL4A) and P53, found in samples incubated 5 minutes after radiation. These proteins have roles in apoptosis and DNA repair and were observed in close proximity to Cdc42 in PPI networks, making them interesting targets for future validation by different experimental approaches

O vírus respiratório sincicial humano (HRSV) é um dos agentes patogênicos respiratórios de grande importância clínica, tendo em vista que acomete 64 milhões de crianças por ano em todo o mundo. A resposta imune do hospedeiro e a variabilidade genética do HRSV podem interferir na produção de uma vacina eficaz, tal como a presença de quasispecies na população viral. O objetivo deste trabalho foi detectar quasispecies em amostras de HRSV e verificar se soros obtidos da criança na fase convalescente da doença e de sua respectiva mãe selecionam estes mutantes. Uma alteração não sinonímia foi detectada no gene F em um dos clones seqüenciados, enquanto duas alterações sinonímias e duas não sinonímias foram encontradas no gene G do HRSV, sendo as últimas no mesmo nucleotídeo. Um dos clones pré-selecionados com soro humano apresentou a mesma alteração não-sinonímia, encontrada na ausência de anticorpos no gene G. Os resultados sugerem que diferentes sequencias virais presentes em menor quantidade na população podem ser selecionadas pelo sistema imunológico do hospedeiro. / Human respiratory syncytial virus (HRSV) is one of the most important clinical respiratory pathogens, since 64 millions children in the world are infected by this agent every year. Host immunity and viral genetic variability are important factors to a vaccine development, besides quasispecies presence in the viral population. In this work, HRSV quasispecies were detected in clinical samples in absence and presence of human polyclonal serum collected by children in the convalescent phase and mother serum. A non-synonymy variation was found in the F gene in antibodies absence. Four mutations were found at HRSV G2 in polyclonal serum absence. Two were synonymy and two were non-synonymy variation, the last in the same nucleotide. A non-synonymy mutation was found in the G2 region in presence of polyclonal serum collected from child convalescent phase. This alteration was the same of the observed in absence of polyclonal serum so it is possible that host antibodies can selected different viral minority sequences present in the population.

O exossomo é um complexo multiproteico conservado evolutivamente de archaea a eucariotos superiores que desempenha funções celulares essenciais tais como: atividade exoribonucleolítica 3\'→5\', regulação dos níveis de mRNA, maturação de RNAs estruturais e controle de qualidade de RNAs durante os vários estágios do mecanismo de expressão gênica. Em Archaea, o exossomo é composto por até quatro subunidades diferentes, duas com domínios de RNase PH, aRrp41 e aRrp42, e duas com domínios de ligação a RNAs, aCsl4 e aRrp4. Três cópias das proteínas aRrp4 e/ou aCsl4 se associam com o núcleo hexamérico catalítico do anel de RNase PH e completam a formação do complexo. A proteína PaNip7 é um cofator de regulação do exossomo da archaea Pyrococcus abyssi e atua na inibição do complexo enzimático ligando-se simultaneamente ao exossomo e a RNAs. Neste projeto, a reconstituição in vitro do exossomo da archaea Pyrococcus abyssi formado pela proteína de topo PaCsl4 foi obtida. Para tanto foram realizadas análises de interação proteica usando as técnicas de cromatografia de afinidade, gel filtração e SDS-PAGE. Em adição à formação da isoforma PaCsl4-exossomo, um fragmento peptídico correspondente à região C-terminal da PaNip7 foi sintetizado pelo método da fase sólida, purificado por RP-HPLC e o purificado foi caracterizado por LC/ESI-MS almejando realizar futuros experimentos de interação com o exossomo. / The exosome is a multiprotein complex evolutionarily conserved from archaea to higher eukaryotes that performs essential cellular functions such as: 3\'→5\' exoribonucleolytic activity, regulation of mRNA levels, maturation of structural RNAs and quality control of RNAs during the various stages of the gene expression mechanism. In Archaea, the exosome is composed of up to four different subunits, two with RNase PH domains, aRrp41 and aRrp42, and two with RNAs binding domains, aCsl4 and aRrp4. Three copies of the aRrp4 and/or aCsl4 proteins associate with the hexameric catalytic core of the RNase PH ring and complete the formation of the complex. The PaNip7 protein is a regulating cofactor of the Pyrococcus abyssi archaeal exosome and acts in the inhibition of the enzyme complex by binding simultaneously to the exosome and RNAs. In this project, the reconstitution in vitro of the Pyrococcus abyssi archaeal exosome formed by the PaCsl4 top protein was achieved. To this end protein interaction analyses were performed using affinity chromatography, gel filtration and SDS-PAGE techniques. In addition to the formation of the PaCsl4-exosome isoform, a peptide fragment corresponding to the C-terminal region of PaNip7 was synthesized by solid-phase method, purified by RP-HPLC and the purified peptide was characterized by LC/ESI-MS aiming to perform future binding experiments with the exosome.

Made available in DSpace on 2015-03-05T13:56:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 6 / Hewlett-Packard Brasil Ltda / Um dos mais importantes desafios para a biologia pós-genômica é atender a estrutura e o comportamento das interações moleculares complexas que controlam o comportamento celular. Para tanto é essencial à integração dos dados biológicos referentes a estas interações armazenadas em diversos banco de dados. Este é um problema difícil, pois estes dados estão disponíveis em banco de dados públicos espalhados geograficamente na rede mundial de computadores e cada um destes possui um sistema diferente de gerenciamento, formato ou visão de como representar os dados. Os principais problemas para a realização desta tarefa são:a necessidade de se desenvolver e aplicar parsers para cada banco de dados sem ausência de um vocabulário unificado. Como uma alternativa para facilitar estes problemas, este trabalho propõe a ontologia MONET (Molecular Network Ontology) que tem como objetivo ser um modelo integrado para a rede de redes que existe dentro da celula. Tal visão integrada ajuda a entender as interações de larga escala / One of the most important challenges for biology in the post-genomic is to understand the structure and behavior of the molecular interactions that controls cell behavior. Therefore is essential to integrate biological data concerning these interactions, which are stored in different databases. The integration task is dificult because these data are distributed in public databases on the world wide web and each database has diferent management systems, formats and views of how to represent biological data. The two main problems involved here are the dificulty in parsing the data when dealing with heterogeneous at file formats and the inconsistencies due to the absence of an united vocabulary. As an alternative to facilitate these problems this work proposes MONET (the Molecular Network) ontology, an integration model for the unifying of diferent molecular networks that exist inside the cell. Such integrated view facilitates the understanding of the large-scale interactions responsible for the behavior of

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arielifernandagavioligomes_dissert.pdf: 1557143 bytes, checksum: 898e0714fcf73f6bc8ba53f5719efc71 (MD5) Previous issue date: 2011-12-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Introduction: The Yellow Fever is characterized by severe hepatitis, renal failure, hemorrhage, and rapid terminal events that lead to shock and death. This disease is caused by the infection with the Yellow Fever Virus (YFV), considered the prototype of the Flavivirus genus. Its mechanism of replication is not well known but includes interactions of viral RNA with cellular and viral proteins. The nonstructural protein 5 (NS5) is the largest and most conserved protein of the Flavivirus genus; it encodes RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) domains, besides possessing many important functions during viral replication, such as genic regulation of host cells. The protein hSlu7 is a homologous human protein, which was isolated interacting with the U5 that is involved in the second the step of alternative splicing. The hSlu7 is a predominantly nuclear protein and participates at the alternative splicing, influencing the correct choice of the alternative AGs of exon 3' so that the spliceossome is able to bind and start alternative splicing. Objective: To characterize the interaction of the hSlu7 protein with the YFV-NS5 protein and its cellular localization during viral infection. Material and Method: We confirmed the interaction of various NS5 with human proteins by two-hybrid assays. Deletion mutants were constructed and co-transformed with hSlu7 in yeast to determine the minimal domain of NS5 required for interaction. The cellular localization of the hSlu7 fused with GFP during the response of vaccine strain 17D of YFV in cells Vero E6, marked with anti-NS4AB and anti-NS5 for detection of the infection was also tested. Results: hSlu7 interacts with initial and final portions of the RdRp and the cytoplasmic sublocalization of hSlu7 occurs in the cells infected with YFV. Conclusions: Our results suggest that hSlu7 interacts with the YFV by two-hybrid system and the cellular sublocalization occurs due to the presence of viral infection. Further studies using RNA interference should be addressed to confirm the cellular function of hSlu7 , and to evaluate which alterations that infected and uninfected cells will suffer with low levels of hSlu7. / Introdução: A Febre Amarela é uma doença decorrente da infecção pelo Vírus da Febre Amarela (YFV) que é um protótipo do gênero Flavivirus que provoca uma severa hepatite, falência renal, hemorragia, e eventos que rapidamente levam ao choque e morte do indivíduo. Os mecanismos de replicação genômico do YFV não são bem conhecidos. A proteína não estrutural 5 (NS5) é a maior proteína e a mais conservada dos Flavivirus, ela codifica a RNA polimerase dependente de RNA (RdRp). A hSlu7 é uma proteína celular, predominantemente nuclear, e foi isolada interagindo com a U5 no segundo passo do splicing alternativo. A hSlu7 auxilia na correta seleção dos AGs alternativos do exon 3 para a realização da reação de splicing. Objetivo: Caracterizar a interação de hSlu7 com a proteína NS5 de YFV, quanto a sua localização celular durante a infecção. Material e Método: Pelo sistema duplo-híbrido em leveduras utilizando plasmid-linkage avaliamos a interação de hSlu7 com deleções mutantes da RdRp de YFV, e a localização celular de GFP-hSlu7 durante a replicação da cepa vacinal 17D de YFV em cultura de células Vero E6, marcadas com anticorpos NS4AB e NS5 para detecção da infecção. Resultados: A hSlu7 interage com as porções inicial e final da RdRp, e a sublocalização citoplasmática de hSlu7, ocorre nas células infectadas com YFV. Conclusão: Nossos resultados sugerem que a hSlu7 possui uma sublocalização celular durante a replicação do YFV, além de interagir com a RdRp viral. Ainda será necessária a confirmação da função celular de hSlu7 utilizando RNA de interferência para avaliar quais as alterações que a célula não infectada e infectada sofrerá diante dos níveis baixos de hSlu7.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 anacarolinabterzian_tese.pdf: 3328386 bytes, checksum: 0bae9bd7c5453a781cfbba32fac30196 (MD5) Previous issue date: 2013-11-08 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo / Introduction. Yellow Fever Virus (YFV) causes a hemorrhagic fever and it is the prototype of genus Flavivirus. Kunjin virus (KUNV) is naturally attenuated and is used to develop vaccine candidates against more pathogenic WNV strains. Flavivirus replication is a complex mechanism that involves interaction between viral RNA and cellular and viral proteins. The NS5 protein is the largest and highly conserved viral protein and it is critical for many functions, including replication, RNA capping and virus-host interactions. Once protein-protein interactions present basic importance for the activation, the regulation and the control of diverse enzymatic functions related to these interactions, the identification and the characterization of them are essential for a better comprehension of the pathogenesis and for the rational design of drugs for YFV. Previously, it was identified that the cellular protein p54nrb/NonO interacts with the RNA dependent RNA polymerase domain of YFV NS5. The p54nrb/NonO protein is a nuclear transcription factor associated with nuclear membrane and exhibits multifunction characteristics in nuclear processes in eukaryotic cells, in frequent association with the U1A and PSF proteins. Interaction between NS5 and p54nrb/NonO may influence localization and transport of proteins and viral RNA within the cell. Objective. The purpose of this study was to confirm the interaction between p54nrb/NonO and YFV and KUNV NS5 and determine the role of p54nrb/NonO on viral replication. Material and Method. Co-immunoprecipitation, mass spectrometry and indirect immunofluorescence assays were realized to confirm the interaction and co-localization between the proteins. To determine the effect on viral replication, the p54nrb/NonO and PSF were overexpressed in cellular culture, as well, the silencing of p54nrb/NonO. After, the replication level was determined by Tempo Real PCR, plaque assay, measuring of β-galactosidase and luciferase activity assays. Results. Immunofluorescence assays showed co-localization of p54nrb/NonO with YFV NS4 in the perinuclar region and with NS5 in the nucleus. In contrast, KUNV NS5 co-localized with p54nrb/NonO in the perinuclear region and co-precipitated with p54nrb/NonO. The co-precipitation between p54nrb/NonO and NS5 YFV was not identified. Again, it was identified by mass spectrometry analysis the co-precipitation of p54nrb/NonO by monoclonal antibodies to KUNV NS5 protein. The p54nrb/NonO overexpression did not affect the YFV and KUNV replication, however, PSF overexpression showed inhibitory effect on viral replication. The RNA interference assays were inconclusive about the role of p54nrb/NonO silencing on YFV replication. Conclusion. p54nrb/NonO and KUNV NS5 interact physically and co-localize in the cytoplasm, while, the co-localization with YFV NS5 occcurs in the nucleus, although, there is no physical interaction between them. However, the overexpression of p54nrb/NonO does not affect the viral replication. PSF was confirmed as an interactive partern of p54nrb/NonO and, when it is overexpressed, it inhibits YFV and KUNV replication. / Introdução. O vírus da Febre Amarela (YFV) causa febre hemorrágica e é o protótipo do gênero Flavivirus. O vírus Kunjin (KUNV) é naturalmente atenuado e usado para o desenvolvimento de candidatos vacinais contra linhagens mais patogênicas do WNV. A replicação do Flavivirus é um mecanismo complexo que envolve interações entre o RNA viral e proteínas virais e celulares. A NS5 é a maior e mais conservada proteína viral e é crítica para muitas funções, incluindo replicação, capeamento do RNA e interação vírus-hospedeiro. Como interações proteicas são de fundamental importância para ativação, regulação e controle de diversas funções enzimáticas a elas relacionadas, fica clara a relevância da identificação e caracterização das interações participantes desse processo para uma melhor compreensão da patogênese e para o desenho racional de drogas para a febre amarela. Foi identificado previamente que a proteína celular p54nrb/NonO interage com o domínio RNA polimerase RNA dependente de NS5 de YFV. p54nrb/NonO é um fator de transcrição nuclear associada a membrana nuclear e apresenta características multifuncionais nos processos celulares em células eucariotas, ocorrendo frequentemente em associação com as proteínas U1A e PSF. Dessa forma, a interação entre p54nrb/NonO e NS5 pode influenciar a localização, transporte das proteínas e do RNA viral dentro da célula. Objetivo. O objetivo deste estudo foi confirmar a interação entre p54nrb/NonO e NS5 de YFV e KUNV, e determinar o efeito da interação sobre a replicação viral. Materiais e Métodos. Para tanto, experimentos de co-imunoprecipitação, espectrometria de massa e imunofluorescência indireta foram realizados para confirmar a interação e a co-localização entre as proteínas. Para determinar o efeito sobre a replicação viral, foi realizado, em cultura celular, a superexpressão p54nrb/NonO e PSF, bem como, o silenciamento de p54nrb/NonO. Posteriormente, a taxa de replicação viral foi determinada por técnicas de qPCR, ensaio de placa, mensuração da atividade de β-galactosidase e luciferase. Resultados. O ensaio de imunofluorescência mostrou co-localização entre p54nrb/NonO e NS4 de YFV na região perinuclear e com NS5 no núcleo. Em contraste, NS5 de KUN co-localizou com p54nrb/NonO na região perinuclear, e da mesma forma, NS5 de KUNV foi identificado co-precipitando p54nrb/NonO. Não foi identificada a co-precipitação entre p54nrb/NonO e NS5 de YFV. Novamente, p54nrb/NonO foi identificada co-precipitando com NS5 de KUNV pela análise por espectrometria de massa com o uso de anticorpo monoclonal para a proteína NS5 de KUNV. A superexpressão de p54nrb/NonO não mostrou afetar a replicação de YFV e KUNV, entretanto, a superexpressão de PSF mostrou efeito inibitório sobre a replicação viral. Os estudos com interferência de RNA, contudo, foram inconclusivos sobre o efeito do silenciamento de p54nrb/NonO sobre a replicação de YFV. Conclusão. p54nrb/NonO e NS5 de KUNV interagem fisicamente e co-localizam no citoplasma, enquanto que, a co-localização com NS5 de YFV ocorre no núcleo, embora não ocorra interação física. Entretanto, a superexpressão de p54nrb/NonO não afeta a replicação viral. PSF foi confirmada como parceira interativa de p54nrb/NonO e, quando superexpressa, inibe a replicação de YFV e KUNV.