Orientador: Jörg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T01:34:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_MarcosTadeudos_D.pdf: 15943486 bytes, checksum: 39810fdf0ace76e5e8963354bdc460ca (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O objetivo deste projeto foi estudar genes ativados em células do estroma da medula óssea, induzidos pela co-cultura com blastos leucêmicos, na tentativa de uma melhor compreensão sobre o crostalk entre estas células no microambiente tumoral. Nós identificamos Stanniocalcina-1 (STC1) como um potencial marcador molecular do microambiente tumoral, uma vez que sua expressão foi aumentada cerca de 7 vezes em células do estroma co-cultivadas com blastos leucêmicos primários. STC1 humana é uma glicoproteína secretada e tem sido descrita participando em diferentes processos fisiológicos, incluindo a angiogênese, hipóxia e principalmente, a carcinogênese. Nós produzimos a proteína recombinante STC1 no sistema baculovírus e também anticorpos monoclonais, usados em um ensaio ELISA, que agora será testado como um novo kit de diagnóstico de leucemia por uma empresa brasileira. Além disso, identificamos novos parceiros de interação para STC1 através do sistema de duplo hibrido em levedura sendo que algumas destas interações foram confirmadas por GST-pull down. A região Nterminal foi identificada como sendo a região responsável pela interação de STC1 com seus parceiros. Estudos de localização sub-celular por microscopia, revelaram uma deposição ubíqua citoplasmática e puntiforme nuclear, lembrando corpúsculos nucleares relacionados a SUMOilação. Embora STC1 interaja com a proteína SUMO1 e tenha uma predição de alta probabilidade para ser SUMOilada, ensaios in vitro e in vivo não conseguiram detectar STC1 SUMOilada. No entanto, observamos que STC1 regula a SUMOilação de forma significativa em três outras proteínas. Essas descobertas sugerem um novo papel para STC1 no ciclo de SUMOilação, agindo como uma SUMO E3 ligase. Observamos também que STC1 possui um receptor na membrana plasmática em linhagem de células leucêmicas K562 e que a incubação de STC1 com outras células leucêmicas parece favorecer a proliferação destas células ao passo que estimula uma maior produção da própria STC1 intracelular em células do estroma. Juntos, todos estes resultados abrem novas pistas promissoras a serem exploradas no futuro, uma vez que todos os resultados mostram ligações interessantes com estudos funcionais anteriores em STC1 / Abstract: The aims of this project is to study upregulated genes on bone marrow stromal cells, induced by the co-culture with leukemic blasts, trying to have a better understand about the crosstalk between these cells in the tumor microenvironment. We identified Stanniocalcin-1 (STC1) as a putative molecular marker for the leukemic microenvironment, once its expression was increased around 7 times in stromal cells co-cultivated with primary leukemic blasts. Human STC1 is a secreted glycoprotein that has been implicated in different physiological process, including angiogenesis, hypoxia and mainly in carcinogenesis. We produced the recombinant protein STC1 in baculovirus system and monoclonal antibodies for an ELISA assay that now will be tested as a new leukemia diagnostic kit by a Brazilian company. Moreover, we identified new interacting protein partners for STC1 by yeast two hybrid system and some of these interactions were confirmed by GST-pull down assays. The N-terminal region was mapped to be the region that mediates the interaction between STC1 and its partners. Microscopic subcellular localization, revealed an ubiquitous cytoplasmic and dot-like nuclear deposition, resembling SUMOylation related nuclear bodies. Although STC1 interacts with SUMO-1 and has a high theoretical prediction score for a SUMOylation site, in vitro and in vivo assays could not detect STC1 SUMOylation. However, we found that STC1 significantly regulates the SUMOylation of three other proteins. These ??ndings suggest a new role for STC1 in SUMOylation cycle, acting as a SUMO E3 ligase. We either observe that STC1 has a plasmatic membrane receptor in K562 leukemic cell lines and the incubation of STC1 with other leukemic cells suggest a increase of proliferation of these cells and stimulates the production of more intracellular STC1 at stromal cells. Together, all of these findings open promising new avenues to be explored in future detailed studies, since they all show interesting connections with previous functional studies on STC1 / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Antonio Carlos Boschiero, Alex Rafacho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T10:53:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Purificacao_ThaisAlmeida_M.pdf: 1255549 bytes, checksum: 5142cacf6ca932aa0dd1a86b9eef5074 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Administração de glicocorticóides em roedores e humanos aumenta a resistência à insulina (RI). A RI, provocada por dexametasona, leva a hiperinsulinemia por aumento da secreção do hormônio pelas ilhotas pancreáticas. Recentemente, demonstrou-se que a AS160, uma GAP (proteína ativadora de GTPase), participa no tráfego de vesículas em diferentes tipos celulares que, por sua vez, pode ser alterado por dexametasona. Neste trabalho, avaliamos possível participação da AS160 na secreção de insulina em ilhotas de ratos RI por dexametasona, para isto foram avaliadas proteínas envolvidas no processo de secreção; pAS160, Akt e AMPK. Ratos Wistar adultos foram tratados com o glicocorticóide (DEX) com 1mg/kg (ip) de peso corporal, ou salina (CTL), durante 5 dias. Ao final do período de tratamento, os ratos foram submetidos a um Teste de Tolerância à Glicose intraperitoneal (ipGTT) e, após sacrifício, amostras de sangue foram coletadas para dosagem de insulina. As ilhotas pancreáticas foram isoladas por digestão do pâncreas com colagenase. As proteínas insulares foram avaliadas por Western Blot e os genes por RCP-TR. A insulina, contida nas amostras de sangue e nas incubações de ilhotas, foi medida por radioimunoensaio (RIA). A razão pAS160/AS160 foi aumentada nas ilhotas DEX (P<0,05). Nestas ilhotas, resultados semelhantes foram observados para a razão pAkt/Akt (P<0,05). O tratamento com DEX também aumentou a expressão gênica e protéica da Rab27A (P<0,05), contudo, reduziu significativamente sua associação com a AS160 (P<0,05). A associação entre essas duas proteínas foi observada pela primeira vez nas ilhotas neste trabalho. O tratamento com DEX também reduziu as expressões gênica e protéica bem como a fosforilação da AMPK. A secreção de insulina foi maior nas ilhotas DEX comparado à CTL e, em ambas, a secreção foi diminuída pela wortmanina (inibidor da PI3K). Ilhotas de ratos CTL e DEX, tratados com anti-sense anti-AS160, tiveram o conteúdo protéico da AS160 reduzido em ± 80%, comparado ao CTL (P<0,05). Nas ilhotas de ratos CTL knockdown, a secreção de insulina foi maior que nos CTL e, nas ilhotas dos DEX knockdown a secreção foi semelhante às DEX. Concluindo, o aumento da secreção de insulina em ilhotas de ratos RI por dexametasona envolve a participação da AS160 e, essa potencialização parece ser mediada pela via PI3K/Akt. Esse aumento de secreção parece também ser diretamente proporcional ao aumento da dissociação entre a Rab27A e a AS160 / Abstract: It is well known that glucocorticoids induce insulin resistance (IR). It is also known that dexamethasone-induced IR is linked to increased levels of plasma insulin due to higher insulin secretion by pancreatic islets. Recent findings show that the Rab-GTPase AS160 plays a role in the traffic of vesicles in different cells type that, in turn, may be affected by dexamethasone. Here, we evaluated the participation of AS160 in the insulin secretion in islets from dexamethasone treated rats. Adult rats were treated with dexamethasone (DEX) with 1.0 mg/kg, body weight (ip) or saline (CTL) for 5 consecutive days. Insulin resistance was evaluated by intraperitoneal Glucose Tolerance Test (ipGTT). After, the rats were sacrificed and the islets isolated by the digestion of their pancreases with collagenase. Protein was measured by Western- Blot, and insulin by RIA. AS160 expression, phosphorylation, and the pAS160/AS160 ratio were increased in DEX islets (P<0.05). Similar results were observed for Akt (P<0.05). Dexamethasone also increased Rab27a protein and gene expression but significantly reduced its association with AS160. The association between these two proteins was observed in pancreatic islets for the first time in this work. AMPK gene and protein expression as well as phosphorylation were reduced by Dexamethasone (P<0.05). The insulin secretion was higher in DEX compared with CTL islets (P<0.05). Both secretions were reduced by wortmanin. Islets from CTL and DEX rats, treated with anti-sense anti-AS160, showed ± 80% reduction on its expression. The CTL knockdown islets secreted more insulin than CTL and the DEX knockdown secreted similar amount of insulin than DEX islets. In conclusion, these results indicated that AS160 participates in the increased insulin secretion in islets from DEX rats, and this effect seems to be dependent on the activation of the PI3K/Akt pathway. The increase in insulin secretion also depends on the dissociation between Rab27a and AS160 / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_ana_albano.pdf: 1506402 bytes, checksum: 95dde41b6fa23dd1ab15dcbaaea21132 (MD5) Previous issue date: 2012-12-12 / The paracoccidioidomycosis (PCM) is one of the most important systemic mycoses in Latin America, especially in Brazil. Although the Rio Grande do Sul is considered endemic area of the disease, there are few studies on the ecology of Paracoccidioides brasiliensis in the state. In this sense, the study aimed to detect infection by P. brasiliensis in animals using them as sentinels for detection of the agent in the region. Serology was performed by the techniques of double radial immunodiffusion in agar gel (AGID) and ELISA for detection of anti-gp43 of P. brasiliensis in wild animals served by Núcleo de Reabilitação da Fauna Silvestre UFPel, and horses from different stables in the region of Bagé. Serology was performed in 128 wild animals, and about 20% of these were positive on ELISA. The presence of anti-gp43 was detected in animals from the mesoregion of Southeast Riograndense and Metropolitan of Porto Alegre. There was no significant difference in seropositivity with respect to gender, age, order and habits of animals (p> 0.05), however seropositivity differed between the conjugates used (p <0.001). The study regarding horses included 200 animals from different places, which 12% had antigp43 antibodies in ELISA, with rates ranging from 0 to 30% according to the place of origin (p <0.001). Neither the wild animals nor equines were positive by immunodiffusion. The results indicate the presence of the fungus P. brasiliensis in different mesoregions of Rio Grande do Sul. / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma das micoses sistêmicas mais importantes da América Latina com destaque no Brasil. Embora o Rio Grande do Sul seja considerado como área endêmica da doença, existem poucos estudos a respeito da ecologia do Paracoccidioides brasiliensis no estado. Neste sentido, o estudo objetivou detectar a infecção por P. brasiliensis em animais, utilizando-os como sentinelas da presença do agente na região. Para tal foi realizada sorologia a partir das técnicas de imunodifusão radial dupla em gel de Ágar (IDGA) e ELISA indireto utilizando distintos conjugados para detecção de anticorpos anti-gp43 do P. brasiliensis em animais silvestres atendidos pelo Núcleo de Reabilitação da Fauna Silvestre da UFPel, e em equinos de distintos haras da região de Bagé. A sorologia foi realizada em 128 animais silvestres, e cerca de 20% destes foram soropositivos no ELISA. A presença de anticorpos anti-gp43 foi detectada em animais oriundos das mesorregiões do sudeste rio-grandense e metropolitana de Porto Alegre. Não foi encontrada diferença significativa de soropositividade considerando gênero, idade, ordem e hábito dos animais (p>0,05), no entanto a soropositividade diferiu entre os conjugados utilizados (p<0,001). O estudo referente aos equinos incluiu 200 animais provenientes de distintos haras, dos quais 12% apresentavam anticorpos anti-gp43 no teste de ELISA, com taxas variando de 0 a 30% de acordo com o local de origem (p<0,001). Tanto no estudo com animais silvestres quanto no estudo com equinos não foi encontrado nenhum animal positivo pela técnica de imunodifusão. Os resultados indicam a presença do fungo P. brasiliensis em distintas mesorregiões do Rio Grande do Sul.

Orientador: Carlos Henrique Inácio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-26T13:20:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Murakami_LeticiaMariaZanphorlin_D.pdf: 5383539 bytes, checksum: 1a45d203e6e3c5a992791b8ce893aa36 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Chaperonas moleculares e proteínas de choque térmico (Heat shock protein, Hsp) atuam contra a agregação e o enovelamento incorreto de proteínas, que são os agentes causais de doenças neurodegenerativas, como por exemplo, Alzheimer e Parkinson. A Hsp90 é uma das mais importantes chaperonas moleculares, considerada essencial para a viabilidade celular em eucariotos, pois está associada com a maturação de proteínas atuantes na sinalização e ciclo celular. Além disso, foi demonstrado que a Hsp90 está envolvida na estabilização do fenótipo tumoral de diversos tipos de câncer, destacando a sua importância biomédica. A interação com co-chaperonas, proteínas auxiliares das chaperonas, permite que a Hsp90 atue como uma proteína "hub", ou seja, um ponto central de regulação de diversas proteínas. Muitas dessas co-chaperonas possuem um ou mais domínios do tipo TPR (do inglês, tetratricopeptide repeat) que interagem com o C-terminal da Hsp90. No presente projeto de doutorado, investigamos as características estruturais e termodinâmicas da interação entre o domínio C-terminal da Hsp90 (C-Hsp90) e a co-chaperona TPR Tom70 humana, utilizando técnicas de reação-cruzada acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS), calorimetria de titulação isotérmica (ITC), espalhamento de raios-X à baixos ângulos (SAXS) e modelagem molecular. Os resultados de LC-MS/MS e ITC evidenciaram novas regiões na interação do complexo C-Hsp90/Tom70 que envolve a hélice A7 presente na Tom70 e experimentos de SAXS revelaram a estrutura em baixa resolução das proteínas C-Hsp90, Tom70 e do complexo C-Hsp90/Tom70. Além disso, investigamos o efeito do celastrol, um composto com potencial atividade anti-câncer, na conformação e na função da Hsp90. Na presença do composto, a Hsp90 sofre um processo de oligomerização e a natureza dos oligômeros foi determinada por ferramentas bioquímicas e biofísicas, tais como espalhamento dinâmico de luz (DLS), cromatografia de exclusão molecular analítica acoplada a espalhamento de luz em multiângulos (SEC-MALS) e eletroforese em gel nativo. Interessantemente, a oligomerização induzida pelo celastrol não afetou a atividade de proteção da Hsp90 contra a agregação protéica e a capacidade de ligação as co-chaperonas com enovelamento tipo TPR. Este é o primeiro trabalho a apontar um possível mecanismo para a ação do celastrol sobre a Hsp90. Coletivamente, nossos resultados e descobertas contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares relacionados à interação entre chaperonas e co-chaperonas, bem como, chaperonas e potenciais ligantes. / Abstract: Molecular chaperones and heat shock proteins (Hsp) act against protein aggregation and misfolding, which are the causal agents of neurodegenerative diseases such as Alzheimer and Parkinson. Hsp90 is one of the most important molecular chaperones, considered essential for cell viability in eukaryotes, since it is associated with the maturation of proteins involved in cell cycle and signaling. In addition, it was demonstrated that Hsp90 is implicated in the stabilization of the tumor phenotype of various types of cancer, highlighting its biomedical importance. The interaction with co-chaperones, auxiliary proteins of chaperones, allows that Hsp90 acts as a hub, being a central point for regulation of several other proteins. Many of these co-chaperones have one or more TPR domains that interact with the C-terminus of Hsp90. In this PhD project, we investigated structural and thermodynamic characteristics of the interaction between the C-terminus domain of Hsp90 (C-Hsp90) and the TPR co-chaperone human Tom70, using techniques of cross-linking coupled with mass spectrometry (LC-MS/MS), isothermal titration calorimetry (ITC), small angle X-ray scattering (SAXS) and molecular modeling. The results of LC-MS/MS and ITC revealed new regions involved in the interaction of the C-Hsp90 with Tom70, which encompasses the A7 helix from Tom70, and SAXS experiments unveiled the low resolution structure of the proteins C-Hsp90, Tom70 and the C-Hsp90/Tom70 complex. In addition, we investigated the effect of celastrol, a compound with a potential anti-cancer activity, on the conformation and function of Hsp90. In the presence of celastrol, Hsp90 undergoes oligomerization and the nature of the oligomers was determined by biochemical and biophysical tools such as dynamic light scattering (DLS), size-exclusion chromatography coupled to multi-angle light scattering (SEC-MALS) and native gel electrophoresis. Interestingly, the celastrol-induced oligomerization did not affect the protective activities of Hsp90 against protein aggregation or the capacity to bind TPR co-chaperones. This is the first study to point out a possible mechanism for the action of celastrol on Hsp90. Collectively, our findings contribute to a better understanding of the molecular mechanisms associated to the interaction between chaperones and co-chaperones, as well as chaperones and potential ligands / Doutorado / Quimica Organica / Doutora em Ciências

A extração de Interações Proteína-Proteína (IPPs) a partir de texto é um problema relevante na área biomédica e um desafio na área de aprendizado de máquina. Na área biomédica, as IPPs são fundamentais para compreender o funcionamento dos seres vivos. No entanto, o número de artigos relacionados com IPPs está aumentando rapidamente, sendo impraticável identicá-las e catalogá-las manualmente. Por exemplo, no caso das IPPs humanas apenas 10% foram catalogadas. Por outro lado, em aprendizado de máquina, métodos baseados em kernels são frequentemente empregados para extrair automaticamente IPPs, atingindo resultados considerados estado da arte. Esses métodos usam informações léxicas, sintáticas ou semânticas como características. Entretanto, os resultados ainda são insuficientes, atingindo uma taxa relativamente baixa, em termos da medida F, devido à complexidade do problema. Apesar dos esforços em produzir kernels, cada vez mais sofisticados, usando árvores sintáticas como árvores constituintes ou de dependência, pouco é conhecido sobre o desempenho de outras abordagens de aprendizado de máquina como, por exemplo, as redes bayesianas. As àrvores constituintes são estruturas de grafos que contêm informação importante da gramática subjacente as sentenças de textos contendo IPPs. Por outro lado, a rede bayesiana permite modelar algumas regras da gramática e atribuir para elas uma distribuição de probabilidade de acordo com as sentenças de treinamento. Neste trabalho de mestrado propõe-se um método para construção automática de redes bayesianas a partir de árvores contituintes para extração de IPPs. O método foi testado em cinco corpora padrões da extração de IPPs, atingindo resultados competitivos, em alguns casos melhores, em comparação a métodos do estado da arte / Extracting Protein-Protein Interactions (PPIs) from text is a relevant problem in the biomedical field and a challenge in the area of machine learning. In the biomedical field, the PPIs are fundamental to understand the functioning of living organisms. However, the number of articles related to PPIs is increasing rapidly, hence it is impractical to identify and catalog them manually. For example, in the case of human PPIs only 10 % have been cataloged. On the other hand, machine learning methods based on kernels are often employed to automatically extract PPIs, achieving state of the art results. These methods use lexical, syntactic and semantic information as features. However, the results are still poor, reaching a relatively low rate of F-measure due to the complexity of the problem. Despite efforts to produce sophisticate kernels, using syntactic trees as constituent or dependency trees, little is known about the performance of other Machine Learning approaches, eg, Bayesian networks. Constituent tree structures are graphs which contain important information of the underlying grammar in sentences containing PPIs. On the other hand, the Bayesian network allows modeling some rules of grammar and assign to them a probability distribution according to the training sentences. In this master thesis we propose a method for automatic construction of Bayesian networks from constituent trees for extracting PPIs. The method was tested in five corpora, considered benchmark of extraction of PPI, achieving competitive results, and in some cases better results when compared to state of the art methods

Doenças complexas são caracterizadas por serem poligênicas e multifatoriais, o que representa um desafio em relação à busca de genes relacionados a elas. Com o advento das tecnologias de sequenciamento em larga escala do genoma e das medições de expressão gênica (transcritoma), bem como o conhecimento de interações proteína-proteína, doenças complexas têm sido sistematicamente investigadas. Particularmente, baseando-se no paradigma Network Medicine, as redes de interação proteína-proteína (PPI -- Protein-Protein Interaction) têm sido utilizadas para priorizar genes relacionados às doenças complexas segundo suas características topológicas. Entretanto, as redes PPI são afetadas pelo viés da literatura, em que as proteínas mais estudadas tendem a ter mais conexões, degradando a qualidade dos resultados. Adicionalmente, métodos que utilizam somente redes PPI fornecem apenas resultados estáticos e não-específicos, uma vez que as topologias destas redes não são específicas de uma determinada doença. Neste trabalho, desenvolvemos uma metodologia para priorizar genes e vias biológicas relacionados à uma dada doença complexa, através de uma abordagem integrativa de dados de redes PPI, transcritômica e genômica, visando aumentar a replicabilidade dos diferentes estudos e a descoberta de novos genes associados à doença. Após a integração das redes PPI com dados de expressão gênica, aplicamos as hipóteses da Network Medicine à rede resultante para conectar genes sementes (relacionados à doença, definidos a partir de estudos de associação) através de caminhos mínimos que possuam maior co-expressão entre seus genes. Dados de expressão em duas condições (controle e doença) são usados separadamente para obter duas redes, em que cada nó (gene) dessas redes é pontuado segundo fatores topológicos e de co-expressão. Baseado nesta pontuação, desenvolvemos dois escores de ranqueamento: um que prioriza genes com maior alteração entre suas pontuações em cada condição, e outro que privilegia genes com a maior soma destas pontuações. A aplicação do método a três estudos envolvendo dados de expressão de esquizofrenia recuperou com sucesso genes diferencialmente co-expressos em duas condições, e ao mesmo tempo evitou o viés da literatura. Além disso, houve uma melhoria substancial na replicação dos resultados pelo método aplicado aos três estudos, que por métodos convencionais não alcançavam replicabilidade satisfatória. / Complex diseases are characterized as being poligenic and multifactorial, so this poses a challenge regarding the search for genes related to them. With the advent of high-throughput technologies for genome sequencing and gene expression measurements (transcriptome), as well as the knowledge of protein-protein interactions, complex diseases have been sistematically investigated. Particularly, Protein-Protein Interaction (PPI) networks have been used to prioritize genes related to complex diseases according to its topological features. However, PPI networks are affected by ascertainment bias, in which the most studied proteins tend to have more connections, degrading the quality of the results. Additionally, methods using only PPI networks can provide just static and non-specific results, since the topologies of these networks are not specific of a given disease. In this work, we developed a methodology to prioritize genes and biological pathways related to a given complex disease, through an approach that integrates data from PPI networks, transcriptomics and genomics, aiming to increase replicability of different studies and to discover new genes associated to the disease. The methodology integrates PPI network and gene expression data, and then applies the Network Medicine Hypotheses to the resulting network in order to connect seed genes (obtained from association studies) through shortest paths possessing larger coexpression among their genes. Gene expression data in two conditions (control and disease) are used to obtain two networks, where each node (gene) in these networks is rated according to topological and coexpression aspects. Based on this rating, we developed two ranking scores: one that prioritizes genes with the largest alteration between their ratings in each condition, and another that favors genes with the greatest sum of these scores. The application of this method to three studies involving schizophrenia expression data successfully recovered differentially co-expressed gene in two conditions, while avoiding the ascertainment bias. Furthermore, when applied to the three studies, the method achieved a substantial improvement in replication of results, while other conventional methods did not reach a satisfactory replicability.

O Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade (TDAH) é a doença do neurodesenvolvimento mais comum na infância, afetando cerca de 5,8% de crianças e adolescentes no mundo. Muitos estudos vêm tentando investigar a suscetibilidade genética em TDAH, mas sem muito sucesso. Este estudo teve como objetivo analisar variantes raras e comuns contribuindo para a arquitetura genética do TDAH. Foram gerados os primeiros dados de exoma de TDAH de 30 trios brasileiros em que o filho foi diagnosticado com TDAH esporádico. Foram analisados tanto variações de único nucleotídeo (ou SNVs, single-nucleotide variants) quanto variações de número de cópias (ou CNVs, copy-number variants), tanto nesses trios quanto em outros conjuntos de dados, incluindo uma amostra brasileira de 503 crianças/adolescentes controles, bem como resultados previamente publicados em quatro estudos com variação de número de cópias e uma meta-análise de estudos de associação ao longo do genoma. Tanto os trios quanto os controles fazem parte da Coorte de Escolares de Alto Risco para o desenvolvimento de Psicopatologia e Resiliência na Infância do Instituto Nacional de Psiquiatria do Desenvolvimento (INPD). Os resultados de trios brasileiros mostraram três padrões marcantes: casos com variações herdadas e somente SNVs de novo ou CNVs de novo, e casos somente com variações herdadas. Embora o tamanho amostral seja pequeno, pudemos ver que diferentes comorbidades são mais frequentes em casos somente com variações herdadas. Após explorarmos a composição de variações nos probandos brasileiros, foram selecionados genes recorrentes entre amostras do nosso estudo ou em bancos de dados públicos. Além disso, usando somente genes expressos no cérebro (amostras pós-mortem dos projetos Brain Atlas e Genotype-Tissue Expression), construímos uma rede de interação proteína-proteína \"in silico\" com interações físicas confirmadas por pelo menos duas fontes. Análises topológicas e funcionais dos genes da rede mostraram genes relacionados a sinapse, adesão celular, vias glutamatérgicas e serotonérgicas, o que confirma achados de trabalhos independentes na literatura indicando ainda novos genes e variantes genéticas nessas vias. / Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder (ADHD) is the most common neuro-developmental disorder in children, affecting 5.8% of children and adolescents in the world. Many studies have attempted to investigate the genetic susceptibility of ADHD without much success. The present study aimed to analyze rare and common variants contributing to the genetic architecture of ADHD. We generated exome data from 30 Brazilian trios where the children were diagnosed with sporadic ADHD. We analyzed both single-nucleotide variants (SNVs) and copy-number variants (CNVs) in these trios and across multiple datasets, including a Brazilian sample of 503 children/adolescent controls from the High Risk Cohort Study for the Development of Childhood Psychiatric Disorders, and also previously published results of four CNV studies of ADHD involving children/adolescent Caucasian samples. The results from the Brazilian trios showed 3 major patterns: cases with inherited variations and de novo SNVs or de novo CNVs and cases with only inherited variations. Although the sample size is small, we could see that various comorbidities are more frequent in cases with only inherited variants. After exploring the rare variant composition in our 30 cases we selected genes with variations (SNVs or located in CNV regions) in our trio analysis that are recurrent in the families analyzed or in public data sets. Moreover, using only genes expressed in brain (post-mortem samples from Brain Atlas and The Genotype-Tissue Expression project), we constructed an in silico protein-protein interaction (PPI) network, with physical interactions confirmed by at least two sources. Topological and functional analyses of genes in this network uncovered genes related to synapse, cell adhesion, glutamatergic and serotoninergic pathways, both confirming findings of previous studies and capturing new genes and genetic variants in these pathways.

[EN] Previous results obtained in the research group where this thesis has been performed shown that the MNSV uses the cellular secretory pathway, through its membrane protein DGBp2 (p7B) to reach the cell periphery. Knowledge about signals/motifs of membrane proteins that facilitate or permit such transport was then rather scarce. In this work we determined the residues involved in the transport of a viral transmembrane protein through the early secretory pathway (DGBp2, MNSV p7B). The residues involved are located in both the Nt (cytosolic) and Ct region (luminal) being one of the first examples in plants of a luminal ER export signal. With this information we have proposed a model in which after insertion and correct folding of the protein in the ER membrane, the luminal Ct of p7B interacts through the K49 residue with a transmembrane adapter associated with the actin cytoskeleton for movement and concentration in the RE-cortical. Nt cytoplasmic seems to be necessary to associate with the COPII vesicle components. Moreover, we have deepened in the study of the interactome of the carmovirus MPs and we have identified through a two-hybrid assay (Y2H), three cellular proteins capable of interacting with three DGBp1 from three different carmovirus (MNSV, TCV and CarMV). These cellular factors are the 60S ribosomal protein P3 (RPP3A), the g subunit of the translation initiation factor 3 (eIF3g) and the transcription factor WRKY36. These interactions were confirmed by BiFC. Furthermore, mutagenesis assays showed that binding domain of these DGBp1 is a FNF conserved domain at the very Ct end. The fact that these three proteins interact with the same host factors suggest a possible mechanism common to most if not all carmoviruses. The unstructured Nt region of MNSV CP, as for other RNA viruses, generally is responsible for viral RNA binding so it is usually called R domain. By using substitution and deletion mutants, we have shown that this R domain (which in MNSV comprising the first 94 residues) is not involved only in the packaging and binding of the viral genome, but is also responsible of CP multifunctionality. By EMSA assays with deletion mutants we could determine that the R domain was essential for binding of RNA. It was further noted that within the R domain there was a conserved region between aa 60 to 91 region, which appears to play a role in both the genomic RNA binding and in vitro encapsidation of subgenomic RNAs. However, in packaging assays, it was observed that the R domain is essential for full genome encapsidation and that the region between residue 31 and 91 is required for both cell to cell and systemic movement. Finally, using PVX as an expression vector, we showed that MNSV CP can act as a suppressor of silencing most likely by sequestering sRNAs. With very few exceptions, plant viruses use the phloem to move from infection sites to distal parts of the plant. In order to know the phloem proteome of infected plants and to identify in the future potential host proteins that facilitate or hinder the systemic transport of viruses, in the last chapter we conducted a comparative proteomic analysis by 2D-DIGE between phloem of MNSV-infected and healthy melon plants. From a total of 1046 spots, 25 were detected having significant abundance changes between the two conditions. After mass spectrometric analysis, 22 spots corresponding to 19 protein, were identified (13 of which were overrepresented and 9 had decreased abundance). Many of the identified proteins were involved in cell death and control of redox homeostasis. Two of these 19 proteins were never described in phloem proteomic assays. / [ES] Resultados previos obtenidos en el grupo de investigación donde se ha realizado la presente Tesis habían puesto de manifiesto que el MNSV utiliza la ruta de secreción celular, a través de su proteína de membrana DGBp2 (p7B), para alcanzar la periferia celular. Hasta el momento de realizar la presente Tesis los conocimientos sobre las señales/motivos de las proteínas de membrana que facilitan o permiten dicho transporte eran más bien escasos. En este trabajo hemos determinado los residuos implicados en la salida de una proteína transmembrana viral en la ruta de secreción temprana (DGBp2, p7B MNSV). Los residuos implicados se encuentran tanto en la región Nt (citosólica) como en la Ct (luminal) siendo éste uno de los primeros ejemplos descritos en plantas de señal luminal de salida de RE. Con todos estos datos se ha propuesto un modelo en el que después de la inserción y correcto plegamiento de la proteína en la membrana del RE, el Ct luminal de p7B interacciona a través del residuo K49 con un adaptador transmembrana asociado al citoesqueleto de actina para su movimiento y concentración en el RE cortical. El motivo Nt citoplasmático sería necesario para el ensamblaje de la vesícula COPII. Por otra parte se ha profundizado en el estudio del interactoma de las MPs de los carmovirus y se han identificado, mediante un ensayo de doble híbrido (Y2H), tres proteínas celulares capaces de interaccionar con tres DGBp1 procedentes de tres carmovirus diferentes (MNSV, TCV y CarMV). Estos factores celulares son la proteína P3 del ribosoma 60S (RPP3A), la subunidad g del factor de iniciación de la traducción 3 (eIF3g) y el factor de transcripción WRKY36. Estas interacciones fueron confirmadas por BiFC. Además, mediante ensayos de mutagénesis se demostró que el dominio de unión de estas DGBp1 es un dominio Ct (FNF) conservado. El hecho de que estas tres proteínas interaccionen con los mismos factores sugiere un posible mecanismo común para todos o la mayor parte de los carmovirus. Las CPs virales constituyen el paradigma de la multifuncionalidad proteica y, además de su obvio papel estructural, intervienen en un gran número de procesos del ciclo viral, incluyendo el transporte del RNA viral. La región Nt desestructurada de la CP del MNSV, al igual que para otros virus de RNA, generalmente es la encargada de unir el RNA viral por lo que se le suele llamar dominio R. Mediante mutantes de deleción y sustitución se ha demostrado que este dominio R (que en el MNSV comprende los primeros 94 residuos) no interviene solo en la encapsidación y unión del genoma viral, sino que es la responsable de la multifuncionalidad de la CP. Mediante EMSAs con mutantes de deleción se pudo determinar que la región R es esencial para la unión del RNA. Además se observó que dentro del dominio R se encuentra una región conservada entre los aa 60 al 91, que parece desempeñar un papel tanto en la unión de RNA genómico in vitro como en la encapsidación de RNAs subgenómicos. Sin embargo, en ensayos de encapsidación se observó que todo el dominio R es esencial para la encapsidación del genoma completo y que la región comprendida entre el residuo 31 y el 91 es necesaria para el movimiento tanto célula a célula como sistémico. Finalmente, utilizando PVX como vector de expresión, se demostró que la CP del MNSV puede actuar como un supresor del silenciamiento mediante la unión a los sRNAs. Con objeto de conocer el proteoma del floema de plantas infectadas y poder en el futuro identificar posibles proteínas del huésped que faciliten o dificulten el transporte sistémico de los virus, en el último capítulo se llevó a cabo un análisis proteómico comparativo, mediante 2D-DIGE, entre floemas de plantas de melón infectadas con MNSV y plantas sanas. Se detectaron 1046 spots de los cuales 2 poseían cambios significativos entre las dos condiciones Dos de estas 19 proteínas no habían sido descritas previamente en ens / [CAT] Resultats previs obtinguts en el grup de recerca on s'ha realitzat la present Tesi havien posat de manifest que el MNSV utilitza la ruta de secreció cel·lular, a través de la seva proteïna de membrana DGBp2 (p7B), per arribar-hi a la perifèria cel·lular. Fins al moment de realitzar la present Tesi els coneixements sobre els senyals/motius de les proteïnes de membrana que faciliten o permeten aquest transport eren més aviat escassos. En aquest treball hem determinat els residus implicats en el transport d'una proteïna transmembrana viral a través de la ruta de secreció primerenca (DGBp2, p7B MNSV). Els residus implicats es troben tant a la regió Nt (citosòlica) com en la Ct (luminal) sent aquest un dels primers exemples descrits en plantes de senyal luminal de sortida de RE. Amb totes aquestes dades s'ha proposat un model en el qual després de la inserció i correcte plegament de la proteïna en la membrana del RE, el Ct luminal de p7B interacciona a través del residu K49 amb un adaptador transmembrana associat al citoesquelet d'actina per al seu moviment i concentració en el RE cortical. El motiu Nt citoplasmàtic caldria per a l'acoblament de la vesícula COPII. D'altra banda s'ha aprofundit en l'estudi del interactoma de les MPs dels carmovirus i s'han identificat, mitjançant un assaig de doble híbrid (Y2H), tres proteïnes cel·lulars capaces d'interaccionar amb tres DGBp1 procedents de tres Carmovirus diferents (MNSV, TCV i CarMV). Aquests factors cel·lulars són la proteïna P3 del ribosoma 60S (RPP3A), la subunitat g del factor d'iniciació de la traducció 3 (eIF3g) i el factor de transcripció WRKY36. Aquestes interaccions van ser confirmades per BiFC. A més, mitjançant assajos de mutagènesi es va demostrar que el domini d'unió d'aquestes DGBp1 és un domini Ct (FNF) conservat. El fet que aquestes tres proteïnes interaccionen amb els mateixos factors suggereix un possible mecanisme comú per a tots o la major part dels carmovirus. Les CPs virals constitueixen el paradigma de la multifuncionalitat proteica i, a més del seu obvi paper estructural, intervenen en un gran nombre de processos del cicle viral, incloent el transport de l'RNA viral. La regió Nt desestructurada de la CP del MNSV, igual que per altres virus de RNA, generalment és l'encarregada d'unir l'RNA viral pel que se li sol cridar domini R. Mitjançant mutants de deleció i substitució s'ha demostrat que aquest domini R (que en el MNSV comprèn els primers 94 residus) no intervé només a la encapsidación i unió del genoma viral, sinó que és la responsable de la multifuncionalitat de la CP. Mitjançant EMSAs amb mutants de deleció es va poder determinar que el domini R essencial per a la unió de l'RNA. A més es va observar que dins del domini R es troba una regió conservada entre els aa 60 al 91, que sembla tenir un paper tant en la unió de RNA genòmic in vitro com en l'encapsidació de RNAs subgenómicos. No obstant això, en assajos d'encapsidació es va observar que tot el domini R és essencial per a l'encapsidació del genoma complet i que la regió compresa entre el residu 31 i el 91 és essencial per al moviment tant cèl·lula a cèl·lula com sistèmic. Finalment, utilitzant PVX com a vector d'expressió, es va demostrar que la CP del MNSV pot actuar com un supressor de silenciament mitjançant la unió als sRNAs. Amb l'objecte de conèixer el proteoma del floema de plantes infectades i poder en el futur identificar possibles proteïnes de l'hoste que facilitin o dificultin el transport sistèmic dels virus, en l'últim capítol es va dur a terme una anàlisi proteòmic comparatiu, mitjançant 2D-DIGE, entre floemas de plantes de meló infectades amb MNSV i plantes sanes. Es van detectar 1046 espots dels quals 25 tenien canvis significatius entre les dues condicions. Després de sotmetre les proteïnes a una anàlisi d'espectrometria de masses , es van identificar 19 proteïnes que corresponien a 22 espots Dues / Serra Soriano, M. (2016). Relación estructura-función de las proteínas virales implicadas en el movimiento de los carmovirus y su interacción con factores celulares [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61634 / TESIS

Memoria para optar al título Profesional de Médico Veterinario / En el presente estudio se evaluó el efecto de la inclusión de tres hidrolizados proteicos de pescado, solos y mezclados con dos fuentes de proteína vegetal de dos orígenes distintos, en las dietas de preinicio de pollos broiler machos sobre los rendimientos de la canal y desarrollo de canal del pollo. Para ello, se utilizaron 630 pollos broiler machos (Ross 308) de un día de edad a los que se les ofreció sólo durante el período de preinicio (1-14 días), cinco dietas distintas , tres que contenían solo hidrolizados proteicos de pescado solos, Mx-100 o Ep400 al 1,6% de inclusión o SYG-200 al 2%, y dos dietas en las que se utilizó el hidrolizado de pescado Ep400 al 1,6%, más 1,8% de proteína vegetal (Gluten de Maíz o Gluten de Trigo). Adicionalmente, se utilizó una dieta en base a maíz soya como dieta control. El resto de las dietas usadas para los períodos de inicio, crecimiento, final fueron las mismas para los distintos tratamientos y se ajustaron a los requerimientos de la línea genética y el NCR (1994). Solo se encontraron diferencias significativas (p≤0,05) para el peso vivo promedio al día 14, manifestándose el efecto tratamiento en el mayor peso alcanzado con Ep400, que superó significativamente (p≤0,05) a Ep400+ Gluten de Trigo y SYG-200. No hubo diferencias estadísticamente significativas (p>0,05) para el resto de las variables de rendimientos de canal y desarrollo muscular al día 14, ni al final del ciclo productivo. La mortalidad tanto de los primeros períodos, como para la totalidad del estudio se consideró dentro de los rangos esperables para los estándares de la línea genética utilizada y de un manejo productivo comercial. Sin embargo, en relación a los pesos de los distintos componentes de la canal, como sus rendimientos porcentuales, ellos fueron numéricamente mejores en los tratamientos Ep400 al 1,6% y Control Maíz- Soya en comparación con los demás tratamientos. / Proyecto INNOVA (CORFO empres) No. 204-4285 (2006)

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Broiler pre-starter (1-10 days) diet supplemented with fish hydrolyzated protein (FHP) were analyzed in different concentrations on some selected organs. 690 male broiler chicks were randomly distributed in 30 floor pens. This study was 42 days long but the diets supplemented with FHP were fed only the first 10 days: pre-star stage ( 1 to 10 days), 5 treatments (T) with 6 replications were supplemented as follow with FHP during this period: T₁ was control corn-soybean, T2 was control fish meal 6%, T3: FHP (BIOCP®) 3,5%,T4: FHP (BIOCP®) 7% and T5: FHP (BIOCP PLUS®) 3,5%. The selected organs was chest muscles, intestine, liver, spleen and bursa of Fabrizius, in case of the day 42, was measured abdominal fat. At the pre-started period differences on chest muscles were (p<0.05) only between T3 (FHP (BIOCP®), 3,5%) and T5 (FHP (BIOCP PLUS®, 3,5%), where T5 showed higher chest muscles weight than T3, but these differences are not statistically evident (p>0,05), at the end of the commercial productive cycle (day 42), this difference could be explained by the alometric growth tissues. For spleen weight differences were found (p<0,05) among treatments, where T2 had lower than T4. You must consider that this treatment there is a value higher than the rest which could accordin to transfer error