A proteólise limitada de certas proteínas leva à liberação de peptídeos opióides endógenos. Vários relatos apontam que peptídeos derivados da hemoglobina como hemorfinas e hemopressinas têm efeito antinociceptivo, pela atividade de modulação de receptores acoplados a proteínas G. No presente estudo, um ensaio de captura do substrato (ECS) foi combinado com a marcação isotópica e LC-MS/MS para identificar e caracterizar um novo fragmento da hemoglobina que se liga à EP24.15. O peptídeo AGH, identificado neste trabalho, inibe respostas de hipernocicepção periféricas através de receptores opióides do tipo <font face=\"Symbol\">m . A persistência do peptídeo AGH no tecido nervoso perfundido sugere relevância fisiológica. Embora o AGH seja derivado de hemoglobina e tenha atividade opióide, falta-lhe a sequência chave das hemorfinas (YPWT), indicando que ele pode pertencer a uma nova classe de peptídeos derivados da hemoglobina. Adicionalmente, o AGH modula as interações entre as proteínas 14-3-3<font face=\"Symbol\">e e EP24.15 in vitro, podendo estar relacionado com a secreção não convencional da EP24.15. / Limited proteolysis of certain proteins leads to the release of endogenous opioid peptides. Several reports have shown that hemoglobin-derived peptides such as hemorphins and hemopressins have an antinociceptive effect by modulating GPCR activity. In the present study, a substrate capture assay (SCA) was combined with isotopic labeling and LC-MS/MS to identify and characterize a new bioactive hemoglobin fragment that binds to EP24.15. AGH, a new peptide identified in this work, inhibits peripheral hyperalgesic responses through <font face=\"Symbol\">m opioid receptors (MOR). The persistence of AGH peptide in perfused nervous tissue suggests its physiological relevance. Although AGH is derived from hemoglobin and it is a peptide with opioid activity, it lacks the key sequence of hemorphins (YPWT), indicating that it is part of a new class of peptides derived from hemoglobin. Additionally, the AGH modulates interactions between 14-3-3<font face=\"Symbol\">e and EP24.15 proteins in vitro and may be related to the unconventional EP24.15 secretion.

O papilomavirus humano (HPV) é o agente etiológico da infecção sexualmente transmissível mais comum na população mundial. A prevalência da infecção por HPV é estimada em 660 milhões de pessoas e mais de 50% das mulheres serão acometidas pela infecção ao menos uma vez na vida. O HPV é responsável por virtualmente todos os casos de câncer de colo de útero (99%), além de causar muitos outros tipos de câncer de mucosa. O câncer cervical afeta aproximadamente 1.4 milhões de mulheres e 500 mil novos casos surgem anualmente, resultando em 250 mil mortes por ano. Os maiores índices de incidência são observados na América Latina e na África. Duas vacinas contra o HPV são comercializadas desde 2006 por empresas estrangeiras. Entretanto, o custo mínimo da vacinação é superior a 600 reais. Este preço torna sua incorporação pelo sistema de saúde um processo economicamente inviável. Dessa forma, devem ser buscadas alternativas para a produção de uma vacina eficaz, de qualidade e de baixo custo no Brasil. A proteína L1, principal proteína do capsídeo do HPV, tem a propriedade de se auto agregar em partículas semelhantes às virais (VLPs), que são o principal componente das vacinas atuais e possuem muita semelhança com os vírions nativos, introduzindo inclusive, uma imunização predominantemente tipo-específica. Este projeto se propôs a construir e avaliar vetores de expressão visando à produção em larga escala da proteína L1 do HPV 16, o tipo de HPV de maior risco e incidência na população mundial. Foram construídos cinco plasmídeos para Pichia pastoris, uma das principais plataformas industriais de expressão. Eles se diferenciam pelos marcadores de seleção e pelas sequências de manutenção do vetor, mas têm exatamente o mesmo objetivo: gerar sistemas que possuam múltiplas cópias do gene da L1 e que não necessitem da utilização de antibióticos. Essa estratégia foi escolhida porque a produtividade de muitas das proteínas heterólogas tem grande dependência da dosagem gênica e porque o uso de antibióticos encarece muito o custo da produção. Na primeira etapa do projeto foi avaliado um sistema de expressão epissomal auxotrófico, mas ele não se manteve estável ao longo de 60 gerações. Na segunda parte, dois vetores de integração ao sítio do DNA ribossomal foram testados. O sistema mais estável e produtivo foi caracterizado quanto ao número de cópias integradas ao genoma da P. pastoris e ao nível de expressão. O sistema é capaz de produzir clones com mais de 30 cópias do gene da L1 e dois clones expressaram cerca de 20 a 30 miligramas/litro de L1. Adicionalmente outros dois vetores integrativos que utilizam sequências teloméricas para integração foram construídos. Ainda são necessários estudos conjuntos de fermentação em larga escala e purificação da proteína para verificar a viabilidade do sistema / The human papillomavirus (HPV) is the etiologic agent of the sexually transmitted infection most common worldwide. The prevalence of HPV infection is estimated at 660 million people and over 50% of women will be affected by the infection at least once in their lifetime. HPV is responsible for virtually all cervical cancers cases (99%), and causes many other types of mucosal cancer. Cervical cancer affects approximately 1.4 million women, and 500.000 new cases occur annually, resulting in 250.000 deaths per year. The highest incidence rates are seen in Latin America and Africa. Two HPV vaccines are marketed since 2006 by foreign companies. However, the minimum cost of vaccination is higher than 360 dollar. This price makes its incorporation by the Brazilian Health System economically unfeasible. Thus, alternatives must be found to produce an effective vaccine, with low cost and high-quality in Brazil. The L1 protein, the major capsid protein of HPV, has the ability to self aggregate into virus-like particles (VLPs) which are the main component of current vaccines. The VLPs are very similar to the native virions and can introduce an immunization predominantly type-specific. This project aimed to construct and evaluate expression vectors to produce, at large scale, the L1 protein of HPV 16, which is the HPV type at greater risk and incidence in the world. Five plasmids were constructed for Pichia pastoris, one of the major industrial expression platforms. They differ in the selection markers and the vector maintenance sequences, but they have exactly the same goal: to create systems with multiple copies of the L1 gene and that don\'t require the use of antibiotics. This strategy was chosen because the productivity of many heterologous proteins have heavy dependence on gene dosage and because the use of antibiotics is extremely expensive for its production. In the first stage of the project, it was rated an episomal auxotrophic expression system, but it was unstable after a period of 60 generations. In the second part, two vectors for integration in the ribosomal DNA locus were tested. The most stable and productive system was featured on the number of copies integrated into the P. pastoris genome and on the expression level. It was proved that the system is able to produce clones with more than 30 copies of the L1 gene and two clones expressed approximately 20-30 milligrams/liter of L1. Additionally, two other integrative vectors for integration in telomeric sequences were constructed for future testing. More studies on large-scale fermentation and protein purification will be necessary to determine the feasibility of the system.

Orientador: Marcel Otavio Cerri / Resumo: Avanços na biotecnologia proporcionaram possibilidades para o eficiente desempenho da produção em larga escala de diversas biomoléculas e consequentemente suas aplicações industriais. A Escherichia coli se destaca dentre a gama de microrganismos que agem como hospedeiros de genes, desempenhando a função de codificar a síntese proteica. Os vetores mais veiculados na produção de proteínas recombinantes em E. coli são baseados no operon lac, onde o isopropil β-D1-tio-galactopiranosídeo (IPTG), análogo a molécula de lactose, é utilizado para a indução da produção da proteína de interesse. Estudos descritos na literatura também observaram o bom desempenho da lactose como agente de indução da E. coli recombinante na expressão de proteína verde fluorescente melhorada (Enhanced Green Fluorescent Protein – EGFP), e suas vantagens quando comparada ao IPTG, como por exemplo menor custo e menor toxicidade. A EGFP se tornou promissora pelo fato de ser monomérica e não precisar de auxilio de quaisquer agentes adicionais para exibir atividade de fluorescência. Possui variadas utilidades no campo biológico como excelente biomarcador da expressão genica e biosensor. Em bioprocessos, operados em biorreatores convencionais é fundamental o estudo dos parâmetros interferentes nos cultivos para a otimização da expressão do produto desejado. A oxigenação em processos conduzidos de maneira aeróbica, também é uma tarefa desafiadora em biorreatores convencionais, sendo imprescindível o controle da con... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Advances in biotechnology have provided possibilities to the performance of large-scale of biomolecules and therefore of their industrial applications. Escherichia coli stands out among microorganisms that act as host genes, functioning as a synthetic protein. The most useful vectors for the production of recombinant proteins in E. coli are based on the operon lac, where isopropyl β-D1-thiogalactopyroside (IPTG), analogous to lactose, is used to induce the production of proteins of interest. Studies in the literature have also observed the good performance of lactose as an inducer of recombinant E. coli in the expression of Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP), and its advantages when compared to IPTG, such as lower cost and toxicity. EGFP becomes promising because it is monomeric and does not need to help the main agents for fluorescence activity. It has several uses in the biological field as an excellent biomarker of gene expression and biosensor. In bioprocesses, operated in conventional bioreactors, it is fundamental to study the interfering parameters in the cultures to optimize the expression of the desired product. Oxygenation in aerobically conducted processes is also a challenging task in conventional bioreactors, with control of the concentration of dissolved oxygen in the culture medium is essential, which may be limiting for growth and expression of the protein of interest. In processes of production of heterologous proteins, it is assumed that the productiv... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A avaliação da estabilidade dos medicamentos e sua correta utilização em diferentes veículos de infusão são fundamentais para garantir a manutenção das características terapêuticas do fármaco e para promover minimização de eventos adversos. Incompatibilidades entre as estruturas dos fármacos, em diferentes veículos de administração, podem gerar possíveis associações antagônicas ou sinérgicas, resultando em alterações das propriedades físico-químicas e, consequentemente, dos efeitos farmacológicos e das respostas clínicas esperadas. A proteína verde fluorescente (GFP) por apresentar propriedades de sensibilidade e especificidade, mostra-se promissora como potencial biossensor da estabilidade de fármacos em soluções parenterais de grande volume (SPGV), por apresentar sensibilidade a alterações das propriedades físico-químicas do meio. GFP é uma proteína compacta, globular e ácida, composta de um monômero de 27kDa, que vem sendo extensivamente utilizada como indicador biológico em processos de esterilização e desinfecção devido a sua estabilidade a altas temperaturas. O surgimento de métodos analíticos modernos e de alta precisão como a espectrofotometria de UV e a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), alinhados a potencial utilização das proteínas fluorescentes como forma de avaliar as alterações da estabilidade de fármacos nas SPGV, vêm contribuir para a correta e racional utilização dos medicamentos no ambiente hospitalar. Diante disso a avaliação da estabilidade do coquetel de fármacos composto por furosemida e aminofilina em solução parenteral de 20% manitol e 0,9% NaCl foi sugerida. Amostras foram preparadas nas seguintes soluções (v/v): 20% manitol ou 0,9% NaCl na seguintes proporções utilizadas frequentemente na prática clínica: (i) 80% solução parenteral adicionada de 16% furosemida e 4% água para injeção (excipiente do fármaco aminofilina), (ii) 80% solução parenteral adicionada de 4% aminofilina e 16% água para injeção + NaOH (excipiente do fármaco furosemida), (iii) 80% solução parenteral, adicionada de 16% furosemida e 4% aminofilina (coquetel). As amostras foram avaliadas em espectrofotômetro imediatamente após o preparo e após um período 20h, em y=228nm e y=275nm para os fármacos furosemida e aminofilina, respectivamente. Para os fármacos individualmente associados às SPGV na faixa de pH 10-11, as concentrações finais obtidas foram correspondente ás inicialmente adicionadas e para o fármaco aminofilina foi estável até o período de 20h. Para avaliar a estabilidade dos fármacos associados à solução de 20% manitol a utilização de HPLC mostrou manutenção da estabilidade dos fármacos durante o período de infusão de até 20h. A proteína GFP adicionada as soluções das amostras na concentração 8?g/mL e determinada em espectrofluorímetro (yex=394nm, yem=509nm), mostrou resultados promissores quanto ao sua potencial utilização como biossensor da estabilidade dos fármacos furosemida e aminofilina nas soluções parenterais, mostrando comportamento de concentração e intensidade de fluorescência característicos e proporcionais a perda da estabilidade das soluções. A utilização de proteínas fluorescentes como potencial biossensor da estabilidade de fármacos em soluções parenterais é importante por fornecer parâmetros que garantam a eficácia dos medicamentos veiculados em soluções parenterais, racionalizando a sua utilização no ambiente hospitalar. / Parenteral solutions (PS) are used as vehicles in drugs administration to the organism. The development of analytical techniques that enables the detection of incompatibilities between drugs and PS is mandatory to guarantee their correct association with minimum adverse events. Incompatibilities of drugs in different infusion vehicles change according to physical-chemical properties of solutions, because of the molecular structure, chemical compounds used for preservation and stability of PS components. This fact can promote antagonic or synergic effects with loss of clinical response. The green fluorescent protein (GFP) is compact, globular, and acidic, with 27KDa and has been used as a biologic indicator of sterilization and disinfection process because it is easily detected using UV light, spectrofluorometry, with high thermal stability. GFP specificity and sensibility to physical-chemical changes in the media favors its use as a biosensor for drugs stability in parenteral solutions. The development of analytical methods such as spectrophotometry and high performance liquid chromatography (HPLC) in association with the fluorescent properties of some proteins enable the detection of potential incompatibilities between drugs and parenteral solutions, promoting a rational utilization of drugs in hospital. The evaluation of a diuretic cocktail with furosemide and aminophylline administrated in parenteral solutions of 20% mannitol and 0.9% NaCl was studied. Samples were prepared either in 20% mannitol or 0.9 % NaCl (PS), as follows: (i) 80% parenteral solution added with 16% furosemide and 4% WFI (solvent for aminophylline), (ii) 80% parenteral solution 4% aminophylline and 16% WFI+NaOH (pH 9-10, solvent for furosemide), (iii) 80% parenteral solution, added with 16% furosemide and 4% aminophylline (cocktail). Samples were diluted and prepared in a pH range of 6.5-7.5 and pH 10-11 for aminophylline and furosemide, individually and associated. The samples were prepared with PS including the excipients used in the drugs formulations. The absorbance was determined immediately after preparation and after 20 hours at 25°C and y= 228 nm, 275 nm, respectively for furosemide and aminophylline. GFP stability was determined in a spectrofluorometer (yex=394nm, yem=509nm) by adding 8 µg/mL of the purified protein in a 3.0mL sample (25°C) and the fluorescence intensity was evaluated after 20 hours. For both drugs in parenteral solutions (pH 10-11) the final concentrations observed were similar to the expected, aminophylline was also stable after 20h. When both drugs were associated in parenteral solutions of 20% mannitol, the use of HPLC showed stability for both drugs in the first 20h. The fluorescence intensity of GFP added to the samples was determined in spectrofluorometer (yex=394nm, yem=509nm), showing that fluorescence intensity was proportional to the drugs stability loss. Therefore, the utilization of fluorescence proteins is important to assure the drugs effectiveness and rational utilization in hospital places.

Como qualquer inseto holometábolo, a abelha Apis mellifera sofre metamorfose completa, apresentando grandes mudanças na forma e fisiologia quando passa do estágio larval para o estágio de pupa (muda metamórfica). Após esta muda, com o prosseguimento do desenvolvimento, o tegumento pupal (cutícula e a epiderme subjacente), extensivamente remodelado, é substituído pelo tegumento adulto, definitivo, que passa por intensa melanização e esclerotização. Eletroforese bidimensional e espectrometria de massas foram utilizadas neste trabalho para caracterizar as mudanças do padrão proteico no tegumento em desenvolvimento de operárias e zangões. No total foram identificadas 51 proteínas diferentes no tegumento torácico extraído de larvas, pupas e adultos (adultos-faratos). Quatorze proteínas foram identificadas como genuinamente cuticulares: Apidermina-3,1-like, Apidermina-2, Cuticular proteins analogous to peritrophins-3C e 3D, AmelCPR3, 12, 16 e 27, Glicoproteína SgAbd-2-like, e cinco outras proteínas homólogas à proteínas cuticulares de outras espécies de insetos contendo um domínio de ligação à quitina. As proteínas diferiram principalmente quantitativamente entre as fases de desenvolvimento e sexo, e poucas diferenças qualitativas foram observadas. Por exemplo, Apidermina-2 é típica de tegumentos fortemente esclerotizados e pigmentados. As diferenças quantitativas foram destacadas pela comparação da abundância de algumas proteínas e seus respectivos RNA mensageiros (utilizando RT-PCR em tempo real) entre as fases de desenvolvimento e entre os sexos. Várias proteínas cuticulares mostraram mais de uma forma molecular, aparentemente derivadas de modificações pós-traducionais. Além de conferir suporte experimental para a validação de genes de A. mellifera preditos, ou não-anotados, nossos dados forneceram novas informações sobre as proteínas que atuam no tegumento em desenvolvimento. / As a holometabolous insect, the honey bee undergoes complete metamorphosis, displaying a marked change in shape and physiology when passing from the larval to the pupal stage (metamorphic molt). As development progresses, the extensively remodeled pupal integument (cuticle and subjacent epidermis) is replaced by the adult integument, which undergoes intense sclerotization and melanization. Two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry were here used to characterize the changing protein patterns in the developing integument of workers and drones. Overall, we identified 51 different proteins in the thoracic integument extracted from larvae, pupae and adults (pharate adults). Fourteen proteins were identified as genuine cuticular proteins: Apidermin-3,1-like protein, Apidermin-2, Cuticular Proteins Analogous to Peritrophins-3C and 3D, AmelCPR3, 12, 16 and 27, Glycoprotein SgAbd-2-like, and 5 other proteins homologous to cuticular proteins from other insect species, and containing the chitin-binding domain. Integument proteins mainly differed quantitatively among the developmental stages and sexes, although few qualitative differences have also been detected. For example, Apidermin-2 is typical of the heavily pigmented and sclerotized integument. The quantitative differences were highlighted by comparing the levels of some of these proteins and their respective mRNAs (using RT-qPCR) among the developmental phases and between sexes. It is noteworthy that several cuticle proteins showed more than one molecular form, apparently derived from post-translational modifications. In addition to give experimental support for validation of predicted, or unannotated, honey bee genes, our data provided new information on proteins acting in the metamorphosing integument.

A selenocisteína (Sec, U) é o aminoácido que representa a principal forma biológica do elemento selênio e sua incorporação é um processo co-traducional em selenoproteínas como resposta ao códon UGA em fase e requer uma complexa maquinaria molecular. O repertório completo de genes envolvidos nessa via de síntese em procariotos é conhecido, porém algumas das interações moleculares ainda não foram totalmente esclarecidas. Este projeto visa à caracterização molecular nas interações entre o Fator de Elongação específico para incorporação de Sec (SelB) e Seril-tRNA sintetase (SerRS) com distintas construções do tRNASec de Escherichia coli afim de compreender a sua especificidade, seletividade e ordem de eventos. Para isso, medidas de Espectroscopia de Anisotropia de Fluorescência (FAS), Ultracentrifugação Analítica (AUC) e Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) foram utilizadas para determinação das constantes de interação desses complexos proteína-tRNA. Além disto, experimentos de Espalhamento de Raios-X a baixo ângulo (SAXS) e Microscopia eletrônica de transmissão por contraste negativo (NS-EM) foram realizados para elucidação estrutural destes complexos. Os estudos propostos irão auxiliar no entendimento do mecanismo de incorporação e de especificidade do tRNA para este aminoácido em bactérias bem como nos demais domínios da vida além de possibilitar um aumento na compreensão de complexos do tipo proteína-tRNA bem como salientar a importância dos elementos estruturais do tRNA para sua especificidade no processo de síntese de novas proteínas. / Selenocysteine (Sec, U) is an amino acid that represents the main biological form of the selenium element and its incorporation is a co-translational process in selenoproteins in response to the in-phase UGA codon and requires complex molecular machinery. The complete repertoire of genes involved in this pathway of synthesis in prokaryotes is known, although some of the molecular interactions have not yet been fully elucidated. This project aims at the molecular characterization in the interactions between the specific elongation factor for the incorporation of Sec (SelB) and Seril-tRNA synthase (SerRS) with different constructions of tRNASec from Escherichia coli in order to their specificity, selectivity and order of events. For this, measurements using Fluorescence Anisotropy Spectroscopy (FAS), Analytical Ultracentrifugation (AUC) and Differential Scanning Calorimetry (DSC) were employed to determine the interaction constants of the protein-tRNA complexes. In addition, Small Angle X-Ray Scattering (SAXS) experiments and negative stain transmission electron microscopy (NS-EM) were performed for structural elucidation of these complexes. The proposed studies will help to understand the mechanism of tRNA incorporation and specificity for this amino acid in bacteria as well as other domains of life. In addition, it allows an increase in the understanding of protein-tRNA-like complexes as well as emphasizing the importance of structural elements of tRNA for its specificity in the process of synthesis of new proteins.

Esta tese teve como objetivo o desenvolvimento de método in vitro pH-stat com enzimas espécie-específicas, avaliando a digestão de proteína (PB) e fósforo (P) em peixes, para prever a digestibilidade in vivo. As espécies utilizadas como modelos experimentais foram a truta arco-íris, Oncorhynchus mykiss, o bijupirá, Rachycentron canadum e a tilápia-do-Nilo, Oreochromis niloticus. Extratos enzimáticos foram obtidos de estômago, cecos pilóricos (truta e bijupirá) ou intestino (tilápia) de indivíduos de diferentes tamanhos e estado alimentar. A capacidade hidrolítica das enzimas foi padronizada utilizando substratos protéicos de grau analítico por meio da determinação do grau de hidrólise protéica (DH) em ensaio pH-stat. Ingredientes práticos foram hidrolisados com extrato enzimático de (i) estômago, (ii) cecos pilóricos (truta e bijupirá)/intestino (tilápia) ou (iii) estômago seguido de cecos pilóricos/intestino (dupla hidrólise) para determinar os valores de DH. O método de determinação de DH apresenta baixo coeficiente de variação, e pode ser uma ferramenta útil no ranqueamento e no controle de qualidade de ingredientes práticos. O P solúvel liberado de amostras de nove rações comerciais para tilápia, com níveis de garantia similares (32% proteína bruta, 4-6 mm) submetidos à digestão in vitro com extrato de estômago, intestino ou dupla hidrólise foram avaliados. Os extratos enzimáticos foram obtidos de tilápias cultivadas em condições comerciais em tanque-rede. Liberação de P solúvel foi determinada em amostras incubadas somente em água destilada (pH 6.4 &plusmn; 0.4), em água destilada a pH 2.0, pH 8.0, e sequencialmente em pH 2.0 e 8.0. Amostras também foram incubadas nesses valores de pH e incluindo os extratos enzimáticos de estômago e intestino separada e sequencialmente (dupla hidrólise). A liberação de P solúvel após digestão do estômago foi maior do que após digestão do intestino ou após dupla hidrólise. A digestibilidade do P parece estar relacionada mais ao pH do meio do que à hidrólise enzimática. Correlações significativas (P<0,05) foram observadas entre P total das rações e o P solúvel liberado em água destilada, e entre P total da ração e P liberado após digestão intestinal. O método in vitro apresentou baixo coeficiente de variação (< 5% c.v.). Coeficientes de digestibilidade aparente (CDA) de PB e P de nove rações comerciais para tilápia foram avaliados in vivo utilizando cinzas insolúveis em ácido como marcador interno. O ensaio foi feito em laboratório com tilápias em fase de crescimento simulando condições comerciais de estocagem. Foram avaliados também o crescimento e correlações entre CDA in vivo e DH in vitro de PB e CDA P in vivo e liberação in vitro de P solúvel. Não houve diferença no ganho de peso entre as rações (P>0,05). Valores de DH não apresentaram correlação significativa (P>0,05) com CDA PB, mas foi possível discriminar entre os maiores e menores valores de CDA PB. A liberação in vitro de P solúvel em água destilada e após digestão intestinal demostraram correlação significativa (P<0,05) com o teor de P total da ração e com o P disponível. Mais estudos são necessários para aumentar a precisão analítica dos teores de cinzas insolúveis em ácido, bem como aprimorar os métodos para correlacionar valores de digestibilidade in vivo com dados de métodos in vitro para proteína e fósforo. / The aim of this study was to develop a species-specific in vitro pH-stat method to assess protein and phosphorus digestion in fish. The fish species used as models to assess protein digestion of feed ingredients were rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, cobia, Rachycentron canadum, and Nile tilapia, Oreochromis niloticus. Crude digestive enzyme extracts were recovered from stomach and pyloric caeca or intestine of different groups of individuals. The hydrolytic capacity of the enzyme extracts was standardized on analytical grade protein substrates and measured as degree of protein hydrolysis (DH) in the pH-stat assay. Feed ingredients were assessed for DH and hydrolyzed with fish (i) stomach extract, (ii) pyloric caeca/intestine extract or (iii) stomach enzymes followed by pyloric caeca/intestine extract (two-stage). The DH determination has shown to be a precise method that may be a useful tool to rank feed ingredients, and also an accessory method in the quality control of feedstuffs. The amount of soluble phosphorus (P) released from feeds submitted to in vitro digestion with stomach, intestine, and stomach followed by intestine (two-stage) enzyme extracts was evaluated. Nine commercial feeds for Nile tilapia from different manufacturers with similar crude protein content (32%, label value) and pellet size (4-6 mm) were tested. Digestive enzyme extracts were obtained from growing Nile tilapia, Oreochromis niloticus, commercially farmed in cages. Release of soluble P (%) was determined after feed samples were incubated in distilled water (pH 6.4 &plusmn; 0.4), in distilled water at pH 2.0, in distilled water at pH 8.0, and after feed digestion with stomach and intestine extracts separately and sequentially (two-stage digestion). The amounts of enzyme extracts tested were 50, 100 and 200 &micro;L. In general, released soluble P with stomach digestion was higher compared to intestine digestion or two-stage digestion. Solubility of P appeared to be more related to medium pH rather than enzymatic hydrolysis. Significant correlations (P<0.05) were observed between feed total P and soluble P released in distilled water and between soluble P released in distilled water and soluble P released in intestinal digestion. This in vitro method was found reproducible as variation was low (<5% c.v.). Crude protein and phosphorus digestibility coefficients of commercial feeds simulating commercial stocking density, using AIA as internal marker, further to evaluate fish growth and the potential correlation of in vivo apparent digestibility data with in vitro protein digestion and released soluble phosphorus from commercial feeds for Nile tilapia. Growth performance between feeds were not significantly different (P>0.05). The in vitro DH did not correlate significantly (P>0.05) with ADC of CP, but it was possible to discriminate between the highest and lowest ADC of CP. In vitro release of soluble P in distilled water and after digestion with intestine extract correlated significantly (P<0.05) with total feed P and available P. Further studies are necessary to increase analytical precision of the AIA determination and also to improve methods to predict in vivo digestibility values with in vitro methods for protein and phosphorus.

Dois peptídeos, designados Let#1 e Let#2, foram delineados do segundo laço extracelular da proteína NaPi2b. Após conjugação, os peptídeos induziram produção de anticorpos específicos em coelhos e camundongos. Os anticorpos com maiores títulos foram selecionados para ensaios complementares. Estes anticorpos reconheceram os peptídeos conjugados aos carreadores pelos métodos de ELISA e WB, não havendo reação cruzada quando testados com a proteína carreadora livre e com antígeno sintético inespecífico. Após a completa validação, foi possível observar que os anticorpos anti-peptídeos reconhecem NaPi2b nativa, presente na superfície de células OV-CAR, bem como mostraram reconhecimento de um alvo comum em todos os soros analisados, mesmo quando o soro era considerado negativo para COV pelo teste comercial. Este reconhecimento não foi observado quando as amostras foram analisadas pelo soro pré-imune dos animais teste, sugerindo um reconhecimento específico dos anticorpos produzidos. / Two peptides, designated Let#1 and Let#2, were outlined from the second extracellular loop of the NaPi2b protein. After conjugation, the peptides induced the production of specific antibodies in rabbits and mice. Antibodies with higher titers were selected for complementary tests. These antibodies recognized peptides conjugated to the carrier by ELISA and WB, with no cross-reaction when tested with the free carrier protein and nonspecific synthetic antigen. After complete validation, it was observed that the anti-peptide antibodies recognize native NaPi2b protein present on the OV-CAR cell surface and showed recognizing a common target in all sera tested, even when the serum was considered negative for ovarian carcinonoma by commercial test. This recognition was not observed when the samples were analyzed by pre-immune serum of test animals, suggesting specific recognition of antibodies produced.

A agalaxia contagiosa é uma doença de notificação obrigatória que causa severas perdas econômicas para produção de ovinos e caprinos mundialmente. Apesar de seu impacto na produção animal, pouco se sabe sobre os fatores de virulência e patogenicidade do M. agalactiae (principal agente etiológico). Desta maneira, o presente estudo possuiu como objetivo a identificação, purificação e caracterização de proteínas antigênicas de M. agalactiae. Para tanto, quatro proteínas de superfície com potencial antigênico (WP_011949419.1, WP_011949418.1 (P40), WP_011949336.1, WP_011949770.1) foram selecionadas. Essas proteínas foram expressas em Escherichia coli e purificadas em coluna de níquel. As proteínas purificadas foram avaliadas quanto a antigenicidade em Western blotting utilizando soros de caprinos naturalmente infectados com M. agalactiae. Todas as proteínas expressas foram imunorreativas aos soros de caprinos naturalmente infectados, demonstrando que as proteínas utilizadas nesse estudo são possivelmente antigênicas e possuem epítopos acessíveis. / The Contagious agalactia is a notifiable disease that causes severe economic losses to sheep and goats worldwide. Despite its impact on animal production, little is known about the virulence factors and pathogenicity of M. agalactiae (main etiological agent). Thus, the present study identified, purified and characterized antigenic proteins of M. agalactiae. Therefore, four surface proteins with antigenic potential (WP_011949419.1, WP_011949418.1 (P40), WP_011949336.1, WP_011949770.1) were selected. These proteins were expressed in Escherichia coli and purified on nickel column. The purified proteins were assayed for antigenicity by Western blotting using goat sera naturally infected with M. agalactiae. All expressed proteins were immunoreactive with sera from naturally infected goats, demonstrating that the proteins used in this study are possibly antigenics and it have acessible epitopes.

Foi desenvolvido um método de recuperação de proteína de cefalotórax de camarão-rosa (Penaeus brasiliensis e Penaeus paulensis), tendo como base a separação física e a insolubilização por precipitação isoelétrica (pH 4,5) e aquecimento (70-75&#176;C/5min), caracterizando-se posteriormente o produto obtido e o resíduo sólido resultante. O método empregado propiciou um rendimento de cerca de 2% e a proteína recuperada mostrou-se acompanhada de reduzida quantidade de cálcio (0,03%) e quitina (0,5%) e de níveis de metais tóxicos (Hg, Cd, Pb, Cu e Zn) muito abaixo de limites permitidos em alimentos. Com base no cômputo químico dos amino ácidos essenciais, a proteína obtida apresentou uma qualidade nutricional de 54% e de 90%, em relação à caseína e à proteína da F.A.O/O.M.S, respectivamente, limitada primariamente pelo triptofano. A eficiência desta proteína em promover o crescimento dos animais foi de 81%, comparada à caseína, prejudicada parcialmente por sua digestibilidade (78%). A solubilidade da proteína estudada foi baixa a pH 7 (8,70%) e pôde ser melhorada (20 a 97,5%) através de tratamento alcalino e/ou eliminação do aquecimento na recuperação da mesma. Sua capacidade de emulsificação foi de 31% a 125% comparada à da proteína de soja comercial (Proteimax 90 HG), quando adotou-se também o tratamento alcalino e/ou a eliminação do aquecimento na sua recuperação. Com base no cômputo químico dos amino ácidos essenciais, a qualidade nutricional da proteína do residuo foi de 21% e de 35%, respectivamente em relação à caseína e à proteína da F.A.O/0.M.S., com limitação primária em triptofano. O rendimento em quitina e em quitosana atingiu 2,7g e 2,5g a partir do resíduo equivalente a 100g de cefalotórax ou 29g e 26g para cada 100g do mesmo, respectivamente. / A method for the protein recuperation from pink shrimp (Penaeus brasilensis and Penaeus palensis) cephalotorax was developed and the recuperated product and generated solid waste were characterized. The physical separation and protein insolubilization by isoelectric precipitation (pH4,5) and heating (70-75&#176;C/5min) were the base of this method. The method promoted a yie1d of 2% and the protein product showed low quantities of calcium (0,03%) and chitin (0,5%) and very low quantities of toxic metals (Hg, Cd, Pb, Cu and Zn) in relation to limits permited in foods. Based on the essential amino acids chemical score the recuperated protein showed a nutritional quality of 54% and 90%, compared to casein and F.A.O/O.M.S reference protein, respectively, primarily limited in triptophan. The eficiency of this protein in animal growth promotion was of 81% in relation to casein, limited partially by its digestibility (78%). The solubilty of the protein was low at pH 7 (8,70%) and was improved (20 to 97,5%) through the alkaline treatment and/or heating elimination in its recuperation. The emulsification capacity of this protein was from 31% to 125% campared to commercial say protein (Proteimax 90 HG) when the a1ka1ine treatment and/or heating elimination was also used. Accarding to the essential amino acids chemical score the protein nutritional quality of the solid waste was of 21% and 35% respectively, in relation to casein and F.A.O/O.M.S. reference proteint with primary limitation in triptophan. The yield in chitin and chitosan was 2,7g and 2,5g/100g cephalotorax or 29g and 26g/100g solid waste, respectively.