Em condições patológicas como o câncer, a angiogênese, ou seja, o crescimento de novos vasos a partir de uma rede vascular pré-existente, resulta numa maior oxigenação e nutrição das células e, consequentemente, num rápido crescimento do tumor [1]. Uma variedade de fatores estimulam a angiogênese, entre eles o Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) e seus receptores (VEGFR). O VEGF é uma proteína homodimérica cujas atividades biológicas são reguladas através da ligação com seu próprio receptor domínio quinase (kinase domain receptor KDR). Dos sete domínios extracelulares de Ig-like no KDR, apenas os domínios dois e três são necessários para uma ligação de alta afinidade com o VEGF. Yamazaki e colaboradores, em 2005, relataram que um componente protéico designado KDRbp (KDR-binding protein) da peçonha da serpente Agkistrodon piscivorus piscivorus liga-se ao domínio extracelular de KDR com alta afinidade, resultando no bloqueio subnanomolar de VEGF. Yamazaki et.al. demonstrou que KDRbp exibe a sequência de aminoácidos da região N-terminal e de fragmentos enzimaticamente digeridos da sequência peptídica de KDR-bp é idêntica a Lys-49-fosfolipase A2, um homólogo inativo da fosfolipase A2, no qual a Lys-49 substitui Asp-49. Diante disso, este trabalho teve por objetivo a síntese funcional de uma sequência de nucleotídeos correspondente aos domínios 2 e 3 do Receptor-2 do Fator do Crescimento Endotelial Vascular in vitro que, ao ser expressa em bactéria Escherichia coli (E.coli), permita aplicações otimizadas de seus códons. O cDNA (HUVEC) de KDR que serviu de molde para a amplificação pela reação em cadeia da polimerase para a obtenção do DNA de 675 pares de bases (pb) que codificam 225 aminoácidos correspondentes aos domínios 2 e 3 de KDR. Visando a otimização do uso de códons da construção do DNA que podem prontamente aperfeiçoar os códons para a expressão da proteína em todo o organismo do hospedeiro, no caso, a bactéria Escherichia coli (E.coli), foi desenhada e sintetizada uma sequência codificadora para os domínios 2 e 3 do KDR (constructo 2 e 3 do KDR). O constructo 2 e 3 do KDR obtido por PCR foi expresso em E.coli BL21 usando o vetor de expressão pET28a. A técnica de obtenção de uma sequência de nucleotídeos partindo do cDNA correspondente a sequência desejada é bastante utilizada por sua praticidade de manipulação e rapidez no resultado. A ORF (open reading frame) que codifica para a proteína de interesse foi clonada em vetor pET28a e a expressão foi induzida por IPTG. A análise da expressão foi monitorada e observado o sucesso devido a obtenção de proteína de 25 kDa expressos. / In pathologic conditions as cancer, angiogenesis can be stimulated with new blood-vessel formation, oxygenation, and nutrition, leading to a rapid growth of tumor. A variety of factors can stimulate angiogenesis. Among these factors, there is vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors (VEGFR). VEGF is homodimeric protein which biological activities are regulated by their kinase domain receptor KDR. From the seven KDR Ig-like domains, only domains 2 and 3 are necessary for a VEGF high-affinity binding. Yamazaki et.al. 2005, report that a protein component designated as KDR-binding protein (KDR-bp) from the venom of eastern cottonmouth (Agkistrodon piscivorus piscivorus) binds to high affinity extracellular KDR resulting in subnanomolar block of VEGF. Yamazaki et.al. demonstrated that KDR-bp exhibits the N-terminal amino acid sequence region, and enzymatically digested fragments of KDR-bp peptide sequence, which is identical to Lys-49-fosfolipase A2, an inactive homologue of phospholipase A2 where Lys-49 replaces Asp-49. Herein, this work aimed the functional synthesis of a nucleotide sequence corresponding to domains 2 and 3 from Receptor-2 of vascular endothelial growth factor in vitro expressed in Escherichia coli (E.coli), it allows to applications optimized of its códons. The cDNA (HUVEC) of KDR was used as amplification model by polymerase chain reaction to obtain the DNA of 675 base pairs that codify 225 amino acids related to domains 2 and 3 of KDR. A codifying sequence for domains 2 and 3 of KDR (construct 2/3 KDR) was designed and synthesized for optimal use of DNA construction codons, which are readily able to improve the expression codons of the proteins thorough the host organism, in this case bacteria Escherichia coli (E.coli). The construct2/3 KDR obtained by PCR was expressed in E.coli BL21 with expression vector pET28a. The technique to obtain a nucleotide sequence from cDNA related to the desired sequence is largely used due to easy manipulation and rapid time to results. The codifying ORF (open reading frame) for the target protein was cloned in pET28a vector and expression was induced by IPTG. The expression analysis was monitored and success was observed due to 25 kDa of protein expressed.

Devido a existência de 2 alphavírus artritogênicos no Brasil, os vírus Mayaro (MAYV) e Chikungunya (CHIKV) tornou-se importante desenvolver testes diagnósticos eficazes para discriminar suas infecções. No presente trabalho, desenvolvemos ELISAs indiretos para diagnóstico de CHIKV e MAYV utilizando proteínas de envelope viral E2 recombinantes, produzidas em Escherichia coli, as rE2-CHIKV e rE2-MAYV ELISAs. As proteínas E2 recombinantes tiveram suas antigenicidades verificadas nos ensaios utilizando anticorpos policlonais oriundos de camundongos hiperimunizados com CHIKV, MAYV e outros alphavírus. O rE2-CHIKV ELISA detectou anticorpos murinos de forma homotípica e não produziu reações cruzadas evidenciáveis utilizando anticorpos murinos específicos contra outros Alphavírus. O rE2-MAYV ELISA detectou anticorpos murinos homotípicos e também, reagiu cruzadamente com anticorpos murinos anti-CHIKV, mas não para outros Alphavírus. Esses ELISAs, também, foram usados na detecção de anticorpos em soros de pacientes com suspeita de infecção arboviral. Pelo o rE2-CHIKV ELISA, testaram-se 59 soros, resultando em 26 amostras IgG positivas. Resultados desse ELISA, quando comparados aos obtidos por teste de neutralização, demonstraram sensibilidade de 89,66% e especificidade de 100%. Soros humanos IgG positivos foram detectados em altas diluições pelo rE2-CHIKV ELISA. Quanto a detecção de IgM, o rE2- CHIKV ELISA apresentou moderada concordância com outros ensaios sorológicos. Com rE2- MAYV ELISA, testaram-se 68 soros resultando em 23 amostras IgG positivas, das quais 11 também mostraram-se positivas em teste de neutralização, demonstrando sensibilidade de 100% e especificidade de 78,95%. Portanto, os rE2-CHIKV e rE2 MAYV ELISAs, particularmente para detecção de IgG, mostraram-se adequadamente sensíveis e específicos para serem validados em estudos com maiores números de amostras e serem aplicados ao diagnóstico de pacientes infectados com CHIKV e MAYV. / Due the existence of 2 arthritogenic alphaviruses in Brasil, the viruses Mayaro (MAYV) and Chikungunya (CHIKV), it became important the development of efficient diagnose tests to discriminate their infections. In the present work, we developed indirect ELISAs for CHIKV and MAYV diagnosis using viral recombinant envelope proteins E2, produced in Escherichia coli, the rE2-CHIKV and rE2-MAYV. The recombinant E2 proteins had their antigenicity confirmed in the assay by using polyclonal antibodies produced in hyperimmunized mice with CHIKV, MAYV and other alphaviruses. The rE2-CHIKV ELISA detected homotypic murine antibodies and did not produced detectable cross-reactivity signal when using murine antibodies from other alphaviruses. The rE2-MAYV ELISA detected homotypic antibodies and also cross-reacted with murine anti-CHIKV antibodies, but not to other alphaviruses. These ELISAs were also tested for the detection of human antibodies, using patient sera suspected of arboviral infection. For rE2- CHIKV ELISA, it were tested 59 sera, resulting in 26 positive IgG samples. These ELISA results, when compared to those of a neutralizing assay, demonstrated a sensibility of 89.66% and specificity of 100%. The IgG positive human sera were detected in high dilutions by rE2-CHIKV ELISA. Regarding the detection of IgM, the rE2-CHIKV ELISA showed a moderate samples detection agreement when compared to other serologic assays. For rE2-MAYV ELISA, it were tested 68 sera, resulting in 23 positive IgG samples, of which 11 demonstrated to be positive by the neutralization assay, demonstrating a sensibility of 100% and specificity of 78.95%. Therefore, the rE2-CHIKV and rE2-MAYV ELISAs, especially for IgG detection, demonstrated to be properly sensitive and specific to be validated in studies using a greater number of samples, and also to be applied in the diagnosis of infected CHIKV and MAYV patients.

Tendões são descritos como tecido conjuntivo denso modelado que inserem os músculos aos ossos. Sua principal função é servir como tecido de transição das forças contráteis geradas pelos músculos aos ossos, podendo assim gerar movimentos. Entre todos os tendões, o calcâneo é um dos mais frequentemente lesados. As lesões ocorrem principalmente em homens e são mais frequentes entre a terceira e quarta década de vida. Dentre os vários métodos de sutura existentes, do ponto de vista clínico, a de Kessler-Tajima com os nós entre os cotos é muito utilizada por evitar o estrangulamento da microcirculação. Após a cirurgia o paciente retorna ao trabalho após 85 dias, em média, podendo atingir até 270 dias. O objetivo do presente estudo foi testar a eficiência da aplicação da proteína biocompatível F1, uma proteína extraída a partir do látex natural da Hevea brasiliensis, sobre tendões lesados, buscando uma melhora no reparo, assim como, a influência da sutura-U e de Kessler-Tajima. Alterações musculares decorrentes da lesão no tendão também foram avaliadas. Para isso, utilizamos ratos Sprague Dawley machos de 3 meses, que foram submetidos a tenotomia completa, a lesão foi corrigida com ambas as suturas, seguido da aplicação da proteína e avaliados após duas e quatro semanas. As técnicas utilizadas para análises no tendão foram as de microscopia de luz, microscopia eletrônica de varredura e transmissão, bem como, a síntese de colágeno tipos I e III, TIMP-1 e 2, MMP-2 e 9 por western blot. Para analisar as alterações musculares, a expressão dos genes MuRF1 e Atrogin1 foram quantificadas por RT-qPCR, seguido de análises de contração muscular máxima e teste de fadiga. Os resultados sugerem uma melhora no reparo do tendão no grupo que utilizamos a sutura-U associada à proteína após quatro semanas, devido ao aumento na síntese de colágeno tipo I e a diminuição de MMP-9, assim como, a capacidade de contração muscular máxima retorna aos níveis do grupo controle. A sutura-U também influencia menos na fadiga muscular. / Tendons are described as dense modeled connective tissue which insert the muscles to the bones. Its main function is to serve as transition tissue of the contractile forces generated by muscles to the bones, and thus generate movements. Among all the tendons, the calcaneal is the most frequently injured one. The lesions occur mainly in men and are more frequent between the third and fourth decade of life. Among the several existing suture methods, from a clinical point of view, the Kessler-Tajima with the nodes between the stumps is used to a great extent in order to avoid the microcirculations strangling. After surgery, the patient returns to work after 85 days, on average, and can reach up to 270 days. The objective of this study was to test the efficiency of the application of biocompatible F1 protein, a protein extracted from natural latex from the Hevea brasiliensis, on injured tendons, seeking an improvement in the repair, as well as the influence of the suture-U and Kessler-Tajima. Muscle changes arising from the tendon injury were also evaluated. For this reason, Sprague Dawley male rats at 3 mounths-old were used, which underwent complete tenotomy, the lesion was corrected with both sutures, followed by the application of protein and evaluated after two and four weeks. The techniques used for analyzes in the tendon were the light microscopy, scanning electron microscopy and transmission, as well as the synthesis of collagen types I and III, TIMP-1, -2, MMP-2, and -9 by Western blot. In order to analyze the muscular alterations, the expression of genes MuRF1 and Atrogin1 were quantified by RT-qPCR, followed by analysis of maximum muscle contraction and fatigue testing. The results suggest an improvement in the tendon repair in the group that the suture-U was used associated with protein after four weeks, due to the increase in the synthesis of collagen type I and the decrease of MMP-9, as well as the ability of maximum muscle contraction to return to the levels of the control group. The suture-U also influences on less muscle fatigue.

O objetivo do trabalho foi avaliar o impacto de intervenções nutricionais no valor da pegada hídrica do produto leite bovino. O cálculo da pegada hídrica considerou as águas verde, azul e cinza, consumidas no sistema de produção e no beneficiamento do produto. Para determinação dos consumos de água no sistema de produção foram selecionados dois grupos experimentais, cada um contendo sete vacas em lactação. As dietas fornecidas a cada grupo continha os mesmos ingredientes. Porém, na composição do concentrado havia diferentes percentuais proteicos. O concentrado fornecido ao Grupo 1, continha 20% de proteína bruta, e o concentrado fornecido ao Grupo 2, tinha seu teor de proteico ajustado de acordo com a produção de leite do grupo, ao longo da lactação. O ajuste do teor de proteína da dieta as necessidades dos animais promoveu a redução dos consumos das águas verde, azul e cinza e da pegada hídrica do produto leite. A pegada hídrica do Grupo 1 com base no nitrato foi de 503,79 L kg-1 de FPCM (86,1% água verde, 13,4% água azul e 0,43% água cinza) e a do Grupo 2 foi de 452,59 L kg-1 de FPCM (85,3% água verde, 14,3% água azul e 0,45% água cinza). Com base no fósforo, a pegada total do Grupo 1 foi igual a 518,43 L kg-1 de FPCM (83,7% água verde, 13,1% água azul e 3,2% água cinza) e a do Grupo 2 foi de 465,16 L kg-1 de FPCM (83% água verde, 13,9 % água azul e 3,1% água cinza). Entre as três águas, a verde foi a que apresentou maior consumo, atestando a importância da eficiência hídrica na agricultura para os produtos de origem animal. A prática de irrigação das pastagens representou o maior consumo de água azul. O Grupo 2 apresentou melhor eficiência de uso de nutrientes, mas em ambos os grupos as entradas foram maiores que as saídas. O balanço do Grupo 1 foi de 962,7 kg de N, 95,2 kg de P e 545,1 kg de K e do Grupo 2, 869,4 kg de N, 57,8 kg de P, 601,9 kg de K. A captação de água de chuva por cisterna foi avaliada como uma tecnologia hídrica. Essa demonstrou ter impacto positivo na redução do volume de água captado de fonte natural, mas a análise financeira da tecnologia se mostrou inviável para a condição produtiva do estudo. A utilização de intervenções nutricionais que promovam o melhor aproveitamento dos nutrientes pelos animais demonstrou ser uma prática que também contribui para melhoria da eficiência hídrica do sistema de produção e dos produtos de origem animal. Estudos que relacionam o cálculo da pegada hídrica com os aspectos produtivos da pecuária promoverão impactos positivos na conservação dos recursos hídricos e no desempenho dos sistemas de produção. / The aim of the study was to evaluate the impact of nutritional interventions on the dairy milk water footprint. Water footprint calculation considered the green, blue and gray water consumed in the production system and in the dairy unit. To determine the water consumption in the production system was selected two experimental groups with seven lactating cows each. The diets provided to each group contained the same feeds. However, concentrate had different crude protein contents. The concentrate feed Group 1 contained 20% of crude protein, and the concentrate feed Group 2 had its protein content adjusted according to the milk production of the group. The adjustment of the protein content promoted a lower consumption of green, blue and gray water and the reduction of water footprint value. The water footprint based on nitrate in the Group 1 was 503.79 L kg-1 of FPCM (86.1% green water, 13.4% blue water, and 0.43% gray water) and in the Group 2 was 452.59 L kg-1 FPCM (85.3% green water, 14.3% blue water, and 0.45% gray water). Water footprint based on phosphorus was 518.43 L kg-1 of FPCM to Group 1 (83.7% green water, 13.1% blue water, and 3.2% gray water) and to Group 2 was 465.16 L kg-1 of FPCM (83% green water, 13.9% blue water, and 3.1% gray water). Green was the highest volume consumed. This shows the relation between agriculture water efficiency and the water footprint of animal products. Irrigation represented the highest consumption of blue water. The nutrient use efficiency was better to Group 2, but in both groups the inputs were higher than the outputs. The nutrient balance for Group 1 was 962.7 kg N, 95.2 kg P and 545.1 kg K and for Group 2, 869.4 kg N, 57.8 kg P, 601.9 kg of K. Rainwater harvesting in a cistern was evaluated as a water technology. It had a positive impact on reducing the withdraw from ground source, but the economic analysis of the cistern was unfeasible for the productive condition. The use of nutritional interventions for lactating cows promoted better nutrient utilization and has proved to be a management that contributes to the increase of water efficiency in the production system and to animal products. Studies that relate the water footprint with productive aspects of livestock will promote positive impacts on the water conservation and on the performance of production systems.

A avaliação da disfunção renal pelos marcadores usuais não tem determinado impacto na redução da incidência da insuficiência renal aguda (IRA) nos pacientes de terapia intensiva. Este estudo avaliou 100 pacientes admitidos em uma unidade de terapia intensiva (UTI) quanto às características demográficas; a relação entre creatinina plasmática e proteína carreadora do retinol (RBPu) e as variáveis clínico-laboratoriais; e a sensibilidade e a especificidade da RBPu. A amostra caracterizou-se como geriátrica (63,4±15,6 anos), do sexo masculino (68%), 47% dos pacientes tiveram tratamento clínico e 53% cirúrgico. A coleta de dados foi realizada no período de 13,9±8,3 horas após a admissão na UTI. A análise dos resultados mostrou associação entre a creatinina plasmática e as variáveis: gênero (p-0,026), idade (p-0,038), uso de droga vasoativa (p-0,003), proteínúria (p-0,025), APACHE II (p-0,000), uréia (p-0,000), potássio (p-0,003) e clearance de creatinina estimado (p-0,000). A RBPu mostrou associação com um número maior de variáveis: peso (IMC), uso de ventilação invasiva (p-0,000), uso de antiinflamatório não-hormonal (p-0,018), uso de droga vasoativa (p-0,021), temperatura > 37,5ºC (p-0,005), proteinúria (p-0,000), bilirrubinúria (p-0,004), fluxo urinário (p-0,019), pressão arterial diastólica mínima (p-0,032), pressão arterial sistólica mínima (p-0,029), APACHE II (p-0,000), creatinina (p-0,001), uréia (p-0,001), clearance de creatinina estimado (p-0,000) e uma tendência a associação com os antecedentes clínicos (doença renal, vasculopatia e neoplasia). A creatinina plasmática e a RBPu apresentaram associação com a fração de excreção de sódio (FENa) quando os dados foram submetidos à análise univariada. O estudo referente à sensibilidade e especificidade da RBPu utilizando a curva ROC (Relative Operating Characteristics) mostrou que pacientes com RBPu maior que 1,47 mg/l têm aproximadamente quatro chances de apresentarem creatinina acima de 1,2 mg/dl (intervalo de confiança - 95%, erro padrão - 0,072). A acurácia global da RBPu, como teste diagnóstico, foi fraca. A RBPu, apesar das fracas sensibilidade e especificidade encontradas no estudo, pode ser considerada na clínica, o marcador de melhor desempenho diagnóstico em pacientes com risco para a ocorrência de IRA quando comparada aos marcadores utilizados rotineiramente. / The early assessment of renal dysfunction using common markers has not determined an impact on lower incidence of acute renal failure (ARF) in intensive care patients, which remains alarming high. This study followed-up 100 patients admitted to an intensive care unit (ICU) and assessed demographic variables as well as plasma creatinine and urinary retinol-binding protein (uRBP) ratio with clinical and laboratory variables within the first hours of admission to the ICU. The sample was characterized as geriatric (63.4±15.6 years), male (68%), 47% clinical and 53% surgical patients. Data were gathered 13.9±8.3 hours after admission to ICU. Statistical analysis showed association between plasma creatinine and the following variables: gender (p-0.026), age (p-0.038), use of vasoactive drugs (p-0.003), proteinuria (p-0.025), APACHE II (p-0.000), urea (p-0.000), potassium (p-0.003) and estimated creatinine clearance (p-0.000). uRBP correlated with more variables: weight (BMI), use of invasive ventilation (p-0.000), use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs (p-0.018), use of vasoactive drugs (p-0.021), temperature > 37.5ºC (p-0.005), proteinuria (p-0.000), bilirubinuria (p-0.004), urinary flow (p-0.019), minimal diastolic pressure (p-0.032), minimal systolic pressure (p-0.029), APACHE II (p-0.000), creatinine (p-0.001), urea (p-0.001), estimated creatinine clearance (p-0.000). uRBP also tended to associate with clinical past medical history (renal disease, vasculopathy and neoplasm). FENa correlated with plasma creatinine and uRBP in univariate analysis. The ROC (Receiver Operating Characteristic) curve demonstrated that patients with uRBP > 1.47 mg/l are four times more likely to have creatinine > 1.2 mg/dl (95% confidence interval, standard error, 0.072). The global accuracy of uRBP as a diagnostic test was poor. Although uRBP sensibility and specificity were not very high in the study, in clinical practice it might be considered the better marker regarding diagnostic performance in patients at risk of developing ARF, as compared with other markers routinely used. Moreover, uRBP has other features of a good diagnostic test - it is a practical and non-invasive method, and its cost may drop as the test becomes more frequently requested.

A Dissulfeto Isomerase Proteína (PDI) é uma chaperona redox essencial responsável pela inserção correta das ligações dissulfeto em proteínas nascentes no retículo endoplasmático. Nesta localização celular, bem como em outras regiões, como na superfície celular, a PDI atua na manutenção da homeostase redox e sinalização. Houve substanciosa evolução no conhecimento sobre a estrutura e funções da PDI, graças a estudos in vitro que utilizam a PDI purificada, quimeras ou seus domínios isolados. Nestas abordagens experimentais, as medidas das atividades redutase e chaperona da PDI são realizadas de forma relativamente simples. Entretanto, medir a atividade isomerase, que é a atividade autêntica da família das PDIs, é tecnicamente bastante complexo. Em células e tecidos, o papel da PDI tem sido descrito com base principalmente em estratégias experimentais de ganho e perda de função. Todavia, ainda há pouca informação na correlação entre os resultados funcionais com a medida das atividades da PDI. Este trabalho compila os principais métodos descritos para medir as quatro atividades da PDI: tiol redutase, tiol oxidase, tiol isomerase e chaperona, com ênfase na descrição de controles e interferentes críticos, como os tampões que contém surfactantes. Ainda, discutir-se-á criticamente os resultados obtidos quando da transposição destes métodos para amostras de homogenatos (celular ou tecidual) / Protein disulfide isomerase is an essential redox chaperone from endoplasmic reticulum, responsible for correct disulfide bond insertion in nascent proteins. At the endoplasmic reticulum and other locations including the cell surface, PDI accounts for redox homeostasis and signaling. Knowledge about PDI structure and function evolved substantially from in vitro studies using purified PDI and chimeras. In these experimental scenarios, PDI reductase and chaperone are readily approachable. However, isomerase activity, the hallmark of PDI family, is significantly complex. Assessment of PDI roles in cells and tissues mainly relies on gain- or loss-of-function experiments. However, there is limited information regarding correlation of these results with PDI activities. In this manuscript, we put together the main methods described for measuring the four PDI activities: thiol reductase, thiol oxidase, thiol isomerase and chaperone, with emphasis on controls and critical interferents, such as detergent-containing buffers. We also discuss the transposition of these methods from purified PDI to cellular or in vivo samples, with critical thoughts about the interpretation of results

O objetivo geral desta pesquisa foi avaliar o metabolismo e a resposta imune celular no sangue de vacas leiteiras no período de transição. Foram utilizadas 13 vacas Holandesas, de 2ª a 4ª parição, avaliadas nas semanas M-2, M-1 (pré-parto), M0 (dia da parição), M1, M2 e M3 (pós-parto). Foram realizadas análises das seguintes variáveis: produção leiteira, escore de condição corporal (ECC), mensuração sérica do beta-hidroxibutirato (BHB), ácidos graxos não esterificados (NEFA), IGF-1 (Fator de Crescimento Semelhante à Insulina Tipo 1), glicose (GLIC), colesterol (COL), triglicerídeos, proteína total (PT), albumina (ALB), globulina (GLOB), AST (Aspartato transaminase), GGT (Gamaglutamiltransferase) e cálcio total e cálcio ionizável. Além disso, a resposta imune celular das vacas forma avaliadas pelas interpretações do leucograma e imunofenotipagem dos linfócitos. Foram encontradas medianas do ECC equivalentes a 4,0; 3,8; 3,5; 3,0; 3,5 e 3,5 dos momentos M-2 ao M3. Em relação aos indicadores energéticos, observou-se aumento da concentração de NEFA e BHB no parto e pós-parto, ao contrário, os teores de triglicerídeos, colesterol e IGF- 1 diminuíram. Além disso, foi possível observar concentração máxima de glicose no momento da parição. Em relação ao metabolismo proteico e hepático, observam-se menores concentrações de proteína total e globulina no momento do parto; os teores de albumina diminuíram no pós-parto. A atividade sérica da AST aumentou a partir da parição, porém não foi possível detectar variações para a GGT. As concentrações de cálcio sério total e ionizado foram menores a partir da parição. A análise do leucograma das vacas no período de transição revelou leucocitose por linfocitose no momento do parto, apesar de não ter sido observada variações no número absoluto e relativo dos linfócitos durante o período de transição, foi possível observar que os linfócitos sanguíneos apresentaram-se elevados durante todo o período de estudo. O aumento no número de linfócitos decorreu da elevação dos linfócitos B (CD21+). A partir desse resultado realizou-se exame sorológico para o vírus da Leucose Enzootica Bovina, detectando 12/13 (92,30%) vacas soropositivas. O linfócito T (CD3+) e suas subpopulções auxiliar (CD3+CD4+) e citotóxica (CD3+CD8+) apresentaram ligeiras oscilações durante o período de estudo. Com base nos resultados obtidos pode-se concluir que: a) As vacas Holandesas apresentaram variações nos parâmetros do perfil energético indicadoras de balanço energético negativo e mobilização lipídica, caracterizados especialmente pela diminuição do ECC e elevações nos teores séricos de NEFA e BHB; b) os teores de PT e GLOB apresentaram variações em decorrência da colostrogênese e infecções uterinas pós-parto. A albumina apresentou diminuição no pós-parto, decorrente do aumento da demanda nutricional para a produção de leite e uso de aminoácidos como precursor energético no processo de gliconeogênese; c) os valores de IGF-I apresentaram acentuada redução no momento do parto, sinalizando para mobilização lipídica e desacoplamento do eixo somatotrópico a partir da parição; d) as vacas apresentaram hipocalcemia, especialmente na parição e primeira semana pós-parto; e) a infecção pelo Vírus da Leucose Enzoótica Bovina influenciou na resposta imune observada no período de transição, caracterizada por linfocitose e aumento da população de linfócitos B (CD21+). / The general aim of this research was to evaluate the metabolism and cellular immune response in blood of dairy cows in transition period. Was evaluated 13 Holstein cows, from 2nd to 4th parturitions in the weeks M-2, M-1 (pre-partum), M0 (parturition day), M1, M2 and M3 (post-partum). Paremeter analysis were performed: milk production, body condition score (BCS), beta-hydroxybutyrate (BHB), nonesterified fatty acids (NEFA), IGF-1 (growth factor Insulin-like similar to insulin type 1), glucose (GLUC), cholesterol (CHOL), triglycerides, total protein (TP), albumin, globulin (GLOB), AST (aspartate transaminase), GGT (gamma-glutamyl transferase), total calcium and ionized calcium. Furthermore, cows cellular immune response was evaluated by WBC and lymphocyte immunophenotyping. Was find for BCS median 4.0; 3.8; 3.5; 3.0; 3.5 and 3.5 between the moments M-2 to M3. Regarding to energy indicators, an increase of NEFA and BHB in parturition and postpartum was observed, in contrast, the values of triglycerides, cholesterol and IGF-1 decreased. Moreover, it was possible to obtain maximum glucose concentration at parturition time. Regarding to protein and hepatic metabolic was find lower values of total protein and globulin was observed in pre-partum and parturition in relation to postpartum; values of albumin decreased in post-partum. The Aspartate aminotransferase activity increased from calving, but it was not possible to detect GGT variations. The concentration of total and ionized calcium serum were lower from calving. The analysis of cows leukogram in the transition period revealed leukocytosis by lymphocytosis at delivery, although no variation in the absolute and relative number of lymphocytes was observed during the transition period. The increase of lymphocytes number occurred due to the increase of B lymphocytes (CD21 +). From this result, serological test for the Enzootic Bovine Leukosis Virus was developed, detecting 12/13 (92,30%) of seropositive cows. T lymphocytes (CD3 +) and subpopulations T helper (CD3+ CD4+) and T cytotoxic (CD3+ CD8+) showed slight fluctuations during period. Based on the results, we can conclude the following: a) Holstein cows showed variations in the parameters of the energy profile indicator of negative energy balance and lipid mobilization, characterized especially by the decreasing of BCS and elevations in serum NEFA and BHB; b) the levels of TP and GLOB showed variations due to colostrogenesis and postpartum uterine infections. The albumin decreased in postpartum, due to increased nutrient requeriment for milk production and use of amino acids as energy precursor in the gluconeogenesis; c) the amounts of IGF-I showed significant reduction at delivery, signaling lipid mobilization and uncoupling of the somatotropic axis after calving; d) cows showed hypocalcemia, especially in calving and first week post-partum; e) Infection with Enzootic Bovine Leukosis Virus influenced the immune response observed in the transition period, characterized by lymphocytosis and the increase of B lymphocytes (CD21 +) population.

Produtos naturais constituem uma das principais fontes de moléculas bioativas que possuem diversas aplicabilidades. Dentre os produtos naturais, policetídeos representam uma ampla classe de compostos estruturalmente diversos cuja atividade biológica, muitas vezes está relacionada com os grupos funcionais que estão ligados ao seu esqueleto central (aglicona). Os macrolídeos representam uma classe de antibiótico amplamente utilizado e são um exemplo de policetídeos cuja atividade é dependente de moléculas de açúcares. As enzimas que realizam a glicosilação de policetídeos são as glicosiltransferases, as quais apresentam uma especificidade estrita para 6-desoxiaçúcares, porém uma especificidade relaxada para açúcares não usuais e substratos aceptores. Estudar essa flexibilidade catalítica das glicosiltransferases de produtos naturais pode contribuir para a geração de novos compostos através de glicodiversificação. Esses novos compostos podem apresentar novas atividades biológicas e propriedades farmacocinéticas melhoradas. Além da especificidade relaxada, existe um pequeno grupo de glicosiltransferases que possui um comportamento peculiar no qual uma proteína auxiliar é necessária para sua atividade catalítica, por exemplo o par TylM2/TylM3 envolvidos na biossíntese do antibiótico macrolídeo tilosina em Strepromyces fradiae. Estudar a interação e as mudanças conformacionais que ocorrem durante a formação do complexo glicosiltransferase-proteína auxiliar é fundamental para entender a influência que essas as proteínas auxiliares exercem sobre as glicosiltransferases, e com isso gerar informações que possam ser úteis na aplicação de glicodiversificação. Neste trabalho foi realizado a sublonagem de genes sintéticos que codificam a glicosiltransferase TylM2 e a proteína auxiliar TylM3 e as proteínas recombinantes foram produzidas e purificadas. Além disso foram realizadas técnicas de caracterização estrutural para proteína TylM2 no qual essa glicosiltransferase parece formar um tetrâmero em solução na ausência de sua proteína auxiliar. Ensaios de cristalização com TylM2 rendeu cristais que difratam a uma resolução abaixo de 3,0Å, mesmo após tentativas de otimização, que dificultam a determinação de sua estrutura A criação de modelos teóricos por modelagem comparativa para TylM2 e TylM3 permitiu uma investigação sobre possíveis diferenças entre a TylM2 e suas homólogas. / Natural products compose one of the main sources of bioactive molecules that have several applications. Amongst natural products, polyketides represent a broad class of structurally diverse compounds whose biological activity is often related to the functional groups that are linked to their central skeleton (aglycone). Macrolides represent a class of widely used antibiotic and are an example of polyketides whose activity is dependent on sugar molecules. The enzymes that perform the glycosylation of polyketides are glycosyltransferases, which have a strict specificity for 6-deoxy sugars, but a relaxed specificity for unusual sugars and acceptor substrates. Studying this catalytic flexibility of glycosyltransferases of natural products may contribute to the generation of novel compounds through glycodiversification. These novel compounds may exhibit new biological activities and improved pharmacokinetic properties. In addition to the relaxed specificity, there is a small group of glycosyltransferases who have a peculiar behavior in which an auxiliary protein is required for its catalytic activity, an example of such is the TylM2 / TylM3 pair involved in the biosynthesis of the macrolide antibiotic tylosin in Strepromyces fradiae. Studying the interaction and conformational changes that occur during the formation of the glycosyltransferase-auxiliary protein complex is critical to understanding the influence that these auxiliary proteins have on glycosyltransferases, and thereby generate information that may be useful in the application of glycodiversification. In this work, synthetic genes coding the glycosyltransferase TylM2 and the auxiliary protein TylM3 was sub cloned into pET28a vectors and the recombinant proteins were produced and purified. In addition, structural characterization techniques were performed with TylM2 which appears to form a tetramer in solution in the absence of its auxiliary protein. Crystallization assays of TylM2 yielded crystals that diffracted bellow 3.0Å and presented pathologies which prevented determining of its structure, even after attempts of optimization. The creation of theoretical models by homology modelling for TylM2 and TylM3 allowed for an investigation into possible differences that make TylM2 possess a more stringent flexibility toward acceptor substrates when compared to other homologues.

Escherichia coli enteropatogênica atípica (aEPEC) é considerada um dos principais agentes etiológicos da diarreia em várias regiões do mundo. O mecanismo central da patogenicidade de aEPEC é a capacidade de causar lesões attaching-effacing (A/E) no epitélio intestinal, uma propriedade desencadeada por proteínas codificadas pelo locus of enterocyte effacement (LEE). Enquanto algumas aEPEC utilizam a via de fosforilação de Tir (Y-P) para induzir a formação de pedestais, outras cepas podem empregar a proteína efetora EspFU (TccP/TccP2) para uma eficiente polimerização de actina. Neste estudo foi avaliada a prevalência e produção de EspFU, como também o papel desempenhado por esta proteína na interação com células epiteliais e colonização intestinal, aspectos essenciais da patogênese de aEPEC. O gene espFU foi detectado em 46% das cepas de aEPEC, com uma predominância do alelo tccP2. A maioria das cepas apresentou o tir fosforilado (Y-P), sugerindo que possam utilizar diferentes mecanismos redundantes para a polimerização de actina. As cepas positivas para tccP e tccP2 foram significativamente associadas com os filogrupos E, e B1, respectivamente. A produção de EspFU (TccP/TccP2) variou de cepa-a-cepa, independentemente dos genótipos e filogrupos. A deleção do gene espFU em uma cepa de aEPEC O55:H7 (BA320) resultou em menor aderência bacteriana e comprometeu a capacidade de induzir polimerização de actina em células HeLa após 6 h de infecção. Adicionalmente, o mutante em espFU apresentou uma menor eficiência na colonização intestinal em um modelo murino de infecção. A análise da cinética da formação de pedestais por aEPEC mostrou que, de modo geral, cepas expressando EspFU foram mais aderentes e induziram polimerização de actina mais rapidamente em comparação à via de TirY-P. A adesão bacteriana e formação de pedestais mediada por EspFU regulou negativamente a expressão de LEE, além de modular a resposta transcricional epitelial por meio da ativação de genes pró-inflamatórios, como NF-kB, IL-6, IL-8, entre outros. Em suma, a proteína EspFU é ampla e filogeneticamente distribuída em cepas de aEPEC, desempenha um importante papel na adesão bacteriana e colonização intestinal, e pode contribuir direta ou indiretamente para a indução de resposta inflamatória. / Atypical enteropathogenic Escherichia coli (aEPEC) is one of the most important pathogen causing diarrhea disease worldwide. The hallmark of aEPEC pathogenesis is the ability to cause attaching and effacing (A/E) lesions on intestinal epithelium, a property triggered by proteins encoded on a pathogenicity island called locus of enterocyte effacement (LEE). While some aEPEC require tyrosine phosphorylation (Y-P) of Tir to trigger actin assembling, certain strains whose Tir is not tyrosine phosphorylated utilize the T3SS effector Tir-cytoskeleton coupling protein (TccP/TccP2) for efficient actin polymerization. In the present study, we evaluated the prevalence, production, and functions played by the EspFU protein on important aspects of aEPEC pathogenesis, such as interaction with epithelial cells and intestinal colonization. The tccP and/or tccP2 genes were detected in 45.8% of the aEPEC strains, with a predominance of tccP2 allele. Most of these strains carried tirY-P, suggesting that can trigger actin polymerization using both Tir tyrosine phosphorylation and TccP/TccP2 pathways. aEPEC strains carrying tccP or tccP2 were significantly associated to phylogroups E and B1, respectively. We also observed a differential production of TccP/TccP2 among the strains, regardless genotypes and phylogeny. Deletion of espFU from aEPEC BA320 (serotype O55:H7) significantly decreased bacterial adherence and impaired the ability to induce actin rearrangement in HeLa cells after 6 h of infection. Also, the espFU mutant showed lower colonization levels compared to the wild-type strain in a murine infection model. Analysis of the kinetics of pedestal formation showed EspFU-expressing strains were more adherent and induced actin rearrangement more rapidly than Tir-phosphorylated (TirY-P) producing aEPEC. Importantly, bacterial adherence and pedestal formation driven by EspFU downregulated the LEE expression, and also induced changes in the epithelial transcriptional response, specifically by activating pro-inflammatory genes such as NKFB, IL6 and IL8. In summary, our data suggest that EspFU protein is widely and phylogenetically distributed among aEPEC strains, and play an important role on bacterial attachment and intestinal colonization. Moreover, aEPEC could induce inflammation in a EspFU-dependent manner.

Os mecanismos exatos que comprometem o sistema imune em estados de desnutrição ainda não estão totalmente esclarecidos, sendo que a desnutrição modifica a funcionalidade das células efetoras da resposta inflamatória/infecciosa, ocasionando menor síntese de citocinas pró-inflamatórias, além de ocasionar alterações da hemopoese. Macrófagos apresentam papel chave tanto na resposta imune inata quanto adaptativa, e apresentam alta taxa de utilização do aminoácido glutamina, que é fundamental para o fornecimento de energia e nitrogênio. Nesse contexto, verifica-se que o metabolismo da glutamina em macrófagos desempenha um papel importante para a síntese de citocinas, sendo que a síntese de diversas citocinas é dependente da concentração extracelular de glutamina. Dada a importância desse aminoácido no organismo e que sob condições de estresse sua manutenção encontra-se prejudicada e diante do fato de que macrófagos utilizam altas taxas desse aminoácido para seu funcionamento propusemo-nos a estudar alguns aspectos da influência desse aminácido sobre células macrofágicas em situação de desnutrição protéica. Camundongos BALB/c, machos, submetidos à desnutrição protéica, após perda de aproximadamente 20% do peso corpóreo, foram eutanasiados. Hemograma, mielograma, e análise das concentrações séricas de glutamina, proteínas totais, albumina e pré-albumina séricas foram realizadas. Células macrofágicas coletadas da cavidade peritonial foram cultivadas, in vitro, com glutamina, em diferentes concentrações, e a capacidade de produção de TNF-α, IL-1 e IL-10, bem como a expressão de moléculas envolvidas na ativação da via do fator de transcrição NF-κB, foram quantificadas. Animais desnutridos apresentaram diminuição da concentração de glutamina plasmática e aumento do corticosterona circulante. Anemia, leucopenia e severa redução na celularidade da medula óssea com comprometimento do setor mielóide foram evidenciadas nos animais desnutridos, bem como diminuição da celularidade da cavidade peritonial com redução da população de células macrofágicas. Os resultados demonstram que a glutamina apresenta um efeito dose dependente na ativação de macrófagos peritoniais cultivados in vitro e estimulados com LPS por 30 minutos, mostrando-se capaz de induzir a uma menor produção de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α e IL-1, e ao mesmo tempo aumentar a produção de IL-10, modulando negativamente a via de sinalização do fator de transcrição NF-κB, principal via para indução de genes da resposta inflamatória e imune, sendo essa modulação mais evidente nos animais desnutridos. Baseando-se nestes resultados, discutimos o papel do estado nutricional modificando a resposta do organismo frente a um estímulo inflamatório e o papel da glutamina, in vitro, em modular esse processo. / The exact mechanisms that commits the immune system in condition of malnutrition are still not fully understood, being that malnutrition modifies the functionality of effector cells in inflammatory/infectious response, leading a reduced synthesis of pro-inflammatory cytokines besides causing changes in hematopoiesis. Macrophages play an essential role on the innate and adaptive immune response, and have high utilization rate of the amino acid glutamine, which is essential for the supply of energy and nitrogen. In this context, it appears that the glutamine metabolism in macrophages is essential for the synthesis of cytokines and synthesis of several cytokines are dependent of the extracellular glutamine concentration. Given the importance of this amino acid in the body and knowing that in stress conditions situations its maintenance is impaired and besides that macrophages use high levels of this amino acid to function, we proposed to investigate some aspects of the influence of this amino acid on macrophages in a situation of protein malnutrition. BALB/c male, subjected to protein malnutrition, after attained about 20% loss of their original body weight were sacrificed. Hemogram, myelogram, and analysis of serum concentrations of glutamine, protein, albumin and prealbumin were evaluated. Macrophages collected from peritoneal cavity were cultivated, in vitro, with glutamine, at different concentrations and the TNF-α, IL-1 and IL-10 capacity of production, as well as the expression of molecules involved in the transcription factor NF-κB activation were evaluated. Malnourished animals showed lower plasma glutamine and increase of corticosterone levels. Anemia, leucopenia and severe reduction of cellularity of bone marrow with myeloid impaired, as well as reduction of the peritoneal cavity cellularity with reduced macrophages population were observed in malnourished animals. Data showed that glutamine has a dose dependent effect on peritoneal macrophages activation in vitro when stimulated with LPS for 30 minutes, being able to induce a decrease of pro-inflammatory cytokines production as TNF-α and IL-1, while at same time an increase of IL-10 production, modulating negatively the signaling pathway transcription factor NF-κB activation which is the main pathway to induce genes of the inflammatory and immune response, and this modulation was more pronounced in malnourished animals. Based on these results, we discuss the role of nutritional status modifying immune response face to inflammatory stimulus and the role of glutamine in vitro in modulating this process.