Introdução: Os aminoácidos de cadeia ramificada (ACR) compreendem três aminoácidos essenciais tais como, leucina (Leu), isoleucina (Ile) e valina (Val). Estes aminoácidos desempenham um papel importante no corpo humano, como a produção de energia, síntese de proteínas e de muitos neurotransmissores. São escassos os estudos que investigam o consumo de ACR e sua associação com as doenças cardiometabólicas. No entanto, estudos metabolômicos sugerem que os ACR encontrados no plasma podem ser preditores de doenças cardiometabólicas. Objetivos: Avaliar a ingestão de aminoácidos de cadeia ramificada (ACR), leucina (Leu), isoleucina (Ile) e valina (Val) e sua associação com fatores demográficos, socioeconômicos e estilo de vida, e com fatores de risco cardiometabólicos. Metodologia: Os dados foram provenientes do Inquérito de Saúde de São Paulo, estudo transversal de base populacional com amostra representativa de residentes do município de São Paulo, de ambos os sexos e com idade igual ou superior a 12 anos. O consumo alimentar foi avaliado por meio de dois recordatórios de 24 horas, não consecutivos. Utilizou-se um questionário estruturado para obter informações socioeconômicas, demográficas e de estilo de vida. Também foram coletadas amostras de sangue, pressão arterial, o peso, a estatura e circunferência da cintura dos indivíduos. Os analitos avaliados foram glicemia plasmática de jejum, triacilgliceróis (TG), lipoproteína de alta densidade (HDL), lipoproteína de baixa densidade (LDL), colesterol total (CT), proteína C reativa ultrassensível (PCRu), homocisteína e leptina séricas (LEP). As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software Stata®, versão 13 com nível de significância de 0,05. Resultados: A ingestão total de ACR foi de 217,14 mg / kg×d (Leu: 97,16 mg / kg×d, Ile: 56,44 mg / kg×d, Val: 63,54 mg / kg×d). Em adolescentes a ingestão de ACR foi negativamente associada ao sexo feminino e a raça autodeclarada não branca. Nos adultos a ingestão de ACR foi negativamente associada ao sexo feminino e fumantes. A renda familiar per capita foi positivamente associada nos adolescentes e adultos. E não foram observadas associações no grupo de idosos. Os principais alimentos contribuintes para a ingestão de ACR foram carne vermelha não processada, aves não processadas, pão e torrada, feijão e arroz. Após o ajuste para potenciais fatores de confusão, o maior consumo de ACR total para o grupo de adultos e idosos (OR = 1,89, 95 por cento IC = 1,09 - 3,27), leucina (OR = 1,93, 95 por cento IC = 1,11 - 3,35), isoleucina (OR = 2,09, 95 por cento IC = 1,23 - 3,54) e valina (OR = 1,98, 95 por cento IC = 1,17 - 3,32) foram positivamente associados com hipertensão. E o mesmo foi observado para o modelo ajustado entre o maior consumo de ACR total (OR = 2,06, 95 por cento IC = 1,18 - 3,59), leucina (OR = 2,08, 95 por cento IC = 1,20 - 3,59), isoleucina (OR = 1,93, 95 por cento IC = 1,10 - 3,39) e valina (OR = 1,98, 95 por cento IC = 1,14 - 3,42) com hipertrigliceridemia. Conclusão: Os adolescentes e os adultos foram os grupos que mais se associaram a ter a ingestão de ACR influenciada por fatores demográficos, socioeconômicos e de estilo de vida. Dentre os fatores de risco cardiometabólicos, destacaram-se a hipertensão e a hipertrigliceridemia como fatores positivamente associados com o maior consumo de ACR total, leucina, isoleucina e valina. Esses resultados reforçam a importância da investigação do limite tolerável de ingestão dos ACR, bem como sua associação nos diferentes desfechos em saúde. / Introduction: Branched chain amino acids (BCAA) comprise three essential amino acids such as leucine (Leu), isoleucine (Ile) and valine (Val). These amino acids play an important role in the human body, such as energy production, protein synthesis and many neurotransmitters. There are few studies that investigate BCAA consumption and its association with cardiometabolic diseases. However, metabolic studies suggest that BCAA found in plasma may be a predictor of cardiometabolic diseases. Objectives: To evaluate the intake of branched chain amino acids (BCAA), leucine (Leu), isoleucine (Ile) and valine (Val) with demographic, socioeconomic and lifestyle factors, and to investigate the intake of BCAA with cardiometabolic risk factors. Methods: Data were obtained from the Health Survey of São Paulo, a population-based cross-sectional study with a representative sample of residents of the city of São Paulo, of both sexes and aged over 12 years. Dietary intake was evaluated by two 24-hour dietary recalls and a structured questionnaire was used to obtain socioeconomic, demographic and lifestyle information. Blood samples were collected and blood pressure, weight, height and waist circumference were measured. The analyzed analytes were fasting plasma glucose, triacylglycerols (TG), high-density lipoprotein cholesterol (HDL), low-density lipoprotein cholesterol (LDL), C-reactive protein (PCRu), homocysteine and serum leptin (LEP). All analyses were performed with Stata®, version 13 and a p-value < 0.05 was considered statistically significant. Results: Total BCAA intake was 217.14 mg/kg.day (Leu: 97.16 mg/kg.day; Ile:56.44 mg/kg.day; Val: 63.54 mg/kg.day). BCAA intake was negatively associated with female sex in adolescents and adult groups, with no white race in adolescents, and with former smoker status in adults. Conversely, BCAA was positively associated with household per capita income in adolescents and adults. No associations were observed in the older adults group. Main food contributors to BCAA for all ages were unprocessed red meat, unprocessed poultry, bread and toast, beans and rice. For the group of adults and older adults, after adjusting for potential confounding factors, higher intakes of total BCAA (OR = 1,89, 95 per cent CI = 1,09 - 3,27), leucine (OR = 1,93, 95 per cent CI = 1,11 - 3,35), isoleucine (OR = 2,09, 95 per cent CI = 1,23 - 3,54) e valine (OR = 1,98, 95 per cent CI = 1,17 - 3,32) were positively associated with hypertension. The same was observed for the adjusted model between the highest consumption of total BCAA (OR = 2,06, 95 per cent CI = 1,18 - 3,59), leucine (OR = 2,08, 95 per cent CI = 1,20 - 3,59), isoleucine (OR = 1,93, 95 per cent CI = 1,10 - 3,39) and valine (OR = 1,98, 95 per cent CI = 1,14 - 3,42) with hypertriglyceridemia. Conclusion: Adolescents and adults were the most vulnerable to having their BCAA intake influenced by demographic, socioeconomic and lifestyle factors. Among the cardiometabolic risk, hypertension and hypertriglyceridemia were positively associated with higher intake of total BCAA, leucine, isoleucine and valine. These results reinforce the importance of investigating the tolerable limit of intake of BCAA, as well as its association in different health outcomes.

Embriões somáticos de Ocotea catharinensis foram utilizados como modelo para a investigação da via biossintética para a formação de neolignanas com esqueleto benzofurânico, através do uso de precursores marcados com 13C e análise dos produtos por RMN de 13C. Isotopômeros de L-[13C]-fenilalanina administrados aos embriões, foram incorporados às neolignanas 5\'-metoxiporosina e armenina B . Entre os precursores intermediários, o acetato de [8-13C]-coniferila, preparado a partir da condensação de Knoevenagel seguido de várias etapas, foi incorporado na neolignana 5\'-metoxiporosina. No ensaio de bioconversão utilizando frações proteicas das culturas dos embriões de O. catharinensis, o acetato de coniferila foi convertido em isoeugenol que, junto com o eugenol, seriam os precursores hipotéticos para a formação dessas neolignanas. A análise filogenética de diversas espécies de Lauraceae indicou a proximidade entre espécies do gênero Ocotea, produzindo como principais metabólitos lignanas e neolignanas. Foi obtida a seqüência parcial do gene de proteína dirigente em O. catharinensis e O. macrophylla e a análise filogenética baseada na homologia das seqüências de proteína dirigente de Ocotea e de espécies de diferentes gêneros, indicaram um clado distinto formado para espécies de Ocotea. Estes dados dão suporte para a proposta de que neolignanas di-hidrobenzofurânicas seriam oriundas do acoplamento oxidativo entre unidades de E-isoeugenol e 5-metóxi-eugenol, com possível participação de proteína dirigente na regio- e estereoespecificidade das reações de dimerização . Baseando-se nestes resultados foi possível propor algumas etapas envolvidas na biossíntese de neolignanas. / Somatic embryos of Ocotea catharinensis were used as model to investigate the biosynthetic pathway of benzofuran neolignans formation by means of feeding precursors followed by analysis with 13C NMR. Isotopomers of L-[13C]-phenylalanine were administered to embryos and incorporated into di-hydrobenzofuran neolignans. Among the intermediate precursors, [8-13C]-coniferyl acetate, prepared by Knoevenagel and several steps, was incorporated in the neolignan 5\'-methoxyporosin. The studies of bioconversion using protein fraction obtained from the embryogenic cultures, the precursor coniferyl acetate was converted into isoeugenol, which together eugenol, is one of the putative precursors to the neolignans formation. Phylogenetic analysis of several species of Lauraceae indicated the proximity of Ocotea species producing lignans and neolignans as the main metabolites. A partial sequence of the dirigent protein gene from O. catharinensis and O. macrophylla were obtained and the phylogenetic analysis based on homology of dirigent protein sequences from Ocotea and from different plant genus indicated a distinct clade formed by Ocotea species. These findings support the hypothesis that the dihydrobenzofuran neolignans would be derived from the oxidative coupling between E- isoeugenol and 5- methoxy-eugenol and the dirigent protein would be involved in the regio- and stereospecificity of the dimerization reactions. Thus, it was possible to suggest some of the steps involved in the biosynthesis of neolignans.

Neospora caninum é um protozoário Apicomplexa, parasita intracelular obrigatório que possui o cão como hospedeiro definitivo e principalmente os bovinos como hospedeiros intermediários, causando nos primeiros encefalopatia e nos últimos abortos com perda da fertilidade, o que acarreta prejuízos significativos na pecuária mundial. O parasita necessita multiplicar de modo intra-celular, utilizando a descarga de proteínas contidas em organelas filo-específicas, como as micronemas que liberam proteínas relacionadas a adesão e invasão ativa, além das roptrias e os grânulos densos. Este trabalho foi realizado sobre um tipo de proteína micronêmica denominada proteína Anônima Relacionada à Trombospondina (TRAP), relacionada à adesão e ligação com o motor intracelular, responsável pelo processo ativo de invasão. TRAP 1 já havia sido descrita pela literatura e o objetivo deste trabalho foi a caracterização molecular do até então desconhecido homólogo TRAP 2, com expressão de suas formas recombinantes e o uso de seus respectivos anti-soros para ensaios funcionais e localização da proteína nativa. Com base em banco dados de ESTs e genômicos de N. caninum e fazendo uso de RLM-RACE (Reação mediada por RNA ligase- amplificação rápida dos términos de cDNA-RNA,) foi possível a obtenção da sequencia completa do gene NcTrap 2, que possui quatro éxons separados por três íntrons. Sua forma protéica, como seu homológo, é formado por um peptídeo sinal, uma integrina, cinco trombospondinas, uma região transmembrana e a cauda citoplasmática. A integrina e as trombospondinas são motivos relacionados à adesão para início do processo invasivo e foram os alvos deste trabalho. Foram expressos dois recombinantes a partir deste cerne funcional (integrina e trombospondinas), com 52 e 78 kDa, e seus respectivos anti-soros foram obtidos. Estes foram utilizados em western blots 1D e 2D para localização da forma nativa de NcTRAP 2 de aproximadamente 80 kDa no extrato total e de sua forma processada no ESA (extrato secretado, simulando o momento invasivo do taquizoíta) com 70 kDa. O soro contra o recombinante 1 teve a capacidade de inibir o processo invasivo em valores de 53 a 61%, dependendo do método utilizado (contagem manual ou real time PCR). NcTRAP 2 foi encontrada no complexo apical parasitário do taquizoíta por imunofluorêscencia confocal, evidenciando sua provável localização nas micronemas. A nova molécula, NcTRAP 2 possui características que a diferencia de NcTRAP 1 o suficiente para ser considerada homóloga. O soro contra sua forma recombinante detectou as formas nativas integral e secretada e demonstrou que NcTRAP 2 possui capacidade de inibir a invasão dos taquizoítas, o que a torna um interessante alvo vacinal. / Neospora caninum is an Apicomplexan protozoan, obligatory intracellular parasite that has the dog as definitive host and especially cattle as intermediate hosts, causing in the first ones encephalopathy and in the last ones abortion with fertility losses. Such facts lead to significant losses to livestock worldwide. The parasite must invade the cells for its development, using the discharge of proteins contained in phylum-specific organelles, like the micronemes proteins related with adhesion and active invasion, besides the proteins from rhoptries and dense granules. This work was performed on a type of micronemic protein, a thrombospondin-related anonymous protein (TRAP), related with adhesion and connection with the intracellular motor responsible for the active process of invasion. Based on the homologue previously described in the literature, TRAP 1, the aim of this study was the characterization of the undescribed TRAP 2 homologue, the expression of its recombinant forms, the use of its anti-sera for functional assays, and detection of its native form. Based on ESTs and genomic data from N. caninum, and using the RLM-RACE (ligase mediated rapid amplification of cDNA ends) technique, the complete sequence of NcTRAP 2 was obtained, which had four exons separated by three introns. As NcTRAP 1, the protein sequence is composed of a signal peptide, an integrin, five thrombospondin, a transmembrane region and a cytoplasmatic tail. The integrin and thrombospondin motifs are related to adhesion for initiation of the invasive process and were the targets of this work. We expressed two recombinant fragments from the functional core (thrombospondin and integrin), with 52 and 78 kDa, which were utilized for antisera production. The anti-sera localized the native form NcTRAP 2 which had approximately 80 kDa, and its processed form in ESA (Excreted/Secreted Antigen) with 70 kDa, both in western blot 1D and 2D. The serum against recombinant 1 had the ability to inhibit the invasive process from 53 to 61%, depending on the experimental method used (manual counting or real time PCR). NcTRAP 2 was localized at the apical complex of the parasite of the tachyzoites by confocal immunofluorescence, pointing towards its micronemal localization. The new molecule, NcTRAP 2, holds features that differentiates it from NcTRAP 1 in a substantial way to be considered homologue. The serum against the recombinant form detected the native full length and secreted forms of NcTRAP 2 and demonstrated that NcTRAP 2 has the ability to inhibit the invasion of tachyzoites, turning it into an interesting vaccine target to be investigated.

Avaliaram-se diferentes níveis de proteína bruta para perus de corte fêmeas, utilizando-se 576 aves de zero a 84 dias (Experimento I), 550 aves de 28 a 56 dias (Experimento II) e 550 aves dos 57 aos 84 dias de idade (Experimento III). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com seis tratamentos e seis repetições. Nos três experimentos, as dietas dos tratamentos eram isoenergéticas, sendo à base de milho e farelo de soja, a suplementação dos aminoácidos foram realizadas, quando necessário. No Experimento I, a fase inicial recebeu tratamentos correspondentes aos níveis 23, 24, 25, 26, 27 e 28% de PB, em dietas com 3020 kcal de EM/kg. Nas duas fases seguintes (fase de ganho compensatório) as dietas foram de 26 e 23% de PB e com 3100 e 3250 de EM/kg para as fases de crescimento e final, respectivamente. No Experimento II, os tratamentos corresponderam aos níveis de 21, 22, 23, 24, 25 e 26% de PB, em dietas com 3100 de EM/kg. No Experimento III, os níveis para os tratamentos foram: 17, 18, 19, 20, 21 e 22% de PB, com 3250 de EM/kg. As variáveis avaliadas foram ganho de peso, consumo de ração, conversão alimentar, composição e deposição de nutrientes corporais, e na fase final (do primeiro e terceiro experimento) as características e rendimento de cortes na carcaça. Na fase inicial, do Experimento I, os níveis de PB dietéticos influenciaram o consumo de ração, consumo de PB e excreção de nitrogênio, constatando-se resposta (P<0,001) linear crescente. Observou-se efeito (P<0,01) quadrático para peso vivo e ganho de peso. Dos componentes químicos, expressos em porcentagem na carcaça, houve resposta (P<0,001) quadrática para todas as variáveis. Nas fases posteriores não houve resposta para nenhuma variável, observando-se um efeito de ganho compensatório, possibilitando a redução protéica na fase inicial. No Experimento II, houve resposta linear crescente para as variáveis de peso vivo, consumo de ração, ganho de peso, deposição de proteína e água. As variáveis restantes não apresentaram resposta significativa (P>0,05), o nível de 26% foi estabelecido como melhor nível para desempenho e deposição de nutrientes nesta fase. Foram encontradas respostas no desempenho, excreção de nitrogênio e composição química, no experimento III, apenas a viabilidade não foi influenciada pelo nível de PB, todas as outras variáveis obtiveram resposta linear decrescente (P<0,05). Para as variáveis de rendimento de abate, houve resposta linear para o rendimento de carcaça (P<0,01) e quadrática para rendimento de peito e peito sem pele e osso, permitindo uma redução para 17% de PB na fase final. Essas informações obtidas nos três experimentos confirmam que a redução de PB pode ser feita sem prejudicar o desempenho e a deposição protéica, reduzindo a excreção de nitrogênio. / Was evaluated at different levels of crude protein for female turkeys, using 576 birds from zero to 84 days (Experiment I), 550 birds 28-56 days (Experiment II) and from 57 to 550 birds 84 days (Experiment III). The experimental design was completely randomized with six treatments and six repetitions. In three experiments, the diets were isocaloric treatments, being based on corn and soybean meal supplementation of amino acids were supplemented when necessary. In Experiment I, the initial treatment received corresponding to levels 23, 24, 25, 26, 27 and 28% CP in diets with 3020 kcal / kg. In the next two phases (phase of compensatory growth) diets were 26 and 23% CP and 3100 and 3250 / kg for the grower and finisher phases, respectively. In Experiment II, the treatments were to levels 21, 22, 23, 24, 25 and 26% CP in diets with 3,100 / kg. In Experiment III, levels for the treatments were: 17, 18, 19, 20, 21 and 22% CP with 3,250 / kg. The parameters evaluated were weight gain, feed intake, feed conversion, composition and body nutrient deposition, and the final stage (the first and third experiment) the characteristics and yield of the carcass. In the initial phase of Experiment I, the levels of dietary CP influenced feed intake, CP intake and nitrogen excretion, we noted the response (P <0.001) increased linearly. Effect was observed (P <0.01) quadratic for body weight and weight gain. Of chemical components, expressed in percentage in the carcass was no response (P <0.001) quadratic for all variables. In later stages there was no answer for any variable, observing an effect of compensatory growth, leading to a protein in the initial phase. In Experiment II, there was a linear correlation for the variables of body weight, feed intake, weight gain, protein deposition and water. The remaining variables showed no significant response (P> 0.05), the level of 26% was established as a better standard for performance and nutrient deposition at this stage. Responses were found in performance, nitrogen excretion and composition in experiment III, only the viability was not affected by CP level, all other variables had decreased linearly (P <0.05). Variables of income for the slaughter, linear response to the carcass (P <0.01) and quadratic for breast meat yield and breast without skin and bone, allowing a reduction to 17% CP in the finals. This information obtained from the three experiments confirm that the reduction of CP can be done without sacrificing performance and protein deposition, reducing nitrogen excretion.

A dengue é uma doença causada por um dos quatro sorotipos de vírus da dengue (DENV 1-4), e representa a principal arbovirose que atualmente atinge seres humanos. Dentre as maiores dificuldades para o desenvolvimento de uma vacina eficaz contra o DENV, correlaciona-se a falta de conhecimento mais preciso sobre os epítopos presentes na superfície do vírus, responsáveis para indução de anticorpos neutralizantes sem promoverem a exacerbação da infecção viral. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi identificar epítopos presentes na superfície do DENV2 capazes de gerar anticorpos neutralizantes sem promover a amplificação viral frente a células que expressem receptores FcR. Avaliamos também a influência dos adjuvantes (LT, LT-K63 e LTB), na modulação da resposta de anticorpos para epítopos presentes nos domínios I, II e III da proteína de envelope do DENV2. Observamos que a administração das LTs como adjuvantes proporcionaram a potencialização da resposta de anticorpos IgG EDI/II ou EDIII-específicos nos animais imunizados, em relação aos outros grupos vacinais. Em relação à qualidade da resposta humoral proporcionada pelas imunizações, os anticorpos antígeno-específicos gerados com LT, LT-K63 ou LTB apresentaram maior capacidade de neutralização viral em comparação com aqueles obtidos dos demais grupos vacinais. Demonstramos de forma inédita através da análise de imunoassinatura dos anticorpos IgG EDIII-específicos, que a administração de LT e LTB como adjuvante vacinal, permitiu a identificação de um epítopo localizado na alça EF e FG da proteína EDIII de DENV2. Além disso, por meio da utilização de um peptídeo 47 contendo a sequência correspondente ao epítopo identificado, foi capaz de inibir a infecção do DENV2, tão bem quanto, a proteína EDIII em ensaios in vitro. Podemos perceber, que a utilização do adjuvante LT e seu derivado atóxico LTB em formulações vacinais, possibilitaram a modulação de anticorpos capazes de reconhecer epítopos presentes no EDIII, importantes para a neutralização viral. Esses resultados, permitem o desenvolvimento de novos antígenos alvos para estratégias vacinas voltadas para o controle dos DENV. / Dengue is a disease caused by one of four dengue virus serotypes (DENV 1-4), represents the main arbovirose that currently affects humans. Among the greatest difficulties for the development of effective vaccine against DENV is the lack of more precise knowledge about the epitopes present at the surface of the virus, responsible for the induction of neutralizing antibodies without promoting the exacerbation of viral infection. Thus, the objective of the present work was to identify epitopes present on the surface of DENV2 capable of generating neutralizing antibodies without promoting viral amplification against cells expressing the FcR receptors. We also evaluated the influence of adjuvants (LT, LT-K63 and LTB) on the modulation of the antibody response to epitopes present in domains I, II and III in envelope protein of DENV2. We have observed that administration of LTs as adjuvants provided potentialization of the antibodies response IgG EDI/II or EDIII-specific in the immunized animals, relative to the other vaccine groups. Regarding the quality of the humoral response provided by the immunizations, the antigen-specific antibodies generated with LT, LT-K63 or LTB presented higher viral neutralization capacity compared to those obtained from the other vaccine groups. We demonstrated through the immunoassay analysis of EDIII-specific IgG antibodies that the administration of LT and LTB as a vaccine adjuvant allowed the identification of an epitope located in the EF and FG loop of the EDIII protein of DENV2. Furthermore, by using a peptide 47 containing the sequence corresponding to the identified epitope, was able to inhibit DENV2 infection as well as the EDIII protein in vitro assays. It can be seen that the use of the LT adjuvant and its non-toxic derivative LTB in vaccine formulations enabled the modulation of antibodies capable of recognizing epitopes present in EDIII, which are important for viral neutralization. These results allow the development of new target antigens for vaccine strategies aimed at the control of DENV.

Organic hydroperoxide resistance (Ohr) proteins are highly efficient thiol-based peroxidases that play central roles in bacterial response towards organic hydroperoxides. In Fungi, Ohr frequently presents a N-terminal extension, which is predicted to target them to mitochondria. The catalytic triad of Ohr comprises the peroxidatic Cys (Cp), the catalytic Arg (Rc) and a Glu (Ec) are fully conserved and interact among themselves by a salt bridge network in a reduced form of the enzyme (the so-called closed state). After getting oxidized to sulfenic acid (Cys-SOH), Cp condenses with the sulfhydryl group of resolution Cys (Cr) in a disulfide bond. The absence of negativity of the thiolate (RS-) in Cp facilitates the opening of the Arg-loop (containing the Rc) away from the active site, generating the so-called open state. However, the molecular events associated with the high reactivity of Ohr enzymes towards hydroperoxides and its specific reducibility by the dihydrolipoamide (DHL) or by lipoylated proteins were still elusive before this work. Additionally, several factors support the idea of Ohr as a target for drug development: (i) Ohr displays unique physicochemical properties; (ii) bacteria mutant for Ohr (&Delta; ohr) are highly sensitive to oxidative stress; (iii) the indications that Ohr might be involved in bacterial virulence; and (iv) its absence in mammals and vascularized plants. In this thesis, several aspects of Ohr enzymes were evaluated. In chapter 2, we biochemically characterized the Ohr homologs from the ascomycete fungus Mycosphaerella fijiensis Mf_1 (MfOhr), the causative agent of Black Sigatoka disease in banana plants, which presented extraordinary reactivity towards linoleic acid hydroperoxides (kobs = 3.18 (± 2.13) ×108 M-1.s-1). Furthermore, through subcellular fractionation of M fijiensis protoplast cells followed by western blot analysis, we confirmed the in silico prediction that MfOhr is a mitochondrial protein. In chapter 3 and 4, we described seven new crystallographic structures from two opportunistic pathogen, one from Xylella fastidiosa and six from Chromobacterium violaceum (including the first representative of the complex between Ohr and its biological reductant, DHL). Taken together these structures might represent new snapshots along the catalysis. Furthermore, several molecular modelling approaches, such as classical mechanics (MM), steered molecular dynamics (SMD), hybrid quantum mechanics (QM-MM) and together with enzymatic assays of point mutations, indicated that Ohr underwent unique structural switches to allow an intermittent opening (oxidized state) and returning to a more stable closed form (reduced state) of an Arg-loop along catalysis. Remarkably, dihydrolipoamide directly assisted the closing the Arg-loop and thereby the turnover of the enzyme. In chapter 5, we describe the identification of two compounds (C-31 & C-42) that could represent a framework for further studies attempting to find specific Ohr inhibitors, either through ab initio design of chemical compounds and virtual screening using pharmacophoric models. The IC50 calculated for C-31 and C-42 were 124.4-248.5 µM and 243.3-321.7 µM, respectively. Finally, this thesis highlights several new aspects related to Ohr function: 1 - evidence that eukaryotic Ohr are preferentially located in mitochondria and share several biochemical properties with the prokaryotic ones; 2 - the network of polar interactions among residues of the catalytic triad (Cp, Rc and E) strongly contributed to stabilize Ohr in the closed state, in an optimum configuration for hydroperoxide reduction; 3 - evidence that disulfide bond formation and the product release (alcohol derived from hydroperoxide reduction) facilitate the opening of the Rc loop to an intermediate state (probably not to the excessively open state presented in crystallographic structures); 4 - mapping the interactions between the biological reductant (DHL) and the Ohr active site; 5 - strong indications that DHL is not able to fit and react with Ohr in the close conformation; 6 - the first trials for search of molecules to specifically target Ohr proteins, although further assays must be performed to verify the specificity of the selected compounds to target Ohr. Therefore, we describe relevant new information for an antioxidant protein that displays highly efficient catalysis, comparable to other very important hydroperoxide removing enzymes, such as GSH peroxidase and peroxiredoxin / As proteínas Ohr (Organic hydroperoxide resistance) são peroxidases dependente de tiól extremamente eficientes e têm um papel central na resposta das bactérias contra peróxidos orgânicos. Em fungos, as proteínas Ohr apresentam uma extensão N-terminal, cujo predições in silico apontam estar associada ao direcionamento da proteína para a mitocôndria. A tríade catalítica é composta pela cisteína peroxidatic (Cp), a arginina (Rc) e o glutamato (Ec) catalíticos que são totalmente conservados e interagem entre eles por uma rede de interações de ponte salina, na forma reduzida da proteína (conformação fechada). Após se tornarem oxidadas em ácido sulfênico (Cis-SOH), a Cp condensa com o grupo sulfidrila da cisteína de resolução (Cr) numa ligação disulfeto. A ausência da carga negativa do tiolato (RS-) da Cp facilita a abertura da alça que contem a Rc para longe do centro ativo, gerando a conformação aberta. No entanto, os eventos moleculares associados a alta reatividade das enzimas Ohr contra hidroperóxidos e a sua redução pela dihydrolipoamida (presente em proteínas lipoiladas), ainda está descrita de forma bem superficial. Adicionalmente, vários fatores suportam a ideia de que a Ohr seria um potencial alvo para o desenvolvimento de drogas: (i) a Ohr exibe propriedade físico-químicas únicas; (ii) as bactérias mutantes para Ohr (&Delta;ohr) são fortemente sensíveis ao stress oxidativo; (iii) indicações de que a Ohr poderá está envolvida na virulência de várias bactérias; e (iv) a ausência de Ohr em mamíferos e plantas vascularizadas. Nesta tese, vários aspetos relacionados com as enzimas Ohr foram avaliados. No Capitulo 2, foi caracterizada bioquimicamente a proteína Ohr homologa de fungo ascomiceto, Mycosphaerella fijiensis Mf_1 (MfOhr), o agente causador da doença de bananas, Sigatoka-negra. A enzima apresentou eficiente atividade contra peroxido de ácido linoleico (kobs = 3.18 (± 2.13) ×108 M-1.s-1). Além disso, através do fracionamento sub celular de protoblasto de M fijiensis seguido de western blot, foram confirmadas as predições in silico de que a MfOhr é uma proteína mitocondrial. No capítulo 3 e 4, foram descritas sete estruturas cristalográficas oriundas de dois patógenos oportunistas, uma de Xylella fastidiosa e seis de Chromobacterium violaceum (incluindo o primeiro representante do complexo entre a Ohr e o seu redutor biológico, DHL). Estas estruturas poderão representar diferentes conformações ao longo do ciclo catalítico. Adicionalmente, várias abordagens de modelagem molecular, tais como mecânica clássica (MM), mecânica molecular direcionada (SMM) e mecânica quântica híbrida (QM-MM), juntamente com ensaios experimentais com mutações pontuais, indicaram que a Ohr sofre várias mudanças conformacionais para permitir uma abertura intermitente (estado oxidado) e o retorno para uma conformação fechada mais estável (estado reduzido) da alça da arginina ao longo da catálise. Notavelmente, a dihydrolipoamide assistiu diretamente o fechamento da alça da arginina e por consequência o turnover da enzima. No capítulo 5, foi descrita a identificação de dois compostos (C-31 e C-42) que representam estudos iniciais com a finalidade de encontrar inibidores específicos para a enzima Ohr. Estes compostos foram encontrados por ab initio design e por varrimento virtual com o uso de modelos farmacofóricos. Os IC50 calculados para o C-31 e C-42 foram de 124.4-248.5 µM e 243.3-321.7 µM, respectivamente. Finalmente, esta tese descreve vários aspetos relacionados com a função da Ohr: 1 - evidências que as Ohr de eucariotos estão preferencialmente localizadas na mitocôndria e partilham várias propriedades bioquímicas com as Ohr de bactéria; 2 - a rede de interações polares entre os resíduos da tríade catalítica (Cp, Rc e Ec) contribuem fortemente para a estabilização do estado fechado, a configuração ótima para a redução de hydroperoxidos; 3 - evidências de que a formação da ligação disulfeto e a liberação do produto (álcool derivado da redução do hydroperoxido) facilitam a abertura da alça da arginina até um estado intermediários (provavelmente não o estado totalmente exposto apresentado nas estruturas cristalográficas) 4 - o mapeamento das interações entre o redutor biológico no centro ativo da Ohr; 5 - fortes indicações de que a DHL não é capaz de interagir e reagir com a Ohr na conformação fechada; 6 - os primeiros ensaios para a procura por moléculas que especificamente interajam com a Ohr, apesar de que futuros ensaios terão de ser executados para verificar a especificidade dos compostos selecionados. Assim, nós descrevemos nova informação relevante sobre uma proteína antioxidante que exibe uma alta eficiência catalítica, comparável com outras importantes enzimas removedores de hydroperoxidos, tais como glutationa peroxidases e peroxiredoxinas

Papilomavírus (PVs) são vírus amplamente estudados, sendo enfatizada sua capacidade de infectar os tecidos epitelial e mucoso em diversos animais, incluindo humanos, causando lesões benignas que podem, ocasionalmente, resultar em câncer. Dentre os gêneros que infectam animais, os Deltapapillomavirus têm uma importância veterinária, ecológica e histórica, pois são capazes de infectar seu hospedeiro natural e outros animais. Por isso, esse trabalho contempla todos os tipos virais pertencentes aos Delta-PVs, incluindo sua história. Dentre as proteínas traduzidas pelos PVs, três são consideradas proteínas oncogênicas: E5, E6 e E7. Determinar a estrutura de uma proteína é crucial para a elucidação da sua função, possibilitando aplicações nas áreas de engenharia de proteínas, anotação genômica e desenho racional de fármacos. A estrutura tridimensional da proteína E6 de cada tipo viral pertencente ao gênero Deltapapillomavirus foi determinada por modelagem molecular por homologia. A história evolutiva dessas proteínas foi avaliada com base na geração de árvores filogenéticas e suas propriedades físico-químicas foram analisadas. Além disso, devido ao seu alto grau de conservação, a E6 demonstrou ser útil como um marcador molecular. Apesar de serem consideradas raras, foram observadas lesões papilomatosas em carneiros em uma fazenda do estado de São Paulo. Foi realizado o diagnóstico molecular dessas lesões. Os resultados mostraram pela primeira vez no mundo que, apesar de serem ovinos, o agente causador da papilomatose era um papilomavírus bovino, o BPV2, um Delta-PV. Logo, além de discutir os Delta-PVs, esta tese demonstra na prática a habilidade desse gênero em romper a barreira espécie-específica. / Papillomaviruses (PVs) are widely studied viruses, emphasizing their ability to infect the epithelial and mucosal tissues in several animals, including humans, causing benign lesions that may occasionally result in cancer. Among the genera that infect animals, Deltapapillomaviruses have a veterinary, ecological and historical importance because they are capable of infecting their natural host and other animals. Therefore, this work contemplates all viral types belonging to the Delta-PVs, including their history. Among the proteins translated by the PVs, three of them are considered oncogenic proteins: E5, E6 and E7. Determining the structure of a protein is crucial to the elucidation of its function, allowing applications in the areas of protein engineering, genomic annotation and rational design of drugs. The three-dimensional structure of the E6 protein of each viral type belonging to the genus Deltapapillomavirus was determined by molecular modeling by homology. The evolutionary history of these proteins was evaluated based on the generation of phylogenetic trees and their physicochemical properties were analyzed. In addition, due to its high degree of conservation, E6 has been shown to be useful as a molecular marker. Despite being considered rare, papillomas lesions were observed in sheep on a farm in the state of São Paulo. The molecular diagnosis of these lesions was performed. The results showed for the first time in the world that, despite being ovines, the causative agent of papillomatosis was a bovine papillomavirus, BPV2, a Delta-PV. Thus, in addition to discussing Delta-PVs, this thesis demonstrates in practice the ability of this genre to break the species-specific barrier.

Este estudo analisou a influência de diferentes superfícies de titânio na adesão, proliferação e diferenciação de células semelhantes a osteoblastos de rato (osteo-1) em culturas, na presença ou não da proteína morfogenética óssea recombinante-2 (rhBMP-2). As células osteo-1 foram cultivadas sobre as seguintes superfícies de titânio: 1. superfície lisa, 2. superfície desgastada com partículas de areia e condicionamento ácido (SLA) e 3. superfície desgastada com partículas de areia e condicionamento ácido sob proteção de nitrogênio e armazenadas em solução isotônica de cloreto de sódio (SLActive), na presença ou não de 20 ng/ml de rhBMP-2. Foram analisadas a adesão celular em 24 horas, o conteúdo total de proteínas, o conteúdo de colágeno e a atividade de fosfatase alcalina em 7, 14 e 21 dias e a formação de nódulos calcificados em 21 dias. Os resultados mostraram que a adesão não foi influenciada nem pelo tipo de superfície nem pelo tratamento com rhBMP-2 (p=0,0936). Quando relacionamos o conteúdo total de proteínas ao número total de células, percebemos que a proliferação não foi influenciada pelo tipo de superfície de titânio, porém a adição de rhBMP-2 levou a uma redução estatisticamente significante na superfície SLA aos 21 dias (p=0,0000). Em relação à diferenciação, pudemos observar que o tipo de superfície não influenciou o conteúdo total de proteínas, o conteúdo de colágeno e a formação de nódulos calcificados em quaisquer dos períodos analisados. A atividade de fosfatase alcalina somente foi influenciada pelo tipo de superfície aos 14 dias, onde o grupo C/SLAactive apresentou valores inferiores ao grupo C/Liso (p=0,0000). A adição de rhBMP-2 promoveu uma maior influência sobre o processo de diferenciação, levando a uma redução estatisticamente significante no conteúdo total de proteínas na superfície SLA aos 21 dias (p=0,0000), a um aumento estatisticamente significante no conteúdo de colágeno na superfície SLActive no período de 7 dias (p=0,0005) e a uma diminuição estatisticamente significante na atividade de fosfatase alcalina na superfície lisa nos períodos de 14 e 21 dias, na superfície SLA aos 14 dias e na superfície SLActive aos 21 dias (p=0,0000). Somente a formação de nódulos calcificados não sofreu influência da adição de rhBMP-2. / This study has analyzed the influence of different titanium surfaces in the adhesion, proliferation and differentiation of rat osteoblast-like cells (osteo-1 culture), in the presence or not, of the recombinant bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2). The osteo-1 cells were grown on the following titanium surfaces: 1. smooth surface; 2. coarse grit-blasted and acid-etched surface (SLA); and 3. coarse grit-blasted and acid-etched surface under nitrogen protection, and stored in sodium chloride isotonic solution (SLActive), in the presence or not, of 20 ng/ml of rhBMP-2. It was analyzed the cell adhesion in 24 hours, the total protein content, the collagen content, and the alkaline phosphatase in 7, 14 and 21-day periods, and also the formation of calcified nodules in 21 days. The results showed that the adhesion was neither influenced by the surface type, nor by the treatment with rhBMP-2 (p=0.0936). When we related the total protein content to the total number of cells, we noticed that the proliferation was not influenced by the titanium surface type; however, the addition of rhBMP-2 led to a statistically significant reduction on the SLA surface at 21 days (p=0.0000). Concerning the differentiation, we could observe that the surface type did not influence the total content of proteins, the collagen content and the formation of calcified nodules in any of the analyzed periods. The alkaline phosphatase activity was only influenced by the surface type at 14 days, where the group C/SLActive presented lower values than the group C/Smooth (p=0.0000). The addition of rhBMP- 2 promoted a bigger influence over the differentiation process, thus leading to a statistically significant reduction in the total protein content on the SLA surface at 21 days (p=0.0000), a statistically significant increase in the collagen content on the surface SLActive in the 7-day period (p=0.0005), a statistically significant reduction in the alkaline phosphatase activity on the smooth surface in the 14 and 21-day periods, on the SLA surface at 14 days, and on the SLActive surface at 21 days (p=0.0000). Only the formation of calcified nodules did not undergo influence of the rhBMP-2 addition.

Uma das alternativas possíveis para substituir os materiais sintéticos na área de embalagem de alimentos é o desenvolvimento de filmes baseados em biopolímeros. Vários estudos têm demostrado o melhoramento nas propriedades de filmes baseados em biopolímeros, devido à utilização de nanopartículas como reforço. No entanto, as melhorias observadas são ainda limitadas e pode-se considerar que isso é devido a problemas de dispersão das nanopartículas em água, especialmente quando se utiliza a técnica tipo casting. Assim, os objetivos deste projeto foram: A) estudar a qualidade da dispersão de nanopartículas de montemorilhonita em água, e B) estudar o efeito dessas dispersões sobre algumas propriedades físicas e funcionais de filmes de gelatina produzidos com elas. As nanopartículas foram dispersas em água na concentração de 1 g MMT/100 g solução, com três dispositivos: homogeneizador mecânico (UT), moinho coloidal (MC) e processador ultrassônico (US). As dispersões foram analisadas para determinação de tamanho das partículas e potencial zeta, e por microscopia eletrônica de varredura e microscopia de força atômica. Os filmes foram produzidos pela técnica de \"casting\", com 5 g de gelatina/100 g de solução filmogênica e 30 g de glicerol/100g de gelatina. A concentração de nanopartículas foi 0, 1, 3, 5 e 7 g de MMT/100g de gelatina. Os filmes de controle e nanocompósitos produzidos com as dispersões de montemorilhonita foram caracterizados para determinação de espessura, umidade, solubilidade, permeabilidade ao vapor de água, propriedades mecânicas por testes de tração e perfuração, cor e opacidade, brilho, microestrutura por microscopia eletrônica de varredura e microscopia de força atômica, transição vítrea por calorimetria diferencial de varredura, difração de raios-X, espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier e ângulo de contato. O potencial zeta e tamanho médio da partícula foi -53, -40, -47 mV e 377, 289, 395 nm, para as dispersões processadas por UT, US e MC, respectivamente. No geral, os filmes reforçados com montemorilhonita, foram 44% menos brilhantes e foram ligeiramente mais hidrofílicos do que os filmes de controle. A tensão na ruptura aumentou de 22 MPa para filmes de controle até 40 MPa, quando a concentração da montemorilhonita foi de até 5 g de MMT/100g de gelatina. A permeabilidade ao vapor de água não variou nos filmes nanocompósitos. O método de dispersão utilizado teve uma forte influência sobre a qualidade das dispersões, afetando o tamanho da partícula e potencial zeta, com efeito evidente sobre as propriedades físicas dos nanocompósitos. A concentração crítica de montemorilhonita como reforço pareceu estar limitada a 5 g de MMT/100 g de gelatina. / One of the possible alternatives to replace synthetic materials in the area of food packaging is the development of films based on biopolymers. Several studies have demonstrated the improvement in properties of films based on biopolymers due to the use of nanoparticles as reinforcement. However, the observed improvements are still limited and it can be considered that this is due to dispersion problems of nanoparticles in water, particularly when using the casting technique. The aim of this project was to study the quality of the dispersion of nanoparticles (montmorillonite) in water, and to analyze the effect of these dispersions on some physical and functional properties of gelatin films. The nanoparticles were dispersed in water (1 g MMT/100 g solution), with three devices: mechanical homogenizer (UT), colloidal mill (MC) and ultrasonic processor (US). The dispersions were analyzed for determination of particle size and zeta potential, and by scanning electron and atomic force microscopies. Films were produced by casting, with 5 g of gelatin/100 g of film-forming solution and 30 g of glycerol/100 g of gelatin. The nanoparticles concentrations were 0, 1, 3, 5 and 7 g of MMT/100g of gelatin. The control and nanocomposite films were characterized for determination of thickness, moisture, water solubility, water vapor permeability, tensile and puncture mechanical properties, color and opacity, brightness, microstructure by scanning electron microscopy and atomic force microscopy, glass transition temperature by differential scanning calorimetry, X-ray diffraction, infrared spectroscopy with Fourier transform and contact angle. The zeta potential and average particle size was -53, -40, -47 mV and 377, 289, 395 nm; for UT, US and MC dispersions, respectively. In general, the films filled with montmorillonite were 44% less glossy and were slightly more hydrophilic than control film. The maximum tensile strength increased from 22 MPa for control film to 40 MPa when the concentration of montmorillonite was up to 5 g of MMT/100g of gelatin. The water vapor permeability did not change in the nanocomposite films. The dispersion method used had a strong influence on the quality of dispersions; it can affect the particle size and zeta potential, with evident effect on the physical properties of nanocomposites. The critical concentration of montmorillonite as reinforcement seemed to be limited to 5 g of MMT/100 g of gelatin maximum tensile strength increased from 22 MPa for control film to 40 MPa when the concentration of montmorillonite was up to 5 g of MMT/100g of gelatin. The water vapor permeability did not change in the nanocomposite films. The dispersion method used had a strong influence on the quality of dispersions; it can affect the particle size and zeta potential, with evident effect on the physical properties of nanocomposites. The critical concentration of montmorillonite as reinforcement seemed to be limited to 5 g of MMT/100 g of gelatin.

Apesar dos grandes avanços na produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, a produção de blastocistos se mantém ainda aquém do observado in vivo, indicando que melhorais ainda são necessárias no processo de PIV. A competência para o desenvolvimento de oócitos tem sido relacionada, entre outros fatores, à interrupção do período de capacitação. Foi sugerido que o bloqueio meiótico poderia permitir ao oócito um tempo adicional para adquirir a competência. Embora ainda não se tenha melhorado o desenvolvimento embrionário com esse procedimento, o bloqueio meiótico com inibidores de cinases dependentes de ciclinas (CDK), como a butirolactona I (BLI), pode ser uma ferramenta útil na compreensão do desenvolvimento do oócito. O presente trabalho teve por objetivo averiguar o efeito da inibição de CDK com BLI, para bloquear temporariamente a retomada da meiose, sobre fatores que controlam o ciclo celular meiótico de oócitos bovinos. Oócitos bovinos obtidos de abatedouros foram bloqueados em vesícula germinativa (VG) in vitro com 10 µM de BLI por 24 h (BVG - bloqueado imaturo). Parte desses oócitos foi depois maturada in vitro por mais 24 h (BMII - bloqueado maturado). Como controles foram utilizados oócitos recém-aspirados dos folículos (VG - controle imaturo) ou maturados in vitro sem bloqueio meiótico prévio (MII - controle maturado). Os diferentes grupos de oócitos foram avaliados quanto a: 1) expressão de RNAm dos componentes do MPF (p34cdc2 e ciclina B1) e da MAPK; 2) expressão das proteínas do MPF (p34cdc2 e ciclina B1) e MAPK (p44 e p42); 3) atividade das proteínas MPF e MAPK durante a maturação in vitro de oócito submetidos ou não ao bloqueio da meiose pré-maturação e 4) a localização subcelular das proteínas p34cdc2, ciclina B1 e MAPK nos oócitos. Foi observado que: 1) a abundância relativa do RNAm de p34cdc2 e MAPK reduziu-se com a maturação, enquanto a ciclina B1 menteve-se estável; o bloqueio meiótico manteve o mesmo padrão de acordo com o estádio de maturação; 2) as proteínas de p34cdc2 e MAPK mantiveram-se estáveis durante a maturação, enquanto a ciclina B1 não foi detectada em oócitos imaturos e o foi nos maturados; o bloqueio meiótico também manteve a expressão das proteínas de acordo com o estádio de maturação; 3) as atividades de MPF e MAPK foram pouco afetadas pelo bloqueio meiótico; 4) as proteínas foram todas detectadas no citoplasma dos oócitos imaturos (bloqueados ou não) e maturados (bloqueados ou não), sendo apenas a p34cdc2 também localizada no núcleo de oócitos imaturos (bloqueados ou não). Diante dos resultados conclui-se que o bloqueio da meiose mantém o mesmo padrão de expressão, atividade e localização subcelular do MPF e da MAPK em oócitos imaturos e maturados, sugerindo que a tradução das mensagens, a ativação das cinases e a distribuição das proteínas foram controladas de acordo com o estádio da meiose, não sendo afetadas pelo bloqueio. / Although there have been great improvements in in vitro production (IVP) of bovine embryos, blastocyst production is still beyond that observed in vivo, indicating that more improvements are necessary in the IVP system. Developmental competence of oocytes has been related to, among other factors, the interruption in oocyte capacitation. Is has been suggested that meiosis block would allow the oocyte additional time to acquire competence. Although this procedure has not been successful in increasing embryo development, meiosis block with cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors, such as butyrolactone I (BLI) can be a useful tool to study oocyte development. The present study aimed to assess the effects CDK inhibition with BLI, to temporarily block meiosis resumption, on factors involved in meiosis cell cycle control in bovine oocytes. Oocytes, obtained form slaughterhouse ovaries, were maintained in germinal vesicle (GV) arrest in vitro with 10 µM BLI for 24 h (BVG - blocked immature). A part of these oocytes was matured in vitro for another 24 h (BMII - blocked and matured). As controls, oocytes were also assessed soon after follicle aspiration (GV -immature control) or matured in vitro for 24 h without prior meiosis block (MII - matured control). The different groups of oocytes were assessed for: 1) mRNA expression for the MPF components (p34cdc2 and cyclin B1) and MAPK; 2) expression of MPF (p34cdc2 and cyclin B1) and MAPK (p44 and p42) proteins; 3) MPF and MAPK activities during maturation of oocytes submitted or not to prematuration meiosis block and 4) p34cdc2, cyclin B1 and MAPK subcellular localization within oocytes. During the study it was observed that: 1) relative abundance of p34cdc2 and MAPK mRNA was reduced after maturation, while cyclin B1 mRNA remained stable; meiosis block maintained the same pattern according to maturation stage; 2) p34cdc2 and MAPK proteins remained stable after maturation while cyclin B1 protein was undetected in immature oocytes and detected in the matured ones; meiosis block also maintained the same protein expression according to maturation stage; 3) MPF and MAPK activities were little affected by meiosis block and 4) all proteins were detected in the cytoplasm of immature (blocked or not) and matured (blocked or not) oocytes, and only showed a specific nuclear localizations in immature oocytes (blocked or not). According to the results it may be concluded that meiosis block maintained the same pattern of MPF and MAPK expression, activity and subcellular localization in immature and matured oocytes, suggesting that mRNA translation, kinase activation and protein distribution were controlled according to the maturation stage and were not affected by meiosis block.