Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal / Made available in DSpace on 2012-10-26T07:35:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 299996.pdf: 2884488 bytes, checksum: bfbf8e27b16985cfe04b998edeac86b4 (MD5) / Ocotea catharinensis Mez. (Lauraceae) é uma arvore nativa da Floresta Atlântica, localizada no sul do Brasil, que se encontra atualmente na lista de espécies ameaçadas de extinção, devido à importância econômica da madeira, que é utilizada na fabricação de móveis e casas. Um sistema de embriogênese somática de alta frequência foi desenvolvido para esta espécie, a fim de solucionar o problema da produção esporádica de sementes, cuja viabilidade é reduzida drasticamente após poucos meses de armazenamento. Os objetivos deste trabalho foram caracterizar as culturas de células embriogênicas dos tipos friável, diferenciada 1 e diferenciada 2 e de embriões somáticos no estágio cotiledonar de Ocotea catharinensis quanto ao crescimento, perfil metabólico, metabólitos secundários, potencial de embriogênese secundária e histoquímica. A análise de dissimilação de carbono apresentou um padrão linear para as culturas de células embriogênicas do tipo diferenciada 2 crescidas em meio de cultura com sacarose, enquanto com glucose o padrão foi variável. A espectroscopia por FT-IR deste tipo de cultura permitiu comparar o perfil metabólico primário e secundário dos extratos, evidenciando diferenças qualitativas em nível molecular. A análise de componentes principais (PCA) de varreduras UV-Vis, evidenciou grupos característicos em função das concentrações de compostos fenólicos. Estes resultados reforçaram os obtidos nas dosagens de carotenóides e compostos fenólicos. As culturas de células embriogênicas do tipo diferenciada 2 apresentaram as maiores concentrações de carotenóides, enquanto que os embriões somáticos, no estágio cotiledonar, apresentaram a maior concentração de compostos fenólicos. Culturas de células embriogênicas do tipo diferenciada 2, crescidas por 3 e 4 semanas apresentaram maior concentração de carotenóides mas as concentrações de compostos fenólicos se mantiveram constantes nas 6 semanas de cultivo. As culturas de células crescidas em meio de cultura WPM com 58,4 mM de sacarose e glutamina apresentaram a maior concentração de carotenóides, e juntamente com 116,8 mM de glucose e glutamina, a maior concentração de compostos fenólicos. Houve forte correlação entre a concentração de compostos fenólicos e atividade antioxidante ao longo das semanas de cultivo. A capacidade antioxidante dos diferentes tipos de culturas de células não apresentou correlação com a concentração de compostos fenólicos. Estruturas de culturas de células embriogênicas do tipo 2 desidratadas por uma semana apresentaram 98,35% de embriogênese secundária e por duas semanas apresentaram 88,66%. A embriogênese secundária foi estimulada em meio de cultura WPM, com 58,4 mM de sacarose e 116,8 mM de glucose, ambos com sorbitol e glutamina, apresentando as maiores porcentagens de embriogênese secundária (88,66% e 83,97%, respectivamente). A adição de frutose no meio de cultura inibiu a embriogênese secundária. O meio de cultura MS não apresentou resultados satisfatórios. Estruturas de culturas de células embriogênicas desidratadas por 2 semanas a 25ºC, seguido de 2 semanas a 5ºC, apresentaram maior porcentagem de embriogênese secundária, quando comparadas com as desidratadas por 4 semanas a 25ºC. A ausência de luz reduziu significativamente a embriogênese secundária. A avaliação do crescimento das culturas de células embriogênicas e a análise de metabólitos primários e secundários, através de espectroscopia de UV-vis e FT-IR, fornecem suporte para a otimização das culturas de células embriogênicas, identificação e seleção de diferentes tipos de culturas de células com potencial para a produção de compostos de interesse. / Ocotea catharinensis Mez. (Lauraceae) is a native tree from the Atlantic rainforest located in southern Brazil, and it is currently on the list of species threatened with extinction due to its economic importance, its wood is used for furniture and houses. A high-frequency somatic embryogenesis system has been developed for this species in order to solve the problem of sporadic seed production, whose viability is drastically reduced over a few months of storage. The aims of this study was to characterize the different types of embryogenic cell cultures (friable, differentiated 1, differentiated 2) and mature cotyledonary somatic embryos of Ocotea catharinensis concerning its in vitro growth, metabolic profile, secondary metabolites, secondary embryogenesis potential and hystochemistry. The FT-IR spectroscopy and UV-vis spectrophotomery allowed the comparison of the primary and secondary metabolism profiles, showing qualitatives differences at molecular level. The analysis of this kind of culture allowed compares the primary and secondary metabolic profile of extracts, showing qualitative differences at the molecular level. FT-IR spectroscopy and UV-Vis spectrophotometry, showed the profile of phenolic compounds and carotenoids and the antioxidant activity from these extracts. The effect of dehydration period, low temperature, presence and absence of light source, sugar alcohols and carbon sources on secondary somatic embryogenesis.The carbon dissimilation analysis showed a linear pattern to somatic embryos growth in the presence of sucrose, while with glucose, the pattern is variable. FTIR spectroscopy allowed the comparison between primary and secondary metabolic profile extracts, and showed qualitative differences at molecular level. The principal component analysis (PCA) of UV-Vis screen showed characteristic groups, which were grouped due to the concentrations of phenolic compounds. These results strengthened those obtained in the measurement of carotenoids and phenolic compounds. The embryogenic cell cultures type differentiated 2 had the highest concentrations of carotenoids, while somatic embryos at cotyledonary stage the highest concentration of phenolic compounds. Embriogenic cell cultures type differentiated 2, with 3 and 4 weeks had higher carotenoid concentration, whilst, phenolic compounds concentrations remained constant during the six weeks of culture. The cell cultures grown on WPM medium containing 58,4 mM of sucrose and glutamine had the highest concentration of carotenoids, and along with 116,8 mM glucose and glutamine had the highest concentration of phenolic compounds.There was a strong correlation between the concentration of phenolic compounds and antioxidant activity over the culture periods. The concentration of phenolic compounds was not correlated with the antioxidant capacity of the different types of embryogenic cell cultures. Dehydrated embryogenic structures produced by the cell cultures type differentiated 2 for one week showed 98.35% of secondary embryogenesis and two weeks showed 88,66%. WPM media supplemented with 58,4 mM of sucrose and 116,8 mM of glucose, both with sorbitol and glutamina, showed the highest percentage of secondary embryogenesis (88,66% and 83,97% respectively). The addition of fructose in the culture medium inhibited secondary embryogenesis. MS medium has not shown satisfactory results on secondary embryogenesis. Embryogenic structures dehydrated for 2 weeks at 25°C, followed by 2 weeks at 5°C, showed the highest percentage of secondary embryogenesis when compared to those dehydrated for 4 weeks at 25°C.The absence of light significantly decreased secondary embryogenesis. The evaluation of growth of somatic embryos, primary and secondary metabolites analysis through the UV-vis and FT-IR spectroscopy, provide the backgroung for further studies on embryogenic cell cultures optimization, identification and selection of cultures with potential to produce compounds of economic interest.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-graduação em Recursos Genéticos Vegetais / Made available in DSpace on 2012-10-22T08:52:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O. catharinensis Mez. é uma árvore nativa, monóica, com flores hermafroditas, dispersão zoocórica e ameaçada de extinção, que ocorre na Floresta Ombrófila Densa nos Estados da região Sul e Sudeste do Brasil. Estudos demográficos e o entendimento da distribuição da variabilidade genética entre e dentro de populações permitem melhor orientação das práticas de restauração, conservação e manejo de uma espécie. Este trabalho teve por objetivo contribuir para a definição de estratégias de conservação em populações naturais de O. catharinensis a partir da avaliação da estrutura demográfica, estrutura genética e estrutura genética interna. Para isto, foram amostrados indivíduos reprodutivos (DAP 5cm) em quatro populações naturais de O. catharinensis no Estado de Santa Catarina: Parque Estadual da Serra do Tabuleiro (PEST), Santo Amaro da Imperatriz, SC (27o44'43"S, 48o49'13"W), Parque Botânico do Morro Baú (PMB), Ilhota, SC (26o47'56"S, 48o55'49"W), Área Particular da MOBASA (CP), Corupá, SC (26º25'06"S, 49º22'02"W) e Área Particular do Produtor Antônio Alberton (GP), Grão Pará, SC (28º14'17"S, 49º17'40"W). O estudo da estrutura demográfica foi realizado a partir do georeferenciamento destes indivíduos nas populações. Obteve-se para a O. catharinensis uma densidade média para o Estado de Santa Catarina de 7 indivíduos por hectare, densidade inferior a registrada para a espécie em estudos realizados na década de 1950. Foi encontrada para a O. catharinensis uma distribuição espacial agregada e similar nas quatro populações estudadas. Sugere-se que esta distribuição agregada nos indivíduos adultos seja conseqüência da possível dispersão e deposição de sementes de maneira agrupada realizados pela fauna, especialmente por primatas (Cebus apella e Alouatta spp). A estrutura genética das quatro populações de O. catharinensis foi investigada utilizando-se 18 locos alozímicos. As estimativas do número médio de alelos por loco (2.2), percentagem de locos polimórficos (83.3%) e a diversidade genética (0.4265), foram similares às obtidas para outras espécies de Lauraceae. A endogamia detectada nas populações ( = -0.0114) e a endogamia total ( = 0.1330) sugerem estrutura nas populações; foi encontrada uma alta divergência entre as populações ( = 0.1428). Sugere-se que a divergência populacional está relacionada à migração e dispersão de sementes realizadas pelos dispersores da O. catharinensis, e associado com a paisagem e as distâncias entre as populações. O resultado obtido da estimativa do tamanho mínimo viável de cada população revelou a possibilidade de sobrevivência de 10 gerações de O. catharinensis, nos locais amostrados. Contudo, a área atual dos fragmentos amostrados mostrou-se insuficiente quando comparada a área mínima viável para conservação destas populações (64ha) por mais de 10 gerações. A análise de autocorrelação espacial evidenciou a presença de uma estrutura interna nas primeiras classes (até 100m), sugerindo a presença de uma estrutura familiar. Os resultados do presente estudo sugerem que a dispersão das sementes da espécie, que ocorre de forma zoocórica, também seja o principal fator responsável pela estruturação dentro das populações. Os presentes resultados sugerem que as estratégias para a conservação in situ da O. catharinensis devem ser intensificadas em diferentes populações localizadas em floresta climáxica entre cotas de 300 a 900m de altitude e que a conectividade dos fragmentos de floresta climáxica tem que ser restabelecida para a manutenção do fluxo gênico e para contrapor um futuro aumento da divergência entre as populações.

O estudo fitoquímico das folhas de Ocotea catharinensis (Lauraceae) resultou no isolamento da neolignana tetraidrofurânica veraguensina (1) e do flavonóide glicosilado afzelina (10), ainda não descritas para a espécie, além de quatro neolignanas hexaidrobenzofurânicas (2-5) anteriormente descritas para mesma. Nos embriões somáticos in vitro constatou-se o acúmulo de duas neolignanas hexaidrobenzofurânicas (2, 3) e duas biciclo[3.2.1]octânicas (6, 7), dois sesquiterpenos (8, 9) e um fenilpropanóide (11). A neolignana biciclo[3.2.1]octânica (7S,8R,1\'R,2\'R,3\'R)-2\'-acetoxi-3,4-metilenodioxi-3\',5\'-dimetoxi-4\'-oxo-Δ1,3,5,5\',8\'-8.1\',7.3\'-neolignana (7), o sesquiterpeno (-)-eudesm-11-em-4α-ol (9) e o fenilpropanóide 6-metóxieugenol (11) não haviam sido isolados anteriormente desta espécie. O perfil dos metabólitos secundários incluiram análises do óleo essencial das folhas cuja análise indicou a predominância de mono- e sesquiterpenos e ausência de fenilpropanóides. Além disso, foram avaliadas atividades antifúngica e antioxidante nos extratos e substâncias isoladas. A fração de CHCl3 do extrato etanólico mostrou atividade antifúngica contra Cladosporium cladosporioide ou C. sphaerospermum. As frações de CHCl3 e de AcOEt do extrato etanólico, as neolignanas hexaidrobenzofurânica (5), biciclooctânica (6), o flavonóide glicosilado (10) e o fenilpropanóide (11) apresentaram atividade antioxidante através do método de DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazila). A avaliação de hipóteses biossintéticas envolvidas na formação de neolignanas em O. catharinensis fizeram uso de culturas embriogênicas como modelo experimental. Foram realizados diversos estudos de bioconversões de precursores como o isoeugenol e 5-metoxieugenol utilizando-se suspensões celulares e frações enzimáticas porém as conversões in vivo utilizando-se precursores marcados e os embriões foram melhor sucedidas. Entre os precursores radioativos, a L-[U-14C]-fenilalanina foi incorporada às neolignanas hexaidrobenzofurânicas (2, 0,30% e 3, 0,19%) e biciclooctânica (6, 0,12%). No caso do ácido [8-14C]-ferúlico, esse foi incorporado à neolignana hexaidrobenzofurânica (2, 0,17%). Por outro lado, o uso de L-[1-13C]-fenilalanina e análise por espectrometria de massas-massas confirmou o enriquecimento de 13C nas neolignanas hexaidrobenzofurânicas (2 e 3). A análise por RMN de 13C indicou o enriquecimento de 4,3 e 5,0% nos carbonos C9 e C9\', respectivamente. Desta maneira, através dos dados de incorporação desses precursores, desvenda-se parte da via biossintética de neolignanas em O. catharinensis. / The phytochemical study of Ocotea catharinensis (Lauraceae) leaves resulted in the isolation of tetrahydrofuran neolignan veraguensin (1) and glycosylated flavonoid afzelin (10), not yet described for this species, besides four hexahydrobenzofuran neolignans (2-5), which had been previously described. The in vitro somatic embryos showed the accumulation of two hexahydrobenzofuran (2, 3) and two bicyclo[3,2,1]octane (6, 7) neolignans, two sesquiterpenes (8, 9) and one phenylpropanoid (11). Among these compounds (7S,8R,1\'R,2\'R,3\'R)-2\'-acetoxy-3,4-methylenedioxy-3\',5\'-dimethoxy-4\'-oxo-Δ1,3,5,5\',8\'-8.1\',7.3\'-neolignan (7), (-)-eudesm-11-en-4α-ol (9) and 6-methoxy-eugenol (11) have not been previously described for this species. The profile of secondary metabolite included the analysis of essential oil of leaves which indicated the predominance of mono- and sesquiterpene and no phenylpropanoids. In addition, antifungal and antioxidative activities were performed with extracts and isolated compounds. The CHCl3 fraction of ethanol extract exhibited antifungal activities against Cladosporium cladosporioide or C. sphaerospermum. The CHCl3 and EtOAc fractions of ethanol extract, the hexahydrobenzofuran (5) and a bicyclo[3.2.1]octane (6) neolignans, afzelin (10) and 6-methoxy-eugenol (11) displayed antioxidant activities using DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl). The evaluations of biosynthetic hypothesis for neolignan formation in O. catharinensis were based on the use of embriogenic culture as an experimental model. Several assessment for conversion of putative precursors such as eugenol and 5-methoxyeugenol were evaluated using suspension cells and cell free preparations but none of them were as effective as in vivo conversion using labeled precursors directly in embryos. Among the radioactive precursors L-[U-14C]-phenylalanine was incorporated to hexahydrobenzofuran (2, 0.30%; 3, 0.19%) and bicyclo[3.2.1]octane (6, 0.17%) neolignans while [8-14C]-ferulic acid was incorporated only to the hexahydrobenzofuran neolignan (2, 0,17%). The tandem mass spectrometry analysis confirmed the incorporation of 13C atoms in the neolignans (2, 3) indicating the incorporation of one or two molecules of L-[1-13C]-phenylalanine. The analysis of 13C NMR data revealed the enrichment of 4.3 and 5.0% at the positions C9 and C9\', respectively. In summary, the labeling experiments have contributed to unravel the biosynthesis of neolignans in O. catharinensis.

Embriões somáticos de Ocotea catharinensis foram utilizados como modelo para a investigação da via biossintética para a formação de neolignanas com esqueleto benzofurânico, através do uso de precursores marcados com 13C e análise dos produtos por RMN de 13C. Isotopômeros de L-[13C]-fenilalanina administrados aos embriões, foram incorporados às neolignanas 5\'-metoxiporosina e armenina B . Entre os precursores intermediários, o acetato de [8-13C]-coniferila, preparado a partir da condensação de Knoevenagel seguido de várias etapas, foi incorporado na neolignana 5\'-metoxiporosina. No ensaio de bioconversão utilizando frações proteicas das culturas dos embriões de O. catharinensis, o acetato de coniferila foi convertido em isoeugenol que, junto com o eugenol, seriam os precursores hipotéticos para a formação dessas neolignanas. A análise filogenética de diversas espécies de Lauraceae indicou a proximidade entre espécies do gênero Ocotea, produzindo como principais metabólitos lignanas e neolignanas. Foi obtida a seqüência parcial do gene de proteína dirigente em O. catharinensis e O. macrophylla e a análise filogenética baseada na homologia das seqüências de proteína dirigente de Ocotea e de espécies de diferentes gêneros, indicaram um clado distinto formado para espécies de Ocotea. Estes dados dão suporte para a proposta de que neolignanas di-hidrobenzofurânicas seriam oriundas do acoplamento oxidativo entre unidades de E-isoeugenol e 5-metóxi-eugenol, com possível participação de proteína dirigente na regio- e estereoespecificidade das reações de dimerização . Baseando-se nestes resultados foi possível propor algumas etapas envolvidas na biossíntese de neolignanas. / Somatic embryos of Ocotea catharinensis were used as model to investigate the biosynthetic pathway of benzofuran neolignans formation by means of feeding precursors followed by analysis with 13C NMR. Isotopomers of L-[13C]-phenylalanine were administered to embryos and incorporated into di-hydrobenzofuran neolignans. Among the intermediate precursors, [8-13C]-coniferyl acetate, prepared by Knoevenagel and several steps, was incorporated in the neolignan 5\'-methoxyporosin. The studies of bioconversion using protein fraction obtained from the embryogenic cultures, the precursor coniferyl acetate was converted into isoeugenol, which together eugenol, is one of the putative precursors to the neolignans formation. Phylogenetic analysis of several species of Lauraceae indicated the proximity of Ocotea species producing lignans and neolignans as the main metabolites. A partial sequence of the dirigent protein gene from O. catharinensis and O. macrophylla were obtained and the phylogenetic analysis based on homology of dirigent protein sequences from Ocotea and from different plant genus indicated a distinct clade formed by Ocotea species. These findings support the hypothesis that the dihydrobenzofuran neolignans would be derived from the oxidative coupling between E- isoeugenol and 5- methoxy-eugenol and the dirigent protein would be involved in the regio- and stereospecificity of the dimerization reactions. Thus, it was possible to suggest some of the steps involved in the biosynthesis of neolignans.

O estudo fitoquímico das folhas de Ocotea catharinensis (Lauraceae) resultou no isolamento da neolignana tetraidrofurânica veraguensina (1) e do flavonóide glicosilado afzelina (10), ainda não descritas para a espécie, além de quatro neolignanas hexaidrobenzofurânicas (2-5) anteriormente descritas para mesma. Nos embriões somáticos in vitro constatou-se o acúmulo de duas neolignanas hexaidrobenzofurânicas (2, 3) e duas biciclo[3.2.1]octânicas (6, 7), dois sesquiterpenos (8, 9) e um fenilpropanóide (11). A neolignana biciclo[3.2.1]octânica (7S,8R,1\'R,2\'R,3\'R)-2\'-acetoxi-3,4-metilenodioxi-3\',5\'-dimetoxi-4\'-oxo-Δ1,3,5,5\',8\'-8.1\',7.3\'-neolignana (7), o sesquiterpeno (-)-eudesm-11-em-4α-ol (9) e o fenilpropanóide 6-metóxieugenol (11) não haviam sido isolados anteriormente desta espécie. O perfil dos metabólitos secundários incluiram análises do óleo essencial das folhas cuja análise indicou a predominância de mono- e sesquiterpenos e ausência de fenilpropanóides. Além disso, foram avaliadas atividades antifúngica e antioxidante nos extratos e substâncias isoladas. A fração de CHCl3 do extrato etanólico mostrou atividade antifúngica contra Cladosporium cladosporioide ou C. sphaerospermum. As frações de CHCl3 e de AcOEt do extrato etanólico, as neolignanas hexaidrobenzofurânica (5), biciclooctânica (6), o flavonóide glicosilado (10) e o fenilpropanóide (11) apresentaram atividade antioxidante através do método de DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazila). A avaliação de hipóteses biossintéticas envolvidas na formação de neolignanas em O. catharinensis fizeram uso de culturas embriogênicas como modelo experimental. Foram realizados diversos estudos de bioconversões de precursores como o isoeugenol e 5-metoxieugenol utilizando-se suspensões celulares e frações enzimáticas porém as conversões in vivo utilizando-se precursores marcados e os embriões foram melhor sucedidas. Entre os precursores radioativos, a L-[U-14C]-fenilalanina foi incorporada às neolignanas hexaidrobenzofurânicas (2, 0,30% e 3, 0,19%) e biciclooctânica (6, 0,12%). No caso do ácido [8-14C]-ferúlico, esse foi incorporado à neolignana hexaidrobenzofurânica (2, 0,17%). Por outro lado, o uso de L-[1-13C]-fenilalanina e análise por espectrometria de massas-massas confirmou o enriquecimento de 13C nas neolignanas hexaidrobenzofurânicas (2 e 3). A análise por RMN de 13C indicou o enriquecimento de 4,3 e 5,0% nos carbonos C9 e C9\', respectivamente. Desta maneira, através dos dados de incorporação desses precursores, desvenda-se parte da via biossintética de neolignanas em O. catharinensis. / The phytochemical study of Ocotea catharinensis (Lauraceae) leaves resulted in the isolation of tetrahydrofuran neolignan veraguensin (1) and glycosylated flavonoid afzelin (10), not yet described for this species, besides four hexahydrobenzofuran neolignans (2-5), which had been previously described. The in vitro somatic embryos showed the accumulation of two hexahydrobenzofuran (2, 3) and two bicyclo[3,2,1]octane (6, 7) neolignans, two sesquiterpenes (8, 9) and one phenylpropanoid (11). Among these compounds (7S,8R,1\'R,2\'R,3\'R)-2\'-acetoxy-3,4-methylenedioxy-3\',5\'-dimethoxy-4\'-oxo-Δ1,3,5,5\',8\'-8.1\',7.3\'-neolignan (7), (-)-eudesm-11-en-4α-ol (9) and 6-methoxy-eugenol (11) have not been previously described for this species. The profile of secondary metabolite included the analysis of essential oil of leaves which indicated the predominance of mono- and sesquiterpene and no phenylpropanoids. In addition, antifungal and antioxidative activities were performed with extracts and isolated compounds. The CHCl3 fraction of ethanol extract exhibited antifungal activities against Cladosporium cladosporioide or C. sphaerospermum. The CHCl3 and EtOAc fractions of ethanol extract, the hexahydrobenzofuran (5) and a bicyclo[3.2.1]octane (6) neolignans, afzelin (10) and 6-methoxy-eugenol (11) displayed antioxidant activities using DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl). The evaluations of biosynthetic hypothesis for neolignan formation in O. catharinensis were based on the use of embriogenic culture as an experimental model. Several assessment for conversion of putative precursors such as eugenol and 5-methoxyeugenol were evaluated using suspension cells and cell free preparations but none of them were as effective as in vivo conversion using labeled precursors directly in embryos. Among the radioactive precursors L-[U-14C]-phenylalanine was incorporated to hexahydrobenzofuran (2, 0.30%; 3, 0.19%) and bicyclo[3.2.1]octane (6, 0.17%) neolignans while [8-14C]-ferulic acid was incorporated only to the hexahydrobenzofuran neolignan (2, 0,17%). The tandem mass spectrometry analysis confirmed the incorporation of 13C atoms in the neolignans (2, 3) indicating the incorporation of one or two molecules of L-[1-13C]-phenylalanine. The analysis of 13C NMR data revealed the enrichment of 4.3 and 5.0% at the positions C9 and C9\', respectively. In summary, the labeling experiments have contributed to unravel the biosynthesis of neolignans in O. catharinensis.

Embriões somáticos de Ocotea catharinensis foram utilizados como modelo para a investigação da via biossintética para a formação de neolignanas com esqueleto benzofurânico, através do uso de precursores marcados com 13C e análise dos produtos por RMN de 13C. Isotopômeros de L-[13C]-fenilalanina administrados aos embriões, foram incorporados às neolignanas 5\'-metoxiporosina e armenina B . Entre os precursores intermediários, o acetato de [8-13C]-coniferila, preparado a partir da condensação de Knoevenagel seguido de várias etapas, foi incorporado na neolignana 5\'-metoxiporosina. No ensaio de bioconversão utilizando frações proteicas das culturas dos embriões de O. catharinensis, o acetato de coniferila foi convertido em isoeugenol que, junto com o eugenol, seriam os precursores hipotéticos para a formação dessas neolignanas. A análise filogenética de diversas espécies de Lauraceae indicou a proximidade entre espécies do gênero Ocotea, produzindo como principais metabólitos lignanas e neolignanas. Foi obtida a seqüência parcial do gene de proteína dirigente em O. catharinensis e O. macrophylla e a análise filogenética baseada na homologia das seqüências de proteína dirigente de Ocotea e de espécies de diferentes gêneros, indicaram um clado distinto formado para espécies de Ocotea. Estes dados dão suporte para a proposta de que neolignanas di-hidrobenzofurânicas seriam oriundas do acoplamento oxidativo entre unidades de E-isoeugenol e 5-metóxi-eugenol, com possível participação de proteína dirigente na regio- e estereoespecificidade das reações de dimerização . Baseando-se nestes resultados foi possível propor algumas etapas envolvidas na biossíntese de neolignanas. / Somatic embryos of Ocotea catharinensis were used as model to investigate the biosynthetic pathway of benzofuran neolignans formation by means of feeding precursors followed by analysis with 13C NMR. Isotopomers of L-[13C]-phenylalanine were administered to embryos and incorporated into di-hydrobenzofuran neolignans. Among the intermediate precursors, [8-13C]-coniferyl acetate, prepared by Knoevenagel and several steps, was incorporated in the neolignan 5\'-methoxyporosin. The studies of bioconversion using protein fraction obtained from the embryogenic cultures, the precursor coniferyl acetate was converted into isoeugenol, which together eugenol, is one of the putative precursors to the neolignans formation. Phylogenetic analysis of several species of Lauraceae indicated the proximity of Ocotea species producing lignans and neolignans as the main metabolites. A partial sequence of the dirigent protein gene from O. catharinensis and O. macrophylla were obtained and the phylogenetic analysis based on homology of dirigent protein sequences from Ocotea and from different plant genus indicated a distinct clade formed by Ocotea species. These findings support the hypothesis that the dihydrobenzofuran neolignans would be derived from the oxidative coupling between E- isoeugenol and 5- methoxy-eugenol and the dirigent protein would be involved in the regio- and stereospecificity of the dimerization reactions. Thus, it was possible to suggest some of the steps involved in the biosynthesis of neolignans.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2013-07-16T01:58:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Ocotea catharinensis Mez. (Lauraceae) é uma importante espécie florestal nativa da Floresta Atlântica. Um sistema de embriogênese somática de alta freqüência foi desenvolvido para esta espécie. A embriogênese repetitiva é uma importante característica deste sistema. O objetivo deste estudo foi avaliar o crescimento de culturas embriogênicas no estágio globular/cotiledonar inicial em diferentes condições de cultura e conduzir as análises preliminares de polifenóis e óleos essenciais. A máxima massa seca foi obtida após quatro semanas de cultivo em sacarose e foi significativamente diferente da frutose e glicose. A análise de desassimilação do carbono mostrou um padrão linear de crescimento e não indicou a presença da fase estacionária em nenhuma das fontes de carbono estudadas. O crescimento em manitol e sorbitol foi obtido em concentrações variando de 0 a 121 mM e não foram observadas diferenças em massa seca entre os tratamentos. Na presença de manitol o carvão ativado não afetou a massa seca, mas na presença de 30,25 mM e 121 mM de sorbitol o carvão ativado reduziu significativamente a massa seca, em comparação com o tratamento sem carvão ativado. Aumento significativo em massa seca foi observado na presença de manitol, com 1,6-4,10 mM de prolina ou com 2,73 mM de glutamina. Na presença de sorbitol a máxima massa seca foi obtida com 2,73-4,10 mM de glutamina. Massa seca significativamente superior foi obtida nos meios de cultura WPM, B5 e MS e a menor massa seca foi obtida nos meios de White e de Kao e Michayluk. O aumento em massa seca de suspensões celulares iniciadas com culturas não desidratadas foi de 1,5% da massa seca inicial inoculada e quando iniciadas com culturas desidratadas por uma, duas ou quatro horas os valores alcançaram 10,8% e 14,2% da massa seca inicial. Os níveis de polifenóis aumentaram com o decorrer do período de cultivo. A extração por hidrodestilação de culturas com quatro semanas de idade indicou a presença de óleos essenciais. Várias estratégias para a produção de novo de culturas embriogênicas estão agora disponíveis para futuros estudos sobre fisiologia, bioquímica, citoquímica, conservação in vitro e metabolismo secundário.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2013-07-16T02:51:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Um sistema de embriogênese somática de alta freqüência foi desenvolvido para Ocotea catharinensis Mez. (Lauraceae), espécie nativa da Floresta Atlântica. O objetivo deste estudo foi avaliar o crescimento das culturas, na fase de agregados celulares, em diferentes condições de cultivo e conduzir análises preliminares sobre teor de proteínas totais e polifenóis. Em meio de cultura MS com carvão ativado e 2,4-D a massa seca foi significativamente superior, quando o meio não foi agitado após a autoclavagem. A máxima massa seca foi obtida em sacarose e glicose. A análise de desassimilação de carbono mostrou um padrão linear de crescimento para todas as fontes de carbono estudadas e maior dissimilação em sacarose. O meio MS com carvão ativado e 2,4-D causou decréscimo significativo na massa seca em comparação com o meio WPM com sorbitol e glutamina. Em ambos os meios a massa seca máxima foi alcançada na quarta semana de cultivo. No meio WPM o máximo aumento em massa seca das culturas foi obtido na quarta semana, em sacarose, glicose e frutose, não sendo observadas diferenças significativas. Os resultados da análise de desassimilação de carbono foram semelhantes e indicaram padrão de crescimento linear, sem a fase estacionária, para todas as fontes de carbono estudadas. Manitol e sorbitol a 30,25 e 60,5 mM não afetaram a massa seca das culturas em comparação com os tratamentos sem manitol e sorbitol, exceto a 121 mM em que um decréscimo significativo foi observado. Nesta concentração o sorbitol causou significativa diminuição da massa seca. Com manitol a maior massa seca foi observada com 1,36-4,10 mM de prolina e em todas as concentrações de glutamina exceto em 2,73 mM. Com sorbitol massa seca significativamente superior foi obtida na ausência de glutamina e prolina ou em todas as concentrações de glutamina. Os meios de cultura AR e SH promoveram significativo aumento em massa seca. A massa seca produzida na luz e no escuro foi semelhante. A massa fresca aumentou significativamente no escuro. Os maiores conteúdos de proteínas totais e polifenóis ocorreram, respectivamente, na quarta e na sexta semanas. Estes resultados são relevantes para a produção de agregados celulares em diferentes condições de cultivo para futuros estudos sobre a fisiologia e metabolismo secundário.