Memoria para optar el título de Bioquímico / La migración celular es un proceso esencial en organismos pluricelulares, cobrando gran importancia durante la embriogénesis y en la respuesta inmune. Para migrar las células deben ser capaces de generar protrusiones fuera del margen celular. Los principales tipos de protrusiones generados por la polimerización de actina son lamelipodios y filopodios, siendo los primeros generados a través del complejo Arp2/3 (Actin related protein). Se ha reportado que la polimerización de actina es regulada por varias GTPasas pequeñas, entre ellas Rab35, la cual recluta a Rac1 y Cdc42 a sitios de formación de protrusiones modulando la formación de lamelipodios y filopodios, respectivamente. PRPK (p53 related protein kinase) es una quinasa atípica, altamente conservada perteneciente al complejo KEOPS (kinase, putative endopeptidase and other proteins of small size), el cual modula la eficiencia del reconocimiento de codones de tipo ANN. En Drosophila se ha visto que PRPK es necesario para la integración de las señales de la vía PI3K/TOR, las cuales se traducen en crecimiento celular y proliferación. Sin embargo, hemos visto que la pérdida de función de PRPK altera la forma celular en hemocitos-células inmunes homólogas a los macrófagos-, generando un fenotipo estrellado, similar a la pérdida de función del complejo Arp2/3. Este fenotipo es suprimido al co-expresar Rab35. También se ha reportado la interacción física entre PRPK y Rab35 en células humanas. Con estos antecedentes me propuse determinar si PRPK posee un rol fuera del complejo KEOPS, participando en la dinámica de protrusiones de membrana y el patrón de migración de hemocitos en Drosophila melanogaster. Para ello manipulamos los niveles de PRPK en tiempos y tejidos específicos a través del sistema Gal4/UAS. Se analizó la dinámica del citoesqueleto de actina y los parámetros de migración celular mediante microscopía confocal, en contextos particulares de migración y cultivo celular. Finalmente se realizaron co-inmunoprecipitaciones para determinar la interacción física entre PRPK-Kae1 (otro miembro del complejo KEOPS) y PRPK-Rab35. Los resultados obtenidos en esta tesis muestran que la pérdida de función de PRPK altera la dinámica del citoesqueleto de actina in vitro, el patrón de migración de hemocitos en estadios embrionarios, disminuye el reclutamiento de hemocitos en larvas en respuesta a un daño tisular y disminuye la velocidad de migración de hemocitos en estadío pupal. También se corroboró la interacción física entre PRPK y Rab35 y, aún cuando PRPK interactúa con Kae1, se concluyó que el rol de PRPK en la determinación de la forma celular se debe a un rol no canónico fuera del complejo KEOPS. Estos resultados sugieren que PRPK posee dos roles: Integración de señales de crecimiento y migración celular / Cell migration is an essential process in multicellular organisms, gaining great importance during embryogenesis and in the immune response. To migrate the cells must be able to generate protrusions outside the cell margin. The main types of actin protrusions are lamellipodia and filopodia, both generated by actin polymerization through the Arp2/3 (Actin related protein) complex. It has been reported that the activation of numerous small GTPases complex including Rab35, which recruits Rac1 and Cdc42 to the site of protrusions formation, where the latter are involved in the formation of lamellipodia and filopodia respectively. p53-related protein kinase (PRPK) is a highly conserved atypical kinase. It is a member of the KEOPS (kinase, putative endopeptidase and other proteins of small size) complex, which modulates the efficiency of recognition of ANN codons. In Drosophila PRPK is necessary for the translation of PI3K/TOR growth signals, which lastly support cell growth and proliferation. However, we observed that loss of function of PRPK alters cellular shape in haemocytes -macrophage-like cells-, generating a star-like phenotype which is also observed in loss of function of the Arp2/3 complex. The phenotype is suppressed by co-expressing Rab35. Also, it has been reported physical interaction between PRPK and Rab35 in human cells. With all this evidence I decided to determine if PRPK has a function independent of the KEOPS complex participating in the dynamics of membrane protrusions and migration pattern of haemocytes in Drosophila melanogaster. To do this, we manipulated PRPK levels in tissues and times specific through the Gal4 / UAS system. In particular contexts, migration and cell cultures, the actin cytoskeleton dynamics and cell migration's parameters were analyzed by confocal microscopy. Finally co-immunoprecipitations were performed to determine the physical interaction between PRPK-kae1 (another member of the complex KEOPS) and PRPK-Rab35. The results obtained in this study show that the loss of function of PRPK alters the dynamics of membrane protrusions in vitro and the migration pattern of embryonic haemocytes, reduces the recruitment of larval haemocytes in response to tissue damage and decreases haemocyte migration rate in pupal stage. We confirmed the physical interaction between PRPK and Rab35 and even when PRPK interacts with kae1, it was concluded that the role of PRPK in determining cell shape is due to a non-canonical role independent of the KEOPS complex. These results suggest that PRPK has two roles: Integration of growth signals and cell migration / Fondecyt

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El corazón está compuesto por varios tipos celulares, de los cuales aproximadamente el 90% corresponde a cardiomiocitos y a fibroblastos. Los fibroblastos representan 2/3 de la población total de células del corazón y están encargados principalmente del recambio de las proteínas de la matriz extracelular. Este tipo celular puede responder frente a una variedad de citoquinas, factores de crecimiento y expresan sus receptores, indicativo de una respuesta autocrina. Por acción del TGF-β1 se diferencian a un fenotipo celular altamente secretor de colágeno, el miofibroblasto, principal célula encargada del proceso de cicatrización. Por otra parte, existen antecedentes que demuestran que en fibroblastos cardíacos la activación de las vías transduccionales que conducen a un aumento en los niveles de AMPc contribuye a disminuir el grado de fibrosis cardíaca, por regulación de procesos tales como adhesión, migración y la diferenciación a miofibroblasto. Para estos efectos, el AMPc es crítico debido al rol que juegan dos proteínas que se activan cuando aumentan los niveles de éste; estas son Epac (Exchange protein activated by cAMP/ proteína intercambiadora de nucleótidos de guanina activada por AMPc) y PKA (proteína quinasa A). Anteriormente se estudió el rol desempeñando por la Epac en los procesos de adhesión y migración de fibroblastos y miofibroblastos, en donde se vio que Epac aumenta la adhesión en ambos fenotipos celulares, y con respecto a migración, se vio que los estímulos que aumentan los niveles de AMPc aumentan la migración en fibroblastos, pero no así en miofibroblastos. Con esto surge la interrogante de saber cómo modula la PKA estos procesos. El objetivo de este trabajo fue determinar el rol que juega la PKA en adhesión, migración y expresión de colágeno. Se utilizaron estímulos que aumentan los niveles de AMPc (isoproterenol y forskolina), el agonista de la PKA 6-Bz-AMPc y su inhibidor H-89. Nuestros resultados mostraron que tanto en fibroblastos como en miofibroblastos, hubo un aumento de la adhesión al estimular con isoproterenol y forskolina, pero con 6-Bz-AMPc no se observó un cambio significativo con respecto al control, aunque sí tendió a disminuir lo que indica que la PKA no regula la adhesión celular. En migración no se observa efecto alguno con el agonista de la PKA y en la expresión de colágeno se vio una disminución con isoproterenol, forskolina, 6-Bz-AMPc y Me-AMPc tanto en fibroblastos como en miofibroblastos. Conclusión: PKA no interviene dentro de los procesos de adhesión y migración, pero sí lo hace en la expresión de colágeno. / The heart is composed by many types of cells, mainly cardiomyocytes and fibroblasts (almost 90% of total cells). Fibroblasts represent two thirds of the whole heart cell population and are responsible for the constant turnover of extracellular matrix proteins. This kind of cells can respond to many cytokines, growth factors and express their receptors indicating an autocrine answer. By the action of TGF-β1, they can be differentiated into a new phenotype called myofibroblasts, highly secreting of collagen and main cell involved into the healing process. Otherwise, there are numerous reports indicating that in cardiac fibroblasts, activation of signal transduction pathways leading to increased cAMP levels contributes to the reduction of cardiac fibrosis by regulating profibrotic processes like adhesion, migration and myofibroblast differentiation. For these effects cAMP is critical due to the role played by two proteins whose activation depends on the increase in the cAMP levels. These proteins are Epac (Exchange protein activated by cAMP) and PKA (protein kinase A). Formerly it was studied the role played by Epac in adhesion and migration of fibroblasts and myofibroblasts. Epac increased cell adhesion in both phenotypes, and about migration, in fibroblasts this phenomenon was increased with all the stimuli that increased the cAMP levels, whereas in myofibroblasts were no effect. So, we can ask about the role lead by PKA in these processes. The objective in this work was determined which role plays PKA in adhesion, migration and collagen expression. We used stimuli that increase cAMP levels (isoproterenol and forskolin), PKA’s agonist 6-ph-cAMP and its inhibitor H-89. Our results showed that both fibroblasts and in myofibroblasts there was an increase in cell adhesion in response to isoproterenol, forskolin and H-89, but with 6-ph-cAMP no significant change was observed respect control but tended to decrease, indicating that PKA is not involved in cell adhesion. In migration no effect was observed with 6-ph-cAMP, and finally in collagen expression these stimuli decreased the expression (we tried with Epac agonist Me-cAMP too) in both phenotypes. Conclusion: PKA does not intervene in adhesion and migration processes, but it does in collagen expression.

Se sabe desde hace tiempo que el NHE1 juega un papel fundamental en la fisiología y fisiopatología del miocardio, En estos procesos la activación por fosforilación del intercambiador pareciera ser clave. Por otro lado, en los últimos años han aparecido trabajos que muestran que la estimulación de la ruta GMPc/PKG determina un efecto antihipertrófico tanto en miocardio adulto como en neonato. Entonces, si GMPc/PKG es capaz de inhibir al NHE1 y además previene el desarrollo de la hipertrofia cardíaca pareciera razonable suponer que estos efectos estén ligados entre sí. En otras palabras, se podría especular que al menos una parte de los efectos antihipertrofiantes de la activación de la ruta GMPc/PKG podrían estar mediados por su acción sobre el NHE1 como hemos sugerido en nuestro trabajo previo (Perez, Piaggio et al. 2007), lo cual podría tener importantes implicancias terapéuticas. Una vez más, la caracterización precisa de las vías de fosforilación del NHE1 y de los efectos que sobre la misma ejerce la activación de la ruta GMPc/PKG será fundamental para conocer más sobre la fisiología del intercambiador y para poder explotar las potencialidades clínicas de los inhibidores de PDE5A. Dado que no existían estudios directos y completos en ningún modelo celular que caractericen esta ruta de señalización, propusimos el estudio de la misma como el objetivo principal del presente trabajo de Tesis Doctoral. <i>(Párrafo extraído del texto a modo de resumen)</i>

Memoria de título para optar al título profesional de Bioquímico / La testosterona es la principal hormona sexual masculina, responsable de múltiples efectos en el organismo. Dentro de estos, se ha descrito que es capaz de producir hipertrofia cardiaca tanto in vitro como in vivo. Una de las etapas claves en el desarrollo de la hipertrofia del cardiomiocito consiste en el aumento del consumo de glucosa, como estrategia para aumentar la producción de energía asociada al crecimiento hipertrófico. Si bien la testosterona es capaz de producir hipertrofia cardiaca, no se ha descrito que además aumente la captación de glucosa en cardiomiocitos. Como hipótesis a este problema, se planteó que la testosterona aumenta la captación de glucosa en cardiomiocitos a través del transportador de glucosa GLUT4. Para evaluar esta hipótesis, se realizó cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas y se evaluó la captación de glucosa por medio de la glucosa fluorescente 2-NBDG (2-(N-(7-nitrobenzo-2- oxa-1,3-diazol-4-il) amino)-2-deoxiglucosa) y 2-deoxi-[3H] glucosa en cardiomiocitos estimulados con testosterona. Adicionalmente, se evaluó la participación del transportador de glucosa GLUT4, la proteína Akt, la proteína dependiente del complejo Ca2+/calmodulina (CaMKII) y la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) en el proceso. Los resultados obtenidos a través de microscopía de epifluorescencia y centelleo líquido, indican que la testosterona aumentó la captación de la glucosa 2-NBDG y 2-deoxi- [3H] glucosa, respectivamente, alcanzando un valor máximo luego de 2 h de estímulo. La inhibición selectiva del transporte de glucosa a través de GLUT4 con indinavir, bloqueó el aumento en la captación de glucosa por testosterona, sugiriendo la participación de GLUT4 en el proceso. Adicionalmente, cardiomiocitos transfectados con el plasmidio GLUT4myceGFP revelaron que la testosterona aumentó la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática. Mediante ensayos de Western blot se determinó que la testosterona aumentó la fosforilación de las proteínas CaMKII y AMPK (alcanzando un máximo en su fosforilación luego de 15 y 60 min de estímulo, respectivamente), las que resultaron ser claves tanto en la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática, como en la captación de glucosa por testosterona. Finalmente, es posible concluir que la testosterona aumenta la captación de glucosa a través de GLUT4 por medio de la activación de la vía de señalización CaMKII/AMPK. Lo anterior revela el papel de la testosterona en la captación de glucosa en cardiomiocitos, lo cual puede constituir un mecanismo de captación de glucosa destinada a la producción de energía celular, síntesis de componentes necesarios para el crecimiento hipertrófico y otros procesos anabólicos importantes para estas células. / Testosterone is the principal male sexual hormone, and plays a key role in the development of male reproductive tissues. It has been reported that testosterone induces cardiac hypertrophy, both in vivo and in vitro. One critical step during cardiac hypertrophy development is the induction of glucose uptake to improve energy production during cardiac growth. Although it is known that testosterone induces cardiac hypertrophy, its effect on glucose uptake in cardiomyocytes remains unknown. The hypothesis of this work is that testosterone increases GLUT4-dependent glucose uptake by the activation of the CaMKII/AMPK signaling pathway. Experiments were performed in primary cell culture of neonatal cardiomyocytes. To evaluate testosterone-induced glucose uptake in cardiomyocytes, the fluorescent analog of glucose 2-NBDG (2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose) and 2-deoxy- [H3] glucose were used. Moreover, participation of the glucose transporter GLUT4, as well as the protein Akt, Ca2+/calmodulin complex dependent protein kinase (CaMKII) and AMP-activated protein kinase (AMPK) were assessed. Testosterone increased both 2-NBDG and 2-deoxy-[H3] glucose uptake (by epifluorescence microscopy and liquid scintillation counting, respectively), reaching a peak after 2 h of testosterone stimulation. Indinavir, a specific GLUT4 blocker, inhibited testosterone-induced glucose uptake in cardiomyocytes. In addition, western blot assays showed that testosterone increased phosphorylation levels of both CaMKII and AMPK, after 15 and 60 min of stimulation, respectively. Moreover, both proteins were crucial for GLUT4 translocation to the plasma membrane and glucose uptake induced by testosterone in cardiomyocytes. Taken together, data showed that testosterone increases GLUT4-dependent glucose uptake through CaMKII/AMPK signaling pathway activation. These findings suggest that testosterone increases glucose uptake in cardiomyocytes, which could be necessary for energy production required for cellular homeostasis, cardiomyocyte growth and other important anabolic process in cardiac cells.

El presente trabajo de tesis realizado en un modelo celular de taquicardia crónica inducido por marcapaseo rápido (MR) tuvo como finalidad la comprobación de la hipótesis de que la taquicardia crónica a través del aumento sostenido del calcio (Ca2+) intracelular y la producción de las especies reactivas de oxígeno (ROS) promuevan la activación de dos quinasas proapoptóticas, la proteína quinasa II dependiente de Ca2+-calmodulina (CaMKII) y la proteína perteneciente a la familia de las quinasas activadas por mitógenos (MAPKs), p38MAPK, que conducen a la activación de la cascada apoptótica. Utilizando corazones enteros y cardiomiocitos de rata y ratón estimulados a baja (0,5Hz) y alta (5 y 8Hz) frecuencia en presencia y ausencia de diferentes compuestos farmacológicos, inhibidores específicos de las quinasas, demostramos que la muerte celular inducida por MR se asocia con el aumento de la activación de las quinasas, CaMKII y p38MAPK, sin embargo, solo la inhibición de CaMKII previno la muerte celular inducida por MR, concluyendo que p38MAPK no está involucrada en la muerte celular inducida por MR. Midiendo Ca2+ y ROS mostramos además que el Ca2+, y no así las ROS, es necesario para la activación de CaMKII durante el MR. Por otra parte, utilizando estabilizadores del receptor de rianodina (RyR2) e inhibidores de la retoma de Ca2+ mitocondrial y de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP) demostramos que la activación de CaMKII inducida por MR conduce a un aumento en la probabilidad de apertura de los RyR2 que resulta en la pérdida de Ca2+ por el retículo sarcoplasmático (RS) y la sobrecarga de Ca2+ mitocondrial con la consecuente apertura del mPTP y la liberación de factores que inician la cascada apoptótica. Otro hallazgo importante y hasta ahora sin precedentes de este trabajo de tesis es que la activación de CaMKII durante el MR activa a la NADPH oxidasa resultando en un aumento en la producción de ROS intracelular. Estos ROS oxidarían a los RyR2 aumentando así su probabilidad de apertura. Finalmente, demostramos que la activación de la vía PI3K/AKT juega un papel protector al reducir la muerte celular inducida por MR. Los resultados obtenidos no solo aportan evidencias del rol crítico de la CaMKII en la muerte celular inducida por MR sino que además indican que su blanco de acción sería el RyR2. Se propone que la estabilización de los RyR2 podría resultar en una novedosa estrategia terapéutica para el tratamiento del remodelado adverso asociado con la taquicardia crónica.

Memoria para optar al título Bioquímico / Como parte del sistema inmune innato existe un grupo de receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) capaces de detectar aquellos patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs). Entre estos PRRs, destacan los receptores de tipo Toll o TLRs. Dentro de esta familia de receptores, TLR2 reconoce PAMPs derivados de bacterias gram positivas, los que promueven la activación de la vía de señalización intracelular dependiente del adaptador molecular MyD88, que conduce a la activación de IKK y de las MAPKs, las que tienen un impacto fundamental sobre la expresión de citoquinas proinflamatorias. El estudio de los mecanismos fisiológicos de control de esta vía de señalización constituye un área de investigación relevante en inmunología. En este sentido, los glucocorticoides, anti-inflamatorios naturales, ejercen su efecto vía un receptor citoplasmático (GR) mediante procesos de trans-represión y de expresión de proteínas reguladoras. A pesar de esto, se desconoce su efecto sobre las vías de inducción de citoquinas pro-inflamatorias mediadas por TLR2, tal como la vía de p38. Basados en estos antecedentes, el objetivo general de esta memoria de título consistió en determinar la participación de p38 en la producción de TNF-α en células A549, inducida por un agonista de TLR2, Pam3Cys-Ser-Lys4, en presencia o ausencia de dexametasona. Los objetivos específicos se centraron en: 1) determinar la expresión de TNF-α, a nivel de transcrito y proteína, en células activadas con el agonista sintético Pam3Cys-Ser-Lys4, en presencia o ausencia de dexametasona 2) evaluar la fosforilación de la proteína quinasa p38 en células estimuladas con Pam3Cys-Ser-Lys4, en presencia o ausencia de dexametasona y 3) evaluar la contribución de la proteína quinasa p38 sobre la expresión de TNF-α en células estimuladas con Pam3Cys-Ser-Lys4, en presencia o ausencia de dexametasona. Los resultados obtenidos indican que la activación de TLR2 por Pam3Cys-Ser-Lys4 induce un aumento en la expresión de TNF-α, el que no es reprimido por dexametasona. Se observó una activación de la vía p38 inducida por Pam3Cys-Ser-Lys4, que está involucrada en la expresión de TNF-α. Por otro lado, constatamos que dexametasona ejerce su efecto anti-inflamatorio clásico mediante la expresión de moléculas reguladoras de la vía de p38, como la fosfatasa MKP-1. Sin embargo, no podemos descartar un efecto independiente de la expresión de genes regulados por el glucocorticoide. Además, observamos que dexametasona no actuaría en los eventos tempranos de señalización de la vía de TLR2, como lo constatamos con la fosforilación de p38. Estos datos demostrarían un mecanismo a través del cual los glucocorticoides regulan procesos inflamatorios inducidos por TLR2, con un impacto relevante en el desarrollo de la inmunidad innata y la inflamación / As part of innate immune system, it exists a group of pattern-recognition receptors (PRRs) capable of detecting those molecular pattern associated to pathogens (pathogenassociated molecular patterns; PAMPs). Among these PRRs, Toll-like receptors (TLRs) stand out. Inside this receptor family, TLR2 recognizes PAMPs derived from gram positive bacteria, thus promoting activation of MyD88-dependent intracellular pathway. It leads to IKK and MAPKs activation, which have a fundamental impact on the expression of proinflammatory cytokines. The study of the physiological control mechanisms of this pathway constitutes an area of relevant research in immunology. In this sense, glucocorticoids, natural anti-inflammatory molecules, exert its effect by a cytoplasmatic receptor (GR) by trans-repression mechanism and regulatory proteins expression. In spite of this, the effect of glucocorticoid on the TLR2-mediated pro-inflammatory cytokine pathway induction, specially on p38, is unknown. Based on these precedents, the general aim of this study was determining the role of p38 in TNF-α production in A549 cells induced with Pam3Cys-Ser-Lys4, a TLR2 agonist, in presence or absence of dexametasona. The specific objectives were centered to: 1) determine TNF-α expression, at messenger and protein level; 2) evaluate the p38 protein kinase phosphorylation and 3) evaluate the contribution of p38 protein kinase on TNF-α expression under the stimulation with Pam3Cys-Ser-Lys4, in presence or absence of dexamethasone. The results indicate that the activation of TLR2 by Pam3Cys-Ser-Lys4 induces an increase in TNF-α expression, which is not suppressed for dexamethasone. It also was observed an activation of p38 pathway induced by Pam3Cys-Ser-Lys4, that was involved in TNF-α expression. On the other hand, that dexametasona exert its classic anti-inflammatory effect by means of expression of regulatory molecules of the p38 pathway, as phosphatase MKP-1. Nevertheless, we can’t reject an independent effect from the expression of glucocorticoid regulated genes. Besides, dexamethasona wouldn’t work on early events of TLR2 signalling pathway, as we observed for p38 phosphorylation. This data would show a mechanism by which glucocorticoids regulates the TLR2- induced inflammatory processes, with a relevant impact in the processes involved in the development of the innate immunity and inflammation