OLIVEIRA, Jefferson Soares de. Múltiplas proteínas estão envolvidas nas atividades antiinflamatória e antinociceptiva do látex da planta medicinal Calotropis procera (AIT.) R. Br. 2009. 101 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2009. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-05-25T13:19:57Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_jsoliveira.pdf: 2272072 bytes, checksum: 0182fc53b1ceb0d4a37902cd816bcd13 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-05T20:11:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_jsoliveira.pdf: 2272072 bytes, checksum: 0182fc53b1ceb0d4a37902cd816bcd13 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-05T20:11:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_jsoliveira.pdf: 2272072 bytes, checksum: 0182fc53b1ceb0d4a37902cd816bcd13 (MD5) Previous issue date: 2009 / Latex is a general term used to describe fluid exudates from plants after mechanical injury. Latex from Calotropis procera is well known for its medicinal properties mainly in Indian traditional medicine. Moreover, it has been experimentally shown that it exhibits interesting biological activities such as anti-inflammation. However its latex has been reported to induce proinflammatory responses. In the present work, (1) the latex was fractionated to segregate pro- and anti-inflammatory activities; (2) assays were carried out to characterize the mechanism of action of active fractions and (3) attempts were done to identify molecules involved in anti-inflammatory and antinociceptive activities. First, the latex was collected in distilled water (1:1; v/v) and submitted to centrifugation and dialysis steps to obtain three different fractions (FD, PL and B). These fractions were evaluated to pro- and anti-inflammatory activities using peritonitis model in rats. FD, constituted by compounds with molecular mass lower than 8,000 Da, did not exhibited anti-inflammatory activity, however induced intense neutrophil migration into peritoneal cavity of rats. The inflammation induced by FD was time and dose dependent. Moreover, it was seen that previous injection of Dexamethasone, Thalidomide and Meclizine in animals inhibited FD inflammatory responses suggesting that inflammation triggered by this fraction occurs through histamine and TNF-α release. Peptides, present in FD as shown in electrophoresis, should be involved in inflammation responses displayed by FD since such activity was diminished after 24 hour pronase treatment. Fractions PL, and B did not induce inflammatory response when injected into peritoneal cavity of animals, however intravenous injection displayed strong anti-inflammatory activity against inflammation induced by carrageenan. The anti-inflammatory activity promoted by B seems to be related to PL proteins present in B. PL fraction inhibited neutrophil migration trigged by FD. PL anti-inflammatory activity ought to be related to proteins since such activity was completely abolished after heat or pronase treatment and it still remained after acetone precipitation. Three protein sub-fractions (PI, PII and PIII) were recovered after PL chromatography on ion-exchange column (CM-Sepharose Fast flow) at pH 5.0. In spite of the fact that PI, PII e PIII were seen to be different by electrophoresis they were equally able to inhibit neutrophil migration induced by carrageenan in rats as well as abdominal writhes stimulated by acetic acid in mice. Intravital microscopy assay revealed that, PI, PII and PIII inhibit both leucocyte rolling and adhesion in mice mesenteric tissues. In addition, PI was able to induce nitric oxid production and inflammation induced by FD. These results show that multiples proteins in PL display anti-inflammatory activity and they act at different pathway of inflammation. Several experiments were performed aiming to detect the anti-inflammatory activity of PL when it was administered by oral route however, we did not obtain success. This is the first report which confirms the presence of pro- and anti-inflammatory activities and it shows that such activities are displayed by compounds suitable to be fractionated on the basis of their molecular size. In addition, these results show that anti-inflammatory and antinociceptive activities are displayed by proteins present in the latex / A planta Calotropis procera, pertencente à família Apocinaceae, tem como uma de suas principais características a produção constitutiva de látex. Este fluido é amplamente utilizado na medicina popular, principalmente da Índia, por apresentar diversas propriedades curativas. Na literatura, o produto da extração do látex íntegro com solvente aquoso e/ou orgânico desta planta é citado por apresentar atividade antinociceptiva e antiinflamatória. Por outro lado, a mesma preparação do látex também é relatada por induzir processos inflamatórios. O presente trabalho teve como objetivo fracionar o látex da planta Calotropis procera para separar as atividades pró- e antiinflamatória; caracterizar estes mecanismos e avançar na identificação das moléculas envolvidas na atividade antiinflamatória e antinociceptiva. O látex coletado em água destilada (1:1; v/v) foi submetido às etapas de centrifugação e diálise e três frações foram obtidas (FD, PL e B) e inicialmente avaliadas quanto à presença de atividade pró- e antiinflamatória, utilizando o modelo de peritonite em ratos. A fração FD, rica em compostos de massa molecular inferior a 8.000 Da, não se mostrou antiinflamatória quando administrada por via endovenosa nos animais. Por outro lado, uma forte atividade pró-inflamatória foi observada quando esta foi injetada na cavidade peritoneal de ratos. A resposta inflamatória induzida por FD foi dependente de tempo e dose e parece estar relacionada com a presença de peptídeos detectados na fração, já que esta atividade foi diminuída quando a fração foi tratada com pronase durante 24 horas antes de sua administração nos ratos. A inflamação induzida por FD foi inibida por Dexametasona, Talidomida e Meclizina sugerindo um processo inflamatório induzido por vias de liberação de histamina e TNF-α. A fração PL, rica em proteínas, e a fração borracha (B) não foram pró-inflamatórias e apresentaram forte atividade antiinflamatória por via endovenosa. A atividade promovida por B parece estar relacionada à presença de proteínas pertencentes à fração PL, como observado em ensaio de detecção imunológica. PL inibiu o processo inflamatório induzido por FD. A atividade antiinflamatória promovida pela fração PL parece ser um evento promovido pela ação de proteínas, visto que a atividade antiinflamatória da fração foi perdida após aquecimento ou tratamento com pronase, e permaneceu ativa após precipitação com acetona. Três novas sub-frações (PI, PII e PIII) foram obtidas após aplicação da fração PL em coluna de troca iônica (CM-Sepharose Fast Flow) em pH 5,0. As sub-frações, distintas entre si, como observado através de eletroforese em gel de poliacrilamida, foram igualmente capazes de reverter a inflamação induzida por carragenina no modelo de peritonite em ratos, bem como reduzir as contorções abdominais induzidas por ácido acético, evidenciando o envolvimento de múltiplas proteínas na resposta antiinflamatória e antinociceptiva produzida pela fração PL. Ensaio de microscopia intravital revelou que PI, PII e PIII inibem o rolamento e a adesão leucocitária no mesentério de camundongos. Somente PI induziu intensa produção de óxido nítrico em ratos além de ter sido a única sub-fração capaz de reverter a resposta pró-inflamatória promovida pela fração FD, evidenciando diferentes mecanismos antiinflamatórios promovidos por diferentes proteínas do látex. A atividade antiinflamatória não foi observada quando a fração PL foi administrada por via oral nos animais. Este é o primeiro trabalho que confirma a presença de duas atividades antagonistas no látex de C. procera e que estas são promovidas por moléculas distintas passíveis de serem separadas com base em seu tamanho molecular. O conjunto de resultados aqui apresentados mostra que a atividade antiinflamatória e antinociceptiva do látex foram promovidas por moléculas protéicas

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2016-06-09T12:50:17Z No. of bitstreams: 1 Maria Taciana Ralph.pdf: 2037861 bytes, checksum: 741dc14a84d30b0c1c5f968794b721c9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-09T12:50:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maria Taciana Ralph.pdf: 2037861 bytes, checksum: 741dc14a84d30b0c1c5f968794b721c9 (MD5) Previous issue date: 2013-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Carica candamarcensis é uma planta pertencente à família Caricaceae, cujo látex possui proteínas com importantes atividades biológicas descritas. A fração proteica P1G10, obtida por cromatografia de gel-filtração a partir do conjunto de proteínas desse látex, já foi relatada por suas atividades mitogênica, angiogênica e gastroprotetora. No presente estudo, um modelo de infecção sistêmica experimental, causada por Salmonella enterica Sor. Typhimurium, em camundongos, foi utilizado para avaliar o potencial de P1G10 no controle da infecção e inflamação decorrente. Os animais receberam P1G10 (1, 5 ou 10 mg/ Kg), ou solução salina tamponada (PBS), via intraperitoneal, 24 horas antes da infecção por Salmonella Typhimurium (0,2 mL; 107 UFC/ mL). A taxa de sobrevivência dos animais pré-tratados com 10 mg/ Kg de P1G10 atingiu 60% após 7 dias da infecção, ao passo que o grupo controle sucumbiu por inteiro até o terceiro dia após o desafio infeccioso. As análises histológicas dos fígados e baços dos animais experimentais, após 72 horas de infecção, mostraram células mais preservadas em relação ao grupo controle. Apesar do menor número de bactérias no fígado, P1G10 não estimulou o clareamento bacteriano no baço, fluido peritoneal e sangue dos animais após a infecção e não demonstrou atividade antibacteriana in vitro contra S. Typhimurium na dosagem máxima de 1 mg/ ml. Após 72h de infecção, houve maior migração de leucócitos para a cavidade peritoneal dos animais experimentais, porém não houve diferença significativa na quantidade de leucócitos no sangue ou na produção de óxido nítrico entre os animais controle e experimentais. A avaliação da expressão gênica de citocinas, por RT-PCR Tempo Real, demonstrou que ocorreu diminuição relativa na produção de transcritos de TNF-α e IL-1β no fígado dos animais experimentais em relação ao grupo controle e que IL-10 não foi expresso por nenhum dos grupos. Para melhor compreensão do efeito das proteínas presentes em P1G10 sobre a resposta inflamatória foi utilizado um modelo de peritonite, em camundongos, induzia pelo agente flogístico carragenina . Foi observado que quando administrada por via intraperitoneal a fração proteica P1G10 potencializa o efeito pró-inflamatório desenvolvido pelo agente flogístico, por outro lado, um efeito anti-inflamatório é desencadeado quando P1G10 foi administrado via endovenosa. Tal efeito parece estar relacionado à inibição da cascata do sistema complemento, uma vez que a exposição de P1G10 ao soro humano e ovino, inibiu a lise de Escherichia coli in vitro, nas concentrações de 5 e 10 mg/ mL, o mesmo não foi observado quando as proteínas presentes em P1G10 foram desnaturadas pelo calor, sugerindo que a ação anti-complemento seja devido a intensa atividade proteolítica presente nesta fração proteica. Conclui-se que, P1G10 possui potencial anti-inflamatório, além de estimular a migração de leucócitos para o foco infeccioso e diminuir relativamente a expressão das citocinas inflamatórias TNF-α e IL-1β evitando assim o choque séptico nos animais pré-tratados, desta forma, P1G10 capaz de aumentar a sobrevida de animais infectados por S. Typhimurium. / Carica candamarcensis é uma planta pertencente à família Caricaceae, cujo látex possui proteínas com importantes atividades biológicas descritas. A fração proteica P1G10, obtida por cromatografia de gel-filtração a partir do conjunto de proteínas desse látex, já foi relatada por suas atividades mitogênica, angiogênica e gastroprotetora. No presente estudo, um modelo de infecção sistêmica experimental, causada por Salmonella enterica Sor. Typhimurium, em camundongos, foi utilizado para avaliar o potencial de P1G10 no controle da infecção e inflamação decorrente. Os animais receberam P1G10 (1, 5 ou 10 mg/ Kg), ou solução salina tamponada (PBS), via intraperitoneal, 24 horas antes da infecção por Salmonella Typhimurium (0,2 mL; 107 UFC/ mL). A taxa de sobrevivência dos animais pré-tratados com 10 mg/ Kg de P1G10 atingiu 60% após 7 dias da infecção, ao passo que o grupo controle sucumbiu por inteiro até o terceiro dia após o desafio infeccioso. As análises histológicas dos fígados e baços dos animais experimentais, após 72 horas de infecção, mostraram células mais preservadas em relação ao grupo controle. Apesar do menor número de bactérias no fígado, P1G10 não estimulou o clareamento bacteriano no baço, fluido peritoneal e sangue dos animais após a infecção e não demonstrou atividade antibacteriana in vitro contra S. Typhimurium na dosagem máxima de 1 mg/ ml. Após 72h de infecção, houve maior migração de leucócitos para a cavidade peritoneal dos animais experimentais, porém não houve diferença significativa na quantidade de leucócitos no sangue ou na produção de óxido nítrico entre os animais controle e experimentais. A avaliação da expressão gênica de citocinas, por RT-PCR Tempo Real, demonstrou que ocorreu diminuição relativa na produção de transcritos de TNF-α e IL-1β no fígado dos animais experimentais em relação ao grupo controle e que IL-10 não foi expresso por nenhum dos grupos. Para melhor compreensão do efeito das proteínas presentes em P1G10 sobre a resposta inflamatória foi utilizado um modelo de peritonite, em camundongos, induzia pelo agente flogístico carragenina . Foi observado que quando administrada por via intraperitoneal a fração proteica P1G10 potencializa o efeito pró-inflamatório desenvolvido pelo agente flogístico, por outro lado, um efeito anti-inflamatório é desencadeado quando P1G10 foi administrado via endovenosa. Tal efeito parece estar relacionado à inibição da cascata do sistema complemento, uma vez que a exposição de P1G10 ao soro humano e ovino, inibiu a lise de Escherichia coli in vitro, nas concentrações de 5 e 10 mg/ mL, o mesmo não foi observado quando as proteínas presentes em P1G10 foram desnaturadas pelo calor, sugerindo que a ação anti-complemento seja devido a intensa atividade proteolítica presente nesta fração proteica. Conclui-se que, P1G10 possui potencial anti-inflamatório, além de estimular a migração de leucócitos para o foco infeccioso e diminuir relativamente a expressão das citocinas inflamatórias TNF-α e IL-1β evitando assim o choque séptico nos animais pré-tratados, desta forma, P1G10 capaz de aumentar a sobrevida de animais infectados por S. Typhimurium.

MATOS, Mayara Patrícia Viana de. Aspectos bioquímicos e etnofarmacológicos do látex de Himatanthus drasticus Mart. (Plumel). 2013. xix, 89 f. : Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Fortaleza-CE, 2013. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-06-20T13:34:18Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_mpvmatos.pdf: 2159476 bytes, checksum: ddbc07e064712e575447b91164349d1e (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-26T20:01:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_mpvmatos.pdf: 2159476 bytes, checksum: ddbc07e064712e575447b91164349d1e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-26T20:01:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_mpvmatos.pdf: 2159476 bytes, checksum: ddbc07e064712e575447b91164349d1e (MD5) Previous issue date: 2013 / Himatanthus drasticus (Apocynaceae) is traditionally used in folk medicine in Northeastern Brazil. The plant is wildly distribuited from Guianas until Southeast Brazil. Latex obtained by cutting its stem bark is mixed with water and extensively sold in public markets. People use Janaguba milk (“Leite de Janaguba”- LJ) to treat or prevent different inflammatory disorders such as gastritis, ulcers as well as cancer, among other uses. Despite, there is not enough scientific data confirming these pharmacological properties. In this work, Janaguba milk was preliminarily investigated in an attempt to validate its anti- inflammatory activity. Its major protein fraction (HdLP) was assessed for the presence of anti- inflammatory, anti-nociceptive and toxicological effects. LJ inhibited the inflammatory response induced by carrageenan in rats (98%, p < 0.05), whereas HdLP did it independent of the route of administration. HdLP significantly reduced the infiltration of neutrophils into the peritoneal cavity (96%, p < 0.05) concomitant with increased nitric oxide synthesis in plasma and decrease of pro-inflammatory cytokines IL- 1 and TNF-α in peritoneal fluid. This fraction also prevented vacuolization and Kupfer cell hyperplasia caused by carrageenan in liver. Further, the anti-inflammatory properties were shown to be associated with the protein fraction of LJ. HdLP exhibited anti-inflammation, even after heat-treatment (100 C, 30 min) or proteolysis. Moreover, a pro-inflammatory effect was observed after HdLP treatment. It also suppressed abdominal constrictions in acetic acid-treated mice and reduced paw licking induced by formalin, both in a dose-dependent manner. An acute toxicological evaluation demonstrated no toxic effects after 14 days from LJ and HdLP administration by oral route even when high doses were tested. A qualitative phytochemical analysis showed the absence of lupeol and presence of saponinas, tannins and free steroids in HdLP. However, pharmacological properties are probably not related to them. It is therefore concluded that the latex of Himatanthus drasticus exhibits both the anti-inflammatory and anti-nociceptive activities claimed by its users. The protein fraction of the latex is an important contributor to the pharmacological properties of LJ. Resistance to heat and proteolytic treatment can explain the effectiveness of HdLP even when administered orally. The absence of toxic effects by oral route confirms the potential use of this plant as a phytotherapic agent. / Himatanthus drasticus (Apocynaceae) é uma espécie tradicionalmente utilizada na medicina popular da região nordeste deste país. Sua distribuição ocorre das Guianas ao sudeste do Brasil. O látex desta planta é obtido após uma injúria no caule e amplamente comercializado em mercados públicos. As pessoas ingerem o látex, conhecido como Leite de Janaguba (LJ), para o tratamento e/ou prevenção de diferentes doenças inflamatórias, gastrite, úlcera, câncer, entre outras. Apesar das diversas informações oriundas da medicina popular, não existem relatos científicos suficientes confirmando tais propriedades farmacológicas. Neste trabalho, LJ foi investigado com o propósito de validar sua tão popularmente relatada atividade anti-inflamatória. A fração proteica deste látex (HdLP) também foi investigada quanto à presença de atividades anti-inflamatória, antinociceptiva, além de seus efeitos toxicológicos. LJ inibiu a resposta inflamatória induzida por carragenina em ratos (98%, p < 0.05), assim como o fez a fração HdLP, independente da rota de administração. HdLP reduziu a infiltração de neutrófilos na cavidade peritoneal (96%, p < 0.05). Paralelamente a isto, ocorreu o aumento da síntese de óxido nítrico no plasma e a redução de citocinas pró-inflamatórias (IL-1 e TNF-α) no fluido peritonal. Esta fração também preveniu a vacuolização e hiperplasia das células de Kupfer, causadas pelo efeito da carragenina no fígado. Atividade anti-inflamatória está provavelmente associada com a fração proteica de LJ. HdLP exibiu um efeito anti-inflamatório mesmo após aquecimento (100 C, 30 minutos) ou proteólise. Além desta atividade, um efeito pró-inflamatório foi observado após o tratamento com HdLP. Esta também suprimiu contrações abdominais induzidas por ácido acético e reduziu a lambedura de pata induzida por formalina, ambos de maneira dose-dependente. A avaliação da toxicidade aguda demonstrou a ausência de efeitos tóxicos após tratamento com LJ e HdLP (v.o.) mesmo utilizando doses 5000 vezes maiores que as recomendadas. Uma dosagem qualitativa de fitoquímicos em HdLP mostrou a ausência de lupeol e presença de saponinas, taninos e esteróides livres. Entretanto, as propriedades farmacológicas provavelmente não estão relacionadas com estas moléculas. Desta forma, concluímos que o látex de H. drasticus exibe duas das atividades farmacológicas relatadas por seus usuários e a fração proteica deste látex é um importante contribuinte para tais propriedades medicinais. A resistência ao aquecimento e à proteólise pode explicar a efetividade de HdLP quando administrada oralmente. A ausência de efeitos tóxicos por via oral torna esta planta uma potencial candidata a fitoterápico.