No / The surface expression and regulated endocytosis of kainate (KA) receptors (KARs) plays a critical role in neuronal function. PKC can modulate KAR trafficking, but the sites of action and molecular consequences have not been fully characterized. Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification of the KAR subunit GluK2 mediates agonist-evoked internalization, but how KAR activation leads to GluK2 SUMOylation is unclear. Here we show that KA stimulation causes rapid phosphorylation of GluK2 by PKC, and that PKC activation increases GluK2 SUMOylation both in vitro and in neurons. The intracellular C-terminal domain of GluK2 contains two predicted PKC phosphorylation sites, S846 and S868, both of which are phosphorylated in response to KA. Phosphomimetic mutagenesis of S868 increased GluK2 SUMOylation, and mutation of S868 to a nonphosphorylatable alanine prevented KA-induced SUMOylation and endocytosis in neurons. Infusion of SUMO-1 dramatically reduced KAR-mediated currents in HEK293 cells expressing WT GluK2 or nonphosphorylatable S846A mutant, but had no effect on currents mediated by the S868A mutant. These data demonstrate that agonist activation of GluK2 promotes PKC-dependent phosphorylation of S846 and S868, but that only S868 phosphorylation is required to enhance GluK2 SUMOylation and promote endocytosis. Thus, direct phosphorylation by PKC and GluK2 SUMOylation are intimately linked in regulating the surface expression and function of GluK2-containing KARs.

Untersucht wurde der Zusammenhang zwischen der Proteinkinase A-vermittelten Ekto-Phosphorylierung des Membranproteins FAT/CD36 [Hatmi et al. 1996] und der initialen zellulären Aufnahme langkettiger Fettsäuren. Wir zeigten einen inhibitorischen Effekt auf die initiale Palmitinsäure-Aufnahme humaner Thrombozyten unter den Bedingungen der Ekto-Phosphorylierung von FAT/CD36. Damit kann erstmalig ein Mechanismus für die kurzfristige Regulation der proteinvermittelten Aufnahme langkettiger Fettsäuren vorgeschlagen werden. Für die Bearbeitung der Fragestellung wurden die Isolation "ruhender", morphologisch und funktionell intakter humaner Thrombozyten und eine Methode zur Messung der initialen Palmitinsäure-Aufnahme etabliert. Die Kinetik der Palmitinsäure-Aufnahme humaner Thrombozyten wurde charakterisiert und bestätigt, dass ein wesentlicher Anteil der initialen Aufnahme proteinvermittelt erfolgt. Die von Hatmi und Co-Autoren beschriebene Ekto-Proteinkinase A-vermittelte, cAMP-abhängige Phosphorylierung von FAT/CD36 [Hatmi et al. 1996] konnte unter unseren experimentellen Bedingungen nachvollzogen werden. Die Ekto-Phosphorylierung von FAT/CD36 ging mit einer signifikanten Abnahme der initialen Palmitinsäure-Aufnahme einher. Die maximale Abnahme auf 72 % des Kontrollwerts wurde bei einer extrazellulären ATP-Konzentration von 0,5 nM erreicht. Der inhibitorische Effekt liess sich durch Co-Inkubation mit dem spezifischen Proteinkinase A-Inhibitorpeptid PKI 5-24 oder mit beta-gamma-ATP aufheben. Der Effekt war durch Dephosphorylierung mit Alkalischer Phosphatase vollständig reversibel. Bei extrazellulären ATP-Konzentrationen zwischen 10 pM und 15 nM war der inhibitorische Effekt der Ekto-Phosphorylierung auf die Palmitinsäure-Aufnahme signifikant. ATP-Konzentrationen über 15 nM verminderten den Effekt, bei über 5 µM ATP war kein Effekt nachzuweisen. Wir konnten ausschliessen, dass die Aufhebung durch ATP-Abbauprodukte verursacht wurde. Unsere Beobachtungen deuten auf einen regulatorischen Einfluss höherer extrazellulärer ATP-Konzentrationen, der dem inhibitorischen Effekt der Ektophosphorylierung von FAT/CD36 auf die Fettsäure-Aufnahme entgegenwirkt. / We investigated the correlation between the ecto-protein kinase A-mediated phosphorylation of the membrane-associated protein FAT/CD36 [Hatmi et al. 1996] and the initial cellular long chain fatty acid uptake. Under the conditions of FAT/CD36-ecto-phosphorylation, an inhibitory effect on the initial palmitate uptake of human platelets could be shown. This is the first time that a mechanism for the short-term regulation of protein-mediated long chain fatty acid uptake can be proposed. The isolation of morphologically and functionally intact resting human platelets and a method for measuring the initial palmitate uptake were established. The kinetics of palmitate uptake by human platelets were characterised and it was shown that a substantial fraction of initial palmitate uptake is protein-mediated. The ecto-protein kinase A-mediated, cAMP-dependent phosphorylation of FAT/CD36 as described by Hatmi and co-authors could be demonstrated under our experimental conditions. The ecto-phosphorylation of FAT/CD36 was paralleled by a significant impairment of the initial palmitate uptake. Maximum inhibition was achieved at 0,5 nM extracellular ATP, when the palmitate uptake was decreased to 72 % compared to control. The inhibition of palmitate uptake was abolished by co-incubation with the specific protein kinase A inhibitor peptide PKI 5-24 or with beta-gamma-methylene-ATP, and was fully reversible upon addition of alkaline phosphatase. The inhibitory effect of the ecto-phosphorylation on the initial palmitate uptake was significant at extracellular ATP concentrations between 10 pM and 15 nM. ATP concentrations over 15 nM reduced the effect and concentrations over 5 µM completely abolished it. We could exclude that the abolishment was caused by ATP-derivates. Our data point to a regulatory influence of higher ATP concentrations, that antagonises the inhibitory effect of the ecto-phosphorylation of FAT/CD36 on the initial palmitate uptake.

Die LAMMER-Kinasen sind Dual-Spezifität-Proteinkinasen, die durch das namensgebende einzigartige LAMMER-Motiv gekennzeichnet sind. Sie sind evolutionär hoch konserviert und in den meisten Eukaryonten vorhanden. Die vorliegende Arbeit stellt die erste funktionelle Charakterisierung eines bisher kaum erforschten Vertreters der LAMMER-Proteinkinase Familie Kns1 aus der Bäckerhefe dar. Phänotypische Analysen belegten eine entscheidende Rolle für Kns1 in der Regulation der Toleranz gegenüber basischem pH-Stress. Das Entfernen des KNS1 Gens führte zu einer gesteigerten Empfindlichkeit der Zellen gegenüber basischen Wachstumsbedingungen. Weitere Analysen zeigten, dass Kns1 neben der katalytischen Aktivität auch nicht-katalytischen Mechanismen zur Förderung des Zellwachstums unter alkalischem pH-Stress nutzt. Die Reinigung des Kns1 Proteins in voller Länge aus E. coli ermöglichte die Identifizierung von neun in vitro-Autophosphorylierungsstellen mittels Massenspektrometrie. Die Mutation von Thr562, eine Autophosphorylierungsstelle innerhalb des LAMMER-Motivs, zu Alanin ergab in vitro eine Kinase mit intrinsischer katalytischer Aktivität, die sich jedoch in vivo hauptsächlich wie die katalytisch inaktive Kns1-Mutante verhielt. Die Calcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II Cmk2, die konstitutiv autokatalytische Eigenschaften besitzt, wurde früher als mögliches in vitro Substrat von Kns1 vorgeschlagen. In dieser Arbeit beweise ich durch Verwendung einer katalytisch inaktiven Cmk2-Mutante als Substrat, dass Kns1 Cmk2 in vitro phosphoryliert. Darüber hinaus zeige ich, dass Cmk2 die basische pH-Toleranz der Zellen beschränkt. Gestützt durch genetische Hinweise agieren beide Proteine gemeinsam bei der Regulation der alkalischen Stresstoleranz, wobei Kns1 möglicherweise Cmk2 herabreguliert. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit eine neue und entscheidende Rolle von Kns1 und Cmk2 bei der Anpassung der Hefe an alkalisches Milieu. / The LAMMER protein kinases, termed after a unique signature motif found in their catalytic domains, are an evolutionary conserved family of dual-specificity kinases that are present in most eukaryotes. Here I report the first functional characterization of one of the most unexplored members of the LAMMER family, the budding yeast Kns1. Phenotypic analysis uncovered a crucial role for Kns1 in the control of the yeast tolerance to high pH stress. Deletion of the KNS1 gene conferred high sensitivity to alkaline pH, whereas its overexpression increased tolerance to this stress. Further analysis established that Kns1 promotes growth under alkaline pH stress using not only its catalytic activity but also non-catalytic mechanisms. Large-scale purification of full-length Kns1 from E. coli allowed for the identification of nine in vitro autophosphorylation sites on Kns1 by mass spectrometry. Mutation of the threonine residue at position 562, an autophosphorylation site located within the LAMMER motif, to a non-phosphorylatable residue yielded a kinase that preserves intrinsic catalytic activity in vitro but mostly behaves like the catalytically inactive mutant in vivo. This finding showed the physiological importance of autophosphorylation site Thr562 in the regulation of Kns1 function. The protein Cmk2, a calcium/calmodulin-dependent protein kinase II with autocatalytic properties, has been previously proposed as a possible in vitro substrate for Kns1. Here I demonstrate that Kns1 phosphorylates Cmk2 in vitro using a catalytically inactive Cmk2 mutant as substrate and show that Cmk2 restricts alkaline tolerance. Genetic evidence suggested that both proteins act in concert on a common pathway, in which Kns1 may downregulate Cmk2 to confer alkaline tolerance. In conclusion, this thesis describes a novel and crucial role for Kns1 and its in vitro substrate Cmk2 in the adaptation of yeast to alkaline stress.

Die Proteinkinase C (PKC) ist eine wichtige Signaltransduktionskomponente, deren Aktivierung die Expression zahlreicher Gene induziert und zur Zelldifferenzierung und Zellproliferation führt. Ein besonders hohes Expressionsniveau der PKC findet man in vielen Tumoren. So korreliert in malignen Gliazellen das Expressionsniveau der PKC mit deren Wachstumsgeschwindigkeit. Es wird angenommen, daß die aktivierte PKC eine wichtige Rolle in der Tumorpromotion hat. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob in Astrozytomzellinien Gene zu finden sind, die nach PKC-Aktivierung durch den Phorbol-Ester TPA differentiell exprimiert werden. Zunächst wurden kultivierte Zellen der Astrozytomzellinie LN-405 mit TPA respektive dem PKC-Inhibitor Chelerythrin behandelt. Nach Gewinnung der mRNA aus der zuvor isolierten RNA wurden in einem mehrstufigem PCR-Verfahren (SSH) cDNA-Abschnitte gewonnen, die zu vermeintlich differentiell exprimierten Genen gehören. Diese cDNA-Abschnitte wurden in Plasmid-Vektoren eingefügt, kloniert und zur Bestimmung sequenziert. Um falsch positive Sequenzen zu erkennen, wurden die zuvor radioaktiv markierten cDNA-Abschnitte mit Northernblots hybridisiert. Gleichzeitig ließ sich so ein zeitabhängiger Anstieg der Expression nach PKC-Stimulation untersuchen. Durch den PCR-Select-Assay (SSH) konnten insgesamt 11 Gene gefunden werden, die sich in der radioaktiven Northernblot-Hybridisierung, als nach PKC-Aktivierung differentiell exprimiert, darstellen ließen. Dabei bestätigt der gefundene Zusammenhang zwischen PKC-Aktivierung und differentieller Exprimierung bei fünf der 11 Gene (IL-8, Calpain, Interferon-gamma Rezeptor 2, Methionin Adenosyltransferase, beta-2 adrenerger Rezeptor) Ergebnisse anderer Autoren, wobei dieser Zusammenhang nur bei zwei Genen (IL-8 und Calpain) auch in Astrozytom- bzw. Gliom-Zellen schon früher gezeigt werden konnte. Sechs Gene (M-Phase Phosphoprotein-1, ect2-Onkogen, ERM-Gen, Ornithin-Decarboxylase-Antizym 2, MHC-bindendes Protein 2, Sequenz aus Cosmid F0811) wurden in der vorliegenden Arbeit erstmalig als PKC-abhängig exprimiert beschrieben. Die gefundenen Gene haben auf verschiedene Funktionen der Zellen Einfluß. So beeinflussen sie die Regulation des Zellzyklus (MPP1, ect2-Oncogen), die Immunregulation (MBP-2, IL-8, Interferon-gamma Rezeptor 2), die Signaltransduktion (beta-2 AR), die Transkription (ERM-Gen), die Proteinsynthese (ODC-Antizym, MAT), die Wachstumskontrolle (ODC-Antizym) und die Regulation der PKC selbst (Calpain). Für fünf Gene läßt sich ein eindeutiger Zusammenhang mit der Tumorpromotion herstellen: IL-8 (Angioneogenese), MBP-2 (Immunsuppression), ERM-Gen (Transkriptionspromotion), MAT (allgemein fördernder Einfluß auf den Metabolismus) und ect2-Oncogen (Oncogen). / The protein kinase C (PKC) is one of the major signal transduction systems and its activation leads to the induction of the expression of several genes, to cell differentiation and cell proliferation. Very high expressed PKC are found in many tumors. In malignant glia cells the expression of PKC correlates with their proliferation rate. The PKC activity has an important role for the tumor promotion. The object of this paper, was to investigated, if there are genes differentialy expressed after activation of PKC through the phorbol-ester TPA in astrocytoma cell lines. The astrocytoma cell line LN-405 was incubated with TPA and the PKC-inhibitor chelerythrine respectively. After isolation of RNA and mRNA the suppression subtractive hybridization (SSH) was used to isolate differentially expressed cDNA fragments. These cDNA fragments were inserted into the T/A cloning vector, cloned and sequenced. To detect false positives the cDNA fragments were analysed with northern blot technique. Examined was also a time-dependent acceleration of expression after TPA treatment. 11 genes were detected by suppression subtractive hybridization, showing differentially expressed in the northern blot hybridization. Five of the genes were found differentially expressed after PKC activation before (IL-8, calpain, interferon gamma receptor 2, beta-2-adrenergic receptor, methionine adenosyltransferase alpha), two of these genes (IL-8, calpain) also in astrocytoma- and glioma-cells respectively. Six genes (M-phase phosphoprotein 1, ect2-onkogene, erm gene, ornithine decarboxylase antizyme 2, MHC binding protein 2, sequence from Cosmid F0811) were described as PKC dependent expressed for the first time. The genes detected influence several cell functions. They are involved in cell-cycle regulation (MPP1, ect2-oncogene), immuneregulation (MBP-2, IL-8, interferon gamma receptor 2), signal transduction (beta 2 adrenergic receptor), transcription (erm-gene), synthesis of proteins (ODC-antizyme 2, MAT), growth control (ODC-antizyme) and regulation of PKC (Calpain). Five genes show a clear connection to tumor promotion: IL-8 (angioneogenesis), MPB-2 (immunesuppression), erm gene (promotion of transcription), MAT (promotion of metabolism) and ect2-oncogene (oncogene).

Le diabète de type 2 (DT2) est une maladie métabolique complexe causée par des facteurs génétiques mais aussi environnementaux, tels la sédentarité et le surpoids. La dysfonction de la cellule β pancréatique est maintenant reconnue comme l’élément déterminant dans le développement du DT2. Notre laboratoire s’intéresse à la sécrétion d’insuline par la cellule β en réponse aux nutriments calorigéniques et aux mécanismes qui la contrôle. Alors que la connaissance des mécanismes responsables de l’induction de la sécrétion d’insuline en réponse aux glucose et acides gras est assez avancée, les procédés d’inhibition de la sécrétion dans des contextes normaux ou pathologiques sont moins bien compris. L’objectif de la présente thèse était d’identifier quelques-uns de ces mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique, et ce en situation normale ou pathologique en lien avec le DT2. La première hypothèse testée était que l’enzyme mitochondriale hydroxyacyl-CoA déshydrogénase spécifique pour les molécules à chaîne courte (short-chain hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, SCHAD) régule la sécrétion d’insuline induite par le glucose (SIIG) par la modulation des concentrations d’acides gras ou leur dérivés tels les acyl-CoA ou acyl-carnitine dans la cellule β. Pour ce faire, nous avons utilisé la technologie des ARN interférants (ARNi) afin de diminuer l’expression de SCHAD dans la lignée cellulaire β pancréatique INS832/13. Nous avons par la suite vérifié chez la souris DIO (diet-induced obesity) si une exposition prolongée à une diète riche en gras activerait certaines voies métaboliques et signalétiques assurant une régulation négative de la sécrétion d’insuline et contribuerait au développement du DT2. Pour ce faire, nous avons mesuré la SIIG, le métabolisme intracellulaire des lipides, la fonction mitochondriale et l’activation de certaines voies signalétiques dans les îlots de Langerhans isolés des souris normales (ND, normal diet) ou nourries à la dière riche en gras (DIO) Nos résultats suggèrent que l’enzyme SCHAD est importante dans l’atténuation de la sécrétion d’insuline induite par le glucose et les acides aminés. En effet, l’oxydation des acides gras par la protéine SCHAD préviendrait l’accumulation d’acyl-CoA ou de leurs dérivés carnitine à chaîne courtes potentialisatrices de la sécrétion d’insuline. De plus, SCHAD régule le métabolisme du glutamate par l’inhibition allostérique de l’enzyme glutamate déshydrogénase (GDH), prévenant ainsi une hyperinsulinémie causée par une sur-activité de GDH. L’étude de la dysfonction de la cellule β dans le modèle de souris DIO a démontré qu’il existe une grande hétérogénéité dans l’obésité et l’hyperglycémie développées suite à la diète riche en gras. L’orginialité de notre étude réside dans la stratification des souris DIO en deux groupes : les faibles et forts répondants à la diète (low diet responders (LDR) et high diet responder (HDR)) sur la base de leur gain de poids corporel. Nous avons mis en lumières divers mécanismes liés au métabolisme des acides gras impliqués dans la diminution de la SIIG. Une diminution du flux à travers le cycle TG/FFA accompagnée d’une augmentation de l’oxydation des acides gras et d’une accumulation intracellulaire de cholestérol contribuent à la diminution de la SIIG chez les souris DIO-HDR. De plus, l’altération de la signalisation par les voies AMPK (AMP-activated protein kinase) et PKC epsilon (protéine kinase C epsilon) pourrait expliquer certaines de ces modifications du métabolisme des îlots DIO et causer le défaut de sécrétion d’insuline. En résumé, nous avons mis en lumière des mécanismes importants pour la régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique saine ou en situation pathologique. Ces mécanismes pourraient permettre d’une part de limiter l’amplitude ou la durée de la sécrétion d’insuline suite à un repas chez la cellule saine, et d’autre part de préserver la fonction de la cellule β en retardant l’épuisement de celle-ci en situation pathologique. Certaines de ces voies peuvent expliquer l’altération de la sécrétion d’insuline dans le cadre du DT2 lié à l’obésité. À la lumière de nos recherches, le développement de thérapies ayant pour cible les mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline pourrait être bénéfique pour le traitement de patients diabétiques. / Type 2 diabetes (T2D) is a complex metabolic disease caused by genetic as well as environmental factors, such as sedentarity and obesity. Pancreatic β cell dysfunction is now recognized as the key factor in T2D development. Our laboratory is studying the mechanisms of regulation of insulin secretion by the pancreatic β cell in response to nutrients. While the knowledge of the mechanisms responsible for initiation of insulin secretion in response to glucose and fatty acids is quite advanced, the inhibitory processes of insulin secretion in normal or pathological situations are still poorly understood. This doctoral thesis has focused on the identification of some of the mechanisms responsible for negative regulation of insulin secretion in pancreatic β cell. We have addressed this issue under normal situation or pathological conditions related to T2D. We first tested the hypothesis by which a mitochondrial enzyme, short-chain hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (SCHAD), negatively regulates glucose-induced insulin secretion (GIIS) by limiting the concentrations of some fatty acids and their derivatives such as acyl-CoA or acyl-carnitine molecules in the β cell. For this purpose, the downregulation of SCHAD by RNA interference (RNAi) was used in the pancreatic β cell line INS832/13. Then, we tested wether a prolonged administration of high-fat diet to mice (diet-induced obesity mouse model, DIO) would modulate intracellular metabolic and molecular pathways responsible for inhibition of insulin secretion. C57BL/6 mice were therefore fed a high-fat diet for 8 weeks followed by insulin secretion, intracellular lipid metabolism, mitochondrial function and intracellular signaling measurements on isolated pancreatic islets of Langerhans of those mice. Our results suggest that SCHAD negatively regulates GIIS and amino acid-induced insulin secretion. We propose that fatty acid oxidation by SCHAD would prevent the accumulation of short-chain acyl-CoAs or acyl-carnitines capable of potentiating insulin secretion. In addition, SCHAD regulates glutamate metabolism by the allosteric inhibition of glutamate dehydrogenase (GDH) preventing the hyperinsulinemia caused by excessive GDH activity. The study of β cell dysfunction in the DIO mouse model stratified LDR and HDR highlighted various fatty acid metabolism pathways involved in the reduction of GIIS. A decrease in the triglycerides/free fatty acid (TG/FFA) cycling associated with an increase in fatty acid oxidation and intracellular accumulation of cholesterol was shown to contribute to the decreased GIIS in DIO-HDR mice. Furthermore, alteration of AMP-activated kinase (AMPK) and protein kinase C epsilon (PKC epsilon) signaling pathways would be responsible for those alterations in metabolic pathways observed in DIO islets and cause decreased insulin secretion. In summary, we have shed light on important pathways negatively regulating insulin secretion in pancreatic β cell. These pathways could either limit the amplitude or duration of insulin secretion after a meal, or help to preserve β-cell function by delaying exhaustion. Some of those signaling pathways could explain the altered insulin secretion observed in T2D obese patients. In light of our research, the development of therapies targeting pathways that negatively regulate insulin secretion may be beneficial for treating diabetic patients.

Le diabète de type 2 (DT2) est une maladie métabolique complexe causée par des facteurs génétiques mais aussi environnementaux, tels la sédentarité et le surpoids. La dysfonction de la cellule β pancréatique est maintenant reconnue comme l’élément déterminant dans le développement du DT2. Notre laboratoire s’intéresse à la sécrétion d’insuline par la cellule β en réponse aux nutriments calorigéniques et aux mécanismes qui la contrôle. Alors que la connaissance des mécanismes responsables de l’induction de la sécrétion d’insuline en réponse aux glucose et acides gras est assez avancée, les procédés d’inhibition de la sécrétion dans des contextes normaux ou pathologiques sont moins bien compris. L’objectif de la présente thèse était d’identifier quelques-uns de ces mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique, et ce en situation normale ou pathologique en lien avec le DT2. La première hypothèse testée était que l’enzyme mitochondriale hydroxyacyl-CoA déshydrogénase spécifique pour les molécules à chaîne courte (short-chain hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, SCHAD) régule la sécrétion d’insuline induite par le glucose (SIIG) par la modulation des concentrations d’acides gras ou leur dérivés tels les acyl-CoA ou acyl-carnitine dans la cellule β. Pour ce faire, nous avons utilisé la technologie des ARN interférants (ARNi) afin de diminuer l’expression de SCHAD dans la lignée cellulaire β pancréatique INS832/13. Nous avons par la suite vérifié chez la souris DIO (diet-induced obesity) si une exposition prolongée à une diète riche en gras activerait certaines voies métaboliques et signalétiques assurant une régulation négative de la sécrétion d’insuline et contribuerait au développement du DT2. Pour ce faire, nous avons mesuré la SIIG, le métabolisme intracellulaire des lipides, la fonction mitochondriale et l’activation de certaines voies signalétiques dans les îlots de Langerhans isolés des souris normales (ND, normal diet) ou nourries à la dière riche en gras (DIO) Nos résultats suggèrent que l’enzyme SCHAD est importante dans l’atténuation de la sécrétion d’insuline induite par le glucose et les acides aminés. En effet, l’oxydation des acides gras par la protéine SCHAD préviendrait l’accumulation d’acyl-CoA ou de leurs dérivés carnitine à chaîne courtes potentialisatrices de la sécrétion d’insuline. De plus, SCHAD régule le métabolisme du glutamate par l’inhibition allostérique de l’enzyme glutamate déshydrogénase (GDH), prévenant ainsi une hyperinsulinémie causée par une sur-activité de GDH. L’étude de la dysfonction de la cellule β dans le modèle de souris DIO a démontré qu’il existe une grande hétérogénéité dans l’obésité et l’hyperglycémie développées suite à la diète riche en gras. L’orginialité de notre étude réside dans la stratification des souris DIO en deux groupes : les faibles et forts répondants à la diète (low diet responders (LDR) et high diet responder (HDR)) sur la base de leur gain de poids corporel. Nous avons mis en lumières divers mécanismes liés au métabolisme des acides gras impliqués dans la diminution de la SIIG. Une diminution du flux à travers le cycle TG/FFA accompagnée d’une augmentation de l’oxydation des acides gras et d’une accumulation intracellulaire de cholestérol contribuent à la diminution de la SIIG chez les souris DIO-HDR. De plus, l’altération de la signalisation par les voies AMPK (AMP-activated protein kinase) et PKC epsilon (protéine kinase C epsilon) pourrait expliquer certaines de ces modifications du métabolisme des îlots DIO et causer le défaut de sécrétion d’insuline. En résumé, nous avons mis en lumière des mécanismes importants pour la régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique saine ou en situation pathologique. Ces mécanismes pourraient permettre d’une part de limiter l’amplitude ou la durée de la sécrétion d’insuline suite à un repas chez la cellule saine, et d’autre part de préserver la fonction de la cellule β en retardant l’épuisement de celle-ci en situation pathologique. Certaines de ces voies peuvent expliquer l’altération de la sécrétion d’insuline dans le cadre du DT2 lié à l’obésité. À la lumière de nos recherches, le développement de thérapies ayant pour cible les mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline pourrait être bénéfique pour le traitement de patients diabétiques. / Type 2 diabetes (T2D) is a complex metabolic disease caused by genetic as well as environmental factors, such as sedentarity and obesity. Pancreatic β cell dysfunction is now recognized as the key factor in T2D development. Our laboratory is studying the mechanisms of regulation of insulin secretion by the pancreatic β cell in response to nutrients. While the knowledge of the mechanisms responsible for initiation of insulin secretion in response to glucose and fatty acids is quite advanced, the inhibitory processes of insulin secretion in normal or pathological situations are still poorly understood. This doctoral thesis has focused on the identification of some of the mechanisms responsible for negative regulation of insulin secretion in pancreatic β cell. We have addressed this issue under normal situation or pathological conditions related to T2D. We first tested the hypothesis by which a mitochondrial enzyme, short-chain hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (SCHAD), negatively regulates glucose-induced insulin secretion (GIIS) by limiting the concentrations of some fatty acids and their derivatives such as acyl-CoA or acyl-carnitine molecules in the β cell. For this purpose, the downregulation of SCHAD by RNA interference (RNAi) was used in the pancreatic β cell line INS832/13. Then, we tested wether a prolonged administration of high-fat diet to mice (diet-induced obesity mouse model, DIO) would modulate intracellular metabolic and molecular pathways responsible for inhibition of insulin secretion. C57BL/6 mice were therefore fed a high-fat diet for 8 weeks followed by insulin secretion, intracellular lipid metabolism, mitochondrial function and intracellular signaling measurements on isolated pancreatic islets of Langerhans of those mice. Our results suggest that SCHAD negatively regulates GIIS and amino acid-induced insulin secretion. We propose that fatty acid oxidation by SCHAD would prevent the accumulation of short-chain acyl-CoAs or acyl-carnitines capable of potentiating insulin secretion. In addition, SCHAD regulates glutamate metabolism by the allosteric inhibition of glutamate dehydrogenase (GDH) preventing the hyperinsulinemia caused by excessive GDH activity. The study of β cell dysfunction in the DIO mouse model stratified LDR and HDR highlighted various fatty acid metabolism pathways involved in the reduction of GIIS. A decrease in the triglycerides/free fatty acid (TG/FFA) cycling associated with an increase in fatty acid oxidation and intracellular accumulation of cholesterol was shown to contribute to the decreased GIIS in DIO-HDR mice. Furthermore, alteration of AMP-activated kinase (AMPK) and protein kinase C epsilon (PKC epsilon) signaling pathways would be responsible for those alterations in metabolic pathways observed in DIO islets and cause decreased insulin secretion. In summary, we have shed light on important pathways negatively regulating insulin secretion in pancreatic β cell. These pathways could either limit the amplitude or duration of insulin secretion after a meal, or help to preserve β-cell function by delaying exhaustion. Some of those signaling pathways could explain the altered insulin secretion observed in T2D obese patients. In light of our research, the development of therapies targeting pathways that negatively regulate insulin secretion may be beneficial for treating diabetic patients.

Nitric oxide (NO) is an important biological molecule within the body, which over production of this molecule in response to different stimulations can cause various inflammatory diseases. Over production of this molecule is caused by the induction of the inducible nitric oxide synthase (iNOS) enzyme. This enzyme uses L-arginine as a substrate and therefore the presence and transport of this amino acid into the cells can be a key factor in regulating NO over production. Different signalling mechanisms have been implicated in the regulation of this pathway and one of which involves the Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK). This family of proteins respond to inflammatory conditions and may mediate effects induced by inflammatory mediators. Of the MAPKs, the role of the c-Jun-N-terminal kinase (JNK) pathway in the induction of iNOS is still controversial. JNK and its downstream target, the transcription factor Activator Protein-1 (AP-1), have shown contradictory effects on iNOS induction leading to controversies over their role in regulating iNOS expression in different cell systems or with various stimuli. The studies described in this thesis have determined the role of JNK/AP-1 on iNOS expression, NO production, L-arginine uptake and also on the transporters responsible for L-arginine transport into the cells. The studies were carried out in two different cell types: rat aortic smooth muscle cells (RASMCs) and J774 macrophages which are both critically associated with the over production of NO in vascular inflammatory disease states. The first approach was to block the expression of the inducible L-arginine-NO pathway using SP600125 and JNK Inhibitor VIII which are both pharmacological inhibitors of JNK. The results from these studies showed that the pharmacological intervention was without effect in RASMCs, but inhibited iNOS, NO and L-arginine transport in J774 macrophages. In contrast, the molecular approach employed using two dominant negative constructs of AP-1 (TAM-67 and a-Fos) revealed a different profile of effects in RASMCs, where a-Fos caused an induction in iNOS and NO while TAM-67 had an inhibitory effect on iNOS, NO, L-arginine transport and CAT-2B mRNA expression. The latter was unaffected in RASMCs but suppressed in J774 macrophages by SP600125. Examination of JNK isoforms expression showed the presence of JNK1 and 2 in both cell systems. Moreover, stimulation with LPS/IFN- or LPS alone resulted in JNK phosphorylation which did not reveal any difference between smooth muscle cells and macrophages. In contrast, expression and activation of AP-1 subunits revealed differences between the two cell systems. Activation of cells with LPS and IFN- (RASMCs) or LPS alone (J774 macrophages) resulted in changes in the activated status of the different AP-1 subunit which was different for the two cell systems. In both cell types c-Jun, JunD and Fra-1 were increased and in macrophages, FosB activity was also enhanced. Inhibition of JNK with SP600125 caused down-regulation in c-Jun in both cell types. Interestingly this down-regulation was in parallel with increases in the subunits JunB, JunD, c-Fos and Fra-1 in RASMCs or JunB and Fra-1 in J774 macrophages. Since, SP600125 was able to exert inhibitory effects in the latter cell type but not in RASMCs, it is possible that the compensatory up-regulation of certain AP-1 subunits in the smooth muscle cells may compensate for c-Jun inhibition thereby preventing suppression of iNOS expression. This notion clearly needs to be confirmed but it is potentially likely that hetero-dimers formed between JunB, JunD, c-Fos and Fra-1 could sustain gene transcription in the absence of c-Jun. The precise dimer required has not been addressed but unlikely to exclusively involve JunB and Fra-1 as these are up-regulated in macrophages but did not sustain iNOS, NO or induced L-arginine transport in the presence of SP600125. To further support the argument above, the dominant negatives caused varied effects on the activation of the different subunits. a-Fos down-regulated c-Jun, c-Fos, FosB, Fra-1 whereas TAM-67 reduced c-Jun and c-Fos but marginally induced Fra-1 activity. Associated with these changes was an up-regulation of iNOS-NO by a-Fos and inhibition by TAM-67. Taken together, the data proposes a complex mechanism(s) that regulate the expression of the inducible L-arginine-NO pathway in different cell systems and the complexity may reflect diverse intracellular changes that may be different in each cell type and not always be apparent using one experimental approach especially where this is pharmacological. Moreover, these findings strongly suggest exercising caution when interpreting pure pharmacological findings in cell-based systems particularly where these are inconsistent or contradictory.

L’acide γ-aminobutyrique (GABA) est le principal neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central et est impliqué dans diverses pathologies incluant l’épilepsie, l’anxiété, la dépression et la dépendance aux drogues. Le GABA agit sur l’activité neuronale par l’activation de deux types de récepteurs; le canal chlorique pentamérique GABAA et l’hétérodimère obligatoire de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) GABAB. Chacun des récepteurs est responsable de phases distinctes de la réponse cellulaire au GABA. Lors d’une stimulation par le GABA, il est essentiel pour la cellule de pouvoir contrôler le niveau d’activité des récepteurs et au besoin, de limiter leur activation par des mécanismes de désensibilisation et de régulation négative. La désensibilisation nécessite le découplage du récepteur de ses effecteurs, ainsi que sa compartimentation hors de la membrane plasmique dans le but de diminuer la réponse cellulaire à l’agoniste. Les mécanismes de contrôle de l’activité de GABAB semblent anormaux pour un RCPG et sont encore mal moléculairement caractérisés. L’objet de cette thèse est d’étudier la régulation du récepteur GABAB et de sa signalisation par la caractérisation de nouvelles protéines d’interactions étant impliquées dans la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation du récepteur. Une première étude nous a permis d’identifier la protéine NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor) comme interagissant avec le récepteur hétérodimérique. Nous avons caractérisé le site d’interaction au niveau du domaine coiled-coil de chacune des deux sous-unités de GABAB et constaté la dépendance de cette interaction au statut de l’activité ATPasique de NSF. Nous avons observé que cette interaction pouvait être dissociée par l’activation de GABAB, induisant la phosphorylation du récepteur par la protéine kinase C (PKC) parallèlement à la désensibilisation du récepteur. L’activation de PKC par le récepteur est dépendante de l’interaction NSF-GABAB, ce qui suggère une boucle de rétroaction entre NSF et PKC. Nous proposons donc un modèle où, à l’état basal, le récepteur interagit avec NSF, lui permettant d’activer PKC en réponse à la stimulation par un agoniste, et où cette activation permet à PKC de phosphoryler le récepteur, induisant sa dissociation de NSF et sa désensibilisation. Nous avons par la suite étudié la dégradation et l’ubiquitination constitutive de GABAB et la régulation de celles-ci par PKC et l’enzyme de déubiquitination USP14 (ubiquitin-specific protease 14). Au niveau basal, le récepteur est ubiquitiné, et présente une internalisation et une dégradation rapide. L’activation de PKC augmente l’ubiquitination à la surface cellulaire et l’internalisation, et accélère la dégradation du récepteur. USP14 est en mesure de déubiquitiner le récepteur suite à l’internalisation, mais accélère aussi la dégradation par un mécanisme indépendant de son activité enzymatique. Nos résultats suggèrent un mécanisme où l’ubiquitination promeut l’internalisation et où USP14 cible le récepteur ubiquitiné vers un processus de dégradation lysosomale. La troisième étude porte sur la régulation de la densité de récepteurs à la membrane plasmique par la protéine Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2). Nous avons déterminé que Grb2 interagit avec GABAB1 au niveau de la séquence PEST (riche en proline, glutamate, sérine et thréonine) du domaine carboxyl-terminal, et que cette interaction module l’expression à la surface du récepteur hétérodimérique en diminuant l’internalisation constitutive par un mécanisme encore inconnu. Cette inhibition de l’internalisation pourrait provenir d’une compétition pour le site de liaison de Grb2 à GABAB1, ce site étant dans une région interagissant avec plusieurs protéines impliquées dans le trafic du récepteur, tels le complexe COPI et la sous-unité γ2S du récepteur GABAA (1, 2). En proposant de nouveaux mécanismes moléculaires contrôlant l’activité et l’expression à la membrane du récepteur GABAB par les protéines NSF, PKC, USP14 et Grb2, les études présentées dans cette thèse permettent de mieux comprendre les processus d’internalisation et de dégradation, ainsi que du contrôle de l’activité de GABAB par la désensibilisation, ouvrant la porte à une meilleure compréhension de la signalisation GABAergique. / γ-aminobutyric acid (GABA) is the principal inhibitory neurotransmitter of the central nervous system and is involved in diverse pathologies such as epilepsy, anxiety, depression and drug addiction. GABAergic modulation of neuronal activity involves two different subsets of receptors: the GABAA receptor chlorine channel and the heterodimer of G protein coupled receptors (GPCR) GABAB. Each of these receptors is responsible for mediating distinct parts of the GABA-induced signaling. Upon stimulation, it is vital for the cell to control the signaling input and prevent overstimulation, using mechanisms such as functional desensitization and down-regulation to achieve this. The processes controlling GABAB receptor activity are atypical for a GPCR and have yet to be fully characterized. The aim of this thesis is to elucidate the mechanisms controlling GABAB activity by discovering novel proteins interactions mediating receptor desensitization, internalization and ubiquitination. In the first study, we identified the N-ethylmaleimide sensitive factor (NSF) as a GABAB interacting protein and characterized its interaction site as the coiled-coil structure on both GABAB sub-units. We also showed that this interaction is sensitive to the ATPase state of NSF and that agonist treatment of GABAB led to dissociation of NSF from the receptor in a protein kinase C (PKC) dependent manner. Interestingly, GABA-induced PKC activation was dependent on the NSF-GABAB interaction, suggesting a feedback mechanism for PKC. Both PKC and NSF were involved in mediating receptor desensitization, suggesting a novel role of NSF in receptor signaling regulation. In the proposed model, NSF interacts with GABAB at the basal state, and upon agonist stimulation, PKC is activated and can phosphorylate the receptor, promoting NSF dissociation and GABAB desensitization. We then studied constitutive GABAB ubiquitination and degradation and its regulation by PKC and the deubiquitinating enzyme USP14 (Ubiquitin-specific protease 14). GABAB shows a high constitutive ubiquitination and internalization level. Activation of PKC promotes both phenomena and accelerates the rate of lysosomal receptor degradation. In contrast, USP14 promotes post-endocytic deubiquitination of the receptor, but also accelerates receptor degradation in a catalytically-independent manner. Our results suggest a mechanism where PKC-induced cell surface ubiquitination promotes GABAB endocytosis and USP14 interaction promotes endosomal sorting toward lysosomal degradation. In the third study, we identified the growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) as a protein interacting with the PEST (proline, glutamate, serine, threonine rich) sequence of GABAB1 through a SH3-domain interaction and forming a ternary complex with the functional GABAB heterodimer. We showed that Grb2 can regulate cell surface density of GABAB by decreasing constitutive endocytosis, suggesting that this interaction can compete for binding of the PEST sequence with proteins such as the GABAA γ2S sub-unit or the COPI complex (1, 2), promoting higher cell surface stability. In proposing novel molecular mechanisms controlling GABAB signaling and cell surface expression through NSF, PKC, USP14 and Grb2, this thesis highlights the complex regulation of GABAB activity by its functional desensitization, ubiquitination, endocytosis and degradation.

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology & Toxicology Student: Šárka Strachoňová Supervisor: PharmDr. Lukáš Červený, Ph.D. Title of diploma thesis: Studium of gene regulation of nucleoside transporters in BeWo cell line Nucleoside transporters (NTs) localized in syncytiotrophoblast control placental uptake of nucleosides. Dysregulation of NTs can disrupt nucleoside homeostasis with a negative consequences on placental and fetal development and can lead to a change in placental pharmacokinetics of nucleoside-derived drugs. Therefore, understanding the expression and function of NTs is necessary for effective and safe pharmacotherapy during pregnancy. The aim of this diploma thesis was to study the adenylate cyclase (AC) activated regulatory pathways of gene expression of concentrative nukleoside transporter 2 (CNT2). For this purpose, qRT-PCR and in vitro accumulation assays using the model substrate [3 H]-adenosine were employed. The human placental choriocarcinoma-derived BeWo cell line has been exposed to an AC activator, forskolin (50 µM), and/or inhibitors of AC/cAMP/PKA, AC/cAMP/MAPK (MEK1/2, p38 MAPK) signaling pathways, PKA inhibitor, KT 5720 (5 μM), an inhibitor of MEK1/2, U0126 (10 μM) and an inhibitor of p38 MAPK, SB202190 (10 μM). The...

No description available.